CN109549987A - 用于保护细胞免受氧化应激的、包含具有改进量的成分的绿茶提取物的组合物 - Google Patents

用于保护细胞免受氧化应激的、包含具有改进量的成分的绿茶提取物的组合物 Download PDF

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Abstract

提供一种组合物以及制备所述组合物的方法，所述组合物衍生自天然产物并显示出保护细胞免受氧化应激的优异作用。根据本发明的一个方面的提取物和组合物衍生自天然产物，因此是安全的。它可以预防、改善和治疗氧化应激和神经元损伤。因此，它允许改善老年人群的生活质量，而不用担心副作用并促进相关产业的发展。

Description

用于保护细胞免受氧化应激的、包含具有改进量的成分的绿 茶提取物的组合物
背景技术
1.技术领域
本发明涉及用于保护细胞免受氧化应激的组合物，该组合物包含具有改进量的成分的绿茶提取物。
2.背景技术
氧化意味着某些原子、分子和离子失去电子或某些物质与氧键合或失去氢。某些物质燃烧、某些物质生锈、醇转化为醛、油酸化以及苹果变褐的现象都是氧化还原反应。即使将某些物质置于空气中也会发生这些现象，可以说这种氧化反应是由氧引起的。
细胞中发生也这种氧化反应，例如，可以提及表现出强氧化能力的活性氧的氧化反应。活性氧也称为有毒氧，是处于不稳定状态的氧，与我们吸入的氧完全不同。活性氧由于环境污染、化学物质、紫外线、血液循环障碍、压力等而过量产生。这种过量产生的活性氧在人体中引起氧化。这将破坏细胞膜、DNA和所有其它细胞结构，并且细胞失去功能或根据损伤程度而改变。与此同时，体内的各种氨基酸被氧化，蛋白质的功能恶化。此外，活性氧损伤核酸，引起核酸碱基的变形和分离、键的裂解和糖的氧化分解等，这可能引起突变或癌症。另外，生理功能恶化，这引起各种疾病和衰老。
特别是，随着老年人群的快速增加，由氧化应激引起的退行性脑神经系统疾病的发病也在增加，实际情况是尽管在医学科学中的显著的进步，退行性脑神经系统疾病的预防和治疗方法仍不清楚，并且尚未发现具有决定性作用的药物。目前，关于退行性脑神经系统疾病的治疗剂和治疗方法的研究一直在进行中，但由于长期使用某些药物产生的副作用和毒性通常是一个问题，并且大多数治疗剂仅表现出减轻症状而不是根治的作用。因此，必须开发一种衍生自天然产物且可以从根治退行性脑神经系统疾病而没有任何副作用和毒性的治疗剂。
发明内容
本发明旨在提供一种衍生自天然产物、不显示毒性、并且表现出优异的细胞保护作用的组合物，以及制备所述组合物的方法。
为了解决上述问题，在一个方面，本发明提供一种用于保护细胞免受氧化应激的组合物，该组合物包含作为活性成分的绿茶提取物，所述绿茶提取物含有占所述组合物总重量5wt％至25wt％的(-)-没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)和占所述组合物总重量7wt％至15wt％的(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。
在另一方面，本发明提供绿茶提取物在制备用于保护细胞免受氧化应激的组合物中的用途，所述绿茶提取物含有占所述组合物总重量5wt％至25wt％的(-)-没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)和7wt％至15wt％的(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。
在另一方面，本发明提供一种用于预防或改善神经退行性疾病的组合物，所述组合物包含作为活性成分的绿茶提取物。在一个方面，神经退行性疾病可能由氧化应激导致的神经元损伤而引起。
在另一方面，本发明提供绿茶提取物在制备用于预防或改善神经退行性疾病的组合物中的用途。
在另一方面，本发明提供一种用于制备所述组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(1)向绿茶中加入乙醇，在50℃至70℃下提取30分钟至4小时；(2)通过过滤和减压除去乙醇；并且(3)加水，在70℃至100℃下搅拌混合物3至8小时，然后在减压下浓缩混合物。
附图说明
图1是实施例1的韩国食品药品安全部(Korean Ministry of Food and DrugSafety)公开的绿茶提取物(样品1)的色谱图。
图2是根据本发明的一个方面的高温加工的绿茶提取物(样品2)的色谱图；
图3显示样品1和样品2的神经毒性测试结果；
图4显示样品1至样品3在保护细胞免受氧化应激作用方面的作用；
图5显示样品2的脂质过氧化(MDA)测定结果；以及
图6显示样品1和样品2的DPPH自由基清除能力。
具体实施方式
如本文所用，术语“绿茶提取物”包括茶树(Camellia sinensis，属于山茶科(Theaceae)的常绿树)提取物，或用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis spp)处理然后发酵的茶叶提取物等，无论提取方法、提取溶剂、提取成分或提取物的形式如何。术语“绿茶提取物”还包括通过用特定溶剂分馏提取物而获得的级分。茶包括选自茶叶、花、茎、果实、根以及茎和根的芯部中的至少一种。茶可优选为茶叶。此外，提取物可以优选为粉末形式。可以使用水、有机溶剂或其混合溶剂进行提取或分馏。有机溶剂可以是醇、异丙醇、丙酮、己烷、乙酸乙酯、二氧化碳，或它们中的两种或更多种的混合溶剂，但不限于此。在绿茶的活性成分不被破坏或使破坏最小化的条件下可以在室温或升高下进行提取或分馏。醇可以是C1至C5低级醇。提取或分馏的次数和方法没有特别限制。例如，可以使用诸如冷提取、超声提取、回流冷却提取、热水提取的方法。优选地，本发明的绿茶提取物可以通过冷提取或热提取来提取或分馏活性成分，过滤提取物，并在减压下浓缩滤液而获得。
如本文所用，术语“氧化应激”是指有害氧的副作用。人体自身调节体内活性氧的量，但是当有害氧的产生由于各种情况突然增加或者除去有害氧的功能下降时，会诱发由有害氧引起的各种疾病。因此引起的有害氧的副作用被称为氧化应激。当活性氧过量产生并且氧化应激在体内持续积聚时，细胞的基因受到影响或损伤。例如，由H2O2过量产生的活性氧物质具有自由基并且处于不稳定状态，因此该活性氧物质表现出强活性。因此，活性氧物质氧化细胞中的蛋白质、脂质等，从而破坏细胞的内稳态并杀死细胞。特别是，这种相对于神经元的氧化应激引起神经退行性疾病等。
如本文所用，术语“表儿茶素”包括表没食子儿茶素(EGC)、(-)表儿茶素(EC)、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和表儿茶素3-O-没食子酸酯(ECG)。
在一个方面，本发明涉及一种用于保护细胞免受氧化应激的组合物，所述组合物包含作为活性成分的绿茶提取物，所述绿茶提取物含有占所述组合物或所述提取物总重量5wt％至25wt％的(-)-没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)和占所述组合物或所述提取物总重量7wt％至15wt％的(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。
在本发明的一个方面中，所述组合物可以是用于治疗、预防或改善由神经元死亡引起的疾病的组合物。
在另一方面，本发明可以是用于预防或改善神经退行性疾病的组合物，所述组合物包含作为活性成分的绿茶提取物。
在一个方面，GCG的含量可以占所述组合物或所述提取物总重量的5wt％或更多、6wt％或更多、7wt％或更多、8wt％或更多、9wt％或更多、10wt％或更多、11wt％或更多、12wt％或更多、12.52wt％或更多、13wt％或更多、14wt％或更多、16wt％或更多、18wt％或更多、20wt％或更多、22wt％或更多、或24wt％或更多。在另一方面，GCG的含量可以占所述组合物或所述提取物总重量的25wt％或更少、23wt％或更少、21wt％或更少、19wt％或更少、17wt％或更少、15wt％或更少、14wt％或更少、13wt％或更少、12.55wt％或更少、12wt％或更少、11wt％或更少、10wt％或更少、9wt％或更少、8wt％或更少、7wt％或更多、或6wt％或更少。
在一个方面，EGCG的含量可以占所述组合物或所述提取物总重量的7wt％或更多、8wt％或更多、8.48wt％或更多、8.5wt％或更多、9wt％或更多、10wt％或更多、12wt％或更多、或14wt％或更多。在另一方面，EGCG的含量可以占所述组合物或所述提取物总重量的15wt％或更少、13wt％或更少、11wt％或更少、10wt％或更少、9wt％或更少、8.5wt％或更少、8.48wt％或更少、8.3wt％或更少、8wt％或更少、或7.5wt％或更少。
在另一种实施方式中，所述提取物中的GCG和EGCG的总含量可以占所述组合物或所述提取物总重量的40wt％或更少。在一个方面，儿茶素的含量可以占所述组合物或所述提取物总重量的40wt％或更少、35wt％或更少、30wt％或更少、25wt％或更少、20wt％或更少、18wt％或更少、16wt％或更少、15wt％或更少、14wt％或更少、12wt％或更少、10wt％或更少、8wt％或更少、6wt％或更少、或4wt％或更少。在另一方面，GCG和EGCG的总含量可以占所述组合物或所述提取物总重量的3wt％或更多、6wt％或更多、8wt％或更多、10wt％或更多、12wt％或更多、13wt％或更多、14wt％或更多、16wt％或更多、18wt％或更多、20wt％或更多、25wt％或更多、30wt％或更多、或35wt％或更多。
在另一种实施方式中，所述提取物中的表儿茶素的含量可以占所述组合物或所述提取物总重量的20wt％或更少。在一个方面，表儿茶素的含量可以占所述组合物或所述提取物总重量的20wt％或更少、18wt％或更少、16wt％或更少、15wt％或更少、14wt％或更少、12wt％或更少、10wt％或更少、8wt％或更少、6wt％或更少、或4wt％或更少。在另一方面，儿茶素的含量可以占所述组合物或所述提取物总重量的3wt％或更多、6wt％或更多、8wt％或更多、10wt％或更多、12wt％或更多、13wt％或更多、14wt％或更多、16wt％或更多、或18wt％或更多。
在另一种实施方式中，所述提取物可以是通过用选自水和C1至C4醇中的至少一种进行至少一次提取而获得的提取物。在一个方面，醇可以是乙醇。在另一方面，醇可以是至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％的乙醇。在另一方面，醇可以是高达70％、高达60％、高达50％、高达40％、或高达30％的乙醇。
在另一种实施方式中，所述组合物中的所述提取物的含量以干重计可以为1wt％至100wt％。在一个方面，所述组合物中的所述提取物的含量以干重计可以为1wt％或更多、10wt％或更多、20wt％或更多、30wt％或更多、40wt％或更多、50wt％或更多、60wt％或更多、70wt％或更多、80wt％或更多、或90wt％或更多。在另一方面，所述组合物中的所述提取物的含量以干重计可以为100wt％或更少、90wt％或更少、80wt％或更少、70wt％或更少、60wt％或更少、50wt％或更少、40wt％或更少、30wt％或更少、或20wt％或更少。
在另一种实施方式中，活性成分的剂量以干重计可以为5mg/kg/天至1000mg/kg/天。在一个方面，所述剂量可以是5mg/kg/或更多、100mg/kg/或更多、200mg/kg/或更多、300mg/kg/或更多、400mg/kg/或更多、500mg/kg/或更多、600mg/kg/或更多、700mg/kg/或更多、800mg/kg/或更多、或900mg/kg/或更多。在另一方面，所述剂量可以是1000mg/kg/或更少、900mg/kg/或更少、800mg/kg/或更少、700mg/kg/或更少、600mg/kg/或更少、500mg/kg/或更少、400mg/kg/或更少、300mg/kg/或更少、200mg/kg/或更少、100mg/kg/或更少、50mg/kg/或更少、或10mg/kg/或更少。
在一种实施方式中，氧化应激可以由活性氧物质引起。活性氧物质是指活性氧物质具有自由基并且是不稳定的状态，因此其表现出强活性。活性氧有时被称为有害氧，因为其过量产生对活体表现出毒性，即引起氧化应激。活性氧物质通过氧化细胞中的巨大分子(蛋白质、脂质等)来破坏细胞的内稳态、杀死细胞，从而对细胞组织造成灾难性损伤。活性氧物质包括单线态氧、超氧自由基、羟基自由基和过氧化氢(H2O2)。换句话说，活性氧物质通过H2O2而增加，因此氧化应激增加。在一个方面，本发明表现出保护细胞免受活性氧物质之害的优异作用，也表现出优异的DPPH(二苯基-2-苦基肼)自由基清除能力，因此能够有效地保护细胞免受氧化应激。
在另一种实施方式中，氧化应激可以由脑组织脂质过氧化引起。
在又一种实施方式中，氧化应激可以由过氧化产物丙二醛引起。
在再一种实施方式中，细胞可以是脑细胞或神经元。
在本发明的一个方面中，所述组合物可以是用于治疗、预防或改善由神经元死亡引起的疾病的组合物。
在另一方面，本发明可以是用于预防或改善神经退行性疾病的组合物，所述组合物包含作为活性成分的绿茶提取物。
已知由氧化应激引起的神经元死亡是退行性脑神经系统疾病的主要原因。最近，由于神经元中活性氧物质的量迅速增加而导致的氧化应激被认为是退行性脑神经系统疾病发生的主要原因，退行性脑神经系统疾病包括中风、肌萎缩侧索硬化症(卢伽雷氏病)、帕金森病、亨廷顿氏病、脊髓小脑变性症和多发性硬化症。因此，据报道，可以通过抑制或减少氧化应激来预防或治疗这些疾病。在一个方面，本发明可以减少由活性氧物质引起的氧化应激，因此可以保护神经元并抑制其死亡。
另外，脂质过氧化是指脂质转化为脂质过氧化物。脂质的脂肪酸部分过氧化。脂质过氧化产物包括具有氢过氧基的脂质、具有内部过氧化结构的脂质、具有氢过氧自由基的脂质，并且在一些情况下，包括其降解产物。通常，氢过氧基不稳定并且经常产生自由基。据信诱导这些自由基的链式反应是生物体组织损伤的原因。换句话说，出现在老年动物的神经、肝脏、肌细胞等中的脂褐质被认为是不溶性不均一聚合物，其中在脂质过氧化物周围清扫了蛋白质等。膜脂质的过氧化改变了膜的性质，例如渗透性。此外，脂质过氧化因被认为是牵涉血管病变的因素而对活体有害。氢过氧基胆固醇也是已知的。鉴于其化学结构，氢过氧基胆固醇可以被认为是过氧化醇。已知其临床上与老化有关。特别是，已知脂质过氧化物是脑老化的原因。因此，脂质过氧化物导致脑老化、脑神经疾病，特别是神经退行性疾病。因此，可以通过减少脂质过氧化物来改善神经退行性疾病。在一个方面，本发明允许减少脑组织中的脂质过氧化产物，从而预防和改善神经退行性疾病。
在一个方面，神经退行性疾病可以是选自中风、肌萎缩侧索硬化症(卢伽雷氏病)、帕金森病、亨廷顿氏病、脊髓小脑变性症和多发性硬化症中的一种或多种。
在另一方面，所述组合物可以是食品组合物或药物组合物。
所述食品组合物的剂型没有特别限制。然而，该组合物可以配制成例如片剂、颗粒剂、丸剂、粉末，液体如饮料、焦糖、凝胶、棒、茶袋等。除活性成分外，每种剂型可包括通常用于相应领域的成分。本领域技术人员可以毫无困难地根据剂型或用途选择和混合该成分，并且当该成分与其它原料一起使用时可以提供协同作用。此外，食品可以是功能性保健食品。
所述组合物可以通过各种方法给药，例如摄入、饮用、注射、喷雾或挤压。
根据本发明的一个方面确定所述食品组合物的活性成分的剂量在本领域技术人员的知识范围内。剂量可以根据包括对象的年龄、健康状况和并发症的各种因素而变化。
根据本发明的一个方面的食品组合物可以是，例如，各种食品，例如口香糖、焦糖产品、糖果、冷冻甜点和糕点糖果；饮料产品，例如软饮料、矿泉水和酒精饮料；以及功能性保健食品，该功能性保健食品包括维生素和矿物质。
除了上述之外，根据本发明的一个方面的食品组合物可以包括各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂如合成调味剂和天然调味剂、着色剂和改良剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸或其盐、海藻酸或其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇和碳酸饮料中使用的碳酸化剂。此外，根据本发明的一个方面的食品组合物可包含用于生产天然果汁、水果饮料和植物饮料的果肉。这些成分可以单独使用或组合使用。这些添加剂的含量并不重要。然而，通常，以根据本发明的一个方面的组合物为100重量份计，这些添加剂为0重量份至约60重量份。
根据本发明的一个方面的药物组合物可以经口服、肠胃外、直肠、局部、经皮、静脉内、肌内、腹腔内、皮下等给药。用于口服给药的剂型可以是片剂、丸剂、硬或软胶囊、颗粒剂、粉末、细颗粒、液体、乳液或团块，但不限于此。用于肠胃外给药的剂型可以是溶液、悬浮液、乳液、凝胶、注射剂、滴剂、栓剂、贴剂或喷雾剂，但不限于此。这些剂型可根据本领域常用的方法轻易地制备并可以进一步包括表面活性剂、赋形剂、保湿乳、乳化促进剂、悬浮剂、用于控制渗透压的盐或缓冲液、着色剂、香精、稳定剂、防腐剂或其它常用的辅助剂。
根据本发明的一个方面的组合物可包含药学上可接受的盐，并且所述盐可包含(1)由无机酸形成的酸加成盐，无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸；或由有机酸形成的酸加成盐，有机酸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2,2,2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂酸或粘康酸；或(2)母体化合物中存在的酸性质子被取代时形成的盐。
根据本发明的一个方面的药物组合物的剂量将根据对象的年龄、性别、体重、病理状况和严重程度、给药途径以及开药者的判断而变化。基于这些因素确定活性成分的剂量在本领域技术人员的知识范围内。
在另一方面，本发明可以涉及一种用于制备所述组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(1)向绿茶中加入乙醇，并在50℃至70℃下提取30分钟至4小时；(2)通过过滤和减压除去乙醇；并且(3)加水，在70℃至100℃下搅拌混合物3至8小时，然后在减压下浓缩混合物。
在一个方面，乙醇可以是至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％的乙醇。在另一方面，乙醇可以是高达70％、高达60％、高达50％，高达40％或高达30％的乙醇。
在一个方面，步骤(1)的温度可以是50℃或更高、55℃或更高、60℃或更高、65℃或更高、或68℃或更高。在另一方面，步骤(1)的温度可以是70℃或更低、65℃或更低、60℃或更低、55℃或更低、或52℃或更低。
在一个方面，步骤(1)的时间可以是30分钟或更多、40分钟或更多、50分钟或更多、60分钟或更多、70分钟或更多、80分钟或更多、90分钟或更多、100分钟或更多、120分钟或更多、140分钟或更多、160分钟或更多、180分钟或更多、200分钟或更多、或220分钟或更多。在另一方面，步骤(1)的时间可以是240分钟或更少、220分钟或更少、200分钟或更少、180分钟或更少、160分钟或更少、140分钟或更少、120分钟或更少、100分钟或更少、90分钟或更少、80分钟或更少、70分钟或更少、60分钟或更少、50分钟或更少、或40分钟或更少。
在一个方面，步骤(3)的温度可以是70℃或更高、75℃或更高、80℃或更高、90℃或更高、95℃或更高、或98℃或更高。在另一方面，步骤(3)的温度可以是100℃或更低、95℃或更低、90℃或更低、85℃或更低、80℃或更低、或75℃或更低。
在一个方面，步骤(3)的搅拌时间可以是30分钟或更多、1小时或更多、2小时或更多、3小时或更多、4小时或更多、5小时或更多、6小时或更多、或7小时或更多。在另一方面，步骤(3)的搅拌时间可以是8小时或更少、7小时或更少、6小时或更少、5小时或更少、4小时或更少、3小时或更少、2小时或更少、或1小时或更少。
在另一个实施例中，步骤(2)的产物与步骤(3)中加入的水的重量比可以是1：7至1：12。在一个方面，所述重量比可以是1：5或更大、1：6或更大、1：7或更大、1：8或更大、1：9或更大、1：10或更大、1：12或更大、1：14或更大、1：16或更大、或1：18或更大。在另一方面，所述重量比可以是1：20或更小、1：18或更小、1：16或更小、1：14或更小、1：12或更小、1：11或更小、1：10或更小、1：9或更小、1：8或更小、1：7或更小、或1：6或更小。
在另一个实施例中，步骤(3)后产物的产率可以占步骤(1)中的绿茶的重量的5wt％至30wt％。在一个方面，所述产率可以是5wt％或更多、6wt％或更多、8wt％或更多、10wt％或更多、12wt％或更多、14wt％或更多、16wt％或更多、18wt％或更多、20wt％或更多、22wt％或更多、24wt％或更多、26wt％或更多、或28wt％或更多。在另一方面，所述产率可以是30wt％或更少、28wt％或更少、26wt％或更少、24wt％或更少、22wt％或更少、20wt％或更少、18wt％或更少、16wt％或更少、14wt％或更少、12wt％或更少、10wt％或更少、8wt％或更多、或6wt％或更少。
下文通过实施例、测试实施例和剂型实施例更详细地描述本发明的组成和作用。然而，以下提供的实施例仅为了说明的目的以便于理解本发明，并且本发明的范围不限于此。
实施例1：由韩国食品药品安全部公布的绿茶提取物和高温加工的绿茶提取物的制备
将1000ml的50％乙醇加入到100g绿茶(茶树(Camellia sinensis)，济州岛的奥雪农场(O'sulloc Farm in Jeju))中，并将混合物在60℃下回流1小时。将样品的温度降至室温，然后过滤。减压蒸馏滤液，得到23g由韩国食品药品安全部公布的绿茶提取物(GT-LE-35CAT，样品1)，其为深棕色粉末(产率：23％)。
将10g样品1溶解在90ml水中，并将混合物在80℃下搅拌30分钟至8小时。然后，将温度降至室温并过滤不溶性物质。减压浓缩滤液，得到10g高温加工的绿茶提取物。此时，使用如下表1所示的装置测量在每个搅拌时间间隔获得的高温加工的绿茶提取物的GCG等的含量，以鉴定GCG等的含量随时间的变化(每个时间间隔的提取物中成分的含量如表4所示)，并鉴定GCG最丰富的时区。在该时区停止搅拌，得到10g高温加工的绿茶提取物(GT-LE-10GCG，HTP-GTE)。将由此获得的提取物用作样品2。
并且使用如下表5所示的装置测量在每个搅拌时间间隔获得的高温加工的绿茶提取物的GCG等的含量，以鉴定GCG等的含量随时间的变化(每个时间间隔的提取物中成分的含量如表7所示)。当GCG含量达到5％至8％时停止搅拌，得到10g高温加工的绿茶提取物。将由此获得的提取物用作样品3。
所得三种提取物的组合物的分析条件和结果分别如表1至表3、表5和表6所示。两种提取物的色谱图如图1(样品1)和图2(样品2)所示。从结果发现样品2的组合物与常规绿茶提取物不同。
表1：组合物的分析条件
表2
表3
表4
搅拌时间 EGCG GCG ECG CG
1小时 11.79 7.6 1.16 1.16
3小时 9.67 11.08 2.44 1.46
5小时 8.48 12.52 1.9 2.38
7小时 6.71 9.44 1.85 1.56
表5：组合物的分析条件
表6
表7
(在上表2至表4、表6和表7中，EGC表示表没食子儿茶素，EC表示(-)表儿茶素，ECG表示表儿茶素3-O-没食子酸酯。)
(在上表2至表4、表6和表7中，单位是占样品总重量的wt％。)
测试实施例1：神经毒性测试
将从韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank)获得的PC12细胞系(神经细胞瘤)以每孔1×105个细胞接种在96孔板(FALCON)中，并在5％CO2培养箱中于37℃培养24小时。细胞用3μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和30μg/ml的样品1和样品2中的每一种进行处理，并进一步培养24小时。
然后，除去培养基，接着使用细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit-8，Dojindo)测定细胞活力。将10μl的细胞计数试剂盒8(Dojindo)溶液加入到100μl的RPMI1640(Lonza)中，并将混合物应用于细胞。通过测量450nm处的吸光度来对活细胞的数量进行定量。细胞计数或细胞活力(％)通过以下等式计算：
细胞活力(％)＝(样品处理组的吸光度-单独的反应试剂的吸光度)/(未处理组的吸光度-仅反应试剂的吸光度)×100
结果如图3所示，证实了样品2对神经元的毒性低于样品1对神经元的毒性。
测试实施例2：抗神经元氧化应激的测定
将从韩国细胞系库获得的PC12细胞系(神经细胞瘤)以每孔1×105个细胞接种在96孔板(FALCON)中，并在5％CO2培养箱中于37℃培养24小时。细胞用3μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和30μg/ml的样品1和样品2中的每一种进行处理，并进一步培养24小时。此后，除对照组外，用300μM的H2O2处理细胞2小时以便诱导氧化应激。然后，除去培养基，接着使用细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit-8，Dojindo)测定细胞活力。将10μl细胞计数试剂盒8(Dojindo)溶液加入到100μl的RPMI1640(Lonza)中，并将混合物应用于细胞。通过测量450nm处的吸光度来对活细胞的数量进行定量。
细胞活力(％)＝(样品处理组的吸光度-单独的反应试剂的吸光度)/(未处理组的吸光度-仅反应试剂的吸光度)×100
结果如图4所示，使用样品2情况下的细胞活力比使用样品1情况下的细胞活力高两倍或更多。使用样品3情况下的细胞活力与使用样品2情况下的细胞活力类似。换句话说，使用样品2和样品3情况下的细胞活力远高于使用样品1情况下的细胞活力。
测试实施例3：脂质过氧化(MDA)测定
脂质过氧化是通过各种生物膜的过氧化反应产生的，并用作氧化应激的量度。使用脂质过氧化(MDA)测定试剂盒(Sigma Aldrich)以便鉴定每种样品对过氧化脂质(丙二醛，MDA)的量的作用。
具体地，以样品2(100mg/kg)或生理盐水对小鼠口服给药4周，然后在最后6天，以东莨菪碱(Sigma Aldrich)(3mg/kg)或生理盐水给药。在最后一天，取出脑部并在丙二醛(MDA)裂解缓冲液(Sigma Aldrich)中匀浆。然后收集上清液。使200μl的上清液与600μl的TBA溶液(Sigma Aldrich)在95℃反应1小时，然后在冰浴中冷却10分钟。使用多板读取器(multiplate reader，Tecan)在532nm处测量吸光度。通过将结果与参比样品的结果进行比较来对MDA的量进行定量，该参比样品直接用丙二醛(MDA)进行处理。
结果如图5所示。从结果发现，以东莨菪碱(Sco)给药增加的丙二醛(MDA)的浓度低于通过样品2(100mg/kg)的摄入增加的丙二醛(MDA)的浓度。
测试实施例4：DDPH测定
为了鉴定样品的抗氧化作用，测量DPPH(二苯基-2-苦基肼基)自由基清除能力。
具体地，使样品1和样品2与0.2mM DPPH试剂(Sigma)反应30分钟，然后使用分光光度计在520nm下测量反应混合物的吸光度，以检测吸光度因DPPH还原导致的降低。通过比较未处理组的值与处理组的值来确定自由基清除活性。
DPPH清除能力(％)＝1-(用样品处理的组的吸光度/未处理组的吸光度)×100
结果发现，如图6所示，样品2在相同浓度(例如，20μg/ml)下显示出的作用比样品1高得多。
剂型实施例1：软胶囊
制备150mg根据实施例1的样品2，并与440mg乳糖、430mg玉米淀粉和2mg硬脂酸镁混合以制备软胶囊填充溶液。单独地，用66重量份的明胶、24重量份的甘油和10重量份的山梨糖醇溶液制备软胶囊片，然后用所述填充溶液填充以制备软胶囊。
剂型实施例2：片剂
制备150mg根据实施例1的样品2，并与15mg维生素E、15mg维生素C、250mg低聚半乳糖、60mg乳糖和140mg麦芽糖混合。使用流化床干燥器将混合物造粒，然后加入8mg糖酯。根据常规方法将所得组合物压片以制备片剂。
剂型实施例3：饮料
制备80mg根据实施例1的样品2，并与9mg维生素E、9mg维生素C、10g葡萄糖、0.6g柠檬酸和25g液体低聚糖混合，然后加入400ml纯净水。将混合物填充入瓶中，然后在30℃下灭菌4至5秒以制备饮料。
剂型实施例4：颗粒剂
制备150mg根据实施例1的样品2，并与9mg维生素E、9mg维生素C、250mg无水结晶葡萄糖和550mg淀粉混合。使用流化床造粒机将混合物造粒成颗粒，然后将其装入小袋中以制备颗粒剂。
剂型实施例5：健康食品
制备150mg根据实施例1的样品2并与维生素(70μg维生素A乙酸酯、1.0mg维生素E、0.13mg维生素B1、0.15mg维生素B2、0.5mg维生素B6、0.2μg维生素B12、10mg维生素C、10μg生物素、1.7mg烟酰胺、50μg叶酸)的混合物和无机物(1.75mg硫酸亚铁、0.82mg氧化锌、25.3mg碳酸镁、15mg磷酸二氢钾、55mg磷酸氢钙、90mg柠檬酸钾、100mg碳酸钙、24.8mg氯化镁)的混合物混合，以制备保健食品。
剂型实施例6：健康饮料
制备50mg根据实施例1的样品2并与1000mg柠檬酸、100g低聚糖、2g李子浓缩物、1g牛磺酸和纯净水余量混合以制备900mL健康饮料。
根据本发明的一个方面的提取物和组合物衍生自天然产物并且是安全的，因此可以促进保护细胞等免受氧化应激。因此，可以在不担心副作用的情况下改善老年人群的生活质量，并且可以促进相关产业的发展。
虽然已经详细描述了本发明的特定部分，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些具体描述仅仅是优选实施方式，并且本发明的范围不限于此。因此，本发明的实际范围将由随附的权利要求书及其等价物定义。

Claims (15)

1.绿茶提取物在制备用于保护细胞免受氧化应激的组合物中用途，所述绿茶提取物含有占组合物总重量5wt％至25wt％的(-)-没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)和7wt％至15wt％的(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述提取物中的GCG和EGCG的总含量占所述组合物总重量的40wt％或更少。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述提取物是通过用选自水和C1至C4醇中的至少一种进行至少一次提取而获得的提取物。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物中的所述提取物的含量以干重计为1wt％至100wt％。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，活性成分的剂量以干重计为5mg/kg/天至1000mg/kg/天。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述氧化应激由活性氧物质引起。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述氧化应激由脑组织中的脂质过氧化引起。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述氧化应激由过氧化产物丙二醛引起。
9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述细胞是脑细胞或神经元。
10.根据权利要求1所述的绿茶提取物在制备用于预防或改善神经退行性疾病的组合物中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病为选自中风、肌萎缩侧索硬化症(卢伽雷氏病)、帕金森病、亨廷顿氏病、脊髓小脑变性症和多发性硬化症中的一种或多种。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物为食品组合物或药物组合物。
13.一种用于制备根据权利要求1至12中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)向绿茶中加入乙醇，并且在50℃至70℃下提取30分钟至4小时；
(2)通过过滤和减压除去乙醇；以及
(3)加水，在70℃至100℃下搅拌混合物3至8小时，然后在减压下浓缩所述混合物。
14.根据权利要求13的方法，其特征在于，步骤(2)的产物与步骤(3)中加入的水的重量比为1：5至1：20。
15.根据权利要求13的方法，其特征在于，步骤(3)后产物的产率占步骤(1)中的绿茶的重量的5wt％至30wt％。
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