CN109477061A

CN109477061A - 抗冷冻酵母及其用途

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Publication number: CN109477061A
Application number: CN201780036306.4A
Authority: CN
Inventors: 察弗拉·科恩; 莫兰·根德尔曼; 玛丽娜·胡托里安; 西万·莫尔; 帕兹·舍梅什; 耶尔·里夫什茨·梅德维德
Original assignee: Nextferm Technologies Ltd
Current assignee: Nextferm Technologies Ltd
Priority date: 2016-04-12
Filing date: 2017-04-12
Publication date: 2019-03-15
Anticipated expiration: 2037-04-12
Also published as: US20190119763A1; CA3020653C; CA3020653A1; US11597908B2; WO2017178879A1; KR102288790B1; MX2018012582A; RU2018139496A; IL262248A; RU2756307C2; JP2019511241A; IL262248B; RU2018139496A3; EP3443127B1; KR20180133485A; EP3443127A1; CN109477061B; BR112018071207A2

Abstract

本发明涉及新的抗冷冻烘焙酵母(酿酒酵母)菌株及其用途，例如用于制备新鲜或冷冻面团产品，例如面包。提供了抗冷冻的烘焙酵母菌株，其例如是从特定的保藏菌株可获得的，例如通过将这些菌株彼此或与其他酿酒酵母菌株一起育种。本发明还涉及使用所述菌株的方法或制备面团或面团产品或酵母产品的方法，以及这些产品。

Description

抗冷冻酵母及其用途

技术领域

本发明涉及新的抗冷冻烘焙酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))菌株及其用途，例如用于制备新鲜或冷冻面团产品，例如面包。其提供了抗冷冻烘焙酵母菌株，其例如可从特定的保藏菌株中获得，例如通过将这些菌株彼此或与其他酿酒酵母菌株一起育种。本发明还涉及使用所述菌株的方法或制备面团或面团产品或酵母产品的方法，以及这些产品。

背景技术

作为家庭用的便利产品和作为商业半成品，冷冻面团或面团产品，例如面包、面包卷或糕点，正变得越来越重要。因此，烘焙酵母的抗冷冻性是一个越来越重要的参数。经典酵母菌株可以用于制备冷冻面团，但通常使用2至3倍过量的酵母来制备这种面团，这可能对烘焙产品的风味产生负面影响。

此外，冷冻酵母产品的保质期远远长于非冷冻、新鲜或干燥酵母的保质期。对于这样的应用，酵母的抗冷冻性也发挥重要作用。

特殊的抗冷冻酵母菌株已经是可用的(例如，US 5,352,606B1、EP 1 209 225 A1、EP 1 541 671 A1)，然而，本领域需要更好地适应于冷冻的烘焙酵母菌株，例如，其具有更高的存活率和/或更好的性能，例如冷冻后增加的发酵能力。

发明内容

通过本发明，特别是通过权利要求的主题解决这个问题。

本发明提供从以下菌株可获得的酵母菌株：以NCYC 4095保藏的菌株OL-01、以NCYC 4094保藏的菌株S3-02、以NCYC 4105保藏的菌株FL-03、以NCYC 4106保藏的菌株IS-310、以NCYC 4128保藏的菌株CC-05和以NCYC-4129保藏的菌株KF-06。本发明的酵母菌株可以是烘焙酵母菌株。

例如，本发明的菌株可以是通过选自由OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05和KF-06组成的群组的第一菌株与也可以是烘焙酵母菌株的第二酿酒酵母菌株之间的育种可获得的。啤酒酵母也可以用于育种，例如，如果需要适于酿造的抗冷冻菌株。然而，优选地，用于育种的两种菌株都是烘焙酵母菌株。第二酿酒酵母菌株也可选自包含OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05和KF-06的群组。例如，OL-01可以用于与OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05、KF-06或另一种烘焙酵母菌株一起育种。S3-02可以用于与OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05、KF-06或另一种烘焙酵母菌株一起育种。FL-03可以用于与OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05、KF-06或另一种烘焙酵母菌株一起育种。IS-310可以用于与OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05、KF-06或另一种烘焙酵母菌株一起育种。CC-05可以用于与OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05、KF-06或另一种烘焙酵母菌株一起育种。KF-06可以用于与OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05、KF-06或另一种烘焙酵母菌株一起育种。育种可以是，例如，通过孢子与孢子或孢子与细胞或细胞与细胞的杂交。另一种烘焙酵母菌株可以是抗冷冻菌株，例如由US 5,352,606 B1、EP 1 209 225 A1、EP 1 541 671 A1公开的，例如FTY-3(BP FERM2363)。其也可以是具有其他特定特征(例如渗透抗性)的非抗冷冻菌株，其可以用于将所述特定的所需特征添加到本发明的酵母中。优选地，在杂种育种(例如杂交)后，进行一轮或多轮抗冷冻性选择。

当然，菌株可以是保藏菌株OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05或KF-06中的一种。优选地，菌株是OL-01，更优选地，菌株是CC-05。

本发明还提供了本发明的烘焙酵母菌株，例如OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05或KF-06，其中优选地，菌株为CC-05，其中菌株包含选自由以下组成的群组的至少两种基因中的突变：

a)位于染色体IV的名为COS7的基因YDL248W，其中突变优选地为缺失；

b)位于染色体X的名为AAD10的基因YJR155W，其中突变优选地为缺失；

c)位于染色体IV的名为HXT15的基因YDL245C，其中突变优选地为缺失；

d)位于染色体X的名为DAN4的基因YJR151C，其中突变优选地为缺失和/或基因组重排和/或终止密码子的引入；

e)位于染色体IV的名为HKR1的基因YDR420W，其中突变优选地为导致氨基酸交换的至少一个点突变。

其中突变存在于所述基因的所有等位基因中。

优选地，酵母菌株包含三种或更多种，或四种或更多种或五种所述基因中的突变。最优选地，酵母菌株包含所有引述的突变。

优选地，本发明的菌株包含选自由以下组成的群组的至少两种基因中的突变：

a)位于染色体IV的名为COS7的基因YDL248W，其中突变是位置2232下游的缺失(其中缺失例如具有至少150个碱基对的长度)；

b)位于染色体X的名为AAD10的基因YJR155W，其中突变是位置727404下游的至少一个缺失(其中缺失的总长度是例如至少360个碱基对)；

c)位于染色体IV的名为HXT15的基因YDL245C，其中突变是位置11657下游的至少一个缺失(其中缺失的总长度是例如至少400个碱基对)；

d)位于染色体X的名为DAN4的基因YJR151C，其中突变是引入一个或两个终止密码子，优选地，在氨基酸位置342(将丝氨酸交换为终止密码子)和/或氨基酸位置53(将酪氨酸交换为终止密码子)和/或至少部分缺失和/或基因组重排，例如，在染色体X的坐标之间：714,902-715,267；

e)位于染色体IV的名为HKR1的基因YDR420W，其中突变是导致氨基酸交换的至少一个点突变，其中突变优选地选自由以下各项组成的群组中的至少一个：导致丝氨酸交换为脯氨酸的位置1308583和位置1308589处的突变和/或导致苯丙氨酸交换为亮氨酸的位置1308951和位置1309390处的突变，优选地所有。

其中突变存在于所述基因的所有等位基因中。

优选地，酵母菌株包含所述基因中的两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种或五种中的突变。最优选地，酵母菌株包含所有引述的突变。

在本发明的上下文中，导致氨基酸交换的点突变优选地显著改变氨基酸的生物化学性质，优选地，它们是非保守突变(如Zhang,J MolEvol 2000,50(1)：56-68所定义)。这种点突变可以导致基因产物的功能性失活。

据信，在所分析的菌株中发现的缺失和/或终止密码子导致各自基因产物的功能性失活，并且导致这种功能性失活的突变在本发明中是优选的。当然，可以通过不同的突变使基因产物失活。因此，在一个实施方式中，本发明的酵母菌株包含导致所有等位基因中至少两种(优选地三种或更多种，四种或更多种或所有)以下基因的基因产物的功能性失活的突变：

d)位于染色体X的名为DAN4的基因YJR151C，其中突变优选地为引入终止密码子和/或缺失和/或基因组重排；

因此，通过例如通过PCR分析本文指定的突变的存在，可以识别本发明的优选酵母菌株并将其与常规酵母菌株区分开。

优选的本发明的烘焙酵母菌株(例如CC-05或KF-06)包含选自由以下组成的群组的至少两种序列：

i)SEQ ID NO:7或包含至多三个、优选地至多两个或至多一个其碱基对的变化的序列变体，其中所述序列或所述序列变体中的一种存在于每个等位基因中，

ii)SEQ ID NO:8或包含至多三个、优选地至多两个或至多一个其碱基对的变化的序列变体，其中所述序列或所述序列变体中的一种存在于每个等位基因中以及

iii)SEQ ID NO:9或包含至多三个、优选地至多两个或至多一个其碱基对的变化的序列变体，其中所述序列或所述序列变体中的一种存在于每个等位基因中，

其中，优选地，菌株包含所述序列的全部三种。在一个实施方式中，所述菌株相对于SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9是纯合的并且相对于SEQ ID NO:7是杂合的。

在一个优选的实施方式中，菌株包含由以下组成的群组中的三种序列：

i)SEQ ID NO:7或包含至多一个其碱基对的变化的序列变体，其中所述序列或所述序列变体中的一种存在于每个等位基因中，

ii)SEQ ID NO:8或包含至多一个其碱基对的变化的序列变体，其中所述序列或所述序列变体中的一种存在于每个等位基因中以及

iii)SEQ ID NO:9或包含至多一个其碱基对的变化的序列变体，其中所述序列或所述序列变体中的一种存在于每个等位基因中。

在一个实施方式中，所述菌株在所有等位基因中包含选自由SEQ ID NO:8和SEQID NO:9组成的群组的两个序列，并且SEQ ID NO:7存在于至少一个等位基因中，具有一个碱基对变化的变体在至少另一个等位基因中。

本发明的所述酵母菌株优选地是抗冷冻的并且适于烘焙，例如，用于烘焙面包。

本发明还提供了本发明的烘焙酵母菌株，其中所述菌株能够以至少1％的存活率在包括冷冻和解冻的方案中存活，其中所述方案可以如下：

a)将酵母菌株在YPD培养基上在振荡培养箱中在30℃和200rpm下生长15小时，

b)收集酵母培养物并再悬浮于YPD培养基中至浓度为5 OD600，

c)将50mL试管(通常为离心管)中的5mL酵母悬浮液在-20℃下温育48-72小时，

d)然后进行四次冷冻/解冻循环，每次冷冻/解冻循环包括在30℃和200rpm下1.5小时，在-20℃下至少1小时，

其中存活率被测定为在所述冷冻/解冻循环后存活的酵母菌落数/在所述冷冻/解冻循环前存活的酵母菌落数×100％，并且其中存活的酵母菌落数使用将酵母悬浮液的十倍稀释液接种在YPD琼脂平板上并在30℃下温育48小时来测量。

在所述方案中具有至少0.5％存活率的酵母菌株是本发明的有利的抗冷冻菌株。优选地，所述方案中的存活率为至少1％、至少1.25％、至少1.5％、至少1.75％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％或至少4％，例如0.5％-4.5％。发明人表明，本发明的酵母菌株在所述方案中具有至少1.2％或至少1.5％的存活率，而用于冷冻面团的市售酵母和抗冷冻菌株FTY3(FERM BP 2363，参见US 5,352,606B l)的存活率分别仅为0.12％或0.26％和0.17％(图1)。

优选地，可以例如通过如以上所描述的在它们之间育种从菌株OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05和KF-06中的任一种获得的酵母菌株在所述方案中具有至少0.5％、至少1％、至少1.25％、至少1.5％、至少1.75％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％或至少4％的存活率，例如，0.5％-4.5％。

可以例如通过如以上所描述的在它们之间育种从菌株OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05和KF-06中的任一种获得的酵母菌株优选地表现出原始亲本的平均存活率的至少54％，优选地至少64％，优选地至少74％，更优选地至少84％的存活率。

本发明还提供了一种制备抗冷冻酵母菌株的方法，特别是本发明的烘焙酵母菌株，其包括以下步骤：

a)在本发明的酵母菌株例如OL-01、S3-02、FL-03、IS-3 10、CC-05和KF-06与选自包含OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05和KF-06的群组的第二酵母菌株之间进行育种；以及

b)针对抗冷冻性选择所得的酵母菌株，并且，可选地，

c)针对其发酵活性选择所得的抗冷冻酵母菌株。

本发明的酵母菌株的发酵性能可以有利地在液体粉悬浮液(LFS)中评估，例如，在下面简要描述的方法中，或在实施例5中更详细地评估。该测试有利地评估抗冷冻性和发酵性能。

发酵性能可以例如通过以下方法测试，该方法包括在30℃和200rpm下，在振荡培养箱中将酵母培养物在5mL YPD底物上繁殖15小时，然后在-18℃下将培养物冷冻3天。如实施例5中所述，立即测试来自每种菌株的一种培养物在LFS例如非糖液体粉悬浮液中的发酵性能。简言之，将培养物用蒸馏水洗涤两次并与LFS一起温育1.5小时。LFS样品在一定时间后形成两个相，底部是粉沉淀物，顶部是液相。以相同的方式进行测试冷冻后测试的另一种培养物。根据以下分数，将酵母发酵性能在90分钟后从0到5分级：

时间：在温育30分钟后开始发酵的酵母菌株得1个点，而在60分钟后开始发酵的酵母菌株得0.5个点，并且在90分钟后延迟开始的酵母菌株不得到任何点。

气泡：液相中没有气泡的样品不得任何点，具有少量气泡的样品得0.5个点，而具有大量气泡的样品得1个点。

孔：固相中没有孔的样品不得点。其中带有小孔的样品得0.5个点，具有大孔的面团得1个点。具有大连接孔的样品得1.5个点。

泡沫：液相顶部没有泡沫的样品不得任何点。具有薄泡沫层的样品得0.5个点，具有厚泡沫层的样品得1个点，具有0.5cm以上的泡沫层的样品得1.5个点。

优选地，通过在冷冻后发酵性能得分为至少1、至少1.5、至少2或至少3来评估本发明的酵母菌株。更优选地，与冷冻前的发酵性能相比，冷冻后发酵性能的降低为至多2或至多1.5或至多1。

优选地，例如通过如以上所描述的在它们之间育种从菌株OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05和KF-06中可获得的任一种酵母菌株表现出冷冻后的发酵性能低于(平均)亲本发酵性能至多1个点，优选地至多0.5个点，优选地等于亲本菌株，更优选地高于亲本菌株。

优选地，例如通过如以上所描述的在它们之间育种从菌株OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05和KF-06中的任一种可获得的酵母菌株表现出冷冻后发酵性能的降低，其不超过亲本菌株(平均)降低1个点以上，优选地，降低等于亲本菌株降低或更优选地低于亲本菌株降低。最优选地，完全没有降低。

本发明的烘焙酵母菌株还有利地具有优异的发酵能力。如果使用非冷冻面团，则可以按照实施例3中公开的方案测定发酵能力，或者如果感兴趣的是冷冻后的发酵能力，则按照实施例4。

优选地，本发明的酵母菌株对非冷冻面团的发酵能力至少与市售酵母菌株如FTY-3(BP FERM 2363)的发酵能力相当(高达+/-20％)。本发明的酵母菌株还可以具有优异的糖面团(特别是高糖面团，例如11％糖或更多)与非糖面团的发酵能力比。发明人表明，在本发明的优选酵母菌株中，例如OL-01或特别是CC-05，对高糖面团的发酵能力是特别高的，这对于应用于冷冻面团的酵母菌株是独特的，优选地，对11％糖面团的发酵能力/对非糖面团的发酵能力的比率为至少1.2，优选地至少1.3、至少1.5、至少1.7或至少1.9。OL-01在高糖面团中显示出具有特别高的发酵能力，特别是CC-05，可以有利地在低和高糖面团中具有高发酵能力。

关于在冷冻面团中的发酵能力，例如，与所述面团在-20℃下储存1天后其发酵能力相比，在用所述酵母菌株制备的面团在-20℃下储存4周，优选地8周后，本发明的菌株可显示出至少90％，优选地至少91％、至少93％、至少95％的发酵能力。

可替代地或另外地，与所述面团在-20℃下储存1天后其发酵能力相比，在用所述酵母菌株制备的面团在-20℃下储存4周，在储存的前2周内进行至少5次、至少10次、至少15次、至少20次或至少25次冷冻/解冻循环(优选地至少10次冷冻/解冻循环)，其中将面团转移至25℃(例如，30分钟)并返回至-20℃进行(例如，至少2小时)一个冷冻/解冻循环，菌株可显示出至少75％，优选地至少78％、至少80％、至少82％或至少84％的发酵能力。

本发明的酵母菌株能够发酵葡萄糖和蔗糖，以及可选地麦芽糖、半乳糖和棉子糖。酵母能够同化来自葡萄糖和蔗糖，以及可选地麦芽糖、半乳糖和/或棉子糖的碳，其可以根据实施例2的方法测定。通常，蜜二糖和可选地半乳糖和/或棉子糖不能被同化。本发明的菌株各自显示出在其上同化和生长的典型糖谱。

本发明还提供了一种酵母产品，其包含本发明的烘焙酵母菌株的酵母，其中酵母产品选自包括压缩酵母、碎酵母、膏状酵母、活性半干酵母、干酵母，例如活性干酵母、即用干酵母或即用活性干酵母和冷冻酵母的群组。酵母产品可具有10-99％的固体含量。

膏状酵母，也称为液体酵母，主要由工业烘焙店使用。该产品的主要优点是它直接在烘焙店的冷藏容器中运输，并可以自动泵送和加料。膏状酵母应在冷却条件下储存，其干物质含量为约20％(T.Boekhout(作者，编辑)，V.Robert(编辑)，Yeasts in Food:Beneficial and Detrimental Aspects，Woodhead Publishing Series in FoodScience,Technology and Nutrition,2003，第297页)。

压缩酵母，也称为新鲜压缩酵母，由膏状酵母生产。通常使用利用压滤机或旋转真空过滤器的过滤以去除膏状酵母中包含的部分水。该产品的干物质在28％与35％之间变化，取决于烘焙师的国家和习惯。具有较低干物质含量的压缩酵母颜色较深并且具有可揉捏的，相当塑性的稠度。在高干物质含量下，压缩酵母更白，变得易碎。新鲜酵母必须在冷却条件下保存，例如在约4℃或更低的温度下，但也可以被冷冻。如果冷链受到干扰并且温度升高，则新鲜酵母迅速失去其活性。该产品可以以不同的形式生产，例如用于家庭烘焙的小方块，500g或1kg的块和25kg的袋子。产品的保质期为约5周。(T.Boekhout(作者，编辑)，V.Robert(编辑)，食品中的酵母：有益和有害方面(Yeasts in Food:Beneficial andDetrimental Aspects,Woodhead Publishing Series in Food Science,Technology andNutrition,2003，第297页)。压缩酵母是本发明优选的酵母，特别是用于商业用途。

碎酵母是一种新鲜酵母，在装入25-50磅袋子之前粉碎成约1cm×5-10cm的不规则碎片，并在冷藏下储存，以在约4周的储存期间确保稳定性。尽管有这些预防性措施，但在5-8℃下每周3-5％的发酵活性损失是不可避免的，包装的产品也可以被冷冻。(Byong H.Lee,Fundamentals of Food Biotechnology,2014,Wiley-Blackwell,第184页)。

活性半干酵母的固体含量为70-80重量％。其通常在0-6℃下储存，但也可以被冷冻。

活性干酵母产品通常具有90重量％或更高的固体含量。所有形式的活性半干或干酵母均可在室温下储存或冷藏。通常不需要冷冻，即使是长期储存，也是可能的。它们优选地在真空或惰性气体(如氮气)中包装。

本发明的酵母菌株也可以用于生产干酵母产品，即活性干酵母(ADY)、即用干酵母(IDY)、即用活性干酵母(即用ADY)和保护性活性干酵母(PADY)。压缩蛋糕酵母可以在干燥之前用加工助剂或抗氧化剂处理，然后挤压成意大利面条状的线。在将线制动成1.5-3cm长度之后，将它们例如在传送带型干燥器的隧道中干燥，例如流化床干燥器。这种干燥产生ADY。为了活化ADY，需要用水再水化的单独步骤。

具有比ADY更高活性的即用ADY需要更温和的干燥，这通过流化床或气升干燥法进行。即用ADY的高活性是由于高孔隙率，不需要再水化，通常可以直接添加到面团中。

PADY含有乳化剂，通过特殊工艺干燥至5-6％的水分含量。在该产品中使用抗氧化剂可减少氧气的不利影响，无需特殊包装。(Karel Kulp,Klaus Lorenz(编),Handbook ofDough Fermentations,2003,CRC Press,ISBN 9780824742645)。

酵母产品可以是冷冻酵母，例如具有70-85％，特别是74-80％(w/w)干物质的冷冻活性半干酵母，例如以干燥冷冻“面条”的形式。冷冻活性半干酵母可以直接掺入面粉中而不需要预先解冻。冷冻酵母也可以是冷冻活性半干酵母产品，其直径小于3mm，干物质含量为70-85重量％，优选地70-80重量％干物质，如在EP 1 209 225 Al和CA 1299435中公开的。冷冻酵母可以例如用于制备冷冻面团。冷冻酵母产品稳定至少4周，优选地至少8周、至少12周、至少3个月、至少4个月、至少20周、至少6个月、至少1年或至少2年。

本发明还提供了一种生产酵母产品的方法，其包括培养本发明的烘焙酵母菌株，和可选地冷冻酵母。

本发明的酵母产品包含本发明的酵母菌株的酵母。它们可另外地包含其他烘焙酵母，即以不同酵母菌株的混合物的形式。

本发明还提供一种面团或面团产品，其包含本发明的烘焙酵母菌株或酵母产品。使用的酵母(用于至少30％干物质的压缩酵母)的浓度可以是例如0.5％至10％(以面粉的w/w计)、1-7％或2-5％。该浓度通常与用于可比产品的传统酵母的浓度相当或低于该浓度。优选地，特别地，如果酵母和/或面团或面团产品是冷冻的，则可以使用较小浓度的酵母，优选地，推荐的经典量的约30-90％、30-85％、40-80％、45-75％或50-70％，不会显著影响所得烘焙面团产品的质地。

面团是通过在添加或不添加糖的情况下，将本发明的酵母与至少一种选自包括面粉和液体的群组的成分混合可获得的。

通常，将酵母与至少面粉和液体混合。面团中使用的典型成分以及合适的浓度是技术人员公知的。添加的液体可以是例如水、牛奶、酪乳、啤酒，可选地添加油。可以使用水和奶粉来代替牛奶。

其他可选的面团成分是例如糖、盐、蛋和/或脂肪。优选地，面团包含盐。可以使用蛋粉来代替新鲜鸡蛋。脂肪可以是例如油、黄油或人造奶油。面团当然还可以包含其他面团成分，例如酸面团或包含至少一种微生物、香料(例如肉桂、香草、胡椒、大蒜和/或草药)、磨碎的柠檬皮、烘焙改良剂、酶和/或盐的预面团混合物。水果和/或蔬菜，例如干燥或捣碎的形式，可以是另外的面团成分，例如用于甜面包或蛋糕的葡萄干。在一个优选的实施方式中，例如，对于面包或面包卷，面团是酸面团。

面团或面团产品可包含例如0-40％糖，特别地，其可以是非糖面团、少糖面团(1-10％糖)或高糖面团(超过10％糖，优选地，高达25％或更多)。发明人已经能够证明，本发明的酵母在非糖面团和少糖面团上具有与市售的酵母菌株相当的发酵能力，并且它们，特别是OL-01，在高糖面团上具有特别高的发酵能力。因此，本发明的酵母菌株优选地用于高糖面团，例如特别是用于冷冻高糖面团。面团可选地包含高达25％的脂肪。

如果使用本发明的冷冻酵母产品，特别是如果所述酵母产品具有小粒径，则面团制备不需要解冻，但可以将冷冻产品直接添加到面团成分，或者至少一种其他成分(如面粉)中。然而，当然可以首先在0-37℃的温度下解冻冷冻的酵母产品，例如在约0-8℃的温度下，或在室温下(优选地，20-25℃)，或者在30-37℃下，或逐步升高温度，例如，首先使温度达到约0-8℃，然后升至室温或更高的温度。

面粉是通过研磨未煮过的谷粒或其他种子或根制成的粉末。通常，面粉是小麦粉、黑麦粉、斯佩耳特小麦粉、玉米粉、燕麦粉、荞麦粉、无麸质面粉或米粉、或其混合物，优选地小麦粉。面粉类型可选自包括糕点面粉、所有用途面粉、强质面粉、超强质面粉和/或全麦面粉、或根据DIN 10355根据矿物质含量分类的任何类型，例如405型、550型、650型、812型、1050型和/或1600型。面粉可含有抗坏血酸。可选地将其用漂白剂和/或熟化剂处理。如果面团含有糖，特别是如果其是高糖面团，通常使用糕点面粉(对应于405型)或来自小麦的550型面粉。

本发明还提供冷冻面团或冷冻面团产品。冷冻描述了保持在-18℃或更低或-20℃下。面团可以通过将面团转移到适当温度的冷冻机中来冷冻，或者优选地，通过使用能够更快地降低面团温度的方法，例如使用鼓风冷冻机。

在一个实施方式中，冷冻面团或面团产品通过将本发明的冷冻酵母产品可选地在解冻后与至少一种上述面团成分混合而获得。

在另一个实施方式中，冷冻面团或面团产品通过将本发明的膏状酵母或压缩酵母产品(优选地压缩酵母产品)与至少一种上述面团成分混合而获得。

在本发明的上下文中，面团产品是成形的面团块。其可以是生的、半生的(即部分烘焙的)或烘焙的。其也可以是冷冻的，特别是生冷冻面团块。半生或烘焙的面团块也可以是冷冻的，但酵母的抗冷冻特性在生面团或面团产品被冷冻时最为相关。在一个实施方式中，面团产品是从冷冻面团或优选地本发明的冷冻面团产品获得的烘焙面团产品。

本发明的面团或面团产品可以是面包面团、面包卷面团、披萨面团、蛋糕面团、羊角面包面团、椒盐卷饼面团、百吉饼面团，所有这些都优选地已经形成，面包、面包卷、披萨、羊角面包、椒盐卷饼、百吉饼和蛋糕。面包可以是例如长棍面包、夏巴塔、全麦面包、混合面包、黑麦面包或甜面包，例如酵母辫。蛋糕包括例如糕点、松饼或饼干。

本发明还提供了一种制备本发明的面团或面团产品的方法，其包括以下步骤

a)在添加或不添加糖的情况下，将本发明的烘焙酵母菌株或本发明的酵母产品与选自包括面粉和液体(如水或牛奶)的群组的至少一种成分混合。

可以加入另外的面团成分，例如如以上所描述的，并获得面团。混合步骤可以是将所有面团成分混合在一起。替代地，其是逐步混合，其中酵母首先与一种成分例如面粉或液体混合，并且其中当使用活性干酵母时，所述液体优选地具有20-37℃的温度，当使用压缩酵母获得第一混合物时，优选地0-25℃，并且例如在0-30分钟后，将该第一混合物与其他成分混合。混合步骤通常包括揉捏面团，例如，1-15分钟，优选地2-10分钟。揉捏通过促进面筋网络的形成影响面团的稠度。揉捏通常在室温下进行，但也可以控制温度，例如16℃至30℃，并且也可以控制面团温度，例如16-37℃。特别是，为了制备冷冻面团，温度低于25℃，例如约16-23℃。

制备本发明的面团或面团产品的方法可选地包括选自包括以下的群组的一个或多个其他步骤

b)使面团成形；

c)醒发面团；

d)冷冻面团；

e)解冻面团；和/或

f)烘焙面团。

步骤b)、c)和d)可以按任何顺序进行，并且可以使用重复的醒发步骤来获得最佳产品。如果进行步骤e)，则在步骤d)之后进行。步骤f)通常最后进行，但可以随后进行冷冻和可选地解冻步骤。

在本发明的上下文中，醒发被视为其中酵母将存在于面团中的可发酵糖转化为二氧化碳和乙醇的过程。这增加了面团体积并影响流变性，例如，所得产品的质地更轻。

醒发通常在20℃与37℃之间的温度下进行，优选地在室温或约25℃下进行。增加的湿度是有益的，优选地，至少75％或至少85％相对湿度。产品的所需特性以及相应地醒发条件取决于产品的类型。

由于与市售酵母相比，本发明的酵母具有相当或增加的发酵能力，所以技术人员可以容易地优化条件。

将面团醒发例如15-90分钟通常在揉捏后进行。面团可以在醒发之前形成。然而，通常，在醒发步骤之后，将面团再加工，或冲压，并可选地成形。然后可以进行另一个醒发步骤，例如15-90分钟。

生的或冷冻的面团产品可能没有经过醒发、完全或部分醒发。因此，可以在揉捏之后，在部分醒发期之后(通常在成形之后)，或在完全(最大)所需的醒发之后进行冷冻。优选地，冷冻在完全所需的醒发期之后进行。在整个发明中，出于方便的原因，优选地是将成形的面团产品冷冻而不是未成形的面团。

在一个优选的实施方式中，对于未经醒发的冷冻面团产品，面团产品在成形后冷冻。解冻后，可以将它们醒发，然后进行烘焙。

在另一个优选的实施方式中，对于醒发或至少部分醒发的冷冻面团产品，形成面团产品，醒发(约60-100％，通常典型的完全所需的醒发体积的约70-80％)，并冷冻。在解冻并且可选地进一步醒发之后，可以将它们烘焙。

冷冻后，可以在烘焙之前将面团或面团产品解冻(0℃-37℃，优选地20℃至32℃)，并且可选地，可以进行醒发步骤。这对于重质面团如含糖和/或脂肪的面团特别有用。然而，使用本发明的酵母，这不是必需的，即面团或面团产品可以是适于烘焙的冷冻面团或面团产品而不解冻，例如细长形状的冷冻面团。

有利地，本发明的冷冻面团或面团产品当在-18℃的温度下冷冻时稳定至少2周、至少4周、至少8周、至少3个月、至少6个月或至少1年。在本发明的上下文中稳定的意味着该产品仍然适合于人类消费，并且保持与相应的新鲜产品至少相当的特性。

在形成之后的任何时间，例如在形成之后，在醒发之后，在冷冻之后，在解冻之后或在烘焙之后，可以进行另外的整理步骤，例如，添加浇头如糖衣，用蛋黄、牛奶、糖、果酱、或其混合物或水果装饰。

本发明的面团产品也可以是烘焙产品。烘焙可以在进行或不进行汽蒸的情况下进行，例如在约160-220℃的温度下进行15-60分钟的时间段。

诸如温度和烘焙时间的条件取决于产品(例如，面团类型和尺寸，所需的外皮)并且可以由技术人员容易地确定。在本发明的上下文中，虽然烘焙通常在烘箱中进行，但烘焙应理解为包括将面团产品加热至使酵母失活的温度的其他方式，例如汽蒸、通过微波加热、油炸、烘烤和/或烹饪。

本发明的面团或面团产品也可以包装在例如罐或箔中。包装可以在真空条件下或在改性气氛中进行，优选地氧气含量降低或不存在氧气的情况下。包装可包括用于生产即食面团产品的说明书，例如用于面团制备和烘焙的进一步步骤。

例如，冷冻面团产品可以通过混合成分，揉捏，醒发面团(例如，在室温下15-30分钟，优选地约25℃，再加工和使面团成形，可选地，进一步在室温下醒发面团，优选地约25℃，进行1-45分钟，例如30-40分钟，和冷冻(例如，-18℃至-20℃)来获得。在烘焙之前，可以将冷冻的面团产品解冻(例如，32℃，75％相对湿度)至少5或至少10分钟，例如约30-45分钟。优选地，解冻足以获得面团稠度，这确保了产品的最大体积。然而，面团产品也可以从冷冻器中直接烘焙而不解冻。

本发明还提供了本发明的烘焙酵母菌株或本发明的酵母产品用于制备面团或面团产品的用途，其中面团或面团产品可以是冷冻面团或面团产品。

本发明在以下实施例中进一步描述以说明本发明，但这些实施例不用于限制本发明的范围。本文引用的所有参考文献出于所有目的在此全部并入本文。

附图说明

图1：与现有技术的商业酵母菌株相比，本发明的酵母菌株的存活率。将酿酒酵母菌株OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05、KF-06、用于冷冻面团的商业烘焙酵母菌株和抗冷冻菌株FTY-3(FERM BP 2363(US 5,352,606 B l))在YPD培养基上生长，收集并再悬浮在新鲜的YPD培养基中至浓度为5 OD₆₀₀。将酵母悬浮液在-20℃温育48-72小时，然后进行4个冷冻/解冻循环(在30℃下1.5小时/在-20℃下至少1小时)。在YPD琼脂平板上接种酵母悬浮液的十倍稀释液并在30℃下温育48小时测量活酵母计数。存活率如下确定：

存活率＝酵母菌落的最终数量/酵母菌落的初始数量×100％

图2：与现有技术的商业酵母菌株相比，本发明的酵母菌株的冷冻非糖面团样品的小面包体积。将如实施例3中所描述获得的酿酒酵母菌株OL-01培养物、用于冷冻面团的商业烘焙酵母和用于所有目的面团应用的商业烘焙酵母用于制备非糖面团。制备面团，分成多个50g部分，模制，并使用鼓风冷冻机冷冻至-20℃，转移至聚乙烯袋中，然后在-20℃冷冻机中储存最长达4周的时间。制备后，在进行冷冻/解冻循环下，在-20℃下储存一天并在-20℃下储存4周，将面团样品在25℃下解冻20-30分钟，醒发并在小面包盘中烘焙。根据用于使用罂粟籽测量不规则固体体积(Physical Properties of Foods,Serpil Sahin,ServetSumnu,第20页)的固体置换法，在冷却至室温后测量小面包的表观体积。

图3：与现有技术的商业酵母菌株相比，本发明的酵母菌株的预醒发的面团样品的小面包体积。在-20℃下储存1天后和在-20℃下储存4周后如实施例4.2中获得非糖面团样品(50-80g)，直接烘焙冷冻的预醒发的小面包，没有解冻阶段，如实施例7.2中描述。根据用于使用罂粟籽测量不规则固体体积(Physical Properties of Foods,Serpil Sahin,ServetSumnu,第20页)的固体置换法，在冷却至室温后测量小面包的表观体积。

具体实施方式

实施例

实施例1：新的酵母菌株及其形态

选择新的抗冷冻酿酒酵母菌株OL-01(NCYC 4095)、S3-02(NCYC 4094)、FL-03(NCYC 4105)、IS-310(NCYC 4106)、CC-05(NCYC 4128)和KF-06(NCYC 4129)并根据布达佩斯条约保藏在NCYC。FL-03和IS-310是通过育种OL-01和S3-02的后代获得的。CC-05是通过育种包括OL-01和S3-02的后代获得。

将每种酵母菌株在YPD培养基中繁殖(参见表2)，并在显微镜下观察形态学特征。将酵母菌落在YPD琼脂上生长(参见表2)并观察其形态学特性。

孢子形成：将在YPD琼脂平板上生长的酵母进一步接种在SPO琼脂平板上(参见表2)，并在25℃下温育7-10天。通过显微镜观察来证实孢子形成的发生。

表1：新的酵母菌株的形态学特性

表2：培养基组成

	YPD	YPD琼脂	SPO琼脂	YNB
					葡萄糖(g)	20	20	0.5	-
酵母提取物(g)	10	10	1	-
					蛋白胨(g)	20	20		-
琼脂(g)	-	20	20	20
					KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(g)	-	-	-	4
MgSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O(g)	-	-	-	0.4
					(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>(g)	-	-	-	5
酵母氮碱(g)	-	-	-	10
					KCH<sub>3</sub>COO(g)	-	-	10	-
蒸馏水(mL)	1000	1000	1000	1000

本发明的其他抗冷冻酵母菌株可以通过在OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05和KF-06中的任一种之间进行育种来获得。

耐冷冻酵母菌株可以通过常规的非GMO酵母改良方法如随机诱变和包括有性重组和基因组改组的育种方法获得。这些方法在两篇评论文章中详述：Giudici P.SolieriL.Pulvirenti A M..Cassanelli S.2005 Appl Microbiol Biotechnol 66:622-628.Steensels J.Snoek T.,Meersman E,Nicolino M.P.,Voordeckers K.M&VerstrepenK.J.2014 FEMS Microbiol Rev 38 947-995。

可以通过使用诱变剂(用于即用化学诱变剂或UV)的随机诱变以在酵母群体中产生遗传多样性，然后朝所需的性状选择来获得所述酵母，如Matsutani,K.,Y.Fukuda,K.Murata,A.Kimura,I.Nakamura,and N.Yajima.1990.J.Ferment.Bioeng.70:275-276中所述。

可替代地，使用包括育种酵母菌株的有性重组通常涉及以下方法中的一种：萌发后生长的单孢子培养物，如Nakagawa,S.和Ouchi,K.1994 Appl.Environ.Microbiol.60,3499-3502所述，以及随机配子，如Giudici P.Solieri L.Pulvirenti A M..CassanelliS.2005 Appl Microbiol Biotechnol 66:622-628所述。

此外，可以使用基因组改组方法获得所述酵母，所述基因组改组方法通过许多亲本之间的重复重组然后通过筛选进行，如Paolo Giudici.Lisa Solieri.AndreaM.Pulvirenti.Stefano Cassanelli 2005 Appl Microbiol Biotechnol 66:622-628所述。

抗冷冻性的筛选方法可以促进每种育种方法。通过在面团中反复冷冻-解冻循环(最多200次)或在YPD培养基中冷冻后测试其活力，可以测试菌株的抗冷冻性，如TeunissenA,等2002.Applied and Environmental Microbiology 68:4780-4787和Tanghe A,等,2002.Applied and Environmental Microbiology 68 5981-5989所述。

实施例2-碳源同化

如下分析碳水化合物同化。将酿酒酵母菌株OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05和KF-06在YPD培养基上生长15小时，同时搅拌(200rpm)，收集并通过离心用无菌水洗涤两次，并分别在含有各种碳水化合物(2％w/v)的YNB培养基中再悬浮至0.5OD/ml的浓度。将悬浮液在30℃下在200rpm搅拌下温育18小时(OL-01、S3-02、FL-03、IS-310)或在37℃下在100rpm搅拌下温育20小时(CC-05、KF-06)。培养物的浊度通过600nm处的吸光度测量，以证实13小时后和18小时后的酵母生长。与在葡萄糖上并不含任何糖的生长相比，计算生长能力的估计。与在葡萄糖上的生长相比，酵母菌株达到其浓度的至少80％的糖类型用“+”评分。与不含任何糖的生长相比，酵母菌株超过其浓度20％以上以及与在葡萄糖上的生长相比，低于其浓度80％的糖类型用“±”评分。与不含任何糖的生长相比，酵母菌株浓度不超过其浓度的20％的糖类型用“-”评分。

表3-新的酵母菌株的碳源同化

OL-01

S3-02

FL-03

IS-310

CC-05

KF-06

葡萄糖

+

蔗糖

+

麦芽糖

±

+

±

半乳糖

±

+

棉子糖

±

NA

蜜二糖

-

该实验表明，本发明的酵母显示出典型的碳同化模式。

实施例3-非冷冻面团的发酵能力

3.1新的酿酒酵母菌株的培养。

将一全环(loopfull)量的新鲜酵母从YPD琼脂平板转移至含有60mL糖蜜12.5°Bx(Brix)的250ml锥形瓶中，并在振荡培养箱中在200rpm搅拌下于30℃温育24小时。将20mL获得的酵母悬浮液无菌转移到含有105mL糖蜜12.5°Bx的1L锥形瓶中，并在相同条件下温育48小时，以产生用于在5L发酵罐中的主发酵的种子酵母。

然后将培养液接种到含有2.5L糖蜜培养基的7L发酵罐中(见表4)，并在表44所示的条件下生长，得到用于5L发酵罐培养的种子酵母。

表4中所示的主要培养基在7L发酵罐容器中以5L的体积制备，并接种在7L发酵罐中的2.5L糖蜜培养基中生长的全部体积的种子培养物，然后在以下条件下培养。

表4：发酵条件

发酵完成后，酵母细胞用无菌水洗涤并离心分离，然后再悬浮在水中以获得酵母膏(18-23％干物质)或通过离心和过滤分离以获得具有28-35％干物质的压缩酵母。

上述发酵步骤描述于例如通过引用并入的由Chandra J.Panchal编辑的YeastStrain Selection，1990，第140页，或在US4232045、US3617306A、EP 0 237 427 B2中，其全部公开内容也通过引用并入。

3.2.对非冷冻面团的发酵能力

3.2.1根据表5中所述的组成，使用550型白色小麦粉(德国规格，即灰分含量0.50-0.58％，提取率-72％，面筋含量9-11％)，为每种酵母样品制备两种类型的面团样品。

在制备后，立即使用ANKOM^RF气体生产测量系统(K.-Auffermann等，2014.Brewing Science 67：72-80)分析面团样品的发酵能力。测量在30℃下进行60分钟。该系统根据转换为CO₂体积的压力和温度来确定烘焙酵母CO₂生产水平。表6显示了获得的结果。

表5：面团组成

表6：对非冷冻(新鲜)面团的发酵能力(ml CO₂)

3.2.2根据表7中所述的组成，使用亮白小麦粉，灰分含量～0.4％，蛋白质～11％，湿面筋含量～29％，为每种酵母样品制备两种类型的面团样品。

在制备后，立即使用ANKOM^RF气体生产测量系统(K.-Auffermann等，2014.Brewing Science 67：72-80)分析面团样品的发酵能力。测量在37℃下进行60分钟。该系统根据转换为CO₂体积的压力和温度来确定烘焙酵母CO₂生产水平。表8显示了获得的结果。

表7：面团组成

表8：对非冷冻(新鲜)面团的发酵能力(ml CO₂)

	2％糖面团[ml CO<sub>2</sub>]	15％糖面团[ml CO<sub>2</sub>]
			OL-01	329	182
S3-02	350	168
			用于冷冻面团的商业烘焙酵母	310	148
来自生产商A的商业烘焙酵母	382	190
			来自生产商B的商业烘焙酵母	318	134

3.2.3根据表9中所述的组成，使用亮白小麦粉，蛋白质～11％，湿面筋含量～32％，为每种酵母样品制备两种类型的面团样品。

在制备后，立即使用ANKOM^RF气体生产测量系统(K.-Auffermann等，2014.Brewing Science 67：72-80)分析面团样品的发酵能力。测量在28℃下进行60分钟。该系统根据转换为CO₂体积的压力和温度来确定烘焙酵母CO₂生产水平。表10显示了获得的结果。

表9：面团组成

表10：对非冷冻(新鲜)面团的发酵能力(ml CO₂)

实验3.2.1、3.2.2和3.2.3显示，测试的新的菌株对新鲜的非冷冻面团显示出与市售酵母菌株的至少相当的发酵能力。在本发明优选的酵母菌株中，对高糖面团的发酵能力是特别高的，这对于应用于冷冻面团的酵母菌株是独特的，优选地，对11％糖面团的发酵能力/对非糖面团的发酵能力的比率为至少1.2，优选地至少1.3、至少1.5、至少1.7或至少1.9。优选地，与非糖面团相比，16％糖面团中发酵活性的降低至少小于30％，优选地小于25％，优选地小于20％，更优选地等于或小于17％。OL-01在高糖面团中显示出具有特别高的发酵能力。在高糖面团中表现出具有特别高的发酵能力。该实验表明，本发明的新的酵母菌株，特别是CC-05，可以有利地在低和高糖面团中具有高发酵能力。

实施例4-对冷冻面团的发酵能力

4.1非糖，冷冻面团：

4.1.1使用亮白小麦粉，将实施例3中获得的酵母培养物和商业酵母产品用于制备含有约2％(面粉重量％)盐、4％(面粉重量％)酵母(30％固体)、53％(面粉重量％)水的非糖面团。制备面团，分成多个50g部分，模制，并使用鼓风冷冻机冷冻至-20℃，转移至聚乙烯袋中，然后在-20℃冷冻机中储存长达4周的时间。制备后一天和4周，将面团样品在25℃下解冻20-30分钟，并使用ANKOM^RF气体生产测量系统在37℃下温育90分钟期间测试CO₂释放。该方法根据进一步转化为CO₂体积的压力和温度确定烘焙酵母的CO₂生产水平。进行测量，并测量样品在-20℃下储存1天和4周的总气体体积。为了测试经受多次冷冻/解冻循环的能力，在平行实验中，在储存的前2周期间进行10次解冻/冷冻循环，其中对于一次解冻/冷冻循环，将面团转移至25℃，持续30分钟并返回至-20℃，持续至少两个小时。表11显示了获得的结果。

表11：以第1天测量值的％表示的冷冻4周后发酵能力的持久性

该实验表明，本发明的新的酵母菌株可以有利地耐受长期冷冻储存，可选地进行多次冷冻/解冻循环，优于市售酵母菌株，例如，显示出在-20℃下储存4周后发酵能力是在-20℃下储存1天后发酵能力的至少90％，优选地至少91％，优选地，至少93％或至少97％，并且在-20℃下储存4周并进行多次冷冻/解冻循环后发酵能力是在-20℃下储存1天后发酵能力的至少70％、至少73％、优选地至少75％、至少78％、至少80％或至少84％。

4.1.2如实施例4.1.1中获得的非糖面团样品(50g)并在-20℃下储存长达12周的一段时间。将面团样品在25℃下解冻20-30分钟，并使用ANKOM^RF气体生产测量系统在37℃下温育60分钟期间测试CO₂释放。进行测量，测量在-20℃下储存1天后、8周后和12周后产生的总气体体积。表12A显示了获得的结果。

在一项单独的实验中，如实施例4.1.1中获得的非糖面团样品(50g)，在-20℃下储存长达24周的一段时间。将面团样品在25℃下解冻20-30分钟，并使用ANKOM^RF气体生产测量系统在37℃下温育90分钟期间测试CO2释放。为了测试经受多次冷冻/解冻循环的能力，在平行实验中，在储存的前2周期间进行10次解冻/冷冻循环，其中对于一次解冻/冷冻循环，将面团转移至25℃，持续30分钟并返回至-20℃，持续至少两个小时。表12B显示了获得的结果。

表12A：以第1天测量值的％表示的冷冻8周和12周后发酵能力的持久性

表12B：以第1天测量值的％表示的冷冻4、8和24周后发酵能力的持久性

该实验表明，本发明的新的酵母菌株可以有利地耐受长期冷冻储存，优于市售酵母菌株，例如，在-20℃下储存8和12周后发酵能力是在-20℃下储存1天后发酵能力的至少77％、至少80％、优选地至少83％、至少87％或至少90％。替代地或另外地，本发明的酵母菌株显示出在-20℃下储存24周后发酵能力是在-20℃下储存1天后发酵能力的至少60％，优选地至少65％、至少70％或至少72％。

4.2无糖，预醒发冷冻面团：

4.2.1使用亮白小麦粉，将实施例3中获得的酵母培养物和商业酵母产品用于制备含有约1.5％(面粉重量％)盐、2％(面粉重量％)酵母(30％固体)、65％(面粉重量％)水的非糖面团。

制备面团，分成多个50g部分，模制，在30℃的醒发室中醒发1小时，然后使用鼓风冷冻机冷冻至-20℃，转移到聚乙烯袋中，然后在-20℃冷冻机中储存长达4周的一段时间。制备后第一天、2周和4周，将面团样品在25℃下解冻20-30分钟，并使用ANKOM^RF气体生产测量系统在37℃下温育60分钟期间测试CO₂释放。进行测量，并测量在-20℃下储存1天后，2周后和4周后产生的总气体体积。为了测试经受多次冷冻/解冻循环的能力，在平行实验中，在储存的前2周期间进行10次解冻/冷冻循环，其中对于一次解冻/冷冻循环，将面团转移至25℃，持续30分钟并返回至-20℃，持续至少两个小时。表13A显示了获得的结果。

表13A：使用2％酵母(30％固体)，以第1天测量值的％表示的预醒发面团冷冻2和4周后发酵能力的持久性

在一种替代的设置中，使用亮白小麦粉，将实施例3中获得的酵母培养物和商业酵母产品用于制备含有约1％(面粉重量％)菜籽油、2.5％(面粉重量％)盐、5％(面粉重量％)酵母(30％固体)、56％(面粉重量％)水的非糖面团。

制备面团，分成多个80g部分，模制，在20℃下醒发70分钟，然后使用鼓风冷冻机冷冻至-20℃，转移到聚乙烯袋中，然后在-20℃冷冻机中储存长达2周的一段时间。制备后第一天和2周，将面团样品在25℃下解冻20-30分钟，并使用ANKOM^RF气体生产测量系统在37℃下温育60分钟期间测试CO₂释放。进行测量，并测量在-20℃下储存1天后和4周后产生的总气体体积。表13B显示了获得的结果。

表13B：使用5％酵母(30％固体)，以第1天测量值的％表示的预醒发面团冷冻4周后发酵能力的持久性

4.2.2预醒发的面团样品的长期储存。使用亮白小麦粉，将实施例3中获得的酵母培养物和商业酵母产品用于制备含有约1％(面粉重量％)菜籽油、2.5％(面粉重量％)盐、5％(面粉重量％)酵母(30％固体)、56％(面粉重量％)水的非糖面团。

制备面团，分成多个80g部分，模制，在20℃下醒发70分钟，然后使用鼓风冷冻机冷冻至-20℃，转移到聚乙烯袋中，然后在-20℃冷冻机中储存长达20周的一段时间。制备后第一天、12周和20周，将面团样品在25℃下解冻20-30分钟，并使用ANKOM^RF气体生产测量系统在37℃下温育90分钟期间测试CO₂释放。进行测量，并测量在-20℃下储存1天后和4周后产生的总气体体积。表14总结了在该实验中获得的结果。

表14：使用5％酵母(30％固体)，以第1天测量值的％表示的预醒发面团冷冻12和20周后发酵能力的持久性

该实验表明，本发明的新的酵母菌株可以有利地耐受预醒发的冷冻非糖面团的长期冷冻储存，可选地进行多次冷冻/解冻循环，优于市售酵母菌株，例如，显示出在-20℃下储存2周后的发酵能力是在-20℃下储存1天后的发酵能力的至少94％，优选地，至少95％，或至少98％，以及在-20℃下储存2周并进行冷冻/解冻循环后的发酵能力是在-20℃下储存1天后的发酵能力的至少65％，优选地至少70％或至少75％。此外，新的酵母菌株优选地表现出预醒发的冷冻非糖面团在-20℃下储存4周后的发酵能力是在-20℃下储存1天后的发酵能力的至少70％，优选地80％，或至少90％。所述菌株也优选地表现出预醒发的冷冻非糖面团在-20℃下储存12周后的发酵能力是在-20℃下储存1天后的发酵能力的至少70％，优选地至少75％，或至少80％；以及在-20℃下储存20周后的发酵能力是在-20℃下储存1天后的发酵能力的至少55％，优选地60％，或至少65％。

4.3 1％糖，预醒发的冷冻面团：

使用亮白小麦粉，将实施例3中获得的酵母培养物和商业酵母产品用于制备含有约1％(面粉重量％)糖、2％(面粉重量％)盐、5％(面粉重量％)酵母(30％固体)、1％(面粉重量％)菜籽油、56％(面粉重量％)水的少糖面团。

制备面团，分成多个70g部分，模制，在室温下醒发40分钟，然后置于-20℃冷冻机中。将冷冻的预醒发的面团样品转移到聚乙烯袋中，然后在-20℃的冷冻机中储存长达8周的一段时间。制备后第一天、4周和8周，将面团样品在32℃，约75％相对湿度下解冻30-35分钟，并使用ANKOM^RF气体生产测量系统在37℃下温育90分钟期间测试CO₂释放。进行测量，并测量在-20℃下储存1天后、4周后和8周后产生的总气体体积。为了测试经受多次冷冻/解冻循环的能力，在平行实验中，在储存的前2周期间进行10次解冻/冷冻循环，其中对于一次解冻/冷冻循环，将面团转移至25℃，持续30分钟并返回至-20℃，持续至少两个小时。表15A显示了获得的结果。

表15A：使用5％酵母(30％固体)，1％糖预醒发面团冷冻1天、4周和8周后发酵能力的持久性

在一个替代的试验中，使用亮白小麦粉，将实施例3中获得的酵母培养物和商业酵母产品用于制备含有约1％(面粉重量％)糖、2％(面粉重量％)盐、7％(面粉重量％)酵母(30％固体)、1％(面粉重量％)黄油、56％(面粉重量％)水的少糖面团。

制备面团，分成多个70g部分，模制，在醒发室中在35℃下醒发10分钟并在室温下醒发10分钟，然后置于鼓风冷冻机中。将冷冻的预醒发的面团样品转移到聚乙烯袋中，然后在-20℃的冷冻机中储存长达4周的一段时间。制备后第一天和4周，将面团样品在32℃，约75％相对湿度下解冻30-35分钟，并使用ANKOM^RF气体生产测量系统在37℃下温育60分钟期间测试CO₂释放。进行测量，并测量在-20℃下储存1天后和4周后产生的总气体体积。为了测试经受多次冷冻/解冻循环的能力，在平行实验中，在储存的前2周期间进行10次解冻/冷冻循环，其中对于一次解冻/冷冻循环，将面团转移至25℃，持续30分钟并返回至-20℃，持续至少两个小时。表15B显示了获得的结果。

表15B：使用7％酵母(30％固体)，1％糖预醒发面团冷冻1天和4周后发酵能力的持久性

该实验表明，本发明的新的酵母菌株可以有利地耐受1％糖预醒发的冷冻面团的长期冷冻储存，可选地进行多次冷冻/解冻循环，优于市售酵母菌株，例如，显示出在-20℃下储存4周并进行冷冻/解冻循环后的发酵能力是在-20℃下储存1天后的发酵能力的至少80％，优选地至少90％、至少95％。

4.4预醒发的小面包6％糖冷冻面团

使用亮白小麦粉，将实施例3中获得的酵母培养物和商业酵母产品用于制备含有约6％(面粉重量％)糖、1.5％(面粉重量％)盐、3.5％(面粉重量％)酵母(30％固体)、5％(面粉重量％)脂肪、52％(面粉重量％)水的高糖面团。

制备面团，分成多个75g部分，模制并在醒发室中在35℃下醒发25分钟并在20℃室温下醒发25分钟，然后使用鼓风冷冻机冷冻至-20℃，转移到聚乙烯袋中，然后在-20℃冷冻机中储存长达8周的一段时间。制备后第一天、2周、4周和8周，将面团样品在25℃下解冻20-30分钟，并使用ANKOM^RF气体生产测量系统在37℃下温育90分钟期间测试CO₂释放。进行测量，并测量在-20℃下储存1天后、2周、4周和8周后新鲜面团的总气体体积。表16显示了获得的结果。

表16：6％糖预醒发的小面包冷冻2周、4周和8周后发酵能力的持久性

4.5 15％糖冷冻面团：

4.5.1使用亮白小麦粉，将实施例3中获得的酵母培养物用于制备含有约5％(面粉重量％)糖、1.5％(面粉重量％)盐、6％(面粉重量％)酵母(30％固体)、50％(面粉重量％)水的高糖面团。

制备面团，分成多个50g部分并模制，测试少量新鲜面团单元的CO₂释放，并使用鼓风冷冻机将其他单元冷冻至-20℃，转移到聚乙烯袋中，然后在-20℃冷冻机中储存长达12周的一段时间。制备后第一天、2周、8周和12周，将面团样品在25℃下解冻20-30分钟，并使用ANKOM^RF气体生产测量系统在37℃下温育60分钟期间测试CO₂释放。进行测量，并测量在-20℃下储存1天后、2周、8周和12周后新鲜面团的总气体体积。为了测试经受多次冷冻/解冻循环的能力，在平行实验中，在储存的前2周期间进行10次解冻/冷冻循环，其中对于一次冷冻/解冻循环，将面团转移至25℃，持续30分钟并返回至-20℃，持续至少两个小时。表17A显示了获得的结果。

表17A：使用6％酵母(30％固体)，15％糖面团冷冻2周、8周和12周后发酵能力的持久性

4.5.2在一个替代的设置中，使用亮白小麦粉，将实施例3中获得的酵母培养物和商业酵母产品用于制备含有约15％(面粉重量％)糖、2.5％(面粉重量％)盐、7％(面粉重量％)酵母(30％固体)、6％(面粉重量％)蛋、14％(面粉重量％)脂肪、25％(面粉重量％)水和25％(面粉重量％)牛奶的高糖面团。

制备面团，在室温下静置20分钟，分成多个50g部分，模制并在-20℃冷冻机中温育2小时，转移到聚乙烯袋中，然后在-20℃冷冻机中储存长达20周的一段时间。制备后第一天、2周、11周和20周，将面团样品在25℃下解冻20-30分钟，并使用ANKOM^RF气体生产测量系统在37℃下温育90分钟期间测试CO₂释放。进行测量，并测量在-20℃下储存1天、2周、11周和20周的总气体体积。表17B显示了获得的结果。

表17B：使用7％酵母(30％固体)，15％糖面团冷冻2周、11周和20周后发酵能力的持久性

该实验表明，本发明的新的酵母菌株可以有利地耐受高糖含量(例如，15％糖)冷冻面团的长期冷冻储存，可选地进行多次冷冻/解冻循环，优于市售酵母菌株，例如，显示出在-20℃下储存2周后的发酵能力是在-20℃下储存1天后的发酵能力的至少80％，优选地，至少90％，或至少95％，在-20℃下储存2周并进行冷冻/解冻循环后的发酵能力是在-20℃下储存1天后的发酵能力的至少70％，优选地至少75％或至少80％，在-20℃下储存8周并进行冷冻/解冻循环后的发酵能力是在-20℃下储存1天后的发酵能力的至少65％，优选地至少70％或至少75％或在-20℃下储存12周并进行冷冻/解冻循环后的发酵能力是在-20℃下储存1天后的发酵能力的至少60％，优选地至少63％或至少65％。此外，新的酵母菌株优选地表现出冷冻的15％糖面团在-20℃下储存11周后的发酵能力是在-20℃下储存1天后的发酵能力的至少68％，优选地72％，优选地78％或至少82％。所述菌株也优选地表现出冷冻的15％糖面团在-20℃下储存20周后的发酵能力是在-20℃下储存1天后的发酵能力的至少50％，优选地至少55％、至少60％或至少63％。

实施例5-发酵性能的评分

5.1将酵母培养物在振荡培养箱中在5mL YPD底物上在30℃和200rpm下繁殖15小时，收集并悬浮在新鲜的YPD培养基中至浓度为5 OD₆₀₀。将50ml离心管(PP,Miniplast,EinShemer)中的5mL酵母悬浮液在-18℃下冷冻3天，在室温下解冻20分钟并测试它们在液体面粉悬浮液(LFS)中的发酵能力。使用离心，在4℃和1300g下将酵母样品用蒸馏水洗涤两次，持续8分钟。将培养物悬浮于10mL少(即非糖)LFS(7.2g水、0.23g盐、2.57g亮白小麦粉)中，并在振荡培养箱中于37℃和100rpm温育。每30分钟(可选地)评估LFS样品。而在90分钟后给出最终等级。酵母发酵性能根据以下分数从0到5分级：根据4个参数评分等级：时间(1个点)，气泡松散到水相中(1个点)，面粉沉积物内的孔(1.5个点)和在水相顶部发泡(1.5个点)。

时间：在温育30分钟后开始发酵的酵母菌株得1个点，而在60分钟后开始发酵的酵母菌株得0.5个点，并且在90分钟后延迟开始的酵母菌株不得到任何点。通过目视检查面粉沉积物和孔的存在来确定发酵开始。

气泡：液相中没有出现气泡的样品不得任何点，具有少量气泡的样品(即，每5-10秒一个气泡释放到液相中)得0.5个点，而具有大量气泡的LFS(每2-5秒至少一个气泡释放到液相中)得1个点。

孔：固相中没有孔的LFS样品不得点。具有小孔(直径小于1.5mm)的LFS得0.5个点，具有大孔(直径1.5-2.5mm)的LFS得1个点。具有大连接孔(直径大于5mm)的LFS得1.5个点。

泡沫：在液相顶部没有泡沫的LFS样品不得任何点。具有低于3mm的薄泡沫层的LFS得0.5个点，具有厚泡沫层(3-5mm)的LFS得1个点并且具有厚于5mm的泡沫层的LFS得1.5个点。

结果显示在表18中。

表18：新的改良酵母的发酵性能分数

5.2在替代设置中，将酵母细胞在振荡培养箱中在50mL YPD底物上在30℃和200rpm下繁殖18-24小时，收集并使用离心，在4℃和1300g下用冷蒸馏水洗涤两次，持续8分钟。测量洗涤的培养物的密度，并将约32 OD₆₀₀的细胞部分悬浮于10ml LFS中(如5.1中所述)。对于每种酵母培养物，立即测试一种LFS样品，将另一种样品在-20℃下温育2-3天，在室温下解冻45分钟，涡旋并测试酵母发酵LFS的能力以评估发酵性能。将LFS样品在振荡培养箱中在37℃和100rpm下温育1小时。基于以下四个参数，酵母发酵性能根据以下分数从0到9分级：气泡释放到水相中(1.5个点)，面粉沉积物内的孔和海绵面团外观(4个点)，在水相顶部发泡(1.5个点)和相分离(2个点)。

气泡：液相中没有出现气泡的样品不得任何点，具有少量气泡的样品(没有气泡释放到液相中，然而，在水相顶部检测到少量气泡)得0.5个点，具有中等数量气泡的样品(即，每5秒释放一个气泡)得1个点，而具有大量气泡的LFS(每5秒至少两个气泡释放到液相中)得1.5个点。

孔：固相中没有孔的LFS样品不得点。具有少量小孔(直径小于1.5mm)的LFS得0.5个点，大量小孔-1个点，具有少量大孔(直径1.5-2.5mm)的LFS得1.5个点，大量大孔-2个点。具有不超过25％LFS的海绵面团外观(直径大于5mm的连通孔)的LFS得2.5个点。在受限区内具有海绵面团外观的LFS得3个点。具有中等海绵(培养基显示的海绵外观的约一半)的LFS-得3.5个点。完全海绵状LFS样品-得4个点。泡沫：在液相顶部没有泡沫的LFS样品不得任何点。具有～1mm的薄泡沫层的LFS得0.5个点，具有中等泡沫层(1-3mm)的LFS得1个点并且具有厚于3mm的厚泡沫层的LFS得1.5个点。

相分离：相分离是除了固相和液相之外，气泡和液体面团块形成第三层的情况。显示第三层厚度小于0.5cm的相分离的样品得1个点，显示第三层厚度在0.5与1cm之间的相分离的样品得1.5个点，显示第三层厚度大于1cm的相分离的样品得2个点。

结果显示在表19中。

表19：新的改良酵母的发酵性能分数

实施例6-酵母存活试验

将酿酒酵母菌株OL-01、S3-02、FL-03、IS-310、CC-05、KF-06、用于冷冻面团的商业烘焙酵母菌株和抗冷冻菌株FTY-3(FERM BP 2363(US 5,352,606 B l))在YPD培养基上生长，收集并再悬浮在新鲜的YPD培养基中至浓度为5 OD₆₀₀。从每种酵母悬浮液中提取样品并立即接种在YPD琼脂平板上以确定最初的菌落数。将50mL离心管(PP，例如，来自Miniplast，EinShemer)中的5mL酵母悬浮液在-20℃下温育48-72小时，然后进行四次冷冻/解冻循环(在30℃下至少1.5小时/在-20℃下至少1小时)。使用将酵母悬浮液的十倍稀释液接种在YPD琼脂平板上并在30℃下温育48小时来测量活酵母计数。

如下确定存活率：

存活率＝酵母菌落的最终数量/酵母菌落的初始数量×100％

结果显示在图1A和图1B中。

实施例7-冷冻面团的烘焙试验

7.1.小面包体积：

在进行冷冻和解冻循环下，在-20℃下储存1天后和在-20℃下储存4周后(如实施例4.1中所述)，如实施例4.1.1中获得的非糖面团样品(50g)在25℃下解冻20-30分钟，并在相对湿度高于85％的醒发室中在35℃下醒发70分钟，然后在小面包盘中在195℃下烘焙7-8分钟。根据用于使用罂粟籽测量不规则固体体积(食物的物理性质,Serpil Sahin,ServetSumnu,第20页)的固体置换法，在冷却至室温后测量小面包的表观体积。结果显示在图2中。

7.2.预醒发的小面包体积：

在-20℃下储存1天后和在-20℃下储存4周后如实施例4.2中获得非糖面团样品(50-80g)，根据以下烘焙程序，直接烘焙冷冻的预醒发的小面包，没有解冻阶段：

温度	汽蒸	时间
			90℃	+	4min
110℃	+	6min
			190℃	-	11min
185℃	-	4min

根据用于使用罂粟籽测量不规则固体体积(食物的物理性质,Serpil Sahin,ServetSumnu,第20页)的固体置换法，在冷却至室温后测量小面包的表观体积。结果显示在图3中。

7.3.小面包醒发时间：

将在-20℃下储存4周后，可选地进行冷冻和解冻循环(如实施例4.1中所述)，如实施例4.1中获得的非糖面团样品(50g)在25℃下解冻20-30分钟并在35℃的醒发室中进行醒发，直到它们在最大尺寸为5.8×8.6×4.5W×L×H[cm³]的透明塑料盒中达到3.5cm的预定高度，持续120分钟。结果显示在表20中。

表20A：冷冻4周后和在进行冷冻和解冻循环下冷冻4周后的醒发时间

在替代设置中，将在-20℃下储存24周后如实施例4.1中获得的非糖面团样品(50g)在25℃下解冻20-30分钟并在35℃的醒发室中进行醒发，直到它们在最大尺寸为5.8×8.6×4.5W×L×H[cm³]的透明塑料盒中达到3.5cm的预定高度，持续120分钟。结果显示在表20B中。

表20B：冷冻24周后的醒发时间

上述烘焙数据增强了先前实施例中呈现的数据，即本发明的新的酵母菌株可以有利地耐受长期冷冻储存，可选地进行多次冷冻/解冻循环，优于市售酵母菌株，例如，与以上给出的商业酵母菌株相比，显示出在进行冷冻/解冻循环下在-20℃下储存4周后最小的小面包体积减少率，以及在-20℃储存4周后和在进行冷冻/解冻循环下在-20℃储存4周后最短的醒发时间。

实施例8

分析产生的酵母菌株的基因组标志物。使用Nextera XT试剂盒(Illumina,SanDiego,CA)根据制造商的说明制备基因组DNA用于测序。处理后，使用Agilent TapeStation2000自动电泳装置(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)评估文库的大小，并使用Qubit fluorometer(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA)评估浓度。以等摩尔比汇集DNA文库，使用Illumina NextSeq500测序仪，通过双端2x150碱基读数进行测序。将新的基因组的原始读数映射到S288C酵母参考基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/15？genome_assembly_id＝22535)。使用至少250x的覆盖率进行生物信息学分析提供至少1000bp长的重叠群。基于覆盖率对每个基因组单独评估拷贝数变异，从全基因组中值寻找大规模波动。评估新的菌株基因组的缺失区域。

发现新的菌株CC-05、KF-06和OL-01的特征在于所有等位基因中来自相同基因的基因组DNA片段的突变，通常是缺失，如下所述和/或在于所有等位基因中相同基因的失活。相反，在用于酵母属基因组数据库的系统测序项目中的酵母菌株S288C中，在所述基因中没有缺失或失活突变。本文提及的所有突变或修饰涉及与S288C的比较。

·位于染色体IV的名为COS7的基因YDL248W在位置2232的下游部分缺失(缺失长度为至少150bp)；

·位于染色体X的名为AAD10的基因YJR155W在位置727404的下游部分缺失(总缺失长度为至少360bp)；

·位于染色体IV的名为HXT15的基因YDL245C在所有等位基因中位置11657的下游部分缺失(总缺失长度为至少400bp)；

·位于染色体X的名为DAN4的基因YJR151C包括导致两个终止密码子的突变，位于氨基酸位置342(将丝氨酸交换为终止密码子)和氨基酸位置53(将酪氨酸交换为终止密码子)，

和至少部分缺失和/或基因组重排，例如，染色体X的坐标之间：714,902-715,267(这些是参考菌株S288C中的坐标)；

·位于染色体IV的基因YDR420W含有许多导致氨基酸交换的单突变，例如位置1308583和位置1308589处的突变，其导致丝氨酸与脯氨酸的交换和位置1308951和位置1309390处的突变，其导致苯丙氨酸交换为亮氨酸。

实施例9

本发明的优选酵母菌株，例如CC-05和KF-06菌株，可以是表征为包含所有下面三个DNA区段，如表21中详述，在至多三个，优选地至多一个碱基对中在等位基因之间具有可选的变异。序列通过使用聚合酶链式反应(PCR)然后进行Sanger测序获得。Sanger测序在3730x1毛细管电泳装置(Applied Biosystems,ThermoFisher Scientific)上使用Big-Dye终止子测序进行。PCR基于如下公开的设计用于扩增所述基因组DNA片段的特异性引物的扩增进行。表21显示了染色体和位置，使用的独特引物组以及CC-05和KF-06中存在的三个扩增的基因组DNA片段。所述菌株的所有等位基因含有表21的序列，在一个碱基对中具有可选的变化，其中所述变化优选地仅在一个基因的一个等位基因中。

表21：来自CC-05和KF-06菌株的基因组的PCR扩增子的PCR结果

从酵母中制备DNA后，使用标准方案(DreamTaq Green PCR Master Mix(2X)，ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)，利用1.4ng DNA在以下条件下进行PCR：95℃初始变性，持续5分钟，然后进行30个循环的95℃变性，持续30秒，55℃或60℃退火，持续45秒，和72℃伸长，持续1分钟。

序列表

<110> 纳斯特姆科技有限公司（NextFerm Technologies Ltd.）

<120> 抗冷冻酵母及其用途

<130> NXF16268PCT

<160> 9

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 1

ctgtatggtt cgccgtttat 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 2

ggtaatctgt gggatgtaac tg 22

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 3

attgcctctc agtatcgt 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 4

cacaaatctt ccaaaccac 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 5

cgctgtagca aagcaaaaag 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 6

gcaatgaccg taggagtga 19

<210> 7

<211> 604

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<400> 7

ctgtatggtt cgccgtttat tttctaagca ccgtttttta ttcatatttt tataatgcaa 60

ctcctataga atatagatgt ttcgtgtttt taattcctgc tatgactttg tgtcaatggt 120

atgtgaacta acaactgtgt ggtagtttgg gatggtacgt aaaggtgttc gtgattatat 180

aagcaatctt aaaatatttg tatcgcacca tgaggtgccc aataatgaaa tgaaaattac 240

tattatgaac tatactaaaa agatgaaact tttttatcaa tcccaggttc ttttacttat 300

tatttttgga tataagaaca aaatcggatt tcccatgctt tttctcaatg tctatatgaa 360

atcttttcga aacagccagt acatgtaaca attatgatac gaacttgatc ggtaacccat 420

aaataacagg agctgcgccg ttcaagtaac gtagatggca tacacctcta gatttagaga 480

cggcatatga aacagatagg ctattaccat tcaaatcgtc agtattacag cgaaatccca 540

tcttttcaaa aagttcctcg ctaaatttat caatatcttt gtcagttaca tcccacagat 600

tacc 604

<210> 8

<211> 372

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<400> 8

attgcctctc agtatcgtaa ttctatgtgg gtatctgact ttcatggcaa ctaggtaaga 60

tacagtttca acagaataat atcctctatc cacgtaatca cccatgaaaa ggtaattggt 120

gtcaggacaa ggaccaccaa tcttgaaaag ttctaacaag tcatggaatt gaccgtgtac 180

gtcaccacaa atagtaacag gcacattaat tggtttaaca ttttcctcga actgcaacac 240

gtccaccgcc attttacata gtcgtgctac atcgtcttct gatagtggct cgcatttact 300

caaatgctca atccattggt caagctgatt tatatttgtg ttattcagtt ctagtggttt 360

ggaagatttg tg 372

<210> 9

<211> 616

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<400> 9

cgctgtagca aagcaaaaag tttctgattc aaaataagtc acctactctt agcgcatttt 60

tattgtatat aaaggcattt aatgtaattt atagagcatt ataaatcgta acaactactg 120

cagtatgagt ttcatgaatt catttctcga tatcttatga atatacacag gtatatatgt 180

atattcatgt taaacgcctt tcgaattgtt cgttggcttt ttttgtgaaa ttatctcggg 240

aaaagggcga aattatatcg ttttgccgtt gatattttga aaaggaataa aagatcatga 300

aaaaaataag aaaggcaatt cgacgcattt ctctcagcaa gctattcttt acttttgaag 360

aataaaatat ttgagtaaaa aggttaagac aatatagtcg gaagcagttc tgcgggatct 420

gaaggaattg cggaataatg agatttcacg atagtatact tatcttcttt tctttggcat 480

cgctttatca acatgttcat ggtgcaagac aagtcgttcg tccaaaggag aaaatgacta 540

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Claims

1.一种烘焙酵母菌株，其是从以下各项可获得的：以NCYC 4095保藏的菌株OL-01、以NCYC 4094保藏的菌株S3-02、以NCYC 4105保藏的菌株FL-03、以NCYC 4106保藏的菌株IS-310、以NCYC 4128保藏的菌株CC-05和以NCYC-4129保藏的菌株KF-06。

2.根据权利要求1所述的烘焙酵母菌株，其中所述菌株是通过选自由以NCYC 4095保藏的OL-01、以NCYC 4094保藏的S3-02、以NCYC 4105保藏的FL-03、以NCYC 4106保藏的IS-310、以NCYC 4128保藏的CC-05和以NCYC-4129保藏的KF-06组成的群组的第一菌株与选自由以NCYC 4095保藏的OL-01、以NCYC 4094保藏的S3-02、以NCYC 4105保藏的FL-03、以NCYC4106保藏的IS-310、以NCYC 4128保藏的CC-05和以NCYC-4129保藏的KF-06组成的群组的第二酿酒酵母菌株之间的育种可获得的。

3.一种烘焙酵母菌株，其中所述菌株是以NCYC 4095保藏的OL-01、以NCYC 4094保藏的S3-02、以NCYC 4105保藏的FL-03、以NCYC 4106保藏的IS-310、以NCYC 4128保藏的CC-05或以NCYC-4129保藏的KF-06，优选地是CC-05。

4.一种烘焙酵母菌株，其中所述菌株包含选自由以下组成的群组的至少两种基因的所有等位基因中的突变：

a)位于染色体IV的名为COS7的基因YDL248W，其中所述突变优选地是缺失，更优选地在位置2232的下游缺失；

b)位于染色体X的名为AAD10的基因YJR155W，其中所述突变优选地是缺失，更优选地在位置727404的下游缺失；

c)位于染色体IV的名为HXT15的基因YDL245C，其中所述突变优选地是缺失，更优选地在位置11657的下游缺失；

d)位于染色体X的名为DAN4的基因YJR151C，其中所述突变优选地是引入至少一个终止密码子，优选地位于氨基酸位置342和/或氨基酸位置53处和/或至少部分缺失和/或基因组重排，例如，染色体X的坐标之间：714,902-715,267；以及

e)位于染色体IV的名为HKR1的基因YDR420W，其中所述突变优选地为导致氨基酸交换的至少一个点突变，其中所述突变优选地选自包括位置1308583和位置1308589处的突变的群组的至少一个，优选地所有，其导致从丝氨酸到脯氨酸的交换和/或位置1308951和位置1309390处的突变，其导致从苯丙氨酸到亮氨酸的交换。

5.一种烘焙酵母菌株，其包含选自由以下组成的群组的至少两种序列：

ii)SEQ ID NO:8或包含至多三个、优选地至多两个或至多一个其碱基对的变化的序列变体，其中所述序列或所述序列变体中的一种存在于每个等位基因中，以及

其中优选地，所述菌种包含所述序列的全部三种。

6.根据权利要求4或5中任一项所述的烘焙酵母菌株，其中所述酵母菌株是权利要求1-3中任一项所述的酵母菌株，其中优选地，所述酵母菌株在所有等位基因中包含所有引述的突变和/或序列。

7.一种烘焙酵母菌株，其中所述菌株能够以至少1％的存活率存活，其中方案为

a)将所述酵母菌株在YPD培养基上在振荡培养箱中在30℃和200rpm下生长15小时，

b)收集所述酵母并再悬浮于新鲜YPD培养基中至浓度为5OD₆₀₀，

c)将50mL试管中的5mL酵母悬浮液在-20℃下温育48-72小时，

d)然后进行四次冷冻/解冻循环，每次冷冻/解冻循环包括在30℃和200rpm下1.5小时，在-20℃下1小时，

其中所述存活率被测定为在所述冷冻/解冻循环后存活的酵母菌落数/在所述冷冻/解冻循环前存活的酵母菌落数×100％，并且其中存活的酵母菌落数是使用将酵母悬浮液的十倍稀释液接种在YPD琼脂平板上并在30℃下温育48小时来测量的。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的烘焙酵母菌株，其是权利要求7所述的菌株。

9.根据前述权利要求中任一项所述的烘焙酵母菌株，其中所述菌株显示出用所述酵母菌株制备的面团在-20℃下储存4周后的发酵能力是所述面团在-20℃下储存1天后其发酵能力的至少90％，

其中，可选地，所述菌株显示出用所述酵母菌株制备的面团在-20℃下储存4周后并在储存的前2周期间进行10次冷冻/解冻循环的发酵能力是所述面团在-20℃下储存1天后其发酵能力的至少73％，其中对于一次冷冻/解冻循环，将面团转移至25℃(例如，持续30分钟)并返回至-20℃(例如，持续至少2小时)。

10.一种酵母产品，其包含前述权利要求中任一项所述的烘焙酵母菌株的酵母，其中所述酵母产品选自包括膏状酵母、压缩酵母、碎酵母、半活性干酵母、即用干酵母、活性干酵母和冷冻酵母的群组。

11.根据权利要求10所述的酵母产品，其中所述酵母产品是冷冻酵母，可选地，具有70-80重量％干物质的冷冻活性半干酵母产品。

12.一种面团或面团产品，包含前述权利要求中任一项所述的烘焙酵母菌株或酵母产品。

13.根据权利要求12所述的面团或面团产品，其是冷冻的。

14.根据权利要求12所述的面团产品，其中所述面团产品是从权利要求13所述的冷冻面团产品获得的烘焙面团产品。

15.根据权利要求12至14中任一项所述的面团或面团产品，其中所述面团或面团产品选自包括以下各项的群组：面包面团、面包卷面团、披萨面团、椒盐卷饼面团、百吉饼面团、蛋糕面团、羊角面包面团、面包、面包卷、披萨、羊角面包、椒盐卷饼、百吉饼和蛋糕。

16.根据权利要求12至15中任一项所述的面团或面团产品，其中所述面团或面团产品选自包括非糖面团、少糖面团(1-10％糖)和高糖面团(超过10％糖)的群组，其中所述面团优选地是高糖面团。

17.一种制备权利要求12至16中任一项所述的面团或面团产品的方法，包括以下步骤

a)将权利要求1-9中任一项所述的烘焙酵母菌株或权利要求10至11中任一项所述的酵母产品与选自包括面粉和液体的群体的至少一种成分混合，

所述方法可选地包括选自包括以下的群组的一个或多个其他步骤

b)形成所述面团；

c)醒发所述面团；

d)冷冻所述面团；

e)解冻所述面团；和/或

f)烘焙所述面团。

18.根据权利要求1至9中任一项所述的烘焙酵母菌株或根据权利要求10至11中任一项所述的酵母产品用于制备面团或面团产品的用途，其中所述面团可选地被冷冻。

19.一种生产酵母产品的方法，其包括培养根据权利要求1至9中任一项所述的烘焙酵母菌株，以及可选地冷冻所述酵母。