CN109504717A - 一种饲用γ-氨基丁酸的生产方法 - Google Patents

一种饲用γ-氨基丁酸的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种饲用γ‑氨基丁酸的生产方法，包括步骤：(1)采用基因工程大肠杆菌经种子培养基培养的种子液，按照1％～4％接种量接种于发酵培养基；(2)加入4‑8g/L诱导剂进行诱导谷氨酸脱羧酶的表达，当OD600达到10‑18，开始梯度调整发酵液的培养条件，同时不断检测菌体酶活力，当酶活力达到55U以上时，发酵结束；(3)将完成的发酵液通过加热系统，将温度升到30‑38℃，搅拌转速100‑200rpm，加入转化原料；(4)将转化后的发酵液直接进行喷雾干燥，即得。本发明饲用γ‑氨基丁酸的生产方法，通过优化谷氨酸生产菌的生产条件，快速检测和控制谷氨酸脱羧酶活力，提高控制谷氨酸脱羧酶活力的方法，达到提高生产效率和稳定生产的能力。

Description

一种饲用γ-氨基丁酸的生产方法
技术领域
本发明涉及饲料加工技术领域，尤其涉及一种饲用γ-氨基丁酸的生产方法。
背景技术
γ-氨基丁酸作为一种非蛋白质氨基酸，是很好的医疗药物及保健品的原料，具有降血压、保持神经安定、改善脑机能、保肝利肾等作用,可作为治疗脑损伤药物的成分，对畜禽具有抗热应激、促生长等作用，目前已发戓成为一种新型功能性因子，被广泛用于医药、食品保健、化工及农业等行业。近年来，国内外市场对γ-氨基丁酸的需求逐年增长。γ-氨基丁酸的生产方法主要有化学合成法、固态发酵法和生物酶转化法。
化学合成法主要采用吡咯烷酮、氢氧化钠和水按一定比例混合后，在高温下进行反应，反应条件剧烈，然后通过树脂分离纯化，浓缩结晶而成。吡咯烷酮与氢氧化钠都为腐蚀性物质，影响人体健康。特别是吡咯烷酮在高温下，有引起燃烧的危险，且可分解释放有毒的氧化氮烟气，操作过程存在危险性，不利于工业化大规模生产。
固态发酵法效率低下，产量仅为0.35mg/g，最终纯度只35％。
生物酶催化合成法主要以重组基因工程菌代谢中产生的谷氨酸脱羧酶GAD，转化底物谷氨酸生产γ-氨基丁酸，与化学法相比，生物酶催化合成法具有条件温和、安全和成本较低的优点生物酶催化法生产过程污染小，成本低廉，利用大肠杆菌产生的谷氨酸脱羧酶GAD用，将L一谷氨酸转化为GABA，然后分离纯化得到产品，而酶工程生产的γ-氨基丁酸因为安全，无有害残留物质，主要作为饲料和食品添加剂使用。
生物酶催化合成法是采用生产用甘油管种子或斜面种子接入种子培养基中进行培养,加入培养结束后接入发酵培养基进行培养。待发酵结束将发酵液通过分离得到菌泥，进行谷氨酸转化。再进行GABA精制成食品级产品或不进行精制直接干燥成饲料产品，当前饲用多采用将转化液体直接喷雾的方法。
但在γ-氨基丁酸(GABA)生产过程中，GABA产量高低主要与菌体产谷氨酸脱羧酶活力有关，而现有GABA生产过程中，GABA生产菌发酵培养过程中所产谷氨酸脱羧酶的活力难控制，对后面生产时水平难以控制和高产。
且现有GABA化学法生产工艺中，化学合成法主要采用吡咯烷酮、氢氧化钠和水按一定比例混合后，在高温下进行反应，反应条件剧烈，然后通过树脂分离纯化，浓缩结晶而成。本工艺通过将含有高活力谷氨酸脱羧酶将谷氨酸(或谷氨酸钠、麸酸)转化成GABA，直接通过喷雾干燥成高GABA含量(80％-95％)的饲料级产品。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题，提出一种饲用γ-氨基丁酸的生产方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种饲用γ-氨基丁酸的生产方法，包括如下步骤：
(1)采用基因工程大肠杆菌经种子培养基培养的种子液，按照1％～4％接种量接种于发酵培养基，即种子液量占发酵培养基的重量百分比为1％～4％，空气量1：0.4～1.2vvm，温度32-37℃，搅拌200-300rpm培养至OD6001.5～2.5降温至25-28℃；
(2)加入4-8g/L诱导剂进行诱导谷氨酸脱羧酶的表达，当OD600达到10-18，开始梯度调整发酵液的培养条件，最低降至温度20℃、转速30rpm、风量1：0.1vvm，同时不断检测菌体酶活力，当酶活力达到55U以上时，发酵结束；
(3)将完成的发酵液通过加热系统，将温度升到30-38℃，搅拌转速100-200rpm，加入转化原料，通过控制添加转化原料的速度，控制发酵液的pH为4.0-6.5，待反应至转化原料浓度0.6％(w/v)以下时，停止转化反应；
(4)将转化后的发酵液直接进行喷雾干燥，即得高含量的饲用γ-氨基丁酸。
进一步地，步骤(1)中，所述种子培养基为：酵母粉3-6g/L，蛋白胨5-12g/L，氯化钠5-12g/L；种子培养条件为：温度32-38℃，空气量0.5～1.0VVM，搅拌200-500rpm，培养至OD6001.1～3.0。
进一步地，所述发酵培养基为：(NH4)2SO4氮源10g/L，葡萄糖碳源5g/L,K2HPO410-18g/L，KH2PO41-3.5g/L，MgSO418-28g/L，谷氨酸0.04-0.12g/L；培养条件温度32-38℃，空气量0.5～1.2vvm，搅拌200-500rpm，培养至OD6003.0～5.0。
进一步地，所述(NH4)2SO4氮源选自氯化铵、硝酸铵、酵母粉、蛋白胨、玉米浆豆粕水解液中的一种或几种，其氮含量为：0.05％-0.4％；所述葡萄糖碳源选自蔗糖、淀粉水解糖、甘油、柠檬酸中的一种或几种，其碳含量：0.1％-0.3％。
进一步地，步骤(2)中，所述诱导剂为乳糖或异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。
进一步地，步骤(2)中，所述梯度调整发酵液的培养条件为：降低培养温度至28℃，转速降低20％，同时风量减少50％，此后每1小时降低温度0.5℃，搅拌转速降低上次转速的10％，空气流量降低至上次的50％。
进一步地，步骤(2)中，所述菌体酶活力的测定方法为：取200ml发酵液，放300ml烧杯中，放入磁转子，放在磁力搅拌器上在磁转子400-600rpm,烧杯溶液控制37℃条件下，加入20g-40g谷氨酸，开始计时；肉眼观察溶液中谷氨酸转化情况，当停止搅拌时看不到烧杯底部有谷氨酸白色沉淀时反应结束，记录反应时间T；
酶活力(U)＝(加入谷氨酸/147.13×1000000/200)/T(U/(mL·min))，即每1mL菌液、1min转化谷氨酸1μmol为1U。酶活力国际单位，规定为：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，称为一个酶活力国际单位(IU，又称U)。
而现有GABA测定为：(1)样品处理：将转化液经8000rpm离心10min收集上清液，进行适当稀释，同时将GABA标品配制成标准溶液；将稀释后的上清液与标准溶液分别经过0.22微孔过滤膜过滤，采用高效液相色谱法测定GABA。
进一步地，步骤(3)中，所述转化原料的添加重量为发酵液重量的50-120％(w/v)。
进一步地，步骤(3)中，所述转化原料为谷氨酸、谷氨酸钠、麸酸中的一种或几种。
进一步地，步骤(4)中，所述喷雾干燥工艺为：采用压力式喷雾设备或离心式喷雾设备，进风160℃-240℃，出风温度70℃-105℃。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明方法通过优化谷氨酸生产菌的生产条件，快速检测和控制谷氨酸脱羧酶活力，提高控制谷氨酸脱羧酶活力的方法，达到提高生产效率和稳定生产的能力；通过将含有高活力谷氨酸脱羧酶将谷氨酸转化成GABA，不经过提纯直接通过喷雾干燥成高GABA含量(85％-95％)的饲料级产品。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围，且实施材料均从市场获得。
实施例1
(1)将大肠杆菌斜甘油管种子接入种子培养基，种子培养基：酵母粉4g/L,蛋白胨8g/L，氯化钠10g/L，pH7.0；种子培养条件：温度36℃，空气量0.6vvm，搅拌350rpm，培养至OD1.5；按照种子4％接种量接种于发酵培养基，发酵培养基：(NH4)2SO49g/L，葡萄糖6g/L,K2HPO417g/L,KH2PO43.0g/L,MgSO418g/L，谷氨酸0.04g/L；空气量1：0.5vvm，温度37℃，搅拌300rpm培养至OD3.0降温至29℃；
(2)加入8g/L乳糖进行诱导谷氨酸脱羧酶的表达，当OD600达到15，开始降低培养温度至25℃，转速降低20％至240，同时风量减少50％，此后每1小时降低温度0.5℃，搅拌转速降低上次转速10％，空气流量降低至上次的50％，同时不断采用酶活力快速测定法，检测菌体酶活力，酶活力达到102U发酵诱导结束；
(3)转化工序：将诱导好的发酵液通过加热系统，将温度升到并维持38℃，搅拌转速100rpm,开始加入谷氨酸，谷氨酸含量99％，通过添加谷氨酸的速度控制pH4.5-6.5，直至加完谷氨酸，谷氨酸添加重量为发酵液的重量125％；待转化至发酵液中谷氨酸0.3％时，GABA含量49.6％(w/v)，停止转化反应；
(4)喷雾干燥：采用压力式喷雾设备，进风195℃，出风温度95℃，得到饲用GABA产品，其含量94.2％(w/w)GABA，水分0.5％。
实施例2
(1)将大肠杆菌斜甘油管种子接入种子培养基，种子培养基：酵母粉7g/L,蛋白胨5g/L，氯化钠0.8g/L，pH7.0。种子培养条件：温度35℃，空气量0.8VVM，搅拌250rpm，培养至OD1.5；按照种子2％接种量接种于发酵培养基，发酵培养基：蛋白胨12g/L，蔗糖4g/L,K2HPO414g/L,KH2PO42g/L,MgSO428g/L，谷氨酸0.11g/L；空气量0.7vvm，温度35℃，搅拌400rpm培养至OD2.5降温至28℃；
(2)加入4.5g/L乳糖进行诱导谷氨酸脱羧酶的表达，当OD600达到18，开始降低培养温度至25℃，转速降低20％至240，同时风量减少50％，此后每1小时降低温度0.5℃，搅拌转速降低上次转速10％，空气流量降低至上次的50％，同时不断采用酶活力快速测定法，检测菌体酶活力，酶活力达到81U发酵诱导结束。
(3)转化工序：将诱导好的发酵液通过加热系统，将温度升到并维持35℃，搅拌转速100rpm,开始加入谷氨酸，谷氨酸含量98％，通过添加谷氨酸的速度控制pH4.5-6.5，直至加完谷氨酸，谷氨酸添加重量为发酵液的重量110％。待转化至发酵液中谷氨酸0.6％，GABA含量47.1％(w/v)，停止转化反应。
(4)喷雾干燥：采用压力式喷雾设备，进风160℃，出风温度75℃，得到饲用GABA产品，其GABA含量86.7％(w/w)，水分1.2％(w/w)。
实施例3
(1)将大肠杆菌斜甘油管种子接入种子培养基，种子培养基：酵母粉3g/L,蛋白胨11g/L，氯化钠0.9g/L，pH7.0；种子培养条件：温度34℃，空气量1.0VVM，搅拌400rpm，培养至OD1.1；按照种子1.5％接种量接种于发酵培养基，发酵培养基：(NH4)2SO411g/L，蔗糖4g/L,K2HPO413g/L,KH2PO41.7g/L,MgSO425g/L，谷氨酸0.08g/L；空气量1：1.0vvm，温度35℃，搅拌350rpm培养至OD1.5～2.5降温至25℃；
(2)加入6g/L乳糖进行诱导谷氨酸脱羧酶的表达，当OD600达到12，开始降低培养温度至25℃，转速降低20％至240，同时风量减少50％，此后每1小时降低温度0.5℃，搅拌转速降低上次转速10％，空气流量降低至上次的50％，同时不断采用酶活力快速测定法，检测菌体酶活力，酶活力达到62U发酵诱导结束；
(3)转化工序：将诱导好的发酵液通过加热系统，将温度升到并维持34℃，搅拌转速150rpm,开始加入谷氨酸，谷氨酸含量99％，通过添加谷氨酸的速度控制pH4.5-6.5，直至加完谷氨酸，谷氨酸添加重量为发酵液的重量100％。待转化至发酵液中谷氨酸0.5％时，停止转化反应。
(4)喷雾干燥：采用压力式喷雾设备，进风180℃，出风温度85℃，得到饲用GABA产品，其含量90.8％GABA，水分0.6％。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种饲用γ-氨基丁酸的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用基因工程大肠杆菌经种子培养基培养的种子液，按照1％～4％接种量接种于发酵培养基，空气量1：0.4～1.2vvm，温度32-37℃，搅拌200-300rpm培养至OD6001.5～2.5降温至25-28℃；
(2)加入4-8g/L诱导剂进行诱导谷氨酸脱羧酶的表达，当OD600达到10-18，开始梯度调整发酵液的培养条件，最低降至温度20℃、转速30rpm、风量1：0.1vvm，同时不断检测菌体酶活力，当酶活力达到55U以上时，发酵结束；
(3)将完成的发酵液通过加热系统，将温度升到30-38℃，搅拌转速100-200rpm，加入转化原料，通过控制添加转化原料的速度，控制发酵液的pH为4.0-6.5，待反应至转化原料浓度0.6％(w/v)以下时，停止转化反应；
(4)将转化后的发酵液直接进行喷雾干燥，即得高含量的饲用γ-氨基丁酸。
2.根据权利要求1所述的饲用γ-氨基丁酸的生产方法，其特征在于，步骤(1)中，所述种子培养基为：酵母粉3-6g/L，蛋白胨5-12g/L，氯化钠5-12g/L；种子培养条件为：温度32-38℃，空气量0.5～1.0VVM，搅拌200-500rpm，培养至OD6001.1～3.0。
3.根据权利要求1所述的饲用γ-氨基丁酸的生产方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵培养基为：(NH4)2SO4氮源10g/L，葡萄糖碳源5g/L,K2HPO410-18g/L，KH2PO41-3.5g/L，MgSO418-28g/L，谷氨酸0.04-0.12g/L；培养条件温度32-38℃，空气量0.5～1.2vvm，搅拌200-500rpm，培养至OD6003.0～5.0。
4.根据权利要求3所述的饲用γ-氨基丁酸的生产方法，其特征在于，所述(NH4)2SO4氮源选自氯化铵、硝酸铵、酵母粉、蛋白胨、玉米浆豆粕水解液中的一种或几种，其氮含量为：0.05％-0.4％；所述葡萄糖碳源选自蔗糖、淀粉水解糖、甘油、柠檬酸中的一种或几种，其碳含量：0.1％-0.3％。
5.根据权利要求1所述的饲用γ-氨基丁酸的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，所述诱导剂为乳糖或异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。
6.根据权利要求1所述的饲用γ-氨基丁酸的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，所述梯度调整发酵液的培养条件为：降低培养温度至28℃，转速降低20％，同时风量减少50％，此后每1小时降低温度0.5℃，搅拌转速降低上次转速的10％，空气流量降低至上次的50％。
7.根据权利要求1所述的饲用γ-氨基丁酸的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，所述菌体酶活力的测定方法为：取200ml发酵液，放300ml烧杯中，放入磁转子，放在磁力搅拌器上在磁转子400-600rpm,烧杯溶液控制37℃条件下，加入20g-40g谷氨酸，开始计时；肉眼观察溶液中谷氨酸转化情况，当停止搅拌时看不到烧杯底部有谷氨酸白色沉淀时反应结束，记录反应时间T；
酶活力(U)＝(加入谷氨酸/147.13/×1000000/200)/T(U/(mL·min))，即每1mL菌液、1min转化底物谷氨酸1μmol为1U。
8.根据权利要求1所述的饲用γ-氨基丁酸的生产方法，其特征在于，步骤(3)中，所述转化原料的添加重量为发酵液重量的50-120％(w/v)。
9.根据权利要求8所述的饲用γ-氨基丁酸的生产方法，其特征在于，步骤(3)中，所述转化原料为谷氨酸、谷氨酸钠、麸酸中的一种或几种。
10.根据权利要求1所述的饲用γ-氨基丁酸的生产方法，其特征在于，步骤(4)中，所述喷雾干燥工艺为：采用压力式喷雾设备或离心式喷雾设备，进风160℃-240℃，出风温度70℃-105℃。
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