CN109563173A - 嵌合蛋白、多核苷酸、遗传结构、激活体、软骨再生的制剂(种类) - Google Patents

嵌合蛋白、多核苷酸、遗传结构、激活体、软骨再生的制剂(种类) Download PDF

Info

Publication number
CN109563173A
CN109563173A CN201780043652.5A CN201780043652A CN109563173A CN 109563173 A CN109563173 A CN 109563173A CN 201780043652 A CN201780043652 A CN 201780043652A CN 109563173 A CN109563173 A CN 109563173A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
chimeric protein
cell
preparation
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780043652.5A
Other languages
English (en)
Inventor
I·V·多科夫里诺夫
E·A·费得洛瓦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biochemical Preparations Co Ltd
Original Assignee
Biochemical Preparations Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biochemical Preparations Co Ltd filed Critical Biochemical Preparations Co Ltd
Publication of CN109563173A publication Critical patent/CN109563173A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/40—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明属于分子生物学、生物工艺学、医学、兽医学。发明组是提出的，发明组如下：包含MATN1蛋白质的配位体的嵌合蛋白和从EGF、TGF、FGF、IGF中的生长因子，结构的组分是用挠性小桥连接的，氨基酸次序评定的，图1；该嵌合蛋白，抗体Fc短链，或者FcRn结合多肽以及/或者转铁蛋白或它的短链，结构的组分是用挠性小桥连接的，氨基酸次序评定的，图1；编码的多核苷酸，用密码子优化的，以表达激活体细胞或靶向生物；遗传结构，以合成激活体细胞或杂合蛋白的靶向生物的细胞；嵌合蛋白的激活体；在细菌细胞基础上遗传结构的激活体；软骨再生的制剂，包含一种嵌合蛋白或者一种遗传结构为活性剂，有效量，以及生理型载体或者缓冲溶液，注射肠外或者在一种杂合蛋白基础上的制剂，包含运输结构域，注射口服，在这件事上，包装肠溶片。

Description

嵌合蛋白、多核苷酸、遗传结构、激活体、软骨再生的制剂(种 类)
发明领域
本发明属于分子生物学、生物工艺学、医学、兽医学，可用于软骨再生。
发明背景
软骨是一种结缔组织。软骨是骨头的一部分，有助于骨头的活动，或者是骨骼外的独立解剖构成物。关节软骨、椎间盘、耳软骨峡、鼻子软骨、耻骨联合与骨头直接连接。有些解剖构成物组成气道(喉头、气管、支气管)、心脏基质的一组软骨。软骨执行整合缓冲、减振、形势保持的功能，参与骨头的发育及生长。生物力学功能由于软骨的有弹性能实行。
软骨的疾病和问题大致可分三大组。第一组包括可能有关发育缺陷的疾病(例如，关节强直、发育不良)(科辛斯卡亚，骨关节器官的发育缺陷，医学出版社，1966年)。第二组包括在变老和许多营养不良性变性时软骨退变性变化引起的疾病(例如，骨节炎、骨软骨病)、代谢过程病情况下(例如，骨质疏松、痛风、关节病、大骨节病、褐黄症)，以及包括全身性疾病(风湿病、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、皮硬化症等)。第三组包括物理(机械的、热的等)、化学和其他创伤影响(例如，软骨膜炎、软骨膜骨折、微创伤导致的软骨损伤)引起的软骨组织孙伤(佩特罗夫斯基主编的多卷体的外科学集，第5卷，M.-L.，1960年)。
世界卫生组织(WHO)的统计数据证明，30至50岁的劳动年龄人口的80％患有各种肌肉骨骼系统疾病。根据官方统计，几千万人患有软骨组织的各种疾病，而更多的人不求助于医生。例如，近二十年注册的关节炎病例数增加一倍，这种趋势似乎年年增加。如果我们解释统计数据，事实证明，每年1％的俄罗斯人为关节炎诊断，健康的美国人数量也减少了大约相同的数量。关节炎、关节炎和骨质疏松症的部分占俄罗斯人口或美国人口的3％左右。世界上约有4％的人口患有骨关节炎，10％的病例中，骨关节病导致残疾。根据各种专家的鉴定，达到85％的俄罗斯成年人口患这种疾病。此外，据据2009年证明的世界卫生组织资料，世界上注册大约2千万至5千万损伤，导致欲动系统的缺陷或者是残疾的原因。2013年注册的资料证明每年大约500个人患脊骨损伤(http：//spinet.ru/public/dinamika_rasprostraneniy_oda.php)。应当注意，软骨治疗是运动创伤学的主要问题，即：软骨组织的损伤说明运动员挂鞋，因为目前不大的损伤时软骨组织恢复很难，严重的损伤时恢复是不可能的。
目前，止痛剂最常用于软骨损伤，非甾体类抗炎药(NSAIDs)用于症状疼痛的治疗，使用方法是口服或者以凝胶局部的(祖帕涅茨等，药物保管：关节和肌肉疼痛的对症治疗，药剂师出版社，第12卷(Zupanets I.A.，etc.Pharmaceutical care：symptomatictreatment of joint and muscle pain，Pharmacist，2002，issue 12)。但是，软骨结构恢复是重要的，因为疼痛综合征是损伤的次要特征。现在在硫酸软骨素和氨基葡萄糖基础上的软骨保护药用于软骨完整的恢复。然而，为了改善病情，需要很长疗程，期间是几个月，每日食用，只有在软骨损伤不大的条件下，这些药品才有效。这些药剂只用现存的细胞刺激基质组分的合成。可是，照发明人的意见，细胞数量在软骨恢复过程中举足轻重。因为在正常状态，况且软骨损伤时细胞不多，所以对现存的细胞影响小幅使软骨的状态好转，以加大基质组分的合成。
大家都知道在US 9133259 B2(04.19.2012)上说明的发明，本发明属于包含软骨基质低聚蛋白质(COMP)的蛋白络合物，其与一种或者几种生长因子化合(例如，TGFβ1或者FGF或者两种因子)，以刺激软骨形成和/或者骨生成及恢复骨头和软骨的结构。TGFβ1或者各种BMP类型(骨形态发生蛋白质)是一个种类提出的生长因子。本发明的说明书证明，优选的种类是在自吸收基质的蛋白质络合物，该基质是板或骨移植物。基质还包含胶原蛋白和纤维素。为了达到治疗效果，蛋白络合物必须与软骨或骨头的患部发生接触或者植入。可是，该方式是一种引起并发症的介入及繁重的方式。
本发明的发明人提出了嵌合蛋白(种类)，包含MATN1蛋白质的配位体和EGF蛋白质或者TGF、FGF、IGF蛋白质，该结构的组分是用挠性小桥连接的。
MATN1(matrilin)是软骨基质的蛋白质。编码该蛋白质的基因的突变与软骨营养障碍和特发性脊柱侧凸有关(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene？Db＝gene&Cmd＝ShowDetail View&TermToSearch＝4146，Montanaro L.et al，“Evidence of a linkagebetween matrilin-1 gene (MATN1)and idiopathic scoliosis”.Scoliosis 1：21，2006)。
EGF(Epidermal Growth Factor)是表皮生长因子，刺激细胞生长和上皮层的细胞分化蛋白质。该蛋白质与细胞表面上的表皮生长因子的受体联系，这联系刺激细胞内酪氨酸激酶的活性(Dawson JP et al“Epidermal growth factor receptor dimerizationand activation require ligand-induced conformational changes in the dimerinterface”，Mol.Cell.Biol.25：17，2005)。
TGF(Transforming growth factor)是由两类TGFα和TGF-β多肽生长因子组成的转化生长因子。TGFα诱导上皮组织的发育。TGF-β由三亚类TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3组成。这些蛋白质在组织再生、细胞分化和胚胎发育过程中起极其重要的作用。TGF通过受体作用，受体又磷酸化特殊信号效应子，从而形成信号蛋白质化合。形成的化合从细胞质到细胞核易位，在那里这些化合调节特殊基因的转录(Matt.P et al，“Circulating transforminggrowth factor-{beta}in Marfan syndrome″”.Circulation 120(6)：526-32，2005).
FGFs(Fibroblast growth factor)是纤维细胞的生长因子。这是参与血管新生、恢复伤势和胚胎发育的生长因子科。已经证明，为了转送纤维细胞的生长因子的信号，必须与细胞表面上的蛋白多糖相互作用。纤维细胞的生长因子在增生和多种细胞和组织的分化过程中起极其重要的作用(https：//embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Developmental_Signals_-_Fibroblast_Growth_Factor；http：//dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/188282).
IGF是胰岛素样生长因子1(IGF-1)，是一种介导促生长激素(GH)生长促进作用的肽类生长因子，是包含153个氨基酸的多肽，分子量为17kDa。在GH的影响下，胰岛素样生长因子1在肝脏和其他组织中形成。胰岛素样生长因子1刺激多达数组织的细胞增生，主要是骨组织、软骨组织和肌肉组织。胰岛素样生长因子1是一种合成代谢剂，各种类型的损伤之后新陈代谢的好转已证实(Meyer N.A.et al.1996.J.Trauma 31(6)：1008-1012)。用胰岛素样生长因子1治疗使恢复损伤好转(Martin，P.1997.Science 276：75-81.1997；SteenfosH.1994.Scand J Plast Reconstr Hand Surg 28：95-105；Pierre et al.1997.J BumCare Rehab 18(4)：287-291).
发明人提出的杂交蛋白质是软骨基质的向性的，因为该蛋白质包含MATN1(matrilin)蛋白质的配位体，因之该蛋白质的使用方法是肠外的或系统的方法，这事减轻该制剂使用。该蛋白质也含有从EGF、TGF、FGF或IGF中的生长因子。嵌合蛋白的组分是用挠性小桥连接的，这事允许执行蛋白质的每种组分的功能作用。
使用嵌合蛋白或者在本发明(种类)基础上制剂的技术结果表现出软骨损伤的治疗的简化。这结果达到，因为不需要注射蛋白质或局部地使用制剂，由于使用是靶向的，因为嵌合蛋白的结构包括与软骨组织的蛋白质结合的组分，而且发明人提出了这一点。因此，由于制剂局部地使用，这技术结果达到，因为注射方法是更简单的，即：注射的，而不需预先设计的使用特殊成分的基质。
使用嵌合蛋白或者在本发明(种类)基础上制剂的技术结果表现出同时发生的安全加大率及减少软骨损伤治疗的并发症发病率，因为这方法使用更安全的器具以把杂交蛋白质送到软骨。
使用嵌合蛋白或者在本发明(种类)基础上制剂的技术结果表现出软骨损伤治疗增效，由于杂交蛋白质分布得均匀在软骨组织中，因为以对基质蛋白质的向性为代价，与根据原型相反，使用由模型组成的制剂，甚至注射时，把制剂使用明确得部分。
使用嵌合蛋白或者在本发明(种类)基础上制剂的技术结果表现出恢复软骨结构的功效成分和制剂的范围扩大。如果有禁忌类似物或者按上述的缺点不想使用类似物，该蛋白质或不同工作原理的制剂将执行软骨再生。因为软骨再生的问题非常严重，并且不很多人可能把制剂投放到市场上去，所以提出的发明将增加这种广泛疾病防治的可能。
同时，发明人提出了遗传结构(种类)，该结构促进嵌合基因或靶向生物(种类)的表达，并编码杂交蛋白质(种类)，包含MATN1蛋白质的配位体和挠性小桥连接的EGF、TGF、FGF、IGF蛋白质的。此外，发明人提出了在这一种结构基础上的制剂，使用的方法是肠外的。在技术中，这种结构和在该结构基础上的制剂是未知的。该遗传结构和在该结构基础上的制剂的优点和技术结果跟杂交蛋白质一样，但是，还有另外的优点。
因此，技术结果也是增加效果的持续时间，并且达到这结果，因为使用遗传结构，注射后合成嵌合蛋白；以及该结构包含成分，该成分确保mRNA稳定，同时，增加mRNA半衰期，结果从一个mRNA分子的蛋白质合成进行更多次，以及合成蛋白质量增加；以及嵌合蛋白的核苷酸序列是用密码子优化的，以表达激活体靶向生物，蛋白质合成的结果是更强烈的。贯彻到实践中去之后，这制剂允许重要地减少注射的质粒DNA量(十至五十倍)，与目前在国内和国际基因治疗实践中使用的剂量相比。
此外，技术结果是加大安全。该技术结果是达到的，因为在身体中合成的遗传结构的蛋白质经过自然的翻译后影响，以及由于随伴细胞确保正确的蛋白质折叠。同时，该技术结果是达到的，因为遗传结构包含调节序列，即：沉默子和/或绝缘子，在本发明的一个种类中，由于合成的蛋白质量是控制的，基本上，蛋白质合成也是控制的，同时，制剂作用也是控制的。如需，可能很快就停止或者减少基因表达。如需，最后的种类中组织特异性表达是可能的。
由于避免体外(in vitro)发生的蛋白质制剂的生产和净化过程，技术结果也是再生制剂生产过程的简化及降低费用，因为蛋白质合成是体内(in vivo)的。DNA制剂的生产、纯化和储存比蛋白质制剂的经济上有利，因为DNA制剂是更稳定的，该制剂的大量生产和较低的费用是可能的。
使用方便的恢复软骨结构的药物发明是现代医学和兽医学的重要任务。口服给药途径是最简单、最安全和最普遍的。结药的该方法的主要是胃黏膜和肠黏膜吸收。结药30-90分钟以后血药物的治疗水平达到并保持4-6个小时，根据有效成分的性能和制剂成分。这种给药方法的优点是结各种药品(药粉、药片、药丸、丸剂、汤药、药水等)的可能，方法的简单和可获性；符合无菌性不是要求。口服药物的缺点是更慢的发展治疗效果比较其他结药方法；对每个患者速度和生物利用度是个人的，因为食物，胃肠道的器质性和官能的状态，结另外的药物对患者发生影响；如果在胃肠道器官中药物吸收得不好或者溶解得不好，口服药物方法是无效的；以及患者呕吐和失掉知觉时，口服药物是很难的或者不可能的(http：//sestrinskoe-delo.ru/puti-i-sposobi-primeneniya-lekarstvennich- sredstv).
大家都知道在WO2013059885A2(02.05.2013)上说明的多肽结构，包含与抗体或者其抗原结合部分结合的肽类或者多肽类信号配位体。根据抗体和Fc受体(FcRn)之间的相互作用类型，从血清内半排出期和生物分布的可能改变。在文件上没有有关口服这种结构的信息。
RU 2562232 C2(03.11.2009)和RU 2489423(02.02.2007)文件介绍CC-1065 DNA烷化剂的类似体及其接合体，以实行选择送到和/或者一种或几种DNA烷化剂释放的控制。这些种接合体，发明人建议用于不良的细胞增生引起的疾病治疗(肿瘤疾病)。接合体可包括各种蛋白质，例如：转铁蛋白，或者(EGF)表皮生长因子、或者(IL-2，IL-6)白细胞介素、或者(TGF)转化生长因子，即：TGF-α和TGF-β等。接合体的一部分也是与Fc受体相互作用的有氨基酸残基中改型的抗体。接合体成分是用链接互相结合的，例如：这链接包括三唑基团，以及单键(-C(O)-，-O-，-S-)也可以是链接。有小尺寸的链接(至多不过4个结合原子)是最好的。包含接合体的制剂药品，发明人建议用各种方法使用(口服、局部或注射)。但是，非特异的接合体送到及接合体向非靶细胞的渗透是可能的
大家都知道在US8932589(B2)(12.03.2013)上说明的包含融合蛋白的组合物。该融合蛋白质包含Klotho蛋白质或其短链，FGF或其短链，以及可能的变形的Fc短链，其增加仿射或者在血清除半衰期。Klotho蛋白或其活性短链能够与FGF受体结合。融合蛋白的组分可以是通过链接或肽链结合的。制剂用于治疗代谢异常及年龄的疾病(包括疾病，即：骨质疏松症和骨关节炎)。制剂是固体、液体、气溶胶的形式，制剂的使用方法是各种的，包括口服的方法，可是，静脉注射法(静脉点滴或推注)是最好的。我们想指出Klotho蛋白对软骨组织不是特殊的。
发明人提出的嵌合蛋白是软骨基质的向性的，因为该蛋白质包含MATN1(matrilin)蛋白质的配位体。该蛋白质也含有从EGF、TGF、FGF或IGF中的生长因子，以及抗体的Fc短链或与FcRn结合的多肽，以使用肠外或口服的方法。嵌合蛋白的组分是用挠性小桥连接的，这事允许执行蛋白质的每种组分的功能作用。
使用嵌合蛋白或者在本发明(种类)基础上制剂的技术结果表现出软骨损伤治疗增效，因为嵌合蛋白只是在软骨组织中有效力的。由于发明人提出使用MATN1(matrilin)蛋白质的配位体，这结果到达，因为嵌合蛋白或者在本蛋白质基础上的制剂作用于软骨组织。
由于发明人提出使用MATN1(matrilin)蛋白质的配位体，使用嵌合蛋白或者在本发明(种类)基础上制剂的技术结果表现出安全加大率，因为软骨损伤治疗的并发症发病率减少，也没有无法预料的结果，由于嵌合蛋白或者在本蛋白质基础上的制剂作用于软骨组织。
使用嵌合蛋白或者在本发明(种类)基础上制剂的技术结果表现出恢复软骨结构的功效成分或制剂的范围扩大。
US 2011092677(A1)(21.04.2011)和WO2004020404(A2)(11.03.2004)文件说明反式体，包含一种或几种可变结构域或者一种或几种抗原的CDR抗体，以治疗或预防疾病，也包含转铁蛋白或者修改的转铁蛋白。使用TNFα作为抗原时，这种反式体也可能治疗某些关节炎。TGF、EGF或FGF可以作为抗体。在这件事上，使用是不同的，但是，在该文件上没有说明。文件上说明的其他抗原是反式体阻断的靶标。该修改的转铁蛋白组不进行糖基化或实际上不进行糖基化，不结合铁和/或转铁蛋白受体，这事实对半排出期的时间有良好的影响。发明人也提出包含反式体的制剂。制剂的使用方法是各种的方法，即：口服或肠外。由于反式体结合及阻断TNFα，该反式体用于关节炎治疗，而且反式体不靶向任何组织。因此，反式体不能引起软骨组织再生。与生长因子结合的反式体是为阻断靶向德。在本发明的发明人提出的情况下，生长因子的使用原理是不同的。
发明人提出的嵌合蛋白是软骨基质的向性的，因为该蛋白质包含MATN1(matrilin)蛋白质的配位体。该嵌合蛋白也包含从EGF、TGF、FGF或IGF中的生长因子，以及转铁蛋白或其短链，以使用肠外或口服。嵌合蛋白的组分是用挠性小桥连接的，这事允许执行蛋白质的每种组分的功能作用。
使用嵌合蛋白或者在本发明(种类)基础上制剂的技术结果表现出软骨再生，因为嵌合蛋白靶向软骨基质，也吸收及刺激需要的细胞生长，由生长因子用于嵌合蛋白的结构。
由于发明人提出使用MATN1(matrilin)蛋白质的配位体，使用嵌合蛋白或者在本发明(种类)基础上制剂的技术结果表现出安全加大率，因为软骨损伤治疗的并发症发病率减少，也没有无法预料的结果，由于嵌合蛋白或者制剂作用于软骨组织。
使用嵌合蛋白或者在本发明(种类)基础上制剂的技术结果表现出治疗软骨结构的功效成分或制剂的范围扩大，口服的使用方法是可能的。
US 9133259 B2(19.04.2012)文件说明属于蛋白质络合物的发明，包含软骨基质低聚蛋白(COMP)的蛋白络合物，其与一种或者几种生长因子化合，例如，TGFβ1或者FGF或者两种规定的生长因子，以刺激软骨形成和/或者骨生成及恢复骨头和软骨。但是，与所提出的发明不同，本申请不提议用口服的使用方法注射包含上述的蛋白质络合物的制剂。因此，发明的说明书证明，优选的实施方案是蛋白质络合物在自吸收基质的，该基质是板或骨移植物。基质还包含胶原和纤维素。
为了达到治疗效果，蛋白络合物必须与软骨或骨头的患部发生接触或者植入。该方式是一种引起并发症的介入及繁重的方式。
WO 2004/062602 A2(29.07.2004)文件提出了结构及靶向物质到极化细胞(肠上皮细胞)方法，以治疗、预防或诊断目的。该组合物包含几种组分的结构，即：与极化细胞表面结合的组分；确保组合物透入细胞的组分；用于治疗、预防或诊断的组分、多肽或化学集总。例如，如果组合物用于诊病，第三组分是造影剂，抗体或者抗体短链用于治疗。可能的前两个组成是多肽、抗体或抗体短链，该两个组成可以与转铁蛋白受体或FcRn结合。结构的组分是共价或非共价互相化合的。该组合物的使用方法是口服的。但是，没有关于其他组分靶向穿过上皮层的分子的消息。本文件说明穿过上皮层的分子途径，引入分子的进一步的途径不是说明的。因此，所使用的第三结构的组分介导这件实事。即：结构保留在上皮细胞中或遍布全身并发生系统影响。
US 8173860 B2(08.05.2012)，WO 2001/046254 A1(28.06.2011)，WO 2012/116453 A1(07.09.2012)，WO 2015/070014 A1(14.05.2015)，WO 2012/170969 A2(13.12.2012)文件中说明发明结构或融合蛋白的想法。该结构或融合蛋白包含或与转铁蛋白或修改的转铁蛋白结合，还包含抗体Fc短链或与FcRn结合的类型，即：为了各种目的，该结构或融合蛋白包含转铁蛋白、Fc短链，例如，改良已现有的蛋白质的性能，生成运输蛋白，生成高效的治疗剂等。除了第一份文件上的说明的以外，上述的结构的使用方法是口服的。该结构的最优选的使用方法是肠外的。结构之中没有软骨再生的制剂。
RU 2555532 C2(06.11.2009)和RU 2490278 C2(19.12.2008)文件中说明各种的抗体种类，是对于IL-1R1特殊的，IL-1R1是在人各种的细胞种类或白细胞介素-4的α受体(hIL-4Rα)上表达的。所提出的抗体可用于IL-1R1介导的疾病治疗，包括风湿性关节炎。但是，发明人建议用上述的抗体治疗的关键的疾病是哮喘和COPD(慢性阻塞性肺病)。上述的抗体包含骨架和一个或几个可变环，其中一个或几个可变环的氨基酸序列是突变的，以形成与抗原靶结合的抗原结合部分。这种结构包含转铁蛋白，并且结合部分包含与FcRn的Fc受体加强结合的一种Fc部，以增加血清除半衰期。包含上述的结构的组合物的使用方法是各种的方法，包括口服的，片状或药粉，最优选的方法-是肠外的。本发明物可减缓疾病过程，因为建议的抗体阻断介导风湿性关节炎发展的分子。但是，由于上述的发明不可影响合成基质物质的细胞量，本发明不可引起软骨再生的需体积。
大家都知道在US8932589(B2)(12.03.2013)上说明的包含融合蛋白的制剂。该融合蛋白包含Klotho蛋白或其短链，FGF或其短链，以及可能的修改的Fc短链，其增加仿射或者在血清除半衰期。Klotho蛋白或其活性短链能够与FGF受体结合。融合蛋白的组分可以是通过链接或肽链结合的。制剂用于治疗代谢异常及年龄的疾病，包括疾病，即：骨质疏松症和骨关节炎。制剂是固体、液体、气溶胶的形式，制剂的使用方法是各种的方法，包括口服的方法，可是，静脉注射法(静脉点滴或推注)是最好的。应当指出Klotho蛋白对软骨组织不是特殊的，所以用上述的融合蛋白不是靶向的。
发明人提出的嵌合蛋白是软骨基质的向性的，因为该蛋白质包含MATN1(matrilin)蛋白的配位体。该蛋白质也包含从EGF、TGF、FGF或IGF中的生长因子，以及转铁蛋白或短链、抗体的Fc短链或与FcRn结合的多肽，以使用肠外或口服的方法。嵌合蛋白的组分是用挠性小桥连接的，这事允许执行蛋白质的每种组分的功能作用。
使用嵌合蛋白或者在本发明(种类)基础上制剂的技术结果表现出软骨再生的增效，因为嵌合蛋白靶向软骨基质。因此，与血流中循环的制剂不同，制剂在靶组织中集合，即：在组织中有制剂的提高浓度。同时，其他EGF、TGF或IGF生长因子用于其中一个种类。
使用嵌合蛋白或者在本发明(种类)基础上制剂的技术结果表现出安全加大率，因为制剂的作用是把向的，这事实排除身体不可预知的反应及副作用。
使用嵌合蛋白或者在本发明(种类)基础上制剂的技术结果表现出治疗软骨结构的功效成分或制剂的范围扩大，肠外或口服的使用方法是可能的。
同时，发明人提出了使用包含转运结构域的(转铁蛋白/转铁蛋白的短链和/或者抗体Fc短链/与FeRn结合的多肽)的上述的嵌合蛋白与不包含转运结构域的嵌合蛋白共同，及包括在软骨再生的制剂中，使用方法是肠外的方法。在这种情况下，技术结果与使用这些活性物质的技术结果一致。在身体中，这种蛋白质也活得更长。
使用在不包含转运结构域的两种嵌合蛋白基础上制剂的技术结果与使用这些活性物质的技术结果一致。
同时，发明人提出了遗传结构(种类)，该结构促进靶向生物(种类)的表达，并编码嵌合蛋白(种类)，包含MATN1蛋白质的配位体从EGF、TGF、FGF、IGF中的生长因子、抗体的Fc短链或与FcRn结合的多肽和/或转铁蛋白或其短链；组分是用挠性小桥连接的。发明人建议用肠外的方法使用这种遗传结构，制剂包含一种结构，其中的一种包含与上述的不包含转运结构域的遗传结构一起，制剂包含一种结构。这种结构和在这种结构基础上的制剂，包括包含上述的附加组分的制剂是未知的。该遗传结构和在该结构基础上的制剂的优点和技术结果跟上述的这种结构编码的嵌合蛋白和上述的不包含转运结构域的遗传结构和在该结构基础上的制剂一样。
因此，目前在靶向软骨组织的嵌合蛋白基础上的制剂是未知的。由于诱导软骨组织的再生，制剂可治疗软骨疾病，而且使用方法是肠外和口服的方法。同时，在遗传结构基础上的制剂也是未知的，这种遗传结构参与在靶向物的细胞里的嵌合蛋白合成，使用方法是肠外的方法。
因此，组成上述的嵌合蛋白和遗传结构的发明物是未知的，上述的嵌合蛋白是多核苷酸、遗传结构、激活体；上述的遗传结构是多核苷酸、激活体。使用它们的技术结果是制出蛋白质、遗传结构和本发明物的制剂。
本发明的本质
现在紧迫的任务是制出制剂，这种制剂能够达到有病的软骨组织的重大的再生，并且这种制剂将发生靶向的作用，使用方便，以及生产和使用的方法是安全和经济的方法。提出的发明组(种类)解决了这种任务。
提出的发明组(种类)包括：(1)包含MATN1蛋白质的配位体的嵌合蛋白，氨基酸次序评定的，图1A，和从EGF、TGF、FGF、IGF中的生长因子，图1B、C、D或J，相应；结构的组分是用氨基酸次序评定的挠性小桥连接的，图1E；(2)附加包含抗体Fc短链的嵌合蛋白(1)，氨基酸次序评定的，图1F，或与FcRn结合的多肽，氨基酸次序评定的，图1G和/或转铁蛋白，氨基酸次序评定的，图1H，或者其短链，氨基酸次序评定的，图1I，结构的组分是用氨基酸次序评定的挠性小桥连接的，图1E；(3)编码嵌合蛋白(1)或(2)的多核苷酸，用密码子优化的，以表达在激活体或靶向生物的细胞里；(4)遗传结构，以合成在嵌合蛋白(1)或(2)的激活体或靶向生物的细胞中，包括多核苷酸(3)的，和实现指定用途的其他组分；(5)嵌合蛋白(1)或(2)的激活体；(6)在细菌细胞基础上遗传结构(4)的激活体；(7)包含一种嵌合蛋白(1)或(2)的软骨再生的制剂，或者；(8)软骨再生的制剂，以合成在靶向生物的细胞中，有效量，以及生理型载体或者缓冲溶液，使用方法是肠外的，或者(9)这在嵌合蛋白(2)基础上的制剂，使用的方法是口服的，在后一种情况下，制剂装入肠溶片。
本发明的详细说明
发明组是提出的，即：嵌合蛋白、多核苷酸、遗传结构、激活体和软骨再生的制剂(种类)。
嵌合蛋白是提出的，每个包含MATN1蛋白质的配位体和从EGF、TGF、FGF、IGF中的生长因子，结构的组分是用挠性小桥连接的，其组分的序列如图1所示。同时，嵌合蛋白是提出的，也包含抗体Fc短链、与FcRn结合的多肽或者其短链、转铁蛋白或者其短链，结构的组分是用挠性小桥连接的，其组分的序列如图1所示。
编码上述的嵌合蛋白的多核苷酸是提出的，用密码子优化的，以在激活体或靶向生物的细胞里表达。靶向物是需要恢复软骨的生物。如果蛋白质的氨基酸序列是已知的，专家能制出核苷酸序列。密码子优化是独立进行的，可使用激活体中密码子频率的消息，例如，在数据库中[例如，Nakamura Y，Gojobori T，Ikemura T.Codon usage tabulated frominternational DNA sequence databases：status for the year 2000.Nucleic AcidsRes.2000 Jan 1；28(1)：292]，或者使用专门的程序，例如，在网站上提供的：http：//www.encorbio.com/protocols/Codon.htm，或者http：//molbiol.ru/scripts/01_19.html.
遗传结构是提出的，该结构用于在激活体或所述多核苷酸的靶向生物的细胞里表达；除了多核苷酸以外，每个结构包含实现指定用途的组分
用于在靶向生物的细胞里表达的遗传结构是“短”线性结构或重组载体，形式是环行的或者线性的，本载体是质粒或病毒的载体。
除了编码本发明蛋白质的嵌合蛋白以外，用于在激活体的细胞里合成嵌合蛋白的遗传结构应该包含主要大量维持和扩增的组分、按用途有效的功能作用的组分及育种转化体的组分。
这种遗传结构是在原核细胞中，主要是细菌细胞，制出的，这种方法是最经济的。鉴于此，按本发明的这种遗传结构包含在细菌细胞中主要大量维持和扩增的组分。这些必需组分是原核复制起点和报告基因或者完成营养缺陷型的基因。原核复制起点用于维持在细胞中，细胞是中拷贝数的，主要是是高拷贝数的；报告基因用于进行激活体菌株育种的可能。合适的复制起点表示，例如，质粒载体：pM1(der.)，ColE1(der.)и F1，pUC и F1，SV40，但是，只不限于它们。可能的组分用于结构集成到激活体基因组。例如，3′AOX1或18S pPHк用于酵母菌。
转化体育种的组分一般是注明抗药性的基因或完成营养缺陷型的基因。例如，如果细胞作为激活体，选择标记是抗氨苄青霉素、卡那霉素或四环素的基因；如果酵母菌作为激活体，选择标记是基因，例如，LEU2、TRP1或URA3；如果真菌作为激活体，选择标记是抗双丙氨膦、潮霉素、金黄担子素或博来霉素的基因；如果植物作为激活体，选择标记是抗卡那霉素或双丙氨膦的基因；如果哺乳动物细胞作为激活体，选择标记是抗新霉素的基因。
除了编码发明蛋白质的嵌合蛋白以外，在靶向生物细胞中合成的遗传结构，“短”线性结构，应包含按用途有效的功能作用的组分。这种遗传结构的制出是通过聚合酶链式反应(PCR)进行的，这种方法是最有利的。
有效的功能作用、表达编码的蛋白质的组分是转录起始信号、助催化剂、翻译起始信号、起始密码子和终止序列转录的终止密码子和调节序列。分泌序列也是可能的。
如果Escherichia coli作为生物激活体，例如，助催化剂是乳糖操纵子、色氨酸操纵子的助催化剂；如果酵母菌作为激活体，助催化剂是酸性磷酸酶基因、乙醇脱氢酶基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因、半乳糖代谢基因的助催化剂；如果真菌作为激活体，助催化剂是纤维二糖水解酶基因、α淀粉酶基因、葡糖淀粉酶基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因或abp1基因的助催化剂；如果植物作为激活体，助催化剂是CaMV 19S RNA、CaMV 35S RNA或胭脂碱合成酶基因的助催化剂。例如，如果哺乳动物细胞作为激活体，助催化剂是包含调节组分的自然助催化剂(例如，CaM kinase II、CMV、nestin、L7、BDNF、NF、MBP、NSE、p-globin、GFAP、GAP43、酪氨酸羟化酶、红藻氨酸受体1亚单位和谷氨酸受体的B亚基等)，或者，助催化剂是包含调节序列的合成助催化剂，以在转录水平上得到靶向基质的必须的表达性质(时间和表达水平的对比)。
翻译启动信号是原核生物的莎伊恩-达尔加尔诺序列[Kapp L.D.，LorschJ.R.The molecular mechanics of eukaryotic translation//Annual Review ofBiochemistry 73/2004，657-704]和真核生物的科扎克序列[Kozak M.(1986)″Pointmutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulatestranslation by eukaryotic ribosomes″，Cell 44，283-292]。当哺乳动物细胞使用时，科扎克序列在ATG起始密码子之前可增加表达[Kozak M，Recognition of AUG andalternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is notgenerally affected by the nucleotides in positions +5 and +6.EMBO J.1997；16(9)：2482-2492]。
终止序列是注明mRNA稳定的组分之一。真核生物的终止序列依次包含终止密码、包含信号和多腺苷酸化位点的3’非翻译区、终止密码子，从而mRNA稳定是保持的，以及正确终止转录和从核心里mRNA输出是实行的。终止序列是牛生长激素(BGH)的天然的终止序列，即：用于蛋白质的cDNA的原来的或其他更强大的序列，例如，是哺乳动物细胞的序列，但是，只不限于它，这种序列可包含3’非翻译区之前的附加的终止密码子。植物细胞的终止序列的实例是胭脂碱合成酶基因(NOS T)的终止序列。
调节序列是核苷酸序列，这种序列可在转录水平和/或翻译水平上影响基因表达及保证遗传结构的存在和功能作用的维持的机制。关于助催化剂的可能的调节序列是增强子，以通过改善RNA聚合酶和DNA的相互作用增加表达水平；是绝缘子，以调制增强子、沉默子的功能；或是其短链，以降低转录水平，例如，是助催化剂之前的5’非翻译区，包括内含子，以用于组织特异性表达。如果结构包含沉默子或绝缘子，靶向基因调节是可能的。
按本发明的一种，在真核细胞中蛋白质合成的遗传结构包含一种上述的调节序列，这取决于助催化剂选择和靶向基因表达的所需参数依据的遗传结构的种类。其他调节序列是：
-助催化剂的downstream非翻译区，包括内含子，以增加mRNA稳定并增加靶向基因的表达。
按本发明物的一种在真核细胞中蛋白质合成的遗传结构还包含这种调节组分。
为了分泌本发明的嵌合蛋白，适合使用激活体或靶向生物的信号肽置于编码靶向基因的多核苷酸的N端。书籍说明这些分泌序列的实例[例如，俄罗斯，特许证2198179号，优先权日期是1999年9月15日，说明E.coli分泌；俄罗斯，特许证2143495号，优先权日期是1994年7月8日、美国，特许证4546082号，优先权日期是1982年6月17日、欧洲的发明申请书116201号、123294号、123544号、163529号、123289号、丹麦的发明申请书3614/83号，优先权日期是1983年8月8日说明酵母菌分泌；Kapila J，Rycke RD，Van Montagu M，Agenon G(1997)An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intactleaves.Plant Sci 122：101-108，Stiefel，V.，Ruiz-Avila，L.，Raz，R.，Valles，M.P.，Ghez，J.，Pages，M.，Martinez-lzquierdo，J.A.，Ludevid，M.D.，Langdale，J.A.，Nelson，T.，and Puigdoménech，P.(1990).Expression of a maize cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in early leaf and root vascular differentiation.PlantCell 2，785-793说明植物分泌]。此外，天然或异源分泌的序列包含是可能的，密码子优化的分泌序列用于本发明的嵌合蛋白合成的细胞。哺乳动物细胞中嵌合蛋白合成的一种发明的遗传结构包含TPA(tissue-type plasminogen activator isoform 1 preproprotein[Homo sapiens]，NCBI Reference Sequence：NP_000921.1)分泌序列。使用TPA分泌序列的优势是以前广泛的临床经验及这关于从各种的靶向基因中合成蛋白质的种序列的高效率。
表达系统功能作用的要求的其他组分也是可能的。根据现有的技术水平、这些组分的一定和明显的种类及种类使用，本发明的遗传结构可包含满足上述条件的任何组合，在遗传结构中这组合可进行在激活体细胞或靶向细胞中嵌合蛋白的合成。
在遗传结构中上述的组分测序对普通的本领域专家是清楚的。
依据激活体，激活体细胞中表达的遗传结构是病毒、质粒、磷酸、黏质或其他可能的载体。例如，当选择E.Coli作为细胞激活体时，例如，基因可是噬菌体的成分，例如，在λ噬菌体基础上，例如，基因可是质粒的成分，例如，在pBR或pUC基础上等。当选择Bacillussubtilis作为生物激活体时，例如，基因可是质粒的成分，例如，在pUB基础上。当使用酵母菌作为激活体时，遗传结构是在Yep、YRp、YCp或Yip基础上的质粒。当使用哺乳动物细胞作为激活体时，例如，遗传结构是pVAX1、pcDNA3.1或腺相关病毒的质粒，但是，只不限于它们。
靶向生物(哺乳动物)细胞中表达的合适的遗传结构是普通本领域专家清楚的结构及书籍说明的结构[Hartikka J，Sawdey M，Cornefert-Jensen F，Margalith M，Barnhart K，Nolasco M，Vahlsing HL，Meek J，Marquet M，Hobart P，Norman J，ManthorpeM.An improved plasmid DNA expression vector for direct injection intoskeletal muscle.Hum Gene Ther.1996Jun 20；7(10)：1205-17等]；以及这种结构是由普通的本领域专家用载体组分的建议制造的[“CloningVectors”，ed.Pouwls et al.，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018，Williams JA，CamesAE，Hodgson CP.Plasmid DNA vaccine vector design：impact on efficacy，safety andupstream production.Biotechnol Adv.2009Jul-Aug；27(4)：353-70.doi：10.1016/j.biotechadv.2009.02.003.Epub 2009 Feb 20.Review等]。人使用的优选的遗传结构是在人体测试的载体，该载体包含适当的调节序列的上述的组分，修改的序列也是可能的，以满足要求的标准，这减少要求注册制剂的试验数量。但是，使用包含必须的上述组分的其他遗传结构也是可能的。
在原核或真核生物基础上的上述的嵌合蛋白激活体是提出的。例如，原核激活体是Escherichia coli、Bacillus subtilis。真核激活体是霉菌、植物细胞和哺乳动物细胞。
在细菌细胞基础上的上述的嵌合蛋白激活体是提出的。例如，原核激活体是Escherichia coli、Bacillus subtilis。
上述的实例是本发明(遗传结构、激活体)的实现明显性，但是，实现只不限于它们。现在科学文献(例如，分子生物学书、生物技术书、文章http：//www.labome.ru/method/Recombinant-Protein-Expression-Vector-Host-Systems.html、具有数据库(例如，载体)的专业网站)说明各种表达系统、系统制造的方法和工作方法，因此专家理解发明物组的说明可实现发明物。
软骨再生的各种制剂是提出的。使用肠外方法的每种制剂包含一种上述的嵌合蛋白，作为活性成分，或者一种上述的遗传结构，以在靶向生物的细胞中合成嵌合蛋白，有效量，以及生理型载体或者缓冲溶液。制剂的每个嵌合蛋白包括两个组分，或者，使用口服方法的结构域时，每个嵌合蛋白包括三四个组分，遗传结构编码一个嵌合蛋白(2至4个组分)。使用口服方法的每种制剂包含一种嵌合蛋白，嵌合蛋白包括三个或四个组分，有效量，以及生理型载体或者缓冲溶液。大家都在技术水平中知道药学可接受的载体或缓冲溶液，这种载体或缓冲溶液包括各种文献说明的制剂。例如，Remington′s PharmaceuticalSciences。人或动物，包括宠物和牲畜，可服药。如果制剂的使用方法是口服的方法，制剂装入胶囊剂，即：肠溶片，胶囊剂溶化在肠中，一部分溶化在胃中。例如，脂质体可以使用，如列阿费龙-利平特(Reaferon-Lipint)重组口服制剂的情况。此外，这种制剂可以包含胶囊填料，以软地附降低酸度(碳酸盐)并保护蛋白质。与受体的相互作用很快发生，蛋白质没有时间崩溃。
发明人进行了实验室研究，研究证明实现说明的发明的可能及有效性。下列的实施列介绍研究结果。
图标、图纸和其他材料清单
图1、本发明的嵌合蛋白的组分如下：A是MATN1蛋白质的配位体；B是EGF；C是TGFβ1；D是FGF2；E是挠性小桥；F是抗体Fc短链；G是与FcRn结合的多肽；H是转铁蛋白；I是转铁蛋白的短链；J是IGF-1。CEA是在嵌合蛋白中组分结合的实施例。
实施例
实施例1.嵌合蛋白模拟化
为了模拟化蛋白质，下列的行动已实行：
1.探索嵌合蛋白的组分；
2.建设整个蛋白质的模型，以确定结构域的方向；
3.建设每个结构域的模型(使用3D结构和ab initio)；
4.使用整个蛋白质的模型，以对接模型
为了自动得到更实物的结果，使用I-Tasser算法，以模拟化蛋白质。
图1表示的包括A，B/C/D/J组分组合模拟嵌合蛋白及附加包含的F/G或H/I组分的这种蛋白质，所有蛋白质的组分是用E挠性小桥连接的，都是用ProtParam程序(http：//au.expasy.org/tools/protparam.html)研究的，这种蛋白质的氨基酸序列是研究的。下列的数据已获得。
图1表示的E连接的包括A、B组分组合的模拟嵌合蛋白包含77氨基酸残基；E连接的包括A、C组分组合的模拟嵌合蛋白包含136氨基酸残基；E连接的包括A、D组分组合的模拟嵌合蛋白包含147氨基酸残基；E连接的包括A，J组分组合的模拟杂交蛋白质包含177氨基酸残基，分子量为8.4kDa、pI 5.1、15kDa、pI 8.74、16.3kDa、pI 9.81、19.2kDa、pI 9.46。
图1表示的E连接的包括A、B、F组分组合的模拟嵌合蛋白包含316氨基酸残基；E连接的包括A、C、F组分组合的模拟嵌合蛋白包含375氨基酸残基；E连接的包括A、D、F组分组合的模拟嵌合蛋白包含386氨基酸残基；E连接的包括A、J、F组分组合的模拟嵌合蛋白包含416氨基酸残基，分子量为34.7kDa、pI 6.34、41.3kDa、pI 8.4、42.7kDa、pI 9.1、45.5kDa、pI8.94。当使用E添加H组分时，蛋白质增长了709氨基酸残基，分子量增长了77,7kDa。当使用E添加不是H组分而是I组分时，蛋白质增长了27氨基酸残基，分子量增长了2,4kDa。
图1表示的E连接的包括A、B、G组分组合的模拟嵌合蛋白包含126氨基酸残基；E连接的包括A、C、G组分组合的模拟嵌合蛋白包含185氨基酸残基；E连接的包括A、D、G组分组合的模拟嵌合蛋白包含196氨基酸残基；E连接的包括A、J、G组分组合表示的模拟嵌合蛋白包含226氨基酸残基，分子量为13.3kDa、pI 5.3、19.9kDa、pI 8.7、21.2kDa、pI 9.65、24.1kDa、pI 9.35。当使用E添加H组分时，蛋白质增长了709氨基酸残基，分子量增长了77,7kDa。当使用E添加不是H组分而是I组分时，蛋白质增长了27氨基酸残基，分子量增长了2,4kDa。
图1表示的E连接的包括A、B、H组分组合的模拟嵌合蛋白包含786氨基酸残基；E连接的包括A、C、H组分组合的模拟嵌合蛋白包含845氨基酸残基；E连接的包括A、D、H，组分组合表示的模拟嵌合蛋白包含856氨基酸残基；E连接的包括A、J、H组分组合的模拟嵌合蛋白包含886氨基酸残基，分子量为86.1kDa、pI 6.52、92.6kDa、pI 7.70、94kDa、pI 8.3、96.9kDa、pI 8.25。
图1表示的E连接的包括A、B、I组分组合的模拟嵌合蛋白包含104氨基酸残基；E连接的包括A、C、I组分组合的模拟嵌合蛋白包含163氨基酸残基；E连接的包括A、D、I，组分组合的模拟嵌合蛋白包含174氨基酸残基；E连接的包括A、J、I组分组合的模拟嵌合蛋白包含204氨基酸残基，分子量为10.8kDa、pI 5.83、17.4kDa、pI 8.88、18.7kDa、pI 9.89、21.6kDa、pI 9.55。
根据上述程序的计算，本实例中介绍的任何蛋白质的最佳半衰期是在所有的细胞中保持的，如果甲硫氨酸在于这种蛋白质的N端。当表达杂合多核苷酸(种类)时，具有甲硫氨酸在于N端的蛋白质是在任何细胞中合成的，因为起始密码子总是开始翻译过程。此外，例如，如果作为分泌肽的一部分，蛋白质是分泌的，甲硫氨酸可天然分离，或者，在蛋白质纯化过程中，甲硫氨酸分离是可能的，如在Escherichia coli细菌和其他细菌中制出的一些蛋白质的情况。因此，本发明的具有甲硫氨酸在于N端的嵌合蛋白的种类是可能的。
实施例2.使用原核生物制出按本发明物的高纯嵌合蛋白
将计算的嵌合蛋白的氨基酸序列翻译成核苷酸序列，同时，用http：//molbiol.ru/scripts/01_19.html程序进行密码子优化，以在E.coli细胞中进行表达过程并添加基因侧翼的限制网站。我们化学合成到了计算的基因。
根据载体的说明书，把所得基因到基因在细菌表达载体pET28a(+)中克隆到限制网站。
为了建模激活体菌株，我们用具有在λDe3因子型中包含溶素原和me131突变的BL21Star(DE3)(Invitrogen，USA)菌株的E.coli细胞，包括F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcmrne131(DE3)因子型。突变的rne(rne131)基因编码核糖核酸酶E(RNase E)截短形式，这事实减少mRNA细胞内破坏并增加其酶稳定。蛋白酶基因的lon和ompT突变可产生非蛋白水解的重组蛋白质，数量很大。
BL21菌株的E.coli细胞，包括F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm rne131(DE3)因子型以下列方法准备。夜间，在气温为+37℃时，细胞是在包含1％胰蛋白胨、1％酵母萃取物和1％氯化钠的L-汤里培养的，汤量为5ml。这种培养物我们用新鲜的L-汤稀释50-100倍，并在气温为+37℃时，光密度为0，2-0，3，波长为590nm，在摇椅上栽培。如果光密度超过0，3，我们用新鲜的L-汤稀释培养物，降低光密度到0，1，并栽培30分钟。把100мл培养物转到无菌离心管里，并在气温为+4℃时把细胞沉淀10分钟，沉淀为5000g。我们弃去上清液，把细胞重悬在去离子水里，数量是原来的，然后我们进行离心过程。洗涤程序重复三次。洗涤后，把细胞沉淀重悬在去离子水里，去离子水量少，并在微量离心机里离心30秒，转度为5000转/分钟。
感受态细胞的转化是用电穿孔方法进行的。为此，把稀释十倍的1μl连接酶混合物加入12μl感受态细胞，混在一起并用Eporator电穿孔仪(Eppendorf，德国)在无菌电穿孔小杯(Eppendorf，德国)里进行电穿孔过程，数量为100μl，间隙为1mm，电脉冲强度为1.7kV，时间为5毫秒。
转化之后，在气温为+37℃时，我们用SOC培养基(2％细菌胰蛋白胨、0，5％酵母萃取物、10mM NaCl，2，5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖)里培养细胞，时间为40分钟。
将10-100μl细胞悬浮液播出在LB选择培养基(Gibko BRL，美国)上，培养基包含卡那霉素(100mkg/ml)，以选择包含质粒的克隆(激活体菌株)。
将生长的E.coli菌落检验是否有具有靶向基因的质粒。包括原来的质粒DNA的细胞克隆认为是嵌合蛋白的激活体菌株。本发明嵌合蛋白的激活体菌株是这样产生的。
为了培养制出的激活体菌株，使用标准琼脂的LB培养基，这种培养基包含卡那霉素(浓度为100mkg/ml)和葡萄糖(浓度为1％)以阻断非特异性表达。
当培养物细胞达到0.6-0.8光单位的光密度，波长为600nm时，表达诱导作用实行。0.2％乳糖作为诱导剂(Studier，2005)。
为了按什图季叶尔(Studier，2005)方法实行表达的法自动诱导，包含1％蛋白胨(Gibco，美国)、0.5％酵母萃取物(Gibco，美国)、50mM Na2HPO4、50mM K2HPO4、25mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.5％甘油、0.05％葡萄糖和0.2％乳糖的PYP-5052培养基使用。将激活体菌株的个别菌落接种在PYP-5052培养基里。在气温为+37℃时，在光密度的大幅度改变(OD600)没有1个小时之前，发酵是在旋转型恒温摇床上实行的，转度为250转/分钟，时间为20个小时。把细胞等量样本用凝胶电泳选择，以进行编码杂交蛋白质的基因表达的分析，剩余的生物质沉淀是通过离心(9000g)沉淀的。
使用3个超声处理循环裂解沉淀的细胞，每个循环为30秒，在冰上间断为2分钟。然后，使用包含500mM磷酸钠缓冲液、pH 8，0、6M盐酸胍、500mM氯化钠的裂解缓冲液破坏包涵体，时间为1个小时。将8ml裂解缓冲液加入从5ml培养基中离心的细胞。
把包含Ni-NTA Sepharose的柱子用上涂缓冲液(500mM磷酸钠缓冲液、pH8.0、8M尿素、500mM氯化钠、10mM咪唑)预平衡。往柱子上涂破坏的包涵体。然后，将柱子用两体积上涂缓冲液(500mM磷酸钠缓冲液、pH8.0、8M尿素、500mM氯化钠、10mM咪唑)冲洗。然后，将柱子用三体积冲洗缓冲液(500mM磷酸钠缓冲液、pH8.0、8M尿素、500mM氯化钠、30mM咪唑)冲洗。将蛋白质用5ml洗脱缓冲液(500mM磷酸钠缓冲液、pH8.0、8M尿素、500mM氯化钠、200mM咪唑)洗脱。将1ml馏分收集，进行电泳分析(12％PAAG-DDS-Na)，将靶蛋白的馏分合并，根据布列德福尔德方法把其中的蛋白质浓度测定。
获得制剂，蛋白纯度为97-98％，根据SDS-PAGE数据，每个制剂的杂交蛋白质浓度为1至2mg/ml。
实施例3.使用真核生物获得按本发明的高纯嵌合蛋白
3.1.使用酵母菌细胞获得高纯嵌合蛋白
将计算的嵌合蛋白的氨基酸序列翻译成核苷酸序列，同时，用http：//molbiol.ru/scripts/01_19.html程序用密码子进行优化，以在Pichia pastoris酵母菌细胞中进行表达过程，并根据克隆载体说明添加基因侧翼区域以制出分泌的蛋白质。将计算的基因合成到了。
根据载体的说明书，将所得基因在pHIL-S1真核表达载体中克隆。
将酵母菌细胞准备，以转化细胞。在几种酵母蛋白酶中有缺陷的SMD1163菌株的Pichia pastoris细胞培养及冰冻，这事实保证分泌蛋白质的稳定。在无菌条件下，将上述的细胞在YPD培养基(1％酵母萃取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、1mM二硫苏糖醇)里的琼脂上接种，在气温为30℃时，把细胞培养。然后在悬浮体液里，把细胞重播并培养16个小时。在包含15％甘油的YPD培养基里，把细胞一部分重悬，并在气温为-86℃时冰冻。为了获得感受态细胞，在气温为30℃时，在加YPD培养基里的琼脂培养皿里，把细胞菌落预先生长两天。然后，在气温为30℃时，在10ml YPD培养基里，将一个菌落的东西生长16个小时。在YPD培养基里，把悬浮体液冲淡，光密度(OD600)为0.2，最终体积为10ml，这种培养物生长4个小时，光密度(OD600)为0至8。将细胞的悬浮体液离心5分钟(500g)，倒出上清液，在10ml溶液I里重悬，在EasyComp Transformation Kit转化一套里有这种溶液，然后，再次离心并在溶液I里重悬沉淀物。将50至200μl的感受态细胞的等量样本装在无菌试管里，试管体积为1.5ml。使用之前，在气温为-90℃时，试管是存放的。
为了进行转化过程，使用Pichia Easy Select Kit(Invitrogen)的EasyCompTransformation Kit套。根据这套的说明书，反应实行。将获得的细胞悬浮体液在无菌培养皿里的琼脂凝胶上播种，琼脂凝胶是YPD培养基中的加1M山梨糖醇和抗生素氨苄青霉素作好的，以终浓度为100μg/ml。3天后，每个培养皿里有几十个菌落。生长菌落的细胞转到培养皿里，培养皿里有MMD(minimal medium dextrose)琼脂，在气温为30℃时，培养皿的东西培养2天。
选择培养基中生长的细胞转到烧瓶里，并在摇椅上的5ml MGY培养基中(250转/分钟)培养1天，光密度(OD600)为5。然后，细胞通过离心沉淀10分钟(3000g)。根据SDS-PAGE方法，监督表达的靶基因。沉淀细胞之后，将培养基过滤(孔隙径为45μm)，然后Tris-HCl pH6.0加入以终浓度为20mM。用Millipore公司制造的蛋白质浓缩器(蛋白质的分子量超过10kDa)将包含嵌合蛋白的培养基浓缩5-10倍。
浓缩之后，将嵌合蛋白的制剂在水浴中煮沸(t＝100℃)，烧开2分钟，然后，在气温为4℃时，制剂离心15分钟，15000×g。
为了进行离子交换层析，用KM-sepharose。为了平衡KM-sepharose柱子，用包含20mM Tris-HCl pH 6.0的缓冲液。嵌合蛋白制剂上涂的速度为60ml/小时。用20mM Tris-HCl pH 6.0或20mM Tris-HCl pH 6.0，200mM NaCl把柱子冲洗。用20mM Tris-HCl pH 6.0，1M NaCl进行洗脱，收集馏分，馏分体积为1ml。
将获得的嵌合蛋白制剂解释2倍，将磷酸盐pH8.0加入以浓度为50mM，并上涂柱子。用涂缓冲液冲洗柱子之后，在相同缓冲液中用20mM咪唑溶液冲洗除去压载蛋白。用包含200mM咪唑的溶液洗脱蛋白质。结果是制出蛋白住的纯度超过95％。在电泳图上存在条带是测验的，条带与靶蛋白质的分子量一致。靶蛋白质表达的高水平对于获得的菌株是代表性的。
3.2.使用哺乳动物细胞获得高纯嵌合蛋白
将TPA信号序列(tissue-type plasminogen activator isoform 1preproprotein[Homo sapiens]，NCBI Reference Sequence：NP_000921.1)置于每个嵌合蛋白的氨基酸序列的N端。将计算的嵌合蛋白的氨基酸序列翻译成核苷酸，同时，用密码子进行优化，以在哺乳动物细胞(CHO)中手动进行表达过程，并添加基因侧翼的限制网站和科扎克序列。将计算的基因合成到了。
根据载体的说明书，将合成的基因在pcDNA3.1(+)载体中克隆。根据第4.1.1.条说明的纪录，基于E.coli DH10 B/R建模本质粒DNA的激活体菌株。
用磷酸钙沉淀的方法进行质粒产生的哺乳动物细胞的转染。
为了用质粒DNA转化哺乳动物细胞(CHO)，将细胞在12孔测图板(Costar，美国)上接种，接种密度为5×104个细胞/cm2。第二天，为了同步细胞分裂，将培养基更换了。3个小时后，把磷酸钙沉淀的质粒DNA加入细胞。为了制备沉淀物，将饱含50μgDNA的250mM CaCl2的250μl溶液与250μl溶液(1.64％NaCl、1.13％HEPES pH 7.12和0.04％Na2HPO4)缓慢混合。在气温为37℃时，具有5％CO2空气中，培养24个小时后，将培养基更换了包含100μg/ml新霉素的同类的培养基，以选择包含插入靶基因质粒的无性系，并因此包含表达的杂合蛋白。选择进行20天，在具有活细胞的孔里的培养剂是更换的(但是，前首的培养基未倒出，按酵素免疫分析法使用这培养基确定分泌蛋白质量)，并且1天后从底物上除去细胞，并表达转化基因的分析进行。转染效率分析在EPICS XL Beckman Coulter流式细胞仪(BeckmanCoulter，美国)上进行。
使用标准的酶联免疫吸附法评定稳定转染品系CHO获得的在培养基中的嵌合蛋白水平。
克隆的结果是稳定的CHO转染瘤，将转染瘤积蓄用于超低温保存及杂交蛋白质的实验批生产。表达嵌合蛋白的CHO转染瘤的生产率为420-540μg/107细胞/天。
使用Bplus生物反应器和高压灭菌的IMDM培养基培养激活体细胞，每91培养基加入45g DFBS(0.5％)和25.8g(100mm)七水合硫酸锌(ZnSO4×7H2O)。指定的工作条件如下：温度为37℃、pH 6，9-7，2、氧气浓度为空气饱和度的50％。达到指定条件后，将生物反应器播种了，在无菌条件下注入种子。培养时间为3天。
培养结束后，把培养液通过无菌Sartopure胶囊(Sartorius，德国)过滤，孔隙径为1.2μm，速率为11/min。然后，使用Viva Flow 200系统(Sartorius，德国)的过滤器浓缩澄清的液体。浓度过程进行以达到200ml的总体积。
使用无菌溶液分两步进行色谱纯化。第一步，BioLogic DuoFlow Pathfinder系统(Bio-Rad)、BioFract自动馏分收集器和YMC TriArt半制备色谱柱，250x4.6mm，C18吸附剂使用。开始工作之前，使用200ml缓冲液(1kg注射用水和1g三氟乙酸)通过色谱仪泵把柱子手动平衡，速度为2ml/min。
将准备的200ml的物质通过色谱仪泵注入色谱仪，速度为0.5ml/min。使用缓冲液(2kg乙腈，2g三氟乙酸)进行洗脱，速度为0.5ml/min。最大吸收时，收集馏分，波长为269nm。馏分体积为500ml左右。
使用BioSil SEC 125-5，300x7.8mm凝胶色谱柱进行第二步纯化。使用0.02M PBS缓冲液预平衡柱子。将准备的物质通过色谱仪泵注入色谱仪，速度为0.5ml/min。使用缓冲液(0.6M NaCl溶液)进行洗脱，浓度梯度为0.1-0.6M。收集馏分，吸收的波长为A280nm，不少3.4光学单位。馏分装入小瓶里。每种蛋白制剂的制出书溶液的体积为1L左右，嵌合蛋白的浓度为2至2.7mg/1ml。
按本发明，为了获得嵌合蛋白，使用其它哺乳动物细胞是可能的，例如，HEK293，COS细胞。
3.3.使用植物细胞获得高纯嵌合蛋白
将计算的嵌合蛋白的氨基酸序列翻译成核苷酸序列，同时，用http：//molbiol.ru/scripts/01_19.html程序用密码子进行优化，以在Nicotiana benthamiana细胞中进行表达过程，并根据克隆载体说明书添加基因侧翼区域。将计算的基因合成到了并在pTRV1真核表达载体中克隆了。使用病毒载体也是可能的(例如，在科马罗瓦、斯库拉切夫、兹韦列瓦、什瓦尔茨、多罗霍夫、阿塔别科夫的文章里说明(2006)，一种新的病毒载体用于在植物中有效产生靶蛋白。生物化学，71(8)，1043-1049)。
将获得的载体注入Agrobaterium tumefaciens GV3101菌株，这种菌株用于N.benthamiana叶子的浸润。把制出的具有杂交基因的Agrobaterium tumefaciens菌株在摇床上培养12个小时，在气温为30℃时。细胞(1，5мл)通过离心沉淀5分钟(4000g)，将沉淀物在缓冲液(1.5ml：10mM MgCl 2，10mM MES(pH 5.5))中重悬以光密度(OD600)为0.2。将土壤杆菌属悬浮体用没有针的注射器往N.benthamiana生长植物的叶子上涂。浸润后第7至11天观察最大的蛋白质合成水平。使用凝胶电泳和DDS Na进行在植物激活体的叶子细胞里嵌合蛋白表达的分析。感染后第10天，将叶片在缓冲液(10mM KCl、50mM Tris pH 8.0、5mMMgCl2、10mM β-巯基甾醇、0.4M蔗糖，10％甘油)中研磨。将制出的提取物离心(14000g，10分钟)，使用SDS凝胶电泳分析沉淀物和上清液。电泳图显示在细胞馏分的蛋白质，该蛋白质与根据本发明的杂合蛋白质分子量一致。在管制下，未经历转化的植物中，相应的蛋白质不是测验的。蛋白质产率为不溶性蛋白质分数的12-14％左右。
根据得到的结果，可以使用原核和真核细胞系统制出提出的嵌合蛋白；可以使用蛋白质纯化的各种方式制出每个蛋白质的高纯制剂。上述的分离及纯化的条件是通过实验选择的，在普通专家知道的值下条件可以变更。
实施例4.获得按本发明的高纯遗传结构
将计算的嵌合蛋白的氨基酸序列翻译成核苷酸序列，同时，用http：//molbiol.ru/scripts/01_19.html程序用密码子进行优化，以在哺乳动物细胞中进行表达过程，并添加基因侧翼的限制网站和科扎克序列。将计算的基因合成到了。
4.1.获得本发明的编码嵌合蛋白的质粒DNA(种类)。
4.1.1.建模质粒DNA的激活体菌株。
根据载体的说明，将获得的基因在数基因侧翼的限制网站中置于pVAX1(Invitrogen)或pcDNA3.1+(Invitrogen)真核表达载体。
为了建模激活体菌株，使用DH10B/R(F-mcrA，Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，80dlacZΔM15，ΔlacX74，deoR，recA1，endA1，araD139，Δ(ara，leu)769，galU，galKλ-，rpsL，nupG)菌株的E.coli细胞，该细胞是按电穿孔方法用MicroPulser(BioRad)电穿孔仪质粒DNA生产的。该菌株不含甲基化酶，这事实可使DNA中突变的可能最小化，包括克隆在该菌株支持的质粒中的基因的突变。把1μl透析的连接酶混合物加入12μl感受态细胞中，置于孔隙的电极之间并用电流脉冲处理。
转化之后，把细胞置于1ml SOC-培养基(2％菌胰蛋白胨、0.5％酵母萃取物、10mMNaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO 4、20mM葡萄糖)，并在气温为+37℃时，培育40分钟。
在相应地包含LB琼脂、50μg/ml卡那霉素或氨苄青霉素的选择培养基中，将包含质粒DNA的E.coli细胞的克隆检测了。
质粒DNA是从生长的克隆中分离的。使用Wizard Minipreps DNA PurificationSystem(Promega，美国)分离质粒DNA。把纯化的重组质粒DNA通过测序验证。
根据森杰尔方法，使用按Applied BiosystemsTerminator(BDT)v3.1Cycle Sequencing Kit套(Applied Biosystems，美国)所附说明书进行克隆短链的测序。使用荧光染料标记的ddNTP标记反应产物，并且每种ddNTP具有其自己的染料。为了测序，使用未标记的质粒特异引物。进行聚合酶连锁反应，然后，根据BigDye X-TerminatorPurification Kit(Applied Biosystems，美国)的说明书把反应混合物从游离标记的ddNTP中纯化。使用Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer(AppliedBiosystems，美国)毛细测序仪和3500/3500xL Genetic Analyzer Polymer“POP-6TM”(Applied Biosystems，美国)试剂分离测序反应产物。
测序反应产物的结果是通过激光扫描和所有类型ddNTP包含四种荧光染料的探测纪录的。
使用个人电脑的Chromas和BioEdit程序进行DNA序列的电脑分析。研究的DNA短链的核苷酸序列关于计算的序列是平均的，并合成短链与计算短链的相同是表明的。结果是选择E.coli细胞的克隆，该细胞包含质粒中靶向基因的全长序列，质粒是编码蛋白质的DNA序列。
4.1.2.生产编码嵌合蛋白的质粒DNA(种类)
个别的E.coli菌落置于10ml选择培养基里，菌落是在培养皿里的卡那霉素或氨苄青霉素加入的LB琼脂上的生长的。在气温为+37℃时，在不断的搅拌(250转/分钟)条件下，细胞生长12个小时。获得的细胞通过离心(4000g)收集。使用EndoFree Plasmid Mega Kit(Qiagen)进一步分离及纯化质粒DNA，上述的套可制备去热原DNA。使用0.8％琼脂糖凝胶进行分离的质粒DNA的电泳分析，使用荧光测定法测量其浓度。质粒DNA的产量为11营养培养基的3.1mg至4.7mg。
4.2.获得在编码本发明物的嵌合蛋白的腺相关病毒基础上的载体(种类)
将制出的基因置于在pAAVK-EF1α-MCS(System Biosciences(SBI))腺相关病毒基础上的载体，在此基础上使用E.coli(RecA-)细胞产生该载体的激活体菌株。然后，根据载体的说明书分离载体用于哺乳动物。载体产量为11营养培养基的2mg至3.2mg。
4.3.获得编码按本发明物的嵌合蛋白的短线性结构(种类)
为了获得短线性结构，使用安第4.1.条获得的质粒DNA。使用特异引物及进行聚合酶连锁反应，扩增质粒DNA短链，该短链包含转录起始信号、助催化剂、翻译起始信号、起始密码子、杂合基因，中断转录序列、调节序列的1个或2个终止密码子。
使用含有5μl 10倍Taq缓冲液(700mM Tris-HCl、pH 8.6/25℃、166mM(NH4)2SO4)、5μl MgCl2(1.25mM)、1μl dNTP、31.5μl水、1μl直接引物和1μl反向引物、5μl质粒DNA和0.5μlTaq聚合酶(Fermentas，立陶宛)薄壁聚丙烯试管，试管的体积为650μl，以扩增上述的序列，进行扩增的体积为50μl。
为了使DNA变性，在气温为+95℃时，把反应混合物加热5分钟。为了防止蒸发，将30μl BayolF矿物油(Sigma，美国)在反应混合物上层叠，反应混合物的体积为50μl。扩增反应在C1000热循环仪(Bio-Rad，美国)里进行。进行35个循环：在气温为95℃时，时间为20秒，在气温为50-62℃时(取决于引物)，时间为20秒，在气温为72℃时，时间为1分钟。为了完成形成的DNA链的形成过程，进行进行另外的循环：在气温为72℃时，时间为5分钟。
将聚合酶连锁反应的结果通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。如果结果良好，进行制备电泳。
扩增的DNA短链浓缩并用1.2％琼脂糖凝胶(Gibko BRL，美国)制备电泳进行纯化过程。进行聚合酶连锁反应后，使用混合料与六倍缓冲液(0.25％溴酚蓝、30％甘油)(ThermoScientific，美国)混合一起并上涂在凝胶上，18μl在每个孔里。电泳在包含TAE缓冲液(40mM Tris-乙酸盐、2mM EDTA pH8.0、0.5μg/ml溴化乙锭)的水平仪器上进行，电压为5-10V/cm。分离DNA的结果是在Macrovue透照仪(LKB，瑞典)的透射紫外光(302nm)里纪录的。根据的DNA迁移率对标记物中短链长度的的对数依赖性，扩增的短链长度是确定的。GeneRuler 1000bp DNA Ladder(Fermentas，立陶宛)DNA短链的名牌混合料作为标记物。含有所需大小的DNA条带的琼脂糖一块是切下的，并使用DNA&Gel Band Purification Kit(GE Healthcare，英国)套纯化DNA短链。使用从哺乳动物中分离出的短线结构。
实施例5.检测按本发明的嵌合蛋白的再生效果
胶原蛋白诱导的大鼠关节炎是人类风湿性关节炎的模型。为了使老鼠诱致这种关节炎，加入弗氏不完全佐剂的天然异源胶蛋白II型原鸡是注射的。这种自身免疫攻击的目标是胶原蛋白II型。当胶原蛋白诱导的关节炎时，在进行有效的反应中胶原自身抗体起重要作用(模型的详细说明：Kleinau S.，1991，格罗梅科、格里楚克，2012年)。
当注射一种蛋白质或蛋白质混合物，使用方法是口服的方法和肠外的方法时，按本发明物的杂合蛋白是研究的。为了评定结果，使用显微镜分析，进行关节的组织切片的分析。
5.1.在一种嵌合蛋白基础上制剂(种类)的再生电位的研究，使用方法是肠外的方法。
5.1.1.在关节周围组织中注射
组成关节炎之后，老鼠注射嵌合蛋白(种类)，在A、B/C/D/J组分基础上，并且在一些种类中，加入F/G和/或H/I，种类的组分表示不同的顺序，是用E组分连接的，所有组分如图1显示，或注射在该组分基础上的混合物，蛋白质的体积为20μg，注射方法是局部的，在关节周围组织中注射，方法主要是在肌肉内注射的，这剂量符合于人体剂量，人体剂量为0.1mg。在7天内，将制剂每天注射。从第6天起，在21天内，关节形态是分析的。生理盐水用作阴性对照。当使用所有研究的杂交蛋白质时，可靠的软骨恢复情况清楚了，与对照相比，注射一种嵌合蛋白的组中的最好的值是在AEJ组观测的，注射两种嵌合蛋白的组中的最好的值是在AEJ+JEA组观测的，不大的差别是在AEC+AEB+DEA+AEJ组观测的，组分如图1显示。包含F/G和/或H/I的另外组分的嵌合蛋白基本上发生效力，与不包括这些结构域的类似结构的蛋白质相当的，即：在包含两个另外结构域的情况下，导致更不大的受损软骨的再生。
5.1.2.系统注射方法
组成关节炎之后，老鼠注射嵌合蛋白(种类)，在A、B/C/D/J组分基础上，并且在一些种类中，加入F/G和/或H/I，种类的组分表示不同的顺序，是用E组分连接的，所有组分如图1显示，或注射在该组分基础上的混合物，蛋白质的体积为20至30μg，使用方法是系统的方法，在尾静脉中注射，这剂量符合于人体剂量，人体剂量为0.2至0.3mg。在7天内，把制剂每天注射。从第6天起，在21天内，关节形态是分析的。生理盐水用作阴性对照。当使用所有研究的杂交蛋白质时，可靠的软骨恢复情况清楚了，与对照相比，注射一种嵌合蛋白的组中的最好的值是在JEA组观测的，注射两种嵌合蛋白的组中的最好的值是在包含在蛋白质的N端蛋氨酸(不包括甲酰基)的CEA+JEA组观测的，不大的差别是在CEA+BEA+JEA组观测的，组分如图1显示。使用包含F/G和/或H/I的另外组分的嵌合蛋白时，试验结果是不太明显的软骨再生，但是，试验结束后，在身体内，这些蛋白质的更长循环是观测的，这可能说明蛋白质继续影响软骨再生过程。
试验结果是不太明显的软骨再生，与第5.1.1.条的实验结果的相当的。
5.2.在一种遗传结构基础上制剂(种类)的再生电位的研究，使用方法是肠外的方法
5.2.1.在关节周围组织中注射
组成关节炎之后，老鼠注射生产的一种遗传结构，在质粒DNA或腺相关病毒、或线短链基础上的，在哺乳动物细胞中嵌合蛋白是从上述的组分合成的，在A、B/C/D/J组分基础上，并且在一些种类中，加入F/G和/或H/I，种类的组分表示不同的顺序，是用E组分连接的，所有组分如图1所示，DNA体积为50μg，注射方法是局部的，在关节周围组织中注射，方法主要是在肌肉内注射的，这剂量符合于人体剂量，人体剂量为1mg。将制剂注射7日一次，一共五次。注射三次之后，在21天内，关节形态是分析的。不包含杂合基因的该遗传结构用作阴性对照。当使用所有研究的遗传结构(DNA)时，可靠的软骨恢复情况清楚了，与对照相比，注射一种遗传结构的组中的最好的值是在编码AEJ嵌合蛋白的质粒DNA pVAX基础上的组观测的，并且在编码AEDEF嵌合蛋白的线结构的组，不大的差别是在编码FEBEA嵌合蛋白的腺相关病毒基础上的组观测的，注射两种遗传结构的组中的最好的值是在编码AEJ+JEA嵌合蛋白(在N端上分泌信号的基因)的质粒DNA pcDNA3.1基础上的组观测的，不大的差别是在编码AEC+AEB+DEA+JEA嵌合蛋白的质粒DNA pVAX基础上的组观测的，组分如图1显示。包含另外第四组分的编码嵌合蛋白的遗传结构基本上发生效力，与不包括这些结构域的类似结构的蛋白质相当的，即：导致更不大的受损软骨的再生。发现的事实如下，试验结束后，注射编码F/G/H/I的一个转运结构域的遗传结构后，在动物血清里，合成的嵌合蛋白检测较久。注射线性化载体的结果是更低的再生指标。
5.2.2.系统注射方法
组成关节炎之后，老鼠注射生产的一种遗传结构，在质粒DNA或腺相关病毒、或线短链基础上的，在哺乳动物细胞中嵌合蛋白是从上述的组分合成的，在A、B/C/D/J组分基础上的，并且在一些种类中，加入F/G和/或H/I，种类的组分表示不同的顺序，是用E组分连接的，所有组分如图1显示，或注射在该遗传结构基础上的混合物，遗传结构的体积为50μg，使用方法是系统的方法，在尾静脉中注射，这剂量符合于人体剂量，人体剂量为1mg。将制剂注射7日一次，一共五次。注射三次之后，在21天内，关节形态是分析的。不包含杂合基因的该遗传结构用作阴性对照。当使用所有研究的遗传结构时，可靠的软骨恢复情况清楚了，与对照相比，注射一种遗传结构的组中的最好的值是在编码JEA嵌合蛋白的腺相关病毒基础上的组观测的，注射两种遗传结构的组中的最好的值是在编码CEA+JEA嵌合蛋白的质粒DNA基础上的组观测的，不大的差别是在编码CEA+BEA嵌合蛋白(在N端上分泌信号的基因)的线短链基础上的组观测的，所有组分如图1所示。试验结果是不太明显的软骨再生，与第5.1.1.条的实验结果的相当的。
包含F/G和/或H/I的另外组分的编码嵌合蛋白的遗传结构发生效力，与不包括这些结构域的类似结构的蛋白质相当的，即：导致受损软骨的再生，但是，试验结束后，在动物血清里，合成的杂交蛋白检测较久。
5.3.在一种遗传结构基础上制剂(种类)的再生电位的研究，使用方法是口服的方法
A、B/C/D/J、F/G和/或H/I组分组成的嵌合蛋白(种类)是不同的顺序的，是用E组分连接的，所有组分如图1显示，或在嵌合蛋白基础上的混合物，上述的组分装包肠溶片。组成关节炎之后，老鼠服制剂，蛋白质的剂量为2-3mg，使用方法是口服的方法，这剂量符合于人体剂量，人体剂量为20至30mg。将制剂每天服7至30天。从第10天起，在21天内，关节形态是分析的。水用作阴性对照。硫酸软骨素的制剂用作阳性对照。在3个星期内，1日2次，剂量为4mg，这剂量符合于人体剂量，人体剂量为750mg。
当使用所有研究的杂交蛋白质时，可靠的软骨恢复情况清楚了，与对照相比，注射一种杂交蛋白质的组中的最好的值是在GEAEB/C/D/J、GEB/C/D/JEA组观测的，注射两种杂交蛋白质的组中的最好的值是在IEJEA+AEBEH组观测的，组分如图1所示。结果表明，当使用两组分杂合蛋白(不包括转运结构域)同三组分的或四组分的(包括转运结构域)一起时，与注射三组分蛋白质或四组分蛋白质相比，结果的差异是微不足道的
由于上述的实验的结构，将与第5.1.1.条的实验结果的相当的软骨再生观测了。此外，将包含转运结构域的血里的嵌合蛋白的长期循环观测了。这种或那种肠溶包装没有强烈地影响研究结果。
将同类的兔子试验进行，兔子是手术半月板裂伤进行的。这种研究的结果同老鼠的胶原诱导的关节炎试验的结果又相互关系。
因此，制出嵌合蛋白、多核苷酸、遗传结构、激活体和软骨再生制剂(种类)的可能是证明的。如上所述，研究的嵌合蛋白确实对受损软骨有再生作用，无论直接注射的嵌合蛋白，还是注射编码嵌合蛋白的遗传结构。在所有进行的研究中，先前受损关节中软骨细胞数量的增加是观测的，这事实可能导致软骨再生。可以作出结论，发生其他软骨损伤时，所提出的发明(种类)可再生软骨。

Claims (9)

1.包含MATN1蛋白质的配位体的嵌合蛋白，氨基酸次序评定的，图1A，和从EGF、TGF、FGF、IGF中的生长因子，氨基酸次序评定的，图1B或C、D或J，相应；结构的组分是用氨基酸次序评定的挠性小桥连接的，图1E。
2.包含MATN1蛋白质的配位体的嵌合蛋白，氨基酸次序评定的，图1A，和从EGF、TGF、FGF、IGF中的生长因子，图1B或C、D或J，相应；抗体Fc短链，氨基酸次序评定的，图1F，或与FcRn结合的多肽，氨基酸次序评定的，图1G和/或转铁蛋白，氨基酸次序评定的，图1H，或者其短链，氨基酸次序评定的，图1I，结构的组分是用氨基酸次序评定的挠性小桥连接的，图1E。
3.根据权利要求1或权利要求2的编码嵌合蛋白的多核苷酸，用密码子优化的，以表达在激活体或靶向生物的细胞中。
4.遗传结构，以合成在根据权利要求1或权利要求2的嵌合蛋白的激活体或靶向生物的细胞中，包括根据权利要求3的多核苷酸，和实现指定用途的其他组分。
5.根据权利要求1或权利要求2嵌合蛋白的激活体。
6.根据权利要求4在细菌细胞基础上遗传结构的激活体。
7.软骨再生的制剂，包含根据权利要求1或权利要求2的一种嵌合蛋白为活性剂，有效量，及生理型载体或者缓冲溶液，使用方法是肠外的。
8.软骨再生的制剂，包含根据权利要求4的一种遗传结构为活性剂，以合成靶向生物的细胞，有效量，及生理型载体或者缓冲溶液，使用方法是肠外的。
9.软骨再生的制剂，包含根据权利要求2的一种嵌合蛋白为活性剂，有效量，及生理型载体或者缓冲溶液，使用的方法是口服的；制剂包装肠溶片。
CN201780043652.5A 2016-07-14 2017-07-13 嵌合蛋白、多核苷酸、遗传结构、激活体、软骨再生的制剂(种类) Pending CN109563173A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201600575A EA037848B1 (ru) 2016-07-14 2016-07-14 Гибридный белок, полинуклеотид, генетическая конструкция, продуцент, препарат для регенерации хряща (варианты)
EA201600575 2016-07-14
PCT/RU2017/000521 WO2018013013A1 (en) 2016-07-14 2017-07-13 Fusion protein, polynucleotide, genetic construct, producer, preparation for regeneration of cartilage (variants)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109563173A true CN109563173A (zh) 2019-04-02

Family

ID=60952156

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780043652.5A Pending CN109563173A (zh) 2016-07-14 2017-07-13 嵌合蛋白、多核苷酸、遗传结构、激活体、软骨再生的制剂(种类)

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11299724B2 (zh)
EP (1) EP3484928A4 (zh)
KR (1) KR20190028505A (zh)
CN (1) CN109563173A (zh)
EA (1) EA037848B1 (zh)
IL (1) IL264174A (zh)
WO (1) WO2018013013A1 (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2003125289A (ru) * 2003-08-18 2005-02-27 Галина Евгеньевна Позмогова (RU) Пептидный вектор, способ его получения, нуклеотидная последовательность, рекомбинантная плазмидная днк и штамм escherichia coli b-8389 вкпм для его получения, способ генетической модификации клеток млекопитающих и человека
CN1765929A (zh) * 2004-10-29 2006-05-03 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 含有肽载体和表皮生长因子的融合蛋白和核酸及其用途
US20080138323A1 (en) * 2006-11-13 2008-06-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods of promoting cardiac repair using growth factors fused to heparin binding sequences
CN101891803A (zh) * 2010-07-15 2010-11-24 北京大学第三医院 一种新的软骨亲和多肽序列、其筛选方法及应用
US20130039884A1 (en) * 2007-08-15 2013-02-14 Amunix Operationg Inc. Compositions and methods for improving production of recombinant polypeptides
CN104098701A (zh) * 2014-07-23 2014-10-15 广州市暨鹏生物科技有限公司 重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白及其制备方法与应用
CN105142657A (zh) * 2013-03-29 2015-12-09 梅里麦克制药股份有限公司 软骨结合型融合蛋白

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE361483C (de) 1922-10-16 Gummiwarenfabrik S Herz G M B Vollgummireifen
US4546082A (en) 1982-06-17 1985-10-08 Regents Of The Univ. Of California E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins
DE3382547D1 (de) 1983-01-12 1992-05-27 Chiron Corp Sekretorische expression in eukaryoten.
JPS60501140A (ja) 1983-04-22 1985-07-25 アムジエン 酵母による外因性ポリペプチドの分泌
NZ207926A (en) 1983-04-25 1988-04-29 Genentech Inc Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast
US4588684A (en) 1983-04-26 1986-05-13 Chiron Corporation a-Factor and its processing signals
DK58285D0 (da) 1984-05-30 1985-02-08 Novo Industri As Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf
DK82893D0 (da) 1993-07-08 1993-07-08 Novo Nordisk As Peptid
KR100316347B1 (ko) 1998-09-15 2002-08-27 한미약품(주) 대장균엔테로톡신ⅱ신호펩티드의변형체와인체성장호르몬의융합단백질을발현하는재조합미생물및그를이용한인체성장호르몬의제조방법
AU6694000A (en) 1999-07-14 2001-01-30 Heinrich Matthaei Method for producing and measuring informative life energy units, copy thereof on a substrate, verification and uses thereof
US20030226155A1 (en) 2001-08-30 2003-12-04 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin-antibody fusion proteins
US20110092677A1 (en) 2001-08-30 2011-04-21 Biorexis Technology, Inc. Modified transferin-antibody fusion proteins
CN100483537C (zh) 2002-07-05 2009-04-29 克西拉特克斯技术有限公司 用于盘驱动单元的安装设备和测试盘驱动单元的方法
DE102004014983A1 (de) * 2004-03-26 2005-10-20 Univ Stuttgart Rekombinante Polypeptide der Mitglieder der TNF Ligandenfamilie und deren Verwendung
AU2007210377B2 (en) 2006-02-02 2012-08-09 Georg-August-Universitat Gottingen Stiftung Offentlichen Rechts (Ohne Bereich Humanmedizin) Water-soluble CC-1065 analogs and their conjugates
WO2007124019A2 (en) 2006-04-21 2007-11-01 Gtc Biotherapeutics, Inc. Methods and products related to the transfer of molecules from blood to the mammary gland
EP2245064B1 (en) 2007-12-21 2014-07-23 Medimmune Limited BINDING MEMBERS FOR INTERLEUKIN-4 RECEPTOR ALPHA (IL-4Ralpha)
US8420088B2 (en) * 2008-01-28 2013-04-16 Novartis Ag Methods and compositions using FGF23 fusion polypeptides
BRPI0921687A8 (pt) 2008-11-03 2022-11-08 Syntarga Bv Composto , conjugado , uso de um composto , composição farmacêutica, processo para preparar uma composição famacêutica , método para tratar um mamífero em necessidade do mesmo ,e, método para tratar ou prevenir um tumor em um mamífero.
US8298533B2 (en) 2008-11-07 2012-10-30 Medimmune Limited Antibodies to IL-1R1
WO2012011645A1 (ko) 2010-07-21 2012-01-26 삼성중공업 주식회사 파력발전장치
WO2012017096A1 (de) 2010-08-06 2012-02-09 Momo Plus Ag Elektrische maschine an einer scheibenbremsaufnahme
WO2012050714A2 (en) * 2010-10-15 2012-04-19 The Regents Of The University Of California Cartilage oligomeric matrix protein (comp)-growth factor complexes and uses thereof
SG11201401518TA (en) 2011-10-28 2014-05-29 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
CN110078831A (zh) * 2011-12-01 2019-08-02 圆祥生命科技股份有限公司 补体和vegf途径的蛋白质抑制剂及其使用方法
CA2885894C (en) * 2012-09-27 2021-11-23 University Of British Columbia Peptide directed protein knockdown
AU2014317861B2 (en) * 2013-09-09 2019-11-28 Figene, Llc Gene therapy for the regeneration of chondrocytes or cartilage type cells
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
EP3659624B1 (en) * 2014-01-15 2022-11-16 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Cartilage targeting agents and their use
JP6426288B2 (ja) * 2014-07-22 2018-11-21 レモネックス インコーポレイテッドLemonex Inc. 生理活性物質又はタンパク質伝達用組成物及びその用途

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2003125289A (ru) * 2003-08-18 2005-02-27 Галина Евгеньевна Позмогова (RU) Пептидный вектор, способ его получения, нуклеотидная последовательность, рекомбинантная плазмидная днк и штамм escherichia coli b-8389 вкпм для его получения, способ генетической модификации клеток млекопитающих и человека
CN1765929A (zh) * 2004-10-29 2006-05-03 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 含有肽载体和表皮生长因子的融合蛋白和核酸及其用途
US20080138323A1 (en) * 2006-11-13 2008-06-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods of promoting cardiac repair using growth factors fused to heparin binding sequences
US20130039884A1 (en) * 2007-08-15 2013-02-14 Amunix Operationg Inc. Compositions and methods for improving production of recombinant polypeptides
CN101891803A (zh) * 2010-07-15 2010-11-24 北京大学第三医院 一种新的软骨亲和多肽序列、其筛选方法及应用
CN105142657A (zh) * 2013-03-29 2015-12-09 梅里麦克制药股份有限公司 软骨结合型融合蛋白
CN104098701A (zh) * 2014-07-23 2014-10-15 广州市暨鹏生物科技有限公司 重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YANBINPI ET AL: "Targeted delivery of non-viral vectors to cartilage in vivo using a chondrocyte-homing peptide identified by phage display", 《BIOMATERIALS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3484928A4 (en) 2020-02-26
KR20190028505A (ko) 2019-03-18
EA201600575A1 (ru) 2018-01-31
EA037848B1 (ru) 2021-05-27
WO2018013013A1 (en) 2018-01-18
US20190218539A1 (en) 2019-07-18
US11299724B2 (en) 2022-04-12
IL264174A (en) 2019-02-28
EP3484928A1 (en) 2019-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190216898A1 (en) Interleukin Combination and Use Thereof
CN103079586B (zh) G‑csf二聚体在治疗嗜中性粒细胞减少症中的应用
CN109689086A (zh) 具有延长的血清半衰期的融合蛋白
CN113683680A (zh) 一种重组ⅰ型人源化胶原蛋白c1l1t及其制备方法和用途
CN106279431B (zh) 一种猪圆环病毒亚单位灭活疫苗
CN113365655A (zh) 包含糖基化ag85a蛋白的用于预防结核病的疫苗组合物及其制备方法
CN112851791B (zh) 一种新型抗代谢紊乱的fgf类似物及其应用
CN104558198A (zh) GLP-1类似物和amylin类似物的融合蛋白制备及其用途
CN106608915A (zh) Glp-1(7-37)多肽类似物
ES2750685T3 (es) Transformante utilizado para perder peso y reducir la grasa, procedimiento de construcción para el transformante y aplicación del transformante
CN101602809B (zh) 具有抗炎作用的抗体靶向补体抑制物
CN105884901B (zh) 具持续控制血糖含量功能的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白
CN109563173A (zh) 嵌合蛋白、多核苷酸、遗传结构、激活体、软骨再生的制剂(种类)
CN102108097A (zh) 一种新型glp-1衍生物
JP2021502322A (ja) ブタのＦｃ断片と融合した抗原およびこれを含むワクチン組成物
JPH07503128A (ja) ヒト毛様体ニューロン親和性因子の先端欠失型および突然変異タンパク質型の合成と精製
CN101475644B (zh) 具有抗炎作用的新型靶向融合蛋白及其应用
CN107880133A (zh) 促皮质素与胰岛素样生长因子1融合蛋白及其制备方法
CN101897953B (zh) 无创性高穿透性表皮生长因子及其应用
KR101466875B1 (ko) 항종양괴사인자 수용체 2를 발현하도록 설계된 미니서클 벡터를 이용한 자가면역질환 치료
CN108728326B (zh) 一种远红光调控基因表达环路控制系统及构建方法和应用
CN101824388A (zh) 一种糖尿病食疗酵母及其构建方法
CN109868281A (zh) 一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法
CN113166207A (zh) 预防狂犬病的疫苗组合物及其制备方法
EA043412B1 (ru) Соматотропин пролонгированного действия, полинуклеотид, рекомбинантная клетка, препарат

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190402