CN109358151A - 一种l-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺杂质的薄层色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种L‑2‑氨基‑5‑胍基戊酸原料中1,4‑丁二胺杂质的薄层色谱检测方法，包括溶液的制备、衍生化处理及测定和结果判定；其中，溶液的制备包括1,4‑丁二胺对照品溶液的制备、铵离子对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、丹磺酰氯衍生化试液的制备；衍生化处理及测定和结果判定包括丹磺酰氯衍生化、待测溶液的制备、待测溶液的薄层色谱检测、紫外光灯下检视、测定结果判定。本发明具有检测灵敏度高、检测时间短、检测成本低、操作简单、设备简单、显色容易、结果直观可靠等优点，适合工业上用于L‑2‑氨基‑5‑胍基戊酸原料中1,4‑丁二胺杂质的检测及质量控制，从而为合理的质量标准制定提供依据，以便更好控制和掌握产品质量，确保临床用药的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及食品和药物分析技术领域，特别的涉及L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺杂质的薄层色谱检测方法。
背景技术
L-2-氨基-5-胍基戊酸（CAS登录号为74-79-3）属于氨基酸类化合物，具有重要的生理功能，常作为营养补充剂，也是氨基酸胶囊和输液的重要成分。L-2-氨基-5-胍基戊酸可有效提高免疫力、促进免疫系统分泌内生性物质，有利于对抗癌细胞及预防病毒感染；可用于严重外伤、烧伤等需要大量组织修护患者的康护；另外，临床上，L-2-氨基-5-胍基戊酸适用于血氨增高的肝昏迷，特别是伴有碱中毒的患者；用于辅助测定脑垂体功能；用于精液分泌不足和精子缺乏引起的男性不育症；用于婴幼儿补充L-2-氨基-5-胍基戊酸缺乏，具有广泛的应用前景。
目前，L-2-氨基-5-胍基戊酸的合成主要采用微生物发酵法，1,4-丁二胺杂质是微生物的代谢产物之一，是L-2-氨基-5-胍基戊酸原料的主要胺类杂质。1，4-丁二胺为无色结晶，有六氢吡啶气味，因其具有一定的毒性，会对眼睛、上呼吸道和皮肤有刺激作用，接触后可引起头痛、面部皮肤发红，还能引起动物血压降低等现象，与氧化剂能发生强烈反应，具有腐蚀性。但目前L-2-氨基-5-胍基戊酸原料的质量标准中对于1,4-丁二胺尚无相关记载，不利于控制其质量，为保证临床使用安全、有效和稳定，非常有必要对L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的1,4-丁二胺杂质建立一种简便、快速、有效的检测方法。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺杂质的薄层色谱检测方法，为L-2-氨基-5-胍基戊酸原料的质量标准制定提供依据，以便更好控制产品质量，确保食用和药用安全。
实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：一种L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺杂质的薄层色谱检测方法，包括以下步骤：溶液的制备、衍生化处理及测定和结果判定；
其中，溶液的制备包括1,4-丁二胺对照品溶液的制备、铵离子对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、丹磺酰氯衍生化试液的制备；衍生化处理及测定和结果判定包括丹磺酰氯衍生化、待测溶液的制备、待测溶液的薄层色谱检测、紫外光灯下检视、测定结果判定；
所述1,4-丁二胺对照品溶液中1,4-丁二胺的浓度与供试品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度之比为1 : 1×105～1×107。
进一步，所述薄层色谱检测采用硅胶G薄层板，展开剂为三氯甲烷和三乙胺的混合溶液或三氯甲烷和二乙胺的混合溶液。所述1,4-丁二胺对照品溶液、铵离子对照品溶液和供试品溶液的溶剂为水；所述丹磺酰氯衍生化试液的溶剂为丙酮；所述待测溶液为1,4-丁二胺对照品溶液或铵离子对照品溶液或供试品溶液经丹磺酰氯衍生化，加入饱和氯化钠溶液终止反应后，加入正己烷萃取后获得的上层有机相溶液。
进一步，所述丹磺酰氯衍生化需要加入饱和碳酸氢钠溶液，衍生化体系中1,4-丁二胺对照品溶液或铵离子对照品溶液或供试品溶液和饱和碳酸氢钠溶液和丹磺酰氯衍生化试液的体积比为1:1:2；所述丹磺酰氯衍生化的温度为55～65℃，时间为15～45min；所述丹磺酰氯衍生化需要加入饱和氯化钠溶液终止反应，其添加体积为丹磺酰氯衍生化试液体积的四分之一；所述待测溶液制备过程中正己烷添加体积为丹磺酰氯衍生化试液体积的二分之一。
进一步，所述铵离子对照品溶液由含铵离子的各种铵盐的单一化合物或混合物加水溶解并稀释配制而成；所述铵离子对照品溶液的铵离子浓度为0.05～50μg/mL；所述衍生化试液的丹磺酰氯浓度为1.0～10.0mg/mL。
进一步，所述L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺杂质的薄层色谱检测方法，包括如下步骤：
1）溶液的配制：
（1）1,4-丁二胺对照品溶液的制备：精密称取1,4-丁二胺对照品，加水溶解并稀释配制成浓度为0.1μg/mL的溶液，作为1,4-丁二胺对照品溶液；
（2）铵离子对照品溶液：精密称取含铵离子化合物对照品，加水溶解并稀释配制成浓度为0.5μg/mL的溶液，作为铵离子对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸待测样品，加水溶解并稀释配制成浓度为100mg/mL的溶液，作为供试品溶液；
（4）衍生化试液的制备：称取丹磺酰氯适量，加丙酮溶解并稀释制成每1mL约含5mg的溶液，作为衍生化试液；
2）衍生化处理及测定：分别取1mL步骤1）制备的各溶液于不同10mL塑料离心管中，加入1mL饱和NaHCO3溶液，再加入5.0mg/mL丹磺酰氯衍生化试剂2mL，混匀1min，置于黑暗60℃恒温水浴锅中衍生30min，取出；室温放置几分钟，加0.5mL饱和NaCl溶液，然后加1mL正己烷，充分混合旋5min，待分层后取20μL上层有机相点样于同一硅胶G薄层板上；再将点样的薄层板置于层析缸中，以氯仿和三乙胺体积比为16:4的混合溶液为展开剂，展开约10cm后，干燥，于365nm波长下检视；
3）结果判定：
①系统适用性试验：如果铵离子对照品溶液的薄层色谱图中显示一个清晰的斑点，1,4-丁二胺对照品溶液的薄层色谱图中显示两个完全分离的清晰斑点，并且其后斑点的位置应与铵离子对照品溶液的斑点相同，则系统适用性试验符合要求；否则系统适用性试验不符合要求；
②样品检测：如果供试品溶液的薄层色谱图中显示1,4-丁二胺斑点，若其荧光强度浅于1,4-丁二胺对照品溶液的前斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺的含量低于十万分之一；若其荧光强度深于1,4-丁二胺对照品溶液的前斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺的含量高于十万分之一。
一种L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺杂质的薄层色谱检测方法，包括以下步骤：制备1,4-丁二胺对照品溶液、铵离子对照品溶液和供试品溶液，对所述1,4-丁二胺对照品溶液、铵离子对照品溶液和供试品溶液进行衍生化处理，然后将其进行薄层色谱检测，并在紫外灯下进行检视和分析；所述1,4-丁二胺对照品溶液的浓度与供试品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度比为1:1×105～1×107；具体包括以下步骤：
1）对照品溶液的制备：称取1,4-丁二胺和铵盐，分别加水溶解得到1,4-丁二胺对照品溶液和铵离子对照品溶液；
2）供试品溶液的制备：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸待测样品，加水溶解得到供试品溶液；
3）衍生化处理：向所述的1,4-丁二胺对照品溶液、铵离子对照品溶液和供试品溶液中分别加入饱和碳酸氢钠溶液使其呈碱性，再加入丹磺酰氯衍生化试液在涡流混合器上涡旋混匀后，然后将其恒温水浴中避光衍生；
4）待测溶液的制备和测定：取步骤3）衍生结束后的反应液，冷却至室温，向反应液中分别加入饱和氯化钠溶液终止反应，然后加入正己烷，涡旋振荡，静置分层，吸取上层有机相，即得到待测溶液；取待测溶液分别点样于同一硅胶薄层色谱板上，以三氯甲烷-三乙胺的混合溶液或三氯甲烷-二乙胺的混合溶液作为展开剂，展开，取出，晾干，置于365nm紫外光灯下检视；
5）结果判定：
系统适用性判定：若铵离子对照品溶液的薄层色谱图中显示一个清晰的斑点，1,4-丁二胺对照品溶液的薄层色谱图中显示两个完全分离的清晰斑点，且1,4-丁二胺对照品溶液的后斑点的位置与铵离子对照品溶液的斑点相同，则系统适用性试验符合要求；否则系统适用性试验不符合要求；
样品检测判定：如果供试品溶液的薄层色谱图中显示1,4-丁二胺的斑点，若其荧光强度弱于1,4-丁二胺对照品溶液的前斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸中1,4-丁二胺的含量低于十万分之一；若其荧光强度强于1,4-丁二胺对照品溶液的前斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸中1,4-丁二胺的含量高于十万分之一。
优选的，所述铵离子对照品溶液的铵离子浓度为0.05～50μg/mL。
优选的，所述丹磺酰氯衍生化试液的浓度为1.0～10.0mg/mL；所述1,4-丁二胺对照品溶液的浓度为0.1~0.5μg/mL。
优选的，所述待测溶液的点样量为5～20μL。
优选的，所述1,4-丁二胺对照品溶液或铵离子对照品溶液或供试品溶液与饱和碳酸氢钠溶液和丹磺酰氯衍生化试液的体积比为1:1:2；。
优选的，所述饱和氯化钠溶液、正己烷与丹磺酰氯衍生化试液的体积比为1:2:4。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明最突出的特点之一是解决了丹磺酰氯衍生TLC法测定L-2-氨基-5-胍基戊酸中1,4-丁二胺含量的干扰问题。研究发现，在高浓度L-2-氨基-5-胍基戊酸背景下，丹磺酰氯衍生1,4-丁二胺生成的衍生物斑点荧光强度显著减弱，也就是1,4-丁二胺斑点的荧光强度不能真实反映L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺的含量，为此，本发明选择以低浓度1,4-丁二胺对照品溶液斑点的荧光强度为参照，解决了L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺含量的限度确定问题。
2、本发明最突出的特点之二是解决了丹磺酰氯衍生TLC法测定L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺含量的灵敏度问题。1,4-丁二胺在L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的含量很低，加上L-2-氨基-5-胍基戊酸对荧光强度的猝灭作用，致使该方法的检测灵敏度较低，不能有效控制1,4-丁二胺的含量在安全限度（10mg/kg）以下，为此，本发明通过供试品溶液L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度试验、丹磺酰氯试液浓度试验、点样量试验等方式优化本发明方法，提高了本发明的灵敏度。
3、本发明最突出的特点之三是解决了丹磺酰氯衍生TLC法测定L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺斑点定位问题。L-2-氨基-5-胍基戊酸原料的TLC图谱中呈现出多个荧光斑点造成干扰，所以确定1,4-丁二胺斑点位置较为困难，使得本发明方法准确判定1,4-丁二胺含量具有不确定性。研究发现，L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中存在铵离子（NH4 +）固有荧光斑点，为此，本发明选择以铵离子对照品溶液的荧光斑点位置为参照，解决了L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺斑点定位问题。
4、本发明的检测方法采用低浓度1,4-丁二胺对照品溶液斑点的荧光强度和铵离子对照品溶液的荧光斑点位置同时为参照，大大降低了原料L-2-氨基-5-胍基戊酸的干扰，解决了1,4-丁二胺斑点难定位的问题，其检测灵敏度高达0.001%，即每1kg L-2-氨基-5-胍基戊酸原料含10mg 1,4-丁二胺也能有效检测出，该检验方法具有灵敏度高、检测时间短、检测成本低、操作简单、设备简单、显色容易、结果直观可靠等优点，能有效准确的检测出L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中存在的微量杂质1,4-丁二胺，为L-2-氨基-5-胍基戊酸原料的质量标准制定提供理论指导和技术支持，以便更好控制和掌握产品质量，确保食用和药用安全，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为L-2-氨基-5-胍基戊酸中含有不同浓度的1,4-丁二胺对荧光强度影响的色谱图；
图2为展开剂对分离效果影响的色谱图；
图3为对L-2-氨基-5-胍基戊酸中1,4-丁二胺的检测最低浓度确定的色谱图；
图4为1,4-丁二胺对照品溶液浓度优化的色谱图；
图5为丹磺酰氯试液的浓度对衍生化处理影响的色谱图；
图6为铵离子对照品溶液浓度优化的色谱图；
图7为专属性评价的色谱图；
图8为点样量对荧光强度影响的色谱图；
图9为对不同批次L-2-氨基-5-胍基戊酸原料进行检测结果的色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规方法操作。
本发明检测方法包括如下步骤：
（1）材料准备：①试剂：1,4-丁二胺（纯度98%），L-2-氨基-5-胍基戊酸（纯度99%），丹磺酰氯（纯度大于98%），正己烷、三乙胺、碳酸氢钠、氯化钠、丙酮，均为分析纯；②耗材和装置：硅胶G薄层板、薄层层析缸、硬质中性玻璃管；③仪器：电热恒温干燥箱、紫外灯检测箱。
（2）溶液配制：供试品溶液、1,4-丁二胺对照品溶液、铵离子对照品溶液、饱和碳酸氢钠溶液、丹磺酰氯衍生化试液、饱和氯化钠溶液、展开剂。
（3）衍生化：分别精密量取供试品溶液、1,4-丁二胺对照品溶液、铵离子对照品溶液各适量，与饱和碳酸氢钠溶液和丹磺酰氯衍生化试液混合，涡旋混匀，置60℃恒温水浴中避光衍生，取出，放冷至室温，加入饱和氯化钠溶液终止反应。
（4）待测溶液的制备：分别在供试品溶液、1,4-丁二胺对照品溶液、铵离子对照品溶液的衍生化混合液中加入正己烷，涡旋振荡，静置分层，吸取上层有机相，作为待测溶液。
（5）TLC检测：吸取上述三种待测溶液各适量，分别用硬质中性玻璃管点样于同一硅胶G薄层板上，将点样后的硅胶板放入层析缸中，加入适量展开剂，密闭展开至溶剂前沿接近薄层板上沿，取出晾干，立即置紫外光灯下检视。
（6）结果判定：
①根据系统适用性试验结果判定检测结果的有效性：如果铵离子对照品溶液的薄层色谱图中显示一个清晰的斑点，1,4-丁二胺对照品溶液的薄层色谱图中显示两个完全分离的清晰斑点，并且其后斑点的位置应与铵离子对照品溶液的斑点相同，则系统适用性试验符合要求；否则系统适用性试验不符合要求。
②根据供试品溶液1,4-丁二胺斑点与1,4-丁二胺对照品溶液对应斑点荧光强度的对比来判断待测L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺的含量是否超标：如果供试品溶液的薄层色谱图中显示1,4-丁二胺斑点，若其荧光强度浅于1,4-丁二胺对照品溶液的前斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺含量合格；若其荧光强度深于1,4-丁二胺对照品溶液的前斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺含量超标。
实施例1 不同浓度的1,4-丁二胺对荧光强度影响
1、样品溶液配制：
（1）铵离子对照品溶液：取氨水0.2mL加水至2mL，记为溶液A1；
（2）供试品溶液：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸1.0g三份，分别加入1mL、2mL和3mL浓度0.1mg/mL的1,4-丁二胺溶液，加水定容至10mL，得到1,4-丁二胺浓度分别为0.01mg/mL、0.02mg/mL和0.03mg/mL的L-2-氨基-5-胍基戊酸混合溶液，分别记为溶液B1、溶液C1和溶液D1。
（3）1,4-丁二胺对照品溶液：称取1,4-丁二胺0.1g，加水至10mL，取此溶液1mL，加水至100mL，再取其2mL，加水至10mL，得到浓度为0.02mg/mL的1,4-丁二胺溶液，记为溶液E1。
2、衍生化处理及测定：分别取1mL步骤1制备的各样品溶液于不同10mL塑料离心管中，加入1mL饱和NaHCO3溶液，再加入5.0mg/mL丹磺酰氯衍生化试剂2mL，混匀1min，置于黑暗60℃恒温水浴锅中衍生30min，取出；室温放置几分钟，加0.5mL饱和NaCl溶液，然后加1mL正己烷，充分混合旋5min，待分层后取上层有机相即得到各样品的待测溶液，分别取5μL各待测溶液进行硅胶板点样。再将点样的薄层板置于层析缸中，以氯仿和三乙胺体积比为16:4的混合溶液为展开剂，展开约10cm后，干燥，于365nm波长下检视。
3、结果分析：如图1所示，溶液B1、溶液C1和溶液D1的荧光强度与1,4-丁二胺浓度呈显著线性增加趋势。而溶液C1的荧光强度显著弱于相同1,4-丁二胺浓度的溶液E的荧光强度，这是由于L-2-氨基-5-胍基戊酸的存在会影响1,4-丁二胺衍生的荧光强度。
实施例2 展开剂对分离效果影响
（1）铵离子对照品溶液：取氨水0.1mL加水至10mL，记为溶液A2；
（2）供试品溶液：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸1.0g三份，加入1mL浓度0.01mg/mL的1,4-丁二胺溶液，加水定容至10mL，得到1,4-丁二胺浓度为0.01mg/mL的L-2-氨基-5-胍基戊酸混合溶液，记为溶液B2。
（3）1,4-丁二胺对照品溶液：取0.1mg/mL的1,4-丁二胺溶液1mL，加水至10mL，得到浓度为0.1mg/mL的1,4-丁二胺溶液，记为溶液C2。
2、衍生化处理及测定：分别取1mL步骤1制备的各样品溶液于不同10mL塑料离心管中，加入1mL饱和NaHCO3溶液，再加入5.0mg/mL丹磺酰氯衍生化试剂2mL，混匀1min，置于黑暗60℃恒温水浴锅中衍生30min，取出；室温放置几分钟，加0.5mL饱和NaCl溶液，然后加1mL正己烷，充分混合旋5min，待分层后取上层有机相即得到各样品的待测溶液，分别取5μL各待测溶液进行硅胶板点样。再将点样的薄层板置于层析缸中，以氯仿和二乙胺体积比为16:3的混合溶液为展开剂，展开约10cm后，干燥，于365nm波长下检视。
3、结果分析：如图2所示，图2与图1比较，1,4-丁二胺前后斑点的分离效果均很好，但当展开剂为氯仿和三乙胺体积比为16:3混合溶液时，斑点的迁移速率Rf为0.63，且各斑点略有拖尾；当展开剂为氯仿和二乙胺体积比为16:4混合溶液时，斑点的迁移速率Rf为0.70，且各斑点更圆。
实施例3 L-2-氨基-5-胍基戊酸中1,4-丁二胺的最低检测浓度确定
供试品溶液：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸1.0g六份，分别加入5mL、4mL、3mL、2mL、1mL和0.5mL浓度0.01mg/mL的1,4-丁二胺溶液，加水定容至10mL，得到1,4-丁二胺浓度为0.005mg/mL、0.004mg/mL、0.003mg/mL、0.002mg/mL、0.001mg/mL和0.0005mg/mL的L-2-氨基-5-胍基戊酸混合溶液，分别记为溶液A3、溶液B3、溶液C3、溶液D3、溶液E3和溶液F3。
2、衍生化处理及测定：分别取1mL步骤1制备的各样品溶液于不同10mL塑料离心管中，加入1mL饱和NaHCO3溶液，再加入5.0mg/mL丹磺酰氯衍生化试剂2mL，混匀1min，置于黑暗60℃恒温水浴锅中衍生30min，取出；室温放置几分钟，加0.5mL饱和NaCl溶液，然后加1mL正己烷，充分混合旋5min，待分层后取上层有机相即得到各样品的待测溶液，分别取5μL各待测溶液进行硅胶板点样。再将点样的薄层板置于层析缸中，以氯仿和三乙胺体积比为16:4的混合溶液为展开剂，展开约10cm后，干燥，于365nm波长下检视。
3、结果分析：如图3所示，如图3所示，在浓度为100mg/mL的L-2-氨基-5-胍基戊酸混合溶液中含有0.001mg/mL的1,4-丁二胺时，薄层色谱图能够检视出清晰的荧光斑点。因此，浓度为100mg/mL L-2-氨基-5-胍基戊酸的混合溶液中1,4-丁二胺最低检出浓度为0.001mg/mL。
实施例4 1,4-丁二胺对照品溶液浓度的优化
（1）供试品溶液：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸1.0g，加入1mL浓度0.01mg/mL的1,4-丁二胺溶液，加水定容至10mL，得到1,4-丁二胺浓度为0.001mg/mL的L-2-氨基-5-胍基戊酸混合溶液，记为溶液A4。
（2）1,4-丁二胺对照品溶液：分别取0.001mg/mL的1,4-丁二胺对照品溶液5ml、3mL、1mL和0.5mL，加水至10mL，分别得0.0005mg/mL、0.0003mg/mL、0.0001mg/mL和0.00005mg/mL的1,4-丁二胺对照品溶液，分别记为溶液B4、溶液C4、溶液D4和溶液E4。
（3）L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液：取L-2-氨基-5-胍基戊酸1.0g，加水至10mL，得到浓度为100mg/mL的L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液，记为溶液H4。
2、衍生化处理及测定：分别取1mL步骤1制备的各样品溶液于不同10mL塑料离心管中，加入1mL饱和NaHCO3溶液，再加入5.0mg/mL丹磺酰氯衍生化试剂2mL，混匀1min，置于黑暗60℃恒温水浴锅中衍生30min，取出；室温放置几分钟，加0.5mL饱和NaCl溶液，然后加1mL正己烷，充分混合旋5min，待分层后取上层有机相即得到各样品的待测溶液，分别取5μL各待测溶液进行硅胶板点样。再将点样的薄层板置于层析缸中，以氯仿和三乙胺体积比为16:4的混合溶液为展开剂，展开约10cm后，干燥，于365nm波长下检视。
3、结果分析：如图4所示，浓度为0.0001mg/mL的1,4-丁二胺对照品溶液D4斑点的荧光强度与1,4-丁二胺浓度为0.001mg/mL的L-2-氨基-5-胍基戊酸混合溶液中1,4-丁二胺斑点的荧光强度基本一致，可确定1,4-丁二胺对照品溶液的最适浓度为0.0001mg/mL（即0.1μg/mL）。
实施例5 丹磺酰氯试液浓度对衍生化处理的影响
（1）供试品溶液：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸1.0g，加入1mL浓度0.1mg/mL的1,4-丁二胺溶液，加水定容至10mL，得到1,4-丁二胺浓度为0.01mg/mL的L-2-氨基-5-胍基戊酸混合溶液。
（2）丹磺酰氯衍生化试液：称取丹磺酰氯50mg，加适量丙酮溶解后定容至10mL，得5mg/mL丹磺酰氯丙酮溶液；分别取5mg/mL丹磺酰氯丙酮溶液1mL、0.4mL、0.1mL和0.04mL于不同试管中，分别加入1mL、1.6mL、1.9mL和1.96mL丙酮，混匀，得2.5mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和0.1mg/mL丹磺酰氯丙酮溶液。
2、衍生化处理及测定：分别取5份1mL步骤1制备的供试品溶液于不同10mL塑料离心管中，加入1mL饱和NaHCO3溶液，再分别加入5.0mg/mL、2.5mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和0.1mg/mL丹磺酰氯衍生化试剂2mL，混匀1min，置于黑暗60℃恒温水浴锅中衍生30min，取出；室温放置几分钟，加0.5mL饱和NaCl溶液，然后加1mL正己烷，充分混合旋5min，待分层后取上层有机相为待测溶液，分别记为溶液A5、溶液B5、溶液C5、溶液D5和溶液E5，并分别取5μL待测溶液进行硅胶板点样。再将点样的薄层板置于层析缸中，以氯仿和三乙胺体积比为16:4的混合溶液为展开剂，展开约10cm后，干燥，于365nm波长下检视。
3、结果分析：如图5所示，当丹磺酰氯衍生化试液浓度低于1.0mg/mL时，薄层色谱图中的荧光斑点不明显，当丹磺酰氯浓度达到2.5mg/mL以上，均可获得清晰的荧光斑点。
实施例6 铵离子对照品溶液浓度的优化
（1）铵离子对照品溶液：称取NH4Cl 29.7mg，加水定容至100mL，取此溶液1mL，加水稀释至10mL，得到浓度为0.01mg/mL的NH4 +溶液，记为溶液A6，依次将溶液A6稀释得到浓度为0.005mg/mL、0.001mg/mL 、0.0005mg/mL和0.0001mg/mL的NH4 +溶液，分别即为溶液B6、溶液C6、溶液D6和溶液E6。
（2）L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液：取L-2-氨基-5-胍基戊酸1.0g，加水至10mL，得到浓度为100mg/mL的L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液，记为溶液F6。
2、衍生化处理及测定：分别取1mL步骤1制备的各样品溶液于不同10mL塑料离心管中，加入1mL饱和NaHCO3溶液，再加入5.0mg/mL丹磺酰氯衍生化试剂2mL，混匀1min，置于黑暗60℃恒温水浴锅中衍生30min，取出；室温放置几分钟，加0.5mL饱和NaCl溶液，然后加1mL正己烷，充分混合旋5min，待分层后取上层有机相即得到各样品的待测溶液，分别取5μL各待测溶液进行硅胶板点样。再将点样的薄层板置于层析缸中，以氯仿和二乙胺体积比为16:4的混合溶液为展开剂，展开约10cm后，干燥，于365nm波长下检视。
3、结果分析：如图6所示，铵离子斑点的荧光强度随其浓度降低而减弱，呈现出良好的线性减弱趋势，同时，与L-2-氨基-5-胍基戊酸中铵离子斑点位置一致。当浓度为0.005mg/mL的NH4 +溶液衍生后可呈现出清晰的荧光斑点，因此该浓度可作为NH4 +对照品溶液，用于1,4-丁二胺检查项检查时NH4 +斑点的定位。
实施例7 专属性评价
（1）供试品溶液：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸1.0g，加入1mL浓度0.01mg/mL的1,4-丁二胺溶液，加水定容至10mL，得到1,4-丁二胺浓度分别为0.001mg/mL的L-2-氨基-5-胍基戊酸混合溶液，记为溶液A7；
（2）铵离子对照品溶液：称取NH4Cl 29.7mg，加水定容至100mL，取此溶液1mL，加水稀释至10mL，得到浓度为0.01mg/mL的NH4 +溶液，记为溶液D7；
（3）L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液：取L-2-氨基-5-胍基戊酸1.0g，加水至10mL，得到浓度为100mg/mL的L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液，溶液C7；
（4）阴性对照液：蒸馏水，记为溶液E7。
2、衍生化处理及测定：分别取1mL步骤1制备的各样品溶液于不同10mL塑料离心管中，加入1mL饱和NaHCO3溶液，再加入5.0mg/mL丹磺酰氯衍生化试剂2mL，混匀1min，置于黑暗60℃恒温水浴锅中衍生30min，取出；室温放置几分钟，加0.5mL饱和NaCl溶液，然后加1mL正己烷，充分混合旋5min，待分层后取上层有机相即得到各样品的待测溶液，分别取5μL各待测溶液进行硅胶板点样。再将点样的薄层板置于层析缸中，以氯仿和三乙胺体积比为16:4的混合溶液为展开剂，展开约10cm后，干燥，于365nm波长下检视。
3、结果分析：如图7所示，采用本发明的方法检测L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的1,4-丁二胺杂质时，1,4-丁二胺可呈现出分离度良好的特定荧光斑点，专属性良好；阴性对照液本身有一个很弱的荧光斑点，与铵离子斑点位置一致，因此用0.01mg/mL NH4 +溶液作为对照品溶液来定位铵离子斑点是必要的，有利于1,4-丁二胺斑点的判断；而L-2-氨基-5-胍基戊酸原料溶液（供试品溶液）仅出现与铵离子位置一致的斑点，未出现与1,4-丁二胺位置一致的斑点，说明L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺杂质含量不超过0.001%（w/w），与实际样品结果一致。
实施例8 点样量对荧光强度的影响
（1）铵离子对照品溶液：称取NH4Cl 29.7mg，加水定容至100mL，取此溶液5mL，加水稀释至10mL，得到浓度为0.0005mg/mL的NH4 +溶液，记为溶液I8；
（2）L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液：取L-2-氨基-5-胍基戊酸1.0g，加水至10mL，得到浓度为100mg/mL的L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液，分别记为溶A8液、溶液C8、溶液E8和溶液G8。
（3）1,4-丁二胺对照品溶液：取0.001mg/mL的1,4-丁二胺溶液1mL，加水至10mL，得到浓度为0.0001mg/mL 1,4-丁二胺对照品溶液，记为溶液B8、溶液D8、溶液F8和溶液H8。
2、衍生化处理及测定：分别取1mL步骤1制备的各样品溶液于不同10mL塑料离心管中，加入1mL饱和NaHCO3溶液，再加入5.0mg/mL丹磺酰氯衍生化试剂2mL，混匀1min，置于黑暗60℃恒温水浴锅中衍生30min，取出；室温放置几分钟，加0.5mL饱和NaCl溶液，然后加1mL正己烷，充分混合旋5min，待分层后取上层有机相即得到各样品的待测溶液，分别取5μL（A8、B8、I8）、10μL（C8、D8）、15μL（E8、F8）和20μL（G8、H8）待测溶液进行硅胶板点样。再将点样的薄层板置于层析缸中，以氯仿和三乙胺体积比为16:4的混合溶液为展开剂，展开约10cm后，干燥，于365nm波长下检视。
3、结果分析：如图8所示，当点样量为5μL时，得到的荧光斑点较弱；当点样量为10～20μL均可获得清晰的荧光斑点，其中点样量为20μL得到的荧光斑点最清晰，且5~20μL点样量得到的1,4-丁二胺斑点均与其它斑点分离度良好。
实施例9 不同批次L-2-氨基-5-胍基戊酸原料的1,4-丁二胺杂质检测
（1）样品溶液：取4个不同批次的L-2-氨基-5-胍基戊酸原料各1.0g，分别加水溶解并稀释至10mL，得到浓度为100mg/mL的L-2-氨基-5-胍基戊酸水溶液，分别记为溶液A9、溶液B9、溶液C9和溶液D9。
（2）1,4-丁二胺对照品溶液：取0.001mg/mL的1,4-丁二胺溶液1mL，加水至10mL，得到浓度为0.0001mg/mL的1,4-丁二胺水溶液，记为溶液E9；
（3）铵离子对照品溶液：取NH4Cl 29.7mg，加水定容至100mL，取此溶液5mL，加水稀释至10mL，得到浓度为0.0005mg/mL的NH4 +溶液，记为溶液F9。
2、衍生化处理及测定：分别取1mL步骤1制备的各溶液于不同10mL塑料离心管中，加入1mL饱和NaHCO3溶液，再加入5.0mg/mL丹磺酰氯衍生化试剂2mL，混匀1min，置于黑暗60℃恒温水浴锅中衍生30min，取出；室温放置几分钟，加0.5mL饱和NaCl溶液，然后加1mL正己烷，充分混合旋5min，待分层后取20μL上层有机相点样于同一硅胶G薄层板上。再将点样的薄层板置于层析缸中，以氯仿和三乙胺体积比为16:4的混合溶液为展开剂，展开约10cm后，干燥，于365nm波长下检视。
3、结果分析：如图9所示，铵离子对照品溶液的薄层色谱图中显示一个清晰的斑点，1,4-丁二胺对照品溶液的薄层色谱图中显示两个完全分离的清晰斑点，并且其后斑点的位置应与铵离子对照品溶液的斑点相同，因此，系统适用性试验符合要求。4个不同批次的L-2-氨基-5-胍基戊酸原料的样品溶液薄层色谱图中未显示1,4-丁二胺前斑点，因此，4个不同批次的L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺的含量低于十万分之一。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺杂质的薄层色谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：溶液的制备、衍生化处理及测定和结果判定；
其中，溶液的制备包括1,4-丁二胺对照品溶液的制备、铵离子对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、丹磺酰氯衍生化试液的制备；衍生化处理及测定和结果判定包括丹磺酰氯衍生化、待测溶液的制备、待测溶液的薄层色谱检测、紫外光灯下检视、测定结果判定；
所述1,4-丁二胺对照品溶液中1,4-丁二胺的浓度与供试品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度比为1 : 1×105～1×107。
2.根据权利要求1所述L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺杂质的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述薄层色谱检测采用硅胶G薄层板，展开剂为三氯甲烷和三乙胺的混合溶液或三氯甲烷和二乙胺的混合溶液。
3.根据权利要求1所述L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺杂质的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述1,4-丁二胺对照品溶液、铵离子对照品溶液和供试品溶液的溶剂为水；所述丹磺酰氯衍生化试液的溶剂为丙酮；所述待测溶液为1,4-丁二胺对照品溶液或铵离子对照品溶液或供试品溶液经丹磺酰氯衍生化，加入饱和氯化钠溶液终止反应后，加入正己烷萃取后获得的上层有机相溶液。
4.根据权利要求1所述L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺杂质的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述丹磺酰氯衍生化需要加入饱和碳酸氢钠溶液，衍生化体系中1,4-丁二胺对照品溶液或铵离子对照品溶液或供试品溶液与饱和碳酸氢钠溶液和丹磺酰氯衍生化试液的体积比为1:1:2；所述丹磺酰氯衍生化的温度为55～65℃，时间为15～45min；所述丹磺酰氯衍生化需要加入饱和氯化钠溶液终止反应，其添加体积为丹磺酰氯衍生化试液体积的四分之一；所述待测溶液制备过程中正己烷添加体积为丹磺酰氯衍生化试液体积的二分之一。
5.根据权利要求1所述L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺杂质的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述丹磺酰氯衍生化试液的丹磺酰氯浓度为1.0～10.0mg/mL。
6.根据权利要求1所述L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺杂质的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述铵离子对照品溶液由含铵离子的各种铵盐的单一化合物或混合物加水溶解并稀释配制而成；所述铵离子对照品溶液的铵离子浓度为0.05～50μg/mL。
7.根据权利要求1～6任一所述L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺杂质的薄层色谱检测方法，其特征在于，具体步骤包括：
1）溶液的配制：
（1）1,4-丁二胺对照品溶液的制备：精密称取1,4-丁二胺对照品，加水溶解并稀释配制成浓度为0.1μg/mL的溶液，作为1,4-丁二胺对照品溶液；
（2）铵离子对照品溶液：精密称取含铵离子化合物对照品，加水溶解并稀释配制成浓度为0.5μg/mL的溶液，作为铵离子对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸待测样品，加水溶解并稀释配制成浓度为100mg/mL的溶液，作为供试品溶液；
（4）衍生化试液的制备：称取丹磺酰氯适量，加丙酮溶解并稀释制成每1mL约含5mg的溶液，作为衍生化试液；
2）衍生化处理及测定：分别取1mL步骤（1）、（2）和（3）制备的各溶液于不同10mL塑料离心管中，加入1mL饱和NaHCO3溶液，再加入5.0mg/mL丹磺酰氯衍生化试剂2mL，混匀1min，置于黑暗60℃恒温水浴锅中衍生30min，取出；室温放置几分钟，加0.5mL饱和NaCl溶液，然后加1mL正己烷，充分混合旋5min，待分层后取20μL上层有机相点样于同一硅胶G薄层板上；再将点样的薄层板置于层析缸中，以氯仿和三乙胺体积比为16:4的混合溶液为展开剂，展开约10cm后，干燥，于365nm波长下检视；
3）结果判定：
①系统适用性试验：如果铵离子对照品溶液的薄层色谱图中显示一个清晰的斑点，1,4-丁二胺对照品溶液的薄层色谱图中显示两个完全分离的清晰斑点，并且其后斑点的位置应与铵离子对照品溶液的斑点相同，则系统适用性试验符合要求；否则系统适用性试验不符合要求；
②样品检测：如果供试品溶液的薄层色谱图中显示1,4-丁二胺斑点，若其荧光强度浅于1,4-丁二胺对照品溶液的前斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺的含量低于十万分之一；若其荧光强度深于1,4-丁二胺对照品溶液的前斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中1,4-丁二胺的含量高于十万分之一。
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