CN109402038A - 一种高产l-脯氨酸的重组菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种高产l-脯氨酸的重组菌及其构建方法与应用 Download PDF

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徐建中
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张峰
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Abstract

本发明公开了一种高产L‑脯氨酸的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明通过在棒杆菌属的L‑脯氨酸生产菌中L‑脯氨酸合成途径关键酶TA编码基因ilvE启动子后插入终止子以及过表达脯氨酸生物合成的关键基因proB，在棒杆菌属的L‑脯氨酸生产菌中构建了高效的L‑脯氨酸合成途径，获得了高产L‑脯氨酸且降低副产物含量的重组菌株。

Description

一种高产L-脯氨酸的重组菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种高产L-脯氨酸的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
L-Pro，即L-脯氨酸，化学名为α-吡咯烷羧酸，分子式为HN(CH2)3CHCOOH，是构成生物体蛋白质的20种基本氨基酸之一，属于杂环族氨基酸，是没有自由的α-氨基的氨基酸，在弱酸性溶液中与茚三酮反应并不释放NH3，生产紫色物质，而是直接生产亮黄色化合物，最大光吸收在440nm，利用脯氨酸的这一特性，可以检测L-脯氨酸的含量。L-脯氨酸具有多种生理功能，广泛应用于制药行业，化妆品行业。同时，也广泛用于临床作为复合氨基酸静脉注射液。因此，选育具有自主知识产权的高L-脯氨酸合成、低副产物积累的生产菌株，实现企业可持续发展具有重要意义。
L-脯氨酸的生产方法主要有提取法，化学合成法，添加前体物质发酵法，直接发酵法等。微生物发酵法反应条件温和，环境友好，产品质量稳定，是L-脯氨酸酸的主要生产方法。L-脯氨酸产生菌多为随机突变获得，通常用嗜醋酸棒杆菌，谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌作为宿主菌，诱变处理，选出营养缺陷型或者氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节过程中反馈阻遏和抑制，达到过量积累L-脯氨酸的目的。然而，化学诱变筛选氨基酸产生菌有很多问题，如产生不必要的突变，生成副产物，菌体生长缓慢等。
谷氨酸激酶(gamma-glutamyl kinase，ProB)脯氨酸合成过程的限速酶，它催化L-谷氨酸向γ-谷氨酰磷酸的转化，该过程还消耗1分子的ATP的耗能反应。Sugiura通过克隆proB基因的放大，并克隆放大L-脯氨酸dpr-1基因的质粒促进L-脯氨酸的分泌，使得粘质沙雷氏菌L-脯氨酸的产量大提高。因此在本实验室保藏的棒杆菌中同源表达ProB，以期提高L-脯氨酸合成途径中L-谷氨酸向γ-谷氨酰磷酸的转化的通量，从而提高脯氨酸的产量。代谢工程提供了一个有效的可替代传统诱变的育种方法。但是现有的通过代谢途径改造的L-脯氨酸生产菌依然存在产量低，副产物含量较高的问题。
转录是RNA聚合酶结合到启动子、合成mRNA以及RNA聚合酶从终止子序列处解离下来的过程。考虑到终止子具有促进RNA聚合酶从DNA上解离下来的作用，而且不同的终止子具有不同的解离效率，因此可以通过终止子来调节转录通量，从而达到控制基因表达量的作用。但是利用终止子来调控基因表达量，终止子序列对菌体生长的影响较大，如何改造得到一株L-脯氨酸产量提高，且副产物含量低的重组菌成为需要研究的课题。
发明内容
为解决上述问题，本发明首次将几个不同强度的终止子插入到分支链氨基酸谷氨酸转氨酶IlvE编码基因启动子相应位置后，得到相应的高产脯氨酸且副产物得到不同程度弱化的棒杆菌，有效降低副产物含量，并且提高了重组菌株中L-脯氨酸的产量。
本发明的第一个目的是提供一种高产L-脯氨酸的重组菌，所述重组菌是在支链氨基酸转氨酶编码基因的启动子与RBS序列之间，插入核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的终止子序列。
进一步地，所述的支链氨基酸转氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，插入终止子序列是以pK18mobsacB作为表达载体。
进一步地，所述的重组菌还过表达了谷氨酸激酶。
进一步地，所述的谷氨酸激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，过表达谷氨酸激酶是以pXMJ19作为表达载体。
进一步地，所述重组菌是以谷氨酸棒杆菌、短杆菌、黄色短杆菌、寇氏杆菌或嗜醋酸棒杆菌为宿主菌。
进一步地，优选谷氨酸棒杆菌为宿主菌。更进一步地，优选谷氨酸棒杆菌C.glutamicum P12作为宿主菌，所述的C.glutamicum P12是由谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株经过诱变筛选得到，用来生产L-脯氨酸。
本发明的第二个目的是提供所述重组菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的终止子序列，分别与支链氨基酸转氨酶基因的上游片段、下游片段和线性化载体pK18mobsacB进行无缝克隆，获得重组质粒pk18-TilvE；
(2)将重组质粒pk18-TilvE转入宿主菌中，得到含有pk18-TilvE的重组菌；
(3)将编码谷氨酸激酶的基因与pXMJ19载体相连接，构建重组质粒pXMJ19-proB；
(4)将重组质粒pXMJ19-proB转入步骤(2)的重组菌中，得到有pk18-TilvE和pXMJ19-proB的重组菌。
本发明的第三个目的是提供所述重组菌发酵生产L-脯氨酸的方法，所述方法是将所述重组菌单菌落接种至液体种子培养基，28-32℃，80-120r·min-1培养12-14h；以5-10％接种量将种子培养液转接至发酵培养基，28-32℃，80-120r·min-1培养60-80h。
进一步地，所述种子培养基(g·L-1)：葡萄糖30-35，玉米浆30-40，(NH4)2SO4 5-15，K2HPO4 2-4，MgSO4·7H2O 0.5-1.5，MnSO4·4H2O 0.05-0.15，酵母膏5-15，硫胺素0.0004-0.0008，生物素0.0002-0.0006，CaCO3 15-25。
进一步地，所述发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖80-120，玉米浆20-30，(NH4)2SO4 10-20，K2HPO4 2-4，MgSO4·7H2O 0.5-1.5，MnSO4·4H2O 0.05-0.15，ZnSO4·7H2O 0.05-0.15，L-谷氨酸钠30-40，生物素0.0003-0.0008，硫胺素0.0005-0.0010，CaCO3 30-50。
本发明的第四个目的是提供所述重组菌在饲料工业、医药工业或食品工业中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明通过在棒杆菌属的L-脯氨酸生产菌中L-脯氨酸合成途径关键酶TA编码基因ilvE启动子后插入终止子以及过表达脯氨酸生物合成的关键基因proB，在棒杆菌属的L-脯氨酸生产菌中构建了高效的L-脯氨酸合成途径，获得了高产L-脯氨酸且降低副产物含量的重组菌株。
附图说明
图1：由葡萄糖生成L-脯氨酸代谢途径；
缩写说明：proB，谷氨酸激酶；ilvE，支链氨基酸转氨酶；
图2：出发菌株和重组菌株生长曲线；
图3：出发菌株和重组菌株发酵产脯氨酸和缬氨酸产量；
图4：ProB在C.gluatmicum P12-T3ilvE中的表达；
泳道说明：M泳道为蛋白质分子量标准Marker；1号泳道为C.gluatmicum P12-T3ilvE；2号泳道为C.glutamicum P12-T3ilvE/pXMJ19-proB；
图5：ProB在C.gluatmicum P12-T3ilvE和C.glutamicum P12-T3ilvE/pXMJ19-proB中酶活力测定；
图6：重组菌株C.glutamicum P12-T3ilvE/pXMJ19-proB产脯氨酸发酵过程曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
在本发明中，出发菌C.gluatmicum P12是谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株经过诱变筛选得到的C.glutamicum P12，由本实验室保藏用来生产L-脯氨酸。
底物与产物的定性与定量分析以及菌体生长情况的监测：发酵液中葡萄糖实时检测通过SBA-40B生物传感分析仪测定。脯氨酸产物实时监测采用氨基酸测定仪测定。菌液浓度测定：吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用分光光度计于1cm光程测定OD562nm。
副产物的定性与定量分析：发酵液中副产物主要考查有机酸和氨基酸。对于有机酸的测定，采用高效液相色谱仪(HLPC)测定；对于氨基酸的测定，采用氨基酸测定仪测定。采用高效液相色谱仪或氨基酸测定仪分别测定标准样品和转化液各自的出峰时间和峰面积，即可以对转化液中待测物质进行定性与定量检测。
表1为PCR扩增所需引物，表2为弱化ilvE的终止子序列：
表1 PCR扩增所需引物序列(下划线为酶切位点)
表2弱化ilvE的终止子序列
实施例1：重组表达质粒pXMJ19-proB的构建
以C.gluatmicum P12基因组为模板，分别以proB-F和proB-R为引物PCR，在其引物上下游分别加入限制性内切酶Hind III和Xba I酶切位点序列，同时在其上游引物加入谷氨酸棒杆菌SD识别序列GAAAGGAGATATACC，PCR获得proB基因片段。将proB片段与经相同限制性内切酶酶切后的C.gluatmicum-E.coli穿梭表达质粒pXMJ19相连构建重组表达质粒pXMJ19-proB。
实施例2：支链氨基酸转氨酶RBS序列前插入不同强度终止子的重组菌株构建
以C.gluatmicum P12基因组为模板，分别以不同强度终止子引物对为引物PCR扩增出ilvE上游片段和下游片段，将以上述PCR产物分别与线性化pK18mobsacB载体相连构建重组质粒pK18mobsacB-TNilvE(N为1-5)；
将上述验证正确的质粒pK18-TNilvE电转化C.gluatmicum P12，30℃培养条件下经LBG+Km固体培养基培养，筛选获得第一次同源重组转化子。随后，将第一次同源重组转化子转接到含10％蔗糖固体培养基中并于30℃培养，胁迫二次重组筛选，最终在LBG平板上进行划线分离并挑取多个转化子。提取转化子基因组，以目标基因ilvE引物ilvE-F和ilvE-R进行PCR产物测序鉴定。最终获得目的重组菌株C.gluatmicum P12-TNilvE。
实施例3：重组菌C.gluatmicum P12-TNilvE和出发菌株C.gluatmicum P12发酵产L-脯氨酸
种子培养基(g·L-1)：葡萄糖30-35，玉米浆30-40，(NH4)2SO4 5-15，K2HPO4 2-4，MgSO4·7H2O 0.5-1.5，MnSO4·4H2O 0.05-0.15，酵母膏5-15，硫胺素0.0004-0.0008，生物素0.0002-0.0006，CaCO3 15-25。发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖80-120，玉米浆20-30，(NH4)2SO4 10-20，K2HPO4 2-4，MgSO4·7H2O 0.5-1.5，MnSO4·4H2O 0.05-0.15，ZnSO4·7H2O0.05-0.15，L-谷氨酸钠30-40，生物素0.0003-0.0008，硫胺素0.0005-0.0010，CaCO3 30-50。
将上述经验证的重组菌C.gluatmicum P12-TNilvE和出发菌株C.gluatmicum P12分别进行摇瓶发酵实验。从新鲜活化的斜面培养基中挑取一满环谷氨酸棒杆菌(出发菌和重组菌)接种到50mL装液量500mL摇瓶种子培养基中，4层纱布封口，30℃100r.min-1往复式摇床培养16h，将种子液按接种量10％接入50/500mL摇瓶发酵培养基，30℃100r·.min-1往复式摇床培养48h；分时间段测定各菌株生长情况，结果如图2和图3所示。从图2和图3中可以看出，终止子强度分别为40，90和180时，重组菌株C.gluatmicum P12-T1ilvE，C.gluatmicum P12-T2ilvE和C.gluatmicum P12-T3ilvE生长较出发菌株相比，生长略微缓慢，但脯氨酸产量略有提高，缬氨酸副产物则明显减少；当终止子强度为280和380时，重组菌株C.gluatmicum P12-T4ilvE和C.gluatmicum P12-T5ilvE生长受限，且脯氨酸产量急速降低，缬氨酸产量几乎没有积累。
实施例4：ProB在C.gluatmicum P12-T3ilvE中的表达
重组表达质粒pXMJ19-proB电转化C.gluatmicum P12-T3ilvE，30℃培养条件下经LBG+Km固体培养基培养筛选出重组表达菌株C.gluatmicum P12-T3ilvE/pXMJ19-proB。将出发菌株与重组菌株接种至液体LBG培养基，IPTG诱导后收集菌体经超声波破碎后，上清液SDS-PAGE电泳，检测到一条分子量约40kDa的特异性条带(图4)，与报道的目标蛋白大小一致，说明ProB可以在C.gluatmicum P12-T3ilvE中正确表达。
实施例5：重组菌C.gluatmicum P12-T3ilvE/pXMJ19-proB和菌株C.gluatmicumP12-T3ilvE中的ProB酶活力测定
ProB的测定：37℃反应90分钟，反应体系为2.5mL：谷氨酸50mmol L-1，ATP 10mmolL-1，MgCl2 20mmol L-1，羟胺HCl 100mmol L-1，Tris碱50mmol L-1调节pH至7.0，加入粗酶液100μL开始反应，结束反应时加入1mL终止反应液：55g L-1FeCl3，20g L-1三氯乙酸和21mL L-1HCl。反应结束，离心取上清，测γ-谷氨酰氧肟酸光吸光值A555。γ-谷氨酰氧肟酸的摩尔消光系数为250Lmol-1cm-1。酶活单位(U)定义为在上述反应条件下每分钟催化生成1nmolγ-谷氨酰氧肟酸所需的酶量，结果如图5所示，菌株C.gluatmicum P12-T3ilvE中的ProB酶活力为9.3±0.17U mg-1，相比较对照菌株C.gluatmicum P12中的ProB酶活力为3.8±0.21Umg-1，说明ProB在C.gluatmicum P12-T3ilvE表达且有酶活。
实施例6：重组菌C.gluatmicum P12-T3ilvE/pXMJ19-proB发酵产L-脯氨酸
将上述经验证的重组菌C.gluatmicum P12-T3ilvE/pXMJ19-proB进行摇瓶发酵实验。从新鲜活化的斜面培养基中挑取一满环谷氨酸棒杆菌接种到50mL装液量500mL摇瓶种子培养基中，4层纱布封口，30℃100r·.min-1往复式摇床培养16h，将种子液按接种量10％接入50/500mL摇瓶发酵培养基，30℃100r·.min-1往复式摇床培养48h；分时间段测定菌株生长情况，结果如图6所示。从图6可以看出，重组菌株C.gluatmicum P12-T3ilvE/pXMJ19-proB脯氨酸产量达到42.1±0.67g·L-1，糖酸转化率为0.35g·g-1，高于出发菌株的35.2±0.32g·L-1和0.32g·g-1。副产物缬氨酸最终产量为1.73±0.97g·L-1，明显低于出发菌株C.gluatmicum P12缬氨酸产量8.71±1.01g·L-1。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种高产L-脯氨酸的重组菌及其构建方法与应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1104
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 1
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tctggcgcca tgaccgaggc atttgcttgc ggtactgcag ctgttatcac ccctgttggc 960
accgtgaaat cagctcacgg caccttcgaa gtgaacaaca atgaagtcgg agaaatcacg 1020
atgaagcttc gtgaaaccct caccggaatt cagcaaggaa acgttgaaga ccaaaacgga 1080
tggctttacc cactggttgg ctaa 1104
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 3
aagacccccg caccgaaagg tccgggggtt tttttt 36
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 4
ccaattattg aacacccaaa tcgggtgttt ttttgtttct ggtctccc 48
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 5
gacgaacaat aaggcctccc taacgggggg ccttttttat tgataacaaa a 51
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 6
aaaaaaaaaa aacaccctaa cgggtgtttt tttttttttg gtctccc 47
<210> 7
<211> 57
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 7
ggaaacacag aaaaaagccc gcacctgaca gtgcgggctt tttttttcga ccaaagg 57
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 8
cccaagctta aaggaggacc ggaatgcgtg ag 32
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 9
gattctagat tacgcgcggc tggcgtagt 29
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 10
gacatgatta cgaattcgtg gtggtcttgt ccttggat 38
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 11
ccgaaaggtc cgggggtttt ttttgtgtat ctgtcaggta gcaggt 46
<210> 12
<211> 51
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 12
cccccggacc tttcggtgcg ggggtcttta gtcagcccca ttttatggga t 51
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 13
gcttcgtctc ataagagctt gtca 24
<210> 14
<211> 56
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 14
cccaaatcgg gtgttttttt gtttctggtc tcccgtgtat ctgtcaggta gcaggt 56
<210> 15
<211> 58
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 15
caaaaaaaca cccgatttgg gtgttcaata attggtagtc agccccattt tatgggat 58
<210> 16
<211> 58
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 16
ctccctaacg gggggccttt tttattgata acaaaagtgt atctgtcagg tagcaggt 58
<210> 17
<211> 56
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 17
aggccccccg ttagggaggc cttattgttc gtctagtcag ccccatttta tgggat 56
<210> 18
<211> 57
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 18
caccctaacg ggtgtttttt tttttttggt ctcccgtgta tctgtcaggt agcaggt 57
<210> 19
<211> 52
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 19
aaacacccgt tagggtgttt tttttttttt agtcagcccc attttatggg at 52
<210> 20
<211> 59
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 20
gcacctgaca gtgcgggctt tttttttcga ccaaagggtg tatctgtcag gtagcaggt 59
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 21
ccgcactgtc aggtgcgggc ttttttctgt gtttcctagt cagccccatt ttatgggat 59

Claims (10)

1.一种高产L-脯氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌是在支链氨基酸转氨酶编码基因的启动子与RBS序列之间，插入核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示的终止子序列。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的支链氨基酸转氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，插入终止子序列是以pK18mobsacB作为表达载体。
4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌还过表达了谷氨酸激酶。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述的谷氨酸激酶的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，过表达谷氨酸激酶是以pXMJ19作为表达载体。
7.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以谷氨酸棒杆菌、短杆菌、黄色短杆菌、寇氏杆菌或嗜醋酸棒杆菌为宿主菌。
8.一种权利要求1～7任一项所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的终止子序列，分别与支链氨基酸转氨酶基因的上游片段、下游片段和线性化载体pK18mobsacB进行无缝克隆，获得重组质粒pk18-TilvE；
(2)将重组质粒pk18-TilvE转入宿主菌中，得到含有pk18-TilvE的重组菌；
(3)将编码谷氨酸激酶的基因与pXMJ19载体相连接，构建重组质粒pXMJ19-proB；
(4)将重组质粒pXMJ19-proB转入步骤(2)的重组菌中，得到有pk18-TilvE和pXMJ19-proB的重组菌。
9.一种权利要求1～7任一项所述的重组菌发酵生产L-脯氨酸的方法，其特征在于，所述方法是将所述重组菌单菌落接种至液体种子培养基，28-32℃，80-120r·min-1培养12-14h；以5-10％接种量将种子培养液转接至发酵培养基，28-32℃，80-120r·min-1培养60-80h。
10.权利要求1～7任一项所述的重组菌在饲料工业、医药工业或食品工业中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110016450A (zh) * 2019-04-28 2019-07-16 江南大学 一株产l-脯氨酸的黄色短杆菌及其应用
CN114874958A (zh) * 2021-02-05 2022-08-09 中国科学院天津工业生物技术研究所 生产l-脯氨酸的菌株及其构建方法和应用
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