ES2628313T3

ES2628313T3 - Composición de reactivo de litio, y método y dispositivo para determinar la cantidad de ion litio usando la misma

Info

Publication number: ES2628313T3
Application number: ES12873711.1T
Authority: ES
Inventors: I Takuya IWABUCH; Tsugikatsu Odashima
Original assignee: METALLOGENICS Co Ltd
Current assignee: METALLOGENICS Co Ltd
Priority date: 2012-04-06
Filing date: 2012-04-25
Publication date: 2017-08-02
Anticipated expiration: 2032-04-25
Also published as: KR101499603B1; CA2869125A1; US9562886B2; JP2013217746A; US10690648B2; US20170102371A1; AU2012376362B2; TW201348237A; AU2012376362A1; KR20140114902A; CA2869125C; EP3179246B1; CN104520705B; SG11201406329XA; RU2571073C1; TWI531574B; WO2013150663A1; EP3179246A1; EP2835637A4; JP5100903B1

Abstract

Uso de una composición acuosa de reactivo de litio para medir la cantidad de litio, caracterizado por comprender un compuesto que tiene una estructura representada por la fórmula (I):**Fórmula** en la que todos los hidrógenos unidos a carbonos de una tetrafenilporfirina están reemplazados por átomos de flúor (F28 tetrafenilporfirina), un disolvente orgánico miscible en agua elegido de dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF) y dimetilacetamida (DMA), y un modificador de pH para ajustar el pH a un intervalo de pH 5 a pH 12, para medir una coloración del complejo de litio resultante en una longitud de onda que varía desde 530 nm a 560 nm, preferentemente a 550 nm.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Composicion de reactivo de litio, y metodo y dispositivo para determinar la cantidad de ion litio usando la misma Campo tecnico

La presente invencion se refiere a una composicion de reactivo usada en la medicion cuantitativa de litio en una solucion acuosa tal como muestras biologicas y muestras de liquidos ambientales, y a un metodo y dispositivo para determinar la cantidad de iones litio usando la composicion de reactivo.

Tecnica anterior

Se sabe que los farmacos que contienen litio son eficaces en la estabilizacion del estado de animo y como antidepresivos, de modo que se usan ampliamente como farmacos estabilizantes del estado de animo y antidepresivos. Los comprimidos de carbonato de litio (para administracion oral) se prescriben generalmente como un estabilizante del estado de animo, asi como un farmaco para el trastorno bipolar (psicosis circular) o un farmaco antidepresivo.

Sin embargo, cuando dicho farmaco que contiene litio se administra a pacientes, es necesario controlar o ajustar la concentracion de litio en suero dentro de un intervalo adecuado. De hecho, el carbonato de litio (Li2CO3) tiene una caracteristica tal que su efecto de administracion se muestra solamente cuando la concentracion de litio en la sangre llega casi a un "nivel de envenenamiento por litio". En otras palabras, cuando se administra el farmaco, la monitorizacion de farmacos terapeuticos (TDM) es indispensable para monitorizar la concentracion de litio en la sangre, ya que un intervalo terapeutico esta muy proximo al nivel de veneno.

En la practica, es necesario controlar o limitar la concentracion de litio en una muestra de sangre del paciente dentro de un intervalo limitado de generalmente desde 0,6 a 1,2 mEq/l. De hecho, cuando la concentracion de litio en suero es inferior a 0,6 mEq/l, no se espera ningun efecto antidepresivo. Por el contrario, una administracion en exceso superior a 1,5 mEq/l de la concentracion en plasma dara como resultado el envenenamiento por litio. La sobredosis da como resultado una causa mortal de sintomas de envenenamiento incluyendo temblor, alalia, nistagmo, alteracion renal y convulsiones. Por lo tanto, cuando se observa un signo de sintomas latentemente peligrosos de envenenamiento por litio, se debe detener el tratamiento con dicho farmaco que contiene litio y la concentracion en plasma se debe medir nuevamente para tomar una medicion necesaria y aliviar el envenenamiento por litio.

Asi pues, la sal de litio es un medicamento eficaz en el tratamiento de pacientes depresivos, pero la sobredosis da como resultado graves problemas. Por lo tanto, cuando se administra un farmaco antidepresivo que contiene litio, es indispensable monitorizar la concentracion de litio en suero y asegurar que la concentracion se mantiene siempre en un intervalo limitado de desde 0,6 a 1,2 mEq/l. Por lo tanto, la medicion cuantitativa de litio en suero es necesaria en el tratamiento de pacientes con depresion.

Se han desarrollado varias composiciones de reactivo liquido que permiten la determinacion colorimetrica del litio para la prueba de laboratorio clinico.

El documento patente 1 divulga una composicion de reactivo usada para medir la concentracion de litio en una muestra biologica usando el cuerpo de color primario cryptideinofa.

El documento patente 2 divulga un reactivo analitico que reacciona con ion litio, que comprende un compuesto macrociclico que tiene un anillo de pirrol y ocho atomos de bromo (Br) combinados en la posicion p del anillo de pirrol.

El documento no patente 1 divulga que el ion litio se puede detectar por un compuesto en el que todo hidrogeno unido a carbonos de tetrafenilporfirina se sustituye reemplaza por fluor.

Listado de tecnicas anteriores

Documento patente 1: JP-A1 -7-113807 Documento patente 2: EP 1283986-B1

Documento no patente 1: Analytical Chemistry vol.51, n.° 9, pp. 803-807, (2002); K. Koyanagi et al., "Synthesis of F28 tetraphenylporphyrin and its use for separation and detection".

Sumario de la invencion

Problemas que debe resolver la invencion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las composiciones de reactivo de litio conocidas, sin embargo, tienen dichos demeritos o problemas, que son composiciones venenosas, que las sustancias farmaceuticas son costosas o no se suministran de manera estable y que la mayoria de las sustancias farmaceuticas no se disuelven en agua o, incluso si son solubles, se desactivan en agua, por lo que la reaccion de coloracion es muy lenta.

El documento no patente 1 mencionado anteriormente se desarrollo para resolver los problemas anteriores y permite el uso de una tecnica de desarrollo del color. Sin embargo, el metodo de este documento no patente 1 requiere una operacion de dilucion de una muestra, ya que la sensibilidad es demasiado alta y la especificacion de la composicion de reactivo de litio requiere un intervalo de pH superior a 11, de manera que se deteriora facilmente con CO2 en el aire y, por tanto, los datos medidos no son estables. Aun mas, en la practica no se dispone de ninguna solucion acuosa concentrada distinta de aquellas de hidroxido de sodio y de hidroxido de potasio para un intervalo de pH superior a 11, de manera que es dificil mantener una concentracion constante. Estas soluciones acuosas concentradas son sustancias peligrosas que son dificiles de manipular, de modo que se debe evitar su uso. Su almacenamiento requiere recipientes especiales y se requiere un equipo o instalacion especial de mayor escala en su manipulacion. Por lo tanto, esta tecnologia es dificil de aplicar a la monitorizacion in situ y POCT (pruebas a la cabecera del paciente).

La composicion de reactivo para medir la cantidad de litio divulgada en el documento patente 1 es completamente diferente de la presente invencion y se puede usar solamente a pH 12. Como se indica anteriormente, en un intervalo de pH superior a 11, en la practica no hay ninguna solucion acuosa concentrada distinta de las de hidroxido de sodio y de hidroxido de potasio, que son sustancias peligrosas que son dificiles de manipular y se requiere un equipo o instalacion especial de mayor escala para su complemento.

El documento de Koyanagi et al., del documento no patente 1 ensena que el ion litio se puede separar y detectar usando F28 tetrafenilporfirina. Sin embargo, la extraccion con cloroformo venenoso oleoso es necesaria para realizar la separacion y deteccion de iones litio. De hecho, era imposible la determinacion directa de litio en solucion acuosa sin un complicado pretratamiento.

Asi pues, existia un problema, que era imposible la medicion rapida y cuantitativa del ion litio en suero. De hecho, la deteccion de iones litio en soluciones acuosas usando F28 tetrafenilporfirina no es facil, de modo que la medicion cuantitativa de iones litio con este compuesto no se ha realizado hasta ahora.

La presente invencion se realizo para resolver el problema y proporciona una composicion de reactivo usada en la medicion cuantitativa de litio (concentracion) en soluciones acuosas tales como muestras biologicas y muestras de liquidos ambientales, y un metodo y dispositivo de medicion que usa la composicion de reactivo para determinar la cantidad de ion litio. La presente invencion permite medir la concentracion de litio rapida o inmediatamente usando el colorimetro convencional. La presente invencion proporciona tambien una composicion de reactivo de litio que se puede usar para la deteccion mediante observacion visual y metodo y aparato que usa la composicion de reactivo de litio para medir el ion litio.

Medios para resolver los problemas

Un objeto de la presente invencion es el uso de una composicion acuosa de reactivo de litio para medir la cantidad de litio de acuerdo con la reivindicacion 1.

Otras caracteristicas del uso de acuerdo con la presente invencion se dan en las reivindicaciones 2 a 10. Un objeto adicional de la invencion es un kit de reactivo de litio como se define en la reivindicacion 11 y/o en la reivindicacion 12.

Otro objeto de la presente invencion es un metodo para determinar la cantidad de iones litio en plasma sanguineo o suero en una muestra de prueba como se define en la reivindicacion 13.

Otras caracteristicas del metodo de acuerdo con la presente invencion se dan en las reivindicaciones 14 a 16.

El litio en una solucion acuosa tal como una muestra biologica y una muestra ambiental genera un color con la composicion de reactivo de litio usada de acuerdo con la presente invencion, en particular, con el compuesto anterior en el que todos los hidrogenos unidos a carbonos de una tetrafenilporfirina estan reemplazados por fluor, que funciona como un reactivo quelante (dasarrollador de color).

El cambio de color de amarillo a rojo por una reaccion de coloracion que se observa entre un compuesto de F28 tetrafenilporfirina e iones litio es dificil de realizar. Sin embargo, lo que se requiere es determinar con precision una cantidad de litio en suero en el intervalo de 0,6 mg/dl a 2,0 mg/dl (0,9 mM a 3 mM). Los inventores encontraron tal hecho de que la cantidad de litio en suero se puede determinar con precision fijando una concentracion del compuesto de F28 tetrafenilporfirina en un intervalo de 0,1 a 1,0 g/l, preferentemente 0,5 g/l en un modo de realizacion de la presente invencion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El modificador de pH se usa preferentemente en la presente invencion. De hecho, en una zona acida inferior a pH 5,0, el compuesto de F28 tetrafenilporfirina, que es un dasarrollador de color (reactivo quelante) de acuerdo con la presente invencion, no se une al ion litio, de modo que no se observa ningun cambio de coloracion y es dificil determinar la cantidad de litio. En un intervalo entre pH 5 y pH 7, se produce una reaccion especifica entre el dasarrollador de color y el ion litio pero la velocidad de reaccion de coloracion es lenta. En un intervalo entre pH 8 y pH 11, el dasarrollador de color reacciona rapidamente con el ion litio y se puede formar un complejo de coloracion estable. En la zona alcalina superior a pH 11, un tono de color del reactivo quelante y del complejo de coloracion formado se vuelve inestable con el tiempo. Esto puede ser provocado por la absorcion de dioxido de carbono en el aire, de modo que el pH fluctua. Por lo tanto, es necesario usar un modificador de pH o un tampon de pH que pueda mantener el pH de la composicion de reactivo de litio usada de acuerdo con la presente invencion en un intervalo desde pH 7 a pH 12, preferentemente desde pH 8 a pH 11.

El modificador de pH se puede seleccionar de medicamento alcalino, incluyendo hidroxido de sodio, hidroxido de potasio y amoniaco, medicamento acido incluyendo acido acetico, acido fosforico, acido citrico, acido carbonico, acido bicarbonico, acido oxalico, acido clorhidrico, acido nitrico y sus sales. El modificador de pH puede ser un tampon de pH y se puede seleccionar de acido citrico, acido carbonico, acido bicarbonico, acido fosforico, acido succinico, acido ftalico, cloruro de amonio, hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, MES como tampon de Good, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricina, Bicina, TAPS, CHES, CAPSO, CAPS y sus sales.

La composicion de reactivo de litio usada de acuerdo con la presente invencion permite la reaccion de color especifica para litio en un intervalo desde pH 5 a pH 12 incorporando el modificador de pH.

Es indispensable que el disolvente (disolvente polar) usado en la presente invencion sea un disolvente organico que sea compatible con el agua. El disolvente puede ser una solucion que consiste principalmente en disolvente organico o una solucion acuosa a la que se anade un disolvente organico, siempre que el disolvente se pueda mezclar uniformemente con una solucion acuosa tal como suero, plasma sanguineo y eluato, que sea una muestra de prueba. De hecho, puesto que una muestra de prueba que se va medir esta en forma de una solucion acuosa cuando la concentracion de litio en la muestra se determina mediante un analizador automatizado de uso general y por un espectrofotometro de luz visible-ultravioleta, es deseable que la composicion de reactivo este en forma de una solucion acuosa.

El disolvente organico se elige preferentemente de dimetilsulfoxido (DMSO), dimetilformamida (DMF) y dimetilacetamida (DMA).

En los productos actuales, se incorpora un estabilizante adecuado en la composicion de reactivo usada de acuerdo con la presente invencion. En un modo de realizacion, se usa un tensioactivo como el estabilizante. El tensioactivo mejora la dispersabilidad del compuesto de F28 tetrafenilporfirina y previene las suspensiones originadas a partir de la muestra durante la reaccion de coloracion. Por lo tanto, el estabilizante se usa para asegurar dicho efecto.

El estabilizante puede ser un tensioactivo no ionico o un tensioactivo anionico. El tensioactivo no ionico puede ser ester de acido graso de sorbitano, ester parcial de acido graso de pentaeritritol, ester de acido monofatico de propilenglicol, monoester de acido graso de glicerina, polioxietilen alquil eter, polioxietilen alquil fenil eter, polioxietileno polioxipropilenglicol, ester parcial de acido graso de polioxietileno, ester parcial de acido graso de polioxietilen sorbitol, ester de acido graso de polioxietileno, dietanolamida de acido graso, etanolamida de acido graso, amida de acido graso de polioxietileno, polioxietilen octilfenil eter (Triton X-100®), p-nonil fenoxi poliglicidol o sus sales. Los tensioactivos no ionicos preferentes son polioxietilen octilfenil eter (Triton X-100®) y p-nonil fenoxi poliglicidol.

El tensioactivo anionico como estabilizante puede ser una sal de ester de alquilsulfato, sal de sulfato de polioxietilen alquil eter, sal de sulfato de polioxietilen fenil eter, alquilbencenosulfonato y alcanosulfonato. El tensioactivo anionico tipico se selecciona de dodecilsulfato de sodio, dodecilbencenosulfonato de sodio y sulfato de sodio de polioxietilen alquilfenil eter.

La composicion de reactivo de litio usada de acuerdo con la presente invencion puede contener mas de un reactivo de enmascaramiento, para evitar la alteracion provocada por otros iones distintos de litio, que pueden estar presentes en la muestra, para suprimir la oxidacion de la composicion de reactivo y para mejorar la estabilidad de almacenamiento. El reactivo de enmascaramiento puede no ser necesario si hay pocos iones distintos de litio.

El reactivo de enmascaramiento que se puede anadir a la composicion de reactivo de litio usada de acuerdo con la presente invencion se puede seleccionar de trietanolamina, etilendiamina, N,N,N',N'-tetraquis-2- (piridilmetil)etilendiamina (TPEN), piridina, 2,2-bipiridina, propilendiamina, dimetilentriamina, acido dimetilentriamino- N,N,N’,N'',N"-pentaacetico (DTPA), trimetilentetramina, acido trimetilentetramino-N,N,N',N",N'",N'"-hexaacetico (TTHA), 1,10-fenantrolina, acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), acido O,O'-bis(2-aminofenil)etilenglicol-N,N',N'- tetraacetico (BAPTA), N,N-bis(2-hidroxietil)glicina (Bicina), acido trans-1,2-diaminociclohexano-N,N,N',N'-tetraacetico (CyDTA), acido O,O'-bis(2-aminoetil)etilenglicol-N,N,N',N'-tetraacetico (EGTA), acido N-(2-hidroxil)iminodiacetico

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(HIDA), acido iminodiacetico (IDA), acido nitrilotriacetico (NTA), trimetilfosfonato de nitrilo (NTPO) y sus sales. Se usa preferentemente trietanolamina.

La composicion de reactivo de litio usada de acuerdo con la presente invencion puede incluir antisepticos para prevenir la degradacion provocada por un microorganismo. Los antisepticos no estan especialmente limitados y pueden ser azida de sodio y Procline ®. Una cantidad de antisepticos no esta especialmente limitada y puede ser una concentracion usada generalmente como un antiseptico. Por ejemplo, en el caso de la azida de sodio, la cantidad de antisepticos es aproximadamente un 0,1 % en masa con respecto a una solucion de reaccion. Los antisepticos se prescriben generalmente para productos que se almacenan durante una duracion de periodos mas largos.

Para garantizar un almacenamiento a largo plazo, la composicion de reactivo de litio usada de acuerdo con la presente invencion se puede almacenar por separado en forma de un kit para medir reactivo de litio que comprende dos reactivos separados que se mezclan justo antes de la medicion para realizar la composicion de reactivo de litio como se usa en la reivindicacion 1. Por ejemplo, un primer reactivo comprende el estabilizante y el modificador de pH o tampon de pH, mientras que un segundo reactivo comprende el compuesto de tetrafenilporfirina, disolvente organico miscible en agua, estabilizante y modificador de pH o tampon de pH.

En los usos actuales, la composicion de reactivo de litio usada de acuerdo con la presente invencion se pone en contacto con una muestra de prueba de suero y/o plasma sanguineo para inducir la coloracion del complejo de litio que se mide en terminos de absorbancia y espectro para determinar una cantidad de litio en la muestra, comparando con concentraciones de referencia de una muestra estandar cuyas concentraciones de litio son conocidas.

En la practica, en la coloracion del complejo de litio y en su espectro, la sensibilidad se mide preferentemente a una longitud de onda de 550 nm o en la proximidad de una longitud de onda desde 530 nm a 560 nm, o la sensibilidad se mide a una longitud de onda de 570 nm o en la proximidad de una longitud de onda desde 565 nm a 650 nm para calcular la concentracion de litio. En este caso, se entiende por sensibilidad la absorbancia o una diferencia de absorbancia en un espectrofotometro de luz ultravioleta-visible.

En el dispositivo de medicion, se mide la coloracion, absorbancia o espectro del complejo de litio generado a partir de la composicion de reactivo de litio usada de acuerdo con la presente invencion en contacto con una muestra de prueba de suero y plasma sanguineo, o la sensibilidad a una longitud de onda de 550 nm o en la proximidad de una longitud de onda desde 530 nm a 560 nm o la sensibilidad a una longitud de onda desde 570 nm o en la proximidad de una longitud de onda desde 565 nm a 650 nm se mide para calcular el valor cuantitativo de litio.

Ventajas de la invencion

La composicion de reactivo de litio usada de acuerdo con la presente invencion y el metodo y dispositivo para medir iones litio permiten determinar o medir facilmente la concentracion de litio en una solucion acuosa tal como una muestra ambiental y una muestra biologica. En la composicion de reactivo de litio como se usa en las reivindicaciones 1 a 10 o como se obtiene con el kit definido en la reivindicacion 11 o 12, la curva de calibracion de la concentracion de litio es lineal en un intervalo practico desde 0,6 a 1,2 mEq/l, de manera que la concentracion se puede calcular mediante una simple operacion a partir de valores numericos del colorimetro y del espectrofotometro de luz ultravioleta-visible. Por lo tanto, la concentracion de litio en la muestra de suero o muestra biologica se puede determinar rapida y cuantitativamente por un espectrofotometro habitual. Los datos resultantes se pueden usar como indice de gestion en el tratamiento TDM, por ejemplo. O, la determinacion cuantitativa de un mayor numero de muestras se puede hacer en un tiempo corto mediante un analizador de quimica clinica automatico.

En la presente invencion, la composicion de reactivo de litio se ajusta a un intervalo de pH de desde pH 5 hasta pH 12 para permitir la medicion por espectrometria. En un intervalo acido por debajo de pH 5, el reactivo quelante de acuerdo con la presente invencion (F28 tetrafenilporfirina litio) no se une a iones de helio de modo que no se observa el cambio de color que es dependiente de la concentracion de litio. Por el contrario, en una zona alcalina por encima de pH 12, un tono de color del reactivo quelante y del complejo de coloracion formado no es estable. La estabilidad del tono de color se vuelve pobre debido a la absorcion de dioxido de carbono en el aire que es una causa de fluctuacion del pH. En el intervalo de pH de pH 5 a pH 7, se puede observar la coloracion especifica del reactivo quelante, ya que el reactivo quelante se une a iones litio pero la velocidad de coloracion es demasiado lenta. Por lo tanto, el intervalo de pH desde pH 8 a pH 11 es preferente, ya que, en el intervalo de pH desde pH 8 a pH 11, el reactivo quelante se une al ion litio rapidamente y la reaccion de coloracion es especifica y estable.

El complejo metalico de tetrafenilporfirina posee un intervalo de espectro especifico tipico en la proximidad desde 380 nm a 460 nm denominado "banda de Soret" en el que se obtiene la maxima sensibilidad. Este intervalo se puede seleccionar como un intervalo de longitud de onda de medicion. Sin embargo, la sensibilidad en este intervalo es demasiado alta para una concentracion de litio que tenga importancia clinica en una muestra de suero, de modo que es necesaria una operacion de dilucion, lo que da como resultado un aumento de operaciones complicadas y de unidades adicionales de dilucion que aumentan el tamano de la unidad de medicion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

En la presente invencion, se usa una longitud de onda de 550 nm o en el intervalo proximo de desde 530 nm a 560 nm en la que la sensibilidad es varias veces mas baja que la de la banda de Soret como el intervalo de longitud de onda de medicion. Al seleccionar este intervalo, se obtiene la sensibilidad optima para una concentracion de muestra que se va a someter a prueba y se puede eliminar la complicada operacion de dilucion y la unidad de dilucion. Aun mas, la curva de calibracion de acuerdo con la presente invencion tiene una mejor linealidad que aquella en el caso de la banda de Soret, de manera que la concentracion se puede calcular facilmente a partir de los valores medidos obtenidos mediante un colorimetro de pequeno tamano o un espectrofotometro de luz ultravioleta-visible. Aun mas, el cambio en el tono de color de amarillo a rojo es muy intenso en la presente invencion, el nivel de concentracion se puede juzgar por observacion visual o a simple vista.

Si la banda de Soret se usa como longitud de onda de fotometria, hay otro problema de que el valor cuantitativo del litio esta influenciado por otras sustancias organicas y componentes de color tales como ion nitrato, creatinina, bilirrubina, biliverdina y hemoglobina hemolizada. Esta influencia o problema se puede reducir en la presente invencion y la concentracion de litio se puede determinar con alta precision.

En el metodo convencional para medir litio, se requerio un aparato de uso unico de gran escala. En la presente invencion, la concentracion de litio se puede determinar mediante un pequeno colorimetro portatil y puede construirse como un kit POCT.

Breve descripcion de los dibujos

[Fig. 1] Una tabla para calcular la concentracion optima de F28 tetraporfirina de acuerdo con la presente invencion.

[Fig. 2] Graficos de espectrofotometro de luz ultravioleta-visible obtenidos en el resultado del ejemplo 1 de acuerdo con la presente invencion.

[Fig. 3] Grafico de la curva de calibracion a diferentes longitudes de onda en el ejemplo 1 de acuerdo con la presente invencion.

[Fig. 4] Graficos que muestran el cambio en el espectro (reaccion de color) cuando se forma el complejo F28 tetrafenilporfirina-litio en el ejemplo 1 de acuerdo con la presente invencion.

[Fig. 5] Un grafico que muestra una correlacion entre los valores medidos de las muestras de suero en el ejemplo 1 de acuerdo con la presente invencion y los valores medidos obtenidos por el metodo de absorcion atomica (metodo convencional).

[Fig. 6] [Tabla 1] muestra una comparacion con valores medidos obtenidos usando un analizador automatizado en el que se usaron las muestras de suero de control.

[Fig. 7] [Tabla 2] muestra como detectar litio por observacion visual en la presente invencion.

[Fig. 8] Una grafica de un espectro de absorbancia en el ejemplo 1 de acuerdo con la presente invencion.

[Fig. 9] [Tabla 3] muestra los valores medidos obtenidos por diferentes disolventes organicos de acuerdo con la presente invencion.

[Fig. 10] [Tabla 4] muestra los valores medidos obtenidos por diferentes estabilizantes de acuerdo con la presente invencion.

[Fig. 11] [Tabla 5] muestra los valores medidos obtenidos por diferentes reactivos de enmascaramiento de acuerdo con la presente invencion.

Modo de llevar a cabo la invencion

Los inventores estudiaron composiciones de reactivo de litio que se pueden usar para medir una concentracion de litio en suero y plasma sanguineo cuantitativa y mas simplemente y enfocada en un compuesto representado por la formula general (I):

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

imagen1

en la que todos los atomos de hidrogeno unidos a los carbonos de un anillo de tetrafenilporfirina estan reemplazados por atomos de fluor (el numero total de fluor es 28) en el compuesto macrocfclico descrito en el documento no patente 1 y completan la presente invencion. El compuesto anterior se denomina en el presente documento "F28 tetrafenilporfirina".

Los documentos de patente 2 y 3 divulgan composiciones similares de reactivo de litio que comprenden un compuesto macrocfclico que tiene anillos de pirrol en los que ocho atomos de bromo (Br) estan unidos a la posicion P del anillo de pirrol, para proporcionar un reactivo analftico que puede reaccionar con iones litio. Este compuesto, sin embargo, es diffcil de hacer reaccionar con litio si el pH no esta en una zona alcalina por encima de pH 11.

En el caso de la F28 tetrafenilporfirina de acuerdo con la presente invencion, la reaccion se produce en un intervalo de pH 5 a pH 12. En la presente invencion, la F28 tetrafenilporfirina se usa como un reactivo quelante y se usa para determinar cuantitativamente los iones litio en un sistema acuoso.

Ahora, la composicion de reactivo de litio usada de acuerdo con la presente invencion se explica con mas detalle usando los ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1 (muestra 1)

En este ejemplo 1, se preparo en primer lugar un primer reactivo como una solucion de tampon de pH y un segundo reactivo como una solucion de reactivo de coloracion. A continuacion, dos reactivos del primer y segundo reactivo se mezclaron justo antes de la operacion de medicion para preparar una composicion de reactivo de litio usada de acuerdo con la presente invencion. Aunque estos dos reactivos pueden ser almacenados en una forma de combinado, es aconsejable almacenarlos por separado y mezclarlos justo antes de la operacion de medicion para evitar el deterioro de los reactivos durante una larga duracion de almacenamiento.

Ahora, explicaremos en detalle como preparar la composicion de reactivo de acuerdo con la presente invencion.

Para empezar, se prepara el primer reactivo (solucion de tampon de pH). Lo siguiente es la composicion del primer reactivo.

(1) Primer reactivo (como estabilizante y solucion de tampon):

- reactivo quelante: ninguno

- disolvente organico: ninguno

- estabilizante (dispersante: tensioactivo no ionico): 1,0 % en peso de TritonX-100® (polioxietilen octilfenil eter)

- reactivo de enmascaramiento: 10 mM de trietanolamina

En una mezcla de los componentes anteriores, se anadio 7 % en peso de cloruro de amonio para ajustar a pH 10. A continuacion, el volumen total se aumento a 1 litro con agua purificada y se almaceno en un recipiente de almacenamiento habitual. Si una proporcion de TritonX-100 ® (polioxietilen octilfenil eter) es inferior al 1,0 % en peso, puede producirse turbidez en algunos casos. Por el contrario, si se usa estabilizante en exceso, se generara espuma en un recipiente de reactor. Dicha turbidez o formacion de espuma puede influir en la reproducibilidad de la medicion, de modo que es preferente un intervalo de 0,1 a 5,0 % en peso y 1,0 % en peso.

En este ejemplo, el reactivo de enmascaramiento es 10 mM de trietanolamina. Si una cantidad del reactivo de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

enmascaramiento es corta, no se obtendra un efecto de enmascaramiento satisfactorio en muestras que contengan iones extranos en exceso distintos del litio. Por el contrario, el exceso de reactivo de enmascaramiento enmascarara el propio ion litio, dando como resultado una causa de errores en la medicion. Por lo tanto, un intervalo de 1,0 a 100 mM es preferente y 10 mM es mas preferente.

El segundo reactivo (solucion de reactivo de revelado de color) se produce como sigue.

(2) Segundo reactivo (como solucion de reactivo de revelado de color):

- reactivo quelante: 0,5 g/l de F28 tetrafenilporfirina

- disolvente organico; 20 % en peso de dimetilsulfoxido (DMSO)

- reactivo de enmascaramiento: 10 mM de trietanolamina

En una mezcla de los componentes anteriores, se anadio 0,05 M (mol/l) de MOPS (tampon de Good) para ajustar a pH 7,0. A continuacion, el volumen total se aumento a 1 litro con agua purificada y la solucion resultante se almaceno en un recipiente de almacenamiento habitual.

En el ejemplo 1, la reaccion de revelado de color del compuesto de F28 tetrafenilporfirina es complicada. Sin embargo, en las pruebas practicas de laboratorio clinico para medir la concentracion de litio en suero, se requiere la precision en un intervalo de concentracion de litio de 0,6 mM a 3 mM. El inventor encontro que la medicion precisa se puede hacer seleccionando la concentracion de compuesto de F28 tetrafenilporfirina de 0,1 a 1,0 g/l, preferentemente 0,5 g/l.

En el intervalo de concentracion de litio de 0,6 mM a 3 mM, la medicion de litio se puede realizar ventajosamente ajustando la concentracion de compuesto de F28 tetrafenilporfirina en la composicion de reactivo final a 0,1 a 1,0 g/l, preferentemente 0,5 g/l. Si la concentracion es inferior al limite anterior, una reaccion entre F28 tetrafenilporfirina e ion litio no es proceder suficiente. Por el contrario, si la concentracion excede el limite anterior, se producira otro problema de aumento de la absorbancia de un blanco de compuesto de F28 tetrafenilporfirina. Por lo tanto, se usa preferentemente la concentracion de 0,5 g/l.

En mas detalle, la reaccion entre F28 tetrafenilporfirina e ion litio es una reaccion de una relacion molar igual de 1:1 para formar un complejo de quelato. Cuando se hace reaccionar una muestra de prueba que contiene 3 mM de litio con la composicion de reactivo usada de acuerdo con la presente invencion bajo la condicion del ejemplo 1, la concentracion de litio en el sistema de reaccion se convierte en 0,02 mM. Por lo tanto, la concentracion de compuesto de F28 tetraporfirina debe existir a una concentracion superior a 0,02 mM para efectuar la reaccion suficientemente (ni demasiado ni demasiado poco).

En la reaccion de formacion de complejos (reaccion de coloracion) entre un reactivo quelante e iones metalicos, es necesario en general usar el reactivo quelante (F28 tetraporfirina) en una cantidad de igual moles a 10 veces mas moles con respecto a un reactivo o un sujeto a ser sometido a prueba (litio). Como se muestra en la fig. 1 que muestra las concentraciones optimas de F28 tetraporfirina, la composicion de reactivo se prepara de tal manera que la concentracion de F28 tetraporfirina durante el tiempo de reaccion se convierte de igual moles a 10 veces mas moles. En la practica, es preferente usar una concentracion del reactivo quelante en la composicion de reactivo de 0,5 g/l (5 veces) en lugar de 0,1 g/l (mismo tamano) para permitir su uso en condiciones de medicion mas amplias, debido a que los parametros de las dosificaciones para medir la reaccion de una cantidad anadida de la composicion de reactivo y de una cantidad de muestra que se va a someter a prueba varian y dependen del aparato de medicion y umbrales deseados. Por ejemplo, en el caso de un aparato de medicion cuya precision de medicion no sea tan alta, se puede aumentar una cantidad de muestra de dos veces a cinco veces la del ejemplo 1. Para preparar dichos casos, es aconsejable usar la concentracion de 0,5 g/l (5 veces) de la composicion de reactivo que es suficiente cantidad de reactivo para la reaccion. El exceso de cantidad de mas de 10 veces no tiene ninguna ventaja porque la mayor cantidad de reactivo puede no tener una ventaja significativa en la cinetica de la reaccion de coloracion, sino mas bien aumentar un problema de elevacion del nivel de blanco.

Lo que se necesita es satisfacer la condicion de reaccion en la relacion molar entre el reactivo quelante y el litio. Por ejemplo, cuando la concentracion de reactivo quelante (F28 tetraporfirina) en el segundo reactivo es 1,0 g/l, una cantidad del segundo reactivo que se anade a la reaccion puede reducirse a la mitad. O, cuando una cantidad de muestra se reduce a la mitad, una cantidad del reactivo quelante puede reducirse a la mitad.

En el ejemplo 1, la concentracion de F28 tetrafenilporfirina es de 0,5 g/l. La concentracion optima de F28 tetrafenilporfirina es de 0,1 a 1,0 g/l que satisface la condicion de reaccion en moles y disminuye el nivel de blanco al minimo.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Una cantidad de dimetilsulfoxido (DMSO) es de 5 a 30 % en peso. Cuando esta cantidad es mas corta, la dispersion de F28 tetrafenilporfirina en una solucion se vuelve pobre. Por el contrario, la cantidad en exceso de dimetilsulfoxido da como resultado un aumento del disolvente organico en la composicion de reactivo. Por lo tanto, una cantidad preferente es un 20 % en peso.

La F28 tetrafenilporfirina usada en este ejemplo 1 tiene una estructura representada por la siguiente formula (I):

imagen2

en la que todos los hidrogenos unidos a carbonos de una tetrafenilporfirina estan reemplazados por atomos de fluor.

(3) Ahora explicaremos como preparar una curva de calibracion de la composicion de reactivo de litio preparada mezclando el primer reactivo con el segundo reactivo para muestras cuyas concentraciones de litio son conocidas.

En el ejemplo 1, se anadieron 720 pl del primer reactivo (solucion de tampon) y 240 pl del segundo reactivo (solucion de reactivo de coloracion) a 6 pl de una muestra. En este caso, el primer reactivo tiene una capacidad tamponadora a pH10. Despues de mezclar el primer y segundo reactivo y la muestra, la mezcla resultante de un lfquido de prueba tiene aproximadamente pH 10.

Asf pues, cuando se usa F28 tetrafenilporfirina de acuerdo con la presente invencion como reactivo quelante, la reaccion de revelado de color se puede llevar a cabo en un intervalo de pH de pH 5 a pH 10. De hecho, la presente invencion proporciona un reactivo para la medicion de litio que posee una fuerte accion tamponadora del pH en un intervalo de pH inferior a 10, de manera que la fluctuacion del pH provocada por la absorcion del CO2 en el aire se puede reducir. Por lo tanto, se puede evitar un efecto adverso a los valores medidos, y es posible almacenar los reactivos de medicion en recipientes de uso general.

Es posible mezclar el primer reactivo con el segundo reactivo justo antes de su uso y anadir la mezcla resultante al mismo volumen de muestra. En este caso, se pueden anadir 940 pl de la mezcla lfquida a 6 pl de una muestra.

Se anadio una muestra de prueba a la mezcla resultante de pH 10 para efectuar una reaccion a temperatura ambiente durante 10 minutos y a continuacion se midio una absorbancia a 550 nm mediante un espectrofotometro de luz visible ultravioleta (HITACHI, tipo U-3900), siendo el blanco la muestra de prueba. La fig. 2 muestra el resultado que es una relacion entre la absorbancia y la concentracion de Li (mg/l). La fig. 4 es un grafico que muestra el cambio en el espectro en un intervalo de luz visible cuando se forma el complejo F28 tetrafenilporfirina- litio.

Para el complejo metalico de tetrafenilporfirina, se obtiene la maxima sensibilidad a un intervalo de longitud de onda de la llamada banda de Soret (aproximadamente de 380 nm a 460 nm). Sin embargo, en la presente invencion no se usa este intervalo de banda de Soret sino que se usa una longitud de onda de 550 nm o en el intervalo alrededor de 530 nm a 560 nm, de modo que operaciones complejas de dilucion y de medios de dilucion o una instalacion auxiliar no son necesarias en la presente invencion.

La fig. 3 que muestra graficas de las curvas de calibracion a diferentes longitudes de onda revela que se puede obtener mejor linealidad en la curva de calibracion cuando se usa una longitud de onda de 550 nm o en el intervalo alrededor de 530 nm a 560 nm que en los casos en que se usan las longitudes de onda de la llamada banda de Soret. Por lo tanto, la concentracion exacta se puede calcular facilmente mediante un colorfmetro simple o un espectrofotometro. Aun mas, el cambio de color de amarillo a rojo es muy agudo, por lo que un nivel de la concentracion se puede detectar facilmente a simple vista. En la tecnica convencional, un aparato de gran escala para uso exclusivo es necesario para medir la concentracion de litio, mientras que en la presente invencion la concentracion de litio puede medirse facilmente mediante un colorfmetro portatil o un espectrofotometro de luz ultravioleta-visual que se usa ampliamente. Se puede construir la presente invencion en forma de un kit POCT.

En el grafico de la fig. 3, se obtuvo una lfnea (•) en una longitud de onda de 550 nm que se uso en el ejemplo 1, mientras que se obtuvieron otras dos curvas en longitudes de onda de 405 nm (*) y 415 nm (x) que corresponden a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

longitudes de onda de la banda de Soret cuando se repitio el mismo procedimiento que en el ejemplo 1. En los casos de 405 nm (*) y 415 nm (x), sin embargo, la medicion se llevo a cabo despues de que las muestras se diluyeran 5 veces ya que la sensibilidad era demasiado alta. La fig. 3 revela que se puede obtener una curva de calibracion que tiene una buena linealidad para la longitud de onda de 550 nm de ejemplo, pero las curvas de calibracion de las longitudes de onda de 405 nm y 415 nm no son lineales.

La fig. 4 muestra cambios en el espectro cuando se forma el complejo F28 tetrafenilporfirina-litio. Se confirma claramente en la fig. 4 que la absorbancia aumentara linealmente con el aumento de la concentracion de litio de 6 mg/dl a 1,2 mg/dl, 1,8 mg/dl, 2,4 mg/dl y 3,0 mg/dl. Un pico de absorcion de 415 nm (banda de Soret) que es tipico para complejo de porfirina-metal y un pico de absorcion de 550 nm (mostrado en la fig. 4) aumentan y un pico de absorcion de 570 nm (tambien mostrado en la fig. 4) disminuye en proporcion a la concentracion de litio. Por lo tanto, se puede calcular una diferencia en absorbancia en estos picos de absorcion. En la presente invencion, la longitud de onda de 550 nm se usa preferentemente como una longitud de onda de medicion de fotometria debido a una buena linealidad en la curva de calibracion.

Es posible seleccionar un intervalo de longitud de onda de 540 nm a 560 nm como el intervalo de medicion fotometrico en lugar de la longitud de onda de 550 nm usada en el ejemplo 1. De hecho, algunos equipos de medicion pueden no tener un filtro fotometrico para los 550 nm. En tal caso, la longitud de onda de medicion de la fotometria se puede seleccionar a partir de un intervalo de longitud de onda en la proximidad tal como 540 nm o 560 nm donde la sensibilidad es tambien alta. Tambien se puede usar una longitud de onda de 570 nm como longitud de onda de medicion de fotometria, ya que la disminucion en la sensibilidad de la absorbancia a 570 nm es tambien cuantitativa como se muestra en la fig. 4. Por lo tanto, tambien se puede calcular una diferencia en la absorbancia (A Abs) a 570 nm con una referencia del reactivo como blanco.

En el raro caso que se produzcan algunos contaminantes que interfieran a la longitud de onda de 550 nm en una muestra de paciente y se produzcan datos erroneos a la longitud de onda de 550 nm, es posible seleccionar una longitud de onda de 570 nm o en la proximidad de desde 565 nm hasta 650 nm como la longitud de onda de medida en la fotometria para evitar tales problemas y para calcular la concentracion de litio a causa de una disminucion en la sensibilidad como una diferencia en absorbancia.

Ahora, explicaremos los datos experimentales del ejemplo 1 que muestran que la concentracion de litio puede medirse con gran exactitud con la composicion de reactivo de litio usada de acuerdo con la presente invencion. Resultados del experimento por espectrofotometro de luz ultravioleta-visible (HITACHI, modelo U-3900).

La fig. 2 muestra un resultado del experimento medido por un espectrofotometro de luz ultravioleta-visible (HITACHI, modelo U-3900) Un eje de abscisas es las concentraciones de iones litio conocidas (concentracion de Li, mg/dl) y un eje de ordenadas es la diferencia de absorbancia medida por el espectrofotometro de luz ultravioleta-visible a una longitud de onda de 550 nm.

La fig. 2 revela que se obtiene una buena linealidad en una relacion entre la absorbancia y la concentracion de litio.

Prueba de correlacion entre el metodo de absorcion atomica (metodo convencional) y el metodo de acuerdo con la presente invencion para una muestra de suero

La fig. 5 es un grafico que muestra una correlacion de los valores medidos entre el metodo de medicion del ejemplo 1 de acuerdo con la presente invencion y el metodo de absorcion atomica convencional (metodo convencional) llevado a cabo para la misma muestra de suero. Los valores medidos obtenidos por el metodo de absorcion atomica convencional (metodo convencional) se representan en el eje de abscisas (X), mientras que los valores medidos de acuerdo con la presente invencion se representan en el eje de ordenadas (Y). Una linea de regresion mostrada en la fig. 5 muestra una buena correlacion de mas del 95 %. Este resultado revela que el litio en una muestra de suero se puede determinar cuantitativamente mediante una absorciometria de luz ultravioleta-visible con la composicion de reactivo usada de acuerdo con la presente invencion.

Comparacion de los valores medidos realizados por analisis automatico para muestras de suero de control

La concentracion de litio se midio para las siguientes muestras de sueros de control en las que se valora la concentracion de litio:

- Precinorm U (Roche)

- Precipath U (Roche)

- Pathonorm H (SERO AS)

- Auto norm (SERO AS)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Utilizando un analizador automatico de bioqufmica(HITACHI, modelo H-7700) a una longitud de onda de medicion de fotometria de 546 nm (que es una longitud de onda ajustada en este analizador y esta cerca de 550 nm) por metodo de 1 punto final.

Parametros del dispositivo:

Reactivo

Muestra:

Longitud de onda de fotometria (principal/sub.): Tiempo de medicion:

Temperatura:

1 punto final:

0,24 ml 0,005 ml 546 nM/700 nM 10 minutos 37°C

metodo de aumento

Los resultados mostrados en la [tabla 1] de la fig. 6 demuestran tal hecho de que los valores medidos obtenidos por la presente invencion coinciden con los valores garantizados en las condiciones anteriores, de modo que se confirmo que la concentracion de litio en sueros se puede medir con exito mediante un analizador automatizado para pruebas clinicas.

Deteccion de litio por observacion visual

La [tabla 2] de la fig. 7 muestra los resultados de la observacion visual para liquidos de muestra de prueba. En esta prueba, se anadieron 920 pl de una solucion de reactivo de coloracion que era una mezcla del primer reactivo y el segundo reactivo usado de acuerdo con la presente invencion a 8 pl de una muestra de prueba y la mezcla resultante se hizo reaccionar durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de realizar la observacion visual. Los colores desarrollados se compararon con una guia de tono de color preparada usando sueros de control en una forma de las soluciones de concentracion de litio estandar a diferentes niveles de concentracion de litio.

Se confirmo un claro cambio de color de amarillo a rojo en los respectivos niveles de concentracion y el cambio en el color de los sueros de control coincide con la guia de color de los sueros de control. A partir de este hecho, se demostro o se confirmo que la concentracion de litio en suero se puede determinar rapida y facilmente sin usar equipo especifico de acuerdo con la presente invencion.

Como se ha explicado anteriormente, se confirma que la concentracion de litio se puede medir a alta precision usando el reactivo de litio del ejemplo 1 de acuerdo con la presente invencion.

Ejemplo 2

Se repitio el procedimiento del ejemplo 1 pero se cambio el primer reactivo en la composicion de reactivo de litio anadiendo 0,1 M (mol/l) de MOPS para ajustar a pH 8,0 y anadiendo agua pura hasta el volumen total de 1 litro. A saber, una mezcla del primer reactivo, el segundo reactivo y el reactivo se ajusto a casi pH = 8 a un tiempo de medicion.

(1) El primer reactivo (como estabilizante y solucion de tampon):

Reactivo quelante: ninguno

Disolvente organico: ninguno

Estabilizante (tensioactivo no ionico dispersante): Triton X-100 @

polioxietilen octilfenil eter: 1,0 % en peso

Agente de enmascaramiento: trietanolamina: 10 mM

Se anadio 0,1 M de MOPS a la mezcla anterior para ajustar el pH de la mezcla a pH 8. A continuacion, el volumen total se aumento a 1 litro con agua purificada y la solucion resultante se almaceno en un recipiente de almacenamiento de proposito general.

(2) El segundo reactivo (como una solucion de reactivo de coloracion):

Reactivo quelante: F28 tetrafenilporfirina: 0,5 g/l

Disolvente organico: Dimetilsulfoxido (DMSO): 20 % en peso

Estabilizante (dispersante, tensioactivo no ionico): TritonX - 100 @

(polioxietilen octilfenil eter) 1,0 % en peso

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

agente de enmascaramiento:

trietanolamina 10 mM

A una mezcla de los componentes anteriores, se anadio 0,05 M de MOPS (tampon) para ajustar el pH a pH 7,0 y se anadio agua purificada hasta el volumen total de 1 litro, que se almaceno en un recipiente de uso general.

De la misma manera que en el ejemplo 1, se anadieron 720 gl del primer reactivo (solucion de tampon) y 240 gl del segundo reactivo (solucion de reactivo de coloracion) a 6 gl de una muestra de prueba en un momento en que se midio la concentracion de litio. Despues de continuar la reaccion durante 10 minutos a temperatura ambiente, se midio la absorbencia a una longitud de onda de 550 nm mediante un espectrofotometro de luz ultravioleta-visible (tipo HITACHI U-3900).

Resultado experimental en el espectrofotometro de luz ultravioleta-visible (tipo HITACHI U-3900)

La fig. 8 es un grafico del resultado experimental del espectrofotometro de luz ultravioleta-visible (HITACHI, tipo U- 3900). La abscisa (X) es las concentraciones de iones litio conocidas (concentracion de Li, mg/dl) y la ordenada (Y) representa las diferencias en la absorbancia a 550 nm en el espectrofotometro de luz ultravioleta-visible.

La fig. 8 revela que la diferencia de absorbancia es proporcional de manera dependiente a la concentracion de litio para la composicion de reactivo preparada a pH 8 o bajo una condicion de medicion de pH 8 y que se obtiene tambien una buena linealidad de una curva de calibracion a pH 8.

Sin embargo, en la condicion de medicion de pH 8, la cinetica de reaccion disminuye un poco y se estabiliza cuantitativamente en aproximadamente de 10 minutos a 20 minutos. En el caso de pH 10, la reaccion se completa en 10 minutos. Por lo tanto, en el sistema de tamponacion en un intervalo de pH 5 a pH 10 de la composicion de reactivo de litio de la presente invencion, no hay necesidad de usar un sistema de tamponacion de pH superior a 11 basado en una solucion de hidroxido denso tal como hidroxido de sodio e hidroxido de potasio por si caso, y por lo tanto la manipulacion de la operacion se hace mas simple. El intervalo de pH se puede ajustar de acuerdo con las necesidades deseadas y se ajusta preferentemente a pH 10 en el que la cinetica de reaccion es rapida y se puede mantener suficiente poder tampon con el tampon de Good, el sistema de cloruro de amonio y el sistema de acido carbonico. Desde un punto de vista practico, es aconsejable llevar a cabo con un sistema de tamponacion de pH 10 del ejemplo 1 en el que la reaccion avanza con precision.

Asi pues, en la composicion de reactivo de litio usada de acuerdo con la presente invencion, es necesario usar un tampon de pH que funcione como modificador de pH para ajustar el pH a un intervalo de 7 a 12 o un tampon de pH como modificador de pH. Mas deseablemente, es preferente usar un modificador de pH o un tampon de pH que ajusta el pH a pH 8 a pH 11 y mas preferentemente usar un modificador de pH o tampon de pH que ajusta el pH alrededor de pH 10.

Ejemplo 3

Ahora, se explicara la seleccion del disolvente organico. En la invencion, es importante que el disolvente sea un disolvente organico que sea miscible con agua ya que las soluciones de reaccion a medir son soluciones acuosas tales como suero. El disolvente puede ser un liquido que consta principalmente de un disolvente organico o una solucion acuosa que contiene un disolvente organico, siempre que los componentes en la composicion de reactivo se estabilicen como una solucion acuosa. En particular, cuando la concentracion de litio en la muestra se mide mediante un analizador automatizado de uso general y por un espectrofotometro de luz ultravioleta-visible, es deseable usar basicamente una solucion acuosa que contenga disolvente organico.

Otros disolventes organicos que se pueden mezclar con agua ademas de los ejemplos 1,2 se explican en el ejemplo 3. En el ejemplo 3, se repitio el mismo procedimiento que en el ejemplo 1, pero el disolvente organico del segundo reactivo de dimetilsulfoxido (DMSO) (20 % en peso) en la composicion de reactivo de litio se reemplazo por dimetilformamida (DMF) (20 % en peso).

(1) El primer reactivo (como solucion de tampon):

- Reactivo quelante: ninguno

- Disolvente organico: ninguno

- Estabilizante (dispersante: tensioactivo no ionico): TritonX-100®

(polioxietilen octilfenil eter) 1,0 % en peso

- Reactivo de fabricacion: trietanolamina 10 mM,

En una mezcla de los componentes anteriores, se anadio 7 % en peso de cloruro de amonio para ajustar el pH a pH 10 y se anadio agua purificada hasta el volumen total de 1 litro, que se almaceno en un recipiente de uso general.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

(2) El segundo reactivo (como solucion de reactivo de coloracion)

- Reactivo quelante:

- Disolvente organico:

- Estabilizante (agente dispersante: tensioactivo no

- Reactivo de enmascaramiento:

F28 tetrafenilporfirina: 0,5 g/l

Dimetilformamida (DMF): 20 % en peso

ionico) TritonX-100®

(polioxietilen octilfenil eter) 1,0 % en peso

trietanolamina 10 mM

En una mezcla de los componentes anteriores, se anadieron 0,05 M de MOPS (tampon) para ajustar el pH a pH 7,0 y se anadio agua purificada hasta el volumen total de 1 litro, que se almaceno en un recipiente de uso general.

Ejemplo 4

Como el disolvente organico que es miscible con agua, se uso dimetilsulfoxido (DMSO) (20 % en peso) en el ejemplo 1 y se uso dimetilformamida (DMF) (20 % en peso) en el ejemplo 2.

En este ejemplo 4, se preparo una composicion de reactivo de litio usando dimetilacetamida (DMA) (20 % en peso) como un disolvente organico que es miscible con agua y la concentracion de litio se midio mediante la composicion de reactivo de litio.

(1) El primer reactivo (como solucion de tampon):

- Reactivo quelante:

- Disolvente organico:

- Estabilizante (dispersante: tensioactivo no ionico):

- Reactivo de fabricacion:

ninguno

TritonX-100®

(polioxietilen octilfenil eter) 1,0 % en peso trietanolamina 10 mM

(2) El segundo reactivo (como solucion de reactivo de coloracion)

F28 tetrafenilporfirina: 0,5 g/l dimetilacetamida (DMA): 20 % en peso TritonX-100®

(polioxietilen octilfenil eter) 1,0 % en peso trietanolamina 10 mM

- Reactivo quelante:

- Disolvente organico:

- Estabilizante (agente dispersante: tensioactivo no ionico)

- Reactivo de enmascaramiento:

La fig. 9 muestra los resultados de una comparacion de litio detectado en la muestra de suero de control, en la que se midio la concentracion de litio por el mismo procedimiento que en el ejemplo 1, pero el disolvente organico se cambio de dimetilsulfoxido (DMSO) del ejemplo 1 a dimetilformamida (DMF) en el ejemplo 3 y a dimetilacetamida (DMA) en el ejemplo 4. La [tabla 3] de la fig. 9 muestra los resultados de una comparacion entre el metodo de medicion convencional y el metodo de medicion de acuerdo con la presente invencion.

La [tabla 3] de la fig. 9 que muestra una "Comparacion entre diferentes disolventes organicos" muestra los siguientes resultados: un valor medido obtenido usando dimetilformamida (DMF) (20 % en peso) como disolvente organico que es miscible con agua en el ejemplo 1 fue 0,83 mM (mmol/l); Un valor medido obtenido usando dimetilformamida (DMF) (20 % en peso) como disolvente organico que es miscible con agua en el ejemplo 3 fue de 0,82 mM (mmol/l); Y un valor medido obtenido usando dimetilacetamida (DMA) (20 % en peso) como disolvente organico que es miscible con agua en el ejemplo 4 fue 0,81 mM (mmol/l). Estos valores coinciden en mas del 95 % con un valor medido obtenido por espectrofotometria de absorcion atomica 0,82 mM (mmol/l). Por lo tanto, es posible determinar cuantitativa y exactamente la concentracion de litio en muestras acuosas tales como suero dispersando uniformemente F28 tetrafenilporfirina en estos disolventes organicos para preparar la composicion de reactivo liquido usada de acuerdo con la presente invencion.

Ejemplo 5

5

10

15

20

25

30

35

En este ejemplo 5, se explica la seleccion del estabilizante para la composicion de reactivo de litio usada de acuerdo con la presente invencion.

El uso de estabilizantes para las composiciones de reactivo de litio en los ejemplos 5 a 7 es basicamente igual que en el ejemplo 1, pero el estabilizante se cambio a un tensioactivo no ionico solo (ejemplo 5), un tensioactivo anionico (ejemplo 6) y ambos un tensioactivo no ionico y un tensioactivo anionico (ejemplo 7 ) respectivamente.

En el ejemplo 5 siguiente, la composicion de reactivo de litio contiene solo tensioactivo no ionico (TritonX-100®) (polioxietilen octilfenil eter) como estabilizante. Otros componentes en la composicion de reactivo de litio son los mismos que en el Ejemplo 1.

Ejemplo 5

(1) El primer reactivo (como solucion de tampon):

- Reactivo quelante:

- Disolvente organico:

- Estabilizante (dispersante: tensioactivo no ionico):

- Reactivo de fabricacion:

ninguno

TritonX-100®

(polioxietilen octilfenil eter) 1,0 % en peso trietanolamina 10 mM

(2) El segundo reactivo (como solucion de reactivo de coloracion)

F28 tetrafenilporfirina: 0,5 g/l Dimetilsulfoxido (DMSO): 20 % en peso TritonX-100®

(polioxietilen octilfenil eter) 1,0 % en peso trietanolamina 10 mM

- Reactivo quelante:

- Disolvente organico:

- Estabilizante (agente dispersante: tensioactivo no ionico)

- Reactivo de enmascaramiento:

Ejemplo 6

En el ejemplo 6, la composicion contiene solo tensioactivo anionico (dodecilsulfato de sodio (Wako Junyaku).

(1) El primer reactivo (como solucion de tampon):

- Reactivo quelante:

- Disolvente organico:

- Estabilizante (dispersante: tensioactivo anionico solo):

- Reactivo de fabricacion:

ninguno

dodecilsulfato de sodio (Wako Junyaku) 1,0 % en peso

trietanolamina 10 mM

(2) El segundo reactivo (como solucion de reactivo de coloracion)

F28 tetrafenilporfirina: 0,5 g/l

Dimetilsulfoxido (DMSO): 20 % en peso

dodecilsulfato de sodio (Wako Junyaku) 1,0 % en peso

trietanolamina 10 mM

- Reactivo quelante:

- Disolvente organico:

- Estabilizante (agente dispersante: tensioactivo anionico solo):

- Reactivo de enmascaramiento:

En una mezcla de los componentes anteriores, se anadieron 0,05 M de MOPS (tampon) para ajustar el pH a pH 7,0.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

A continuacion, el volumen total se aumento a 1 litro con agua purificada y la solucion resultante se almaceno en un recipiente de almacenamiento de uso general.

Ejemplo 7

En el ejemplo 7, la composicion contiene tanto tensioactivo anionico como tensioactivo no ionico como estabilizante en la composicion de reactivo de litio.

(1) El primer reactivo (como solucion de tampon):

- Reactivo quelante: ninguno

- Disolvente organico: ninguno

- Estabilizante (dispersante: tensioactivo no ionico y tensioactivo anionico):

(a) tensioactivo no ionico: TritonX-100® (polioxietilen octilfenil eter) 1,0 % en peso

(b) tensioactivo anionico: dodecilsulfato de sodio (Wako Junyaku) 1,0 % en peso

- Reactivo de fabricacion: trietanolamina 10 mM

En una mezcla de los componentes anteriores, se anadio 7 % en peso de cloruro de amonio para ajustar el pH a pH 10. A continuacion, el volumen total se aumento a 1 litro con agua purificada y la solucion resultante se almaceno en un recipiente de almacenamiento de uso general.

(2) El segundo reactivo (como solucion de reactivo de coloracion)

- Reactivo quelante: F28 tetrafenilporfirina: 0,5 g/l

- Disolvente organico: Dimetilsulfoxido (DMSO): 20 % en peso

- Estabilizante (agente dispersante: tensioactivo no ionico y tensioactivo anionico):

(b) tensioactivo anionico: dodecilsulfato de sodio (Wako Junyaku) 1,0 % en peso

- Reactivo de enmascaramiento: trietanolamina 10 mM

En una mezcla de los componentes anteriores, se anadieron 0,05 M de MOPS (tampon) para ajustar el pH a pH 7,0. A continuacion, el volumen total se aumento a 1 litro con agua purificada y la solucion resultante se almaceno en un recipiente de almacenamiento de uso general.

La concentracion de litio en la muestra de suero de control se determino cuantitativamente por el mismo procedimiento que en el ejemplo 1 usando composiciones de reactivo de litio preparadas en el ejemplo 5, ejemplo 6 y ejemplo 7. Los resultados se resumen en la [tabla 4] de la fig. 10 "Comparacion de valores medidos entre diferentes estabilizantes".

La fig. 10 revela que los valores medidos coinciden mas de 95 % entre un valor medido para el tensioactivo no ionico solo (0,82 mM), un valor medido para tensioactivo anionico solo (0,82 mM) y un valor medido para dos tensioactivos (0,83 mM).

Este resultado muestra que se pueden obtener casi los mismos valores de medicion independientemente del tipo de tensioactivo usado o de su combinacion. Por lo tanto, los tensioactivos se pueden usar en combinacion para una muestra en la que preocupa la suspension o la turbidez.

Ahora, se explica la seleccion del reactivo de enmascaramiento para la composicion de reactivo de litio. En los ejemplos antes mencionados, se uso trietanolamina como reactivo de enmascaramiento para la composicion de reactivo de litio, pero tambien se puede usar acido etilendiaminotetraacetico (EDTA).

El ejemplo 5 muestra un caso de una composicion de reactivo de litio que contiene trietanolamina como reactivo de enmascaramiento, el ejemplo 8 muestra un caso de acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) solo y el ejemplo 9 muestra un caso que contiene ambos reactivos de enmascaramiento.

Ejemplo 8

En el ejemplo 8, se uso acido etilendiaminotetraacetico de potasio (EDTA, 2K) solo como reactivo de enmascaramiento.

(1) El primer reactivo (como solucion de tampon):

5

10

15

20

25

30

- Reactivo quelante:

- Disolvente organico:

- Estabilizante (dispersante: tensioactivo no ionico):

- Reactivo de fabricacion:

ninguno

TritonX-100®

(polioxietilen octilfenil eter) 1,0 % en peso

acido etilendiaminotetraacetico (EDTA 2K) (Dojin Chemical) 10 mM

(2) El segundo reactivo (como solucion de reactivo de coloracion)

- Reactivo quelante:

- Disolvente organico:

- Estabilizante:

- Reactivo de enmascaramiento:

(polioxietilen octilfenil eter): 1,0 % en peso

acido etilendiaminotetraacetico (EDTA 2K) (Dojin Chemical): 10 mM

Ejemplo 9

En el ejemplo 9, tanto la trietanolamina como el acido etilendiaminotetraacetico (EDTA 2K) se usan en combinacion como un reactivo de enmascaramiento.

(1) El primer reactivo (como solucion de tampon):

- Reactivo quelante:

ninguno

- Disolvente organico:

- Estabilizante (dispersante: tensioactivo no ionico):

- Reactivo de fabricacion:

ninguno

TritonX-100®

(polioxietilen octilfenil eter): 1,0 % en peso trietanolamina 10 mM

(2) El segundo reactivo (como solucion de reactivo de coloracion)

- Reactivo quelante: F28 tetrafenilporfirina: 0,5 g/l

- Disolvente organico: Dimetilsulfoxido (DMSO): 20 % en peso

- Estabilizante: T ritonX-100® (polioxietilen octilfenil eter) 1,0 % en peso

- Reactivo de enmascaramiento: trietanolamina: 10 mM

acido etilendiaminotetraacetico (EDTA 2K) (Dojin Chemical): 0,1 mM

La concentracion de litio en la muestra de suero de control se determino cuantitativamente por el mismo procedimiento que en el ejemplo 1 usando composiciones de reactivo de litio preparadas en el ejemplo 8 y ejemplo 9. Los resultados se resumen en la [tabla 5] de la fig. 11 "Comparacion de valores medidos entre diferentes agentes de enmascaramiento".

La fig. 11 revela que los valores medidos coinciden en mas del 95 % entre un valor medido para la trietanolamina sola (0,83 mM), un valor medido para el acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) solo (0,83 mM) y un valor medido para su uso combinado (0,82 mM).

Este resultado muestra que pueden obtenerse casi los mismos valores de medicion independientemente del tipo de agente de enmascaramiento usado o de su combinacion. Por lo tanto, puede usarse agente (s) de enmascaramiento adecuado (s) para prevenir la degradacion del reactivo provocado por los iones metalicos traza que pueden estar contenidos en un reactivo almacenado. El agente de enmascaramiento puede usarse para una muestra de prueba 10 que contiene iones de inclusion en exceso.

Como se ha explicado en los ejemplos anteriores de acuerdo con la presente invencion, la concentracion de litio en solucion acuosa tal como muestra ambiental y muestra biologica se puede determinar mediante el colorimetro conveniente y se puede juzgar inmediatamente por observacion visual.

15

Un alcance de la presente invencion no se debe limitar a los ejemplos, sino que esta definido por las reivindicaciones. Los detalles de los ejemplos se pueden cambiar, alterar y modificar a condicion de que la caracteristica de la presente invencion no se vea afectada. Por ejemplo, en los ejemplos 1-9, la composicion de reactivo para determinar la concentracion de litio se divide en dos reactivos del primer y segundo reactivo por 20 separado para almacenar la composicion de reactivo durante un plazo mas largo. Sin embargo, si la medicion se lleva a cabo dentro de un periodo corto, el primer reactivo y el segundo reactivo se pueden mezclar desde el principio y la mezcla resultante se usa en la medicion.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Uso de una composicion acuosa de reactivo de litio para medir la cantidad de litio, caracterizado por comprender un compuesto que tiene una estructura representada por la formula (I):

imagen1

en la que todos los hidrogenos unidos a carbonos de una tetrafenilporfirina estan reemplazados por atomos de fluor (F28 tetrafenilporfirina), un disolvente organico miscible en agua elegido de dimetilsulfoxido (DMSO), dimetilformamida (DMF) y dimetilacetamida (DMA), y un modificador de pH para ajustar el pH a un intervalo de pH 5 a pH 12, para medir una coloracion del complejo de litio resultante en una longitud de onda que varfa desde 530 nm a 560 nm, preferentemente a 550 nm.
2. Uso de la composicion acuosa de reactivo de litio de la reivindicacion 1, en el que dicho modificador de pH se selecciona de acidos incluyendo acido clorhfdrico, acido nftrico, acido acetico, acido fosforico, acido cftrico, acido carbonico, acido bicarbonico, acido oxalico y sus sales, medicamento alcalino incluyendo hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, amonfaco y sus sales.
3. Uso de la composicion acuosa de reactivo de litio de la reivindicacion 1, en el que dicho modificador de pH es un tampon de pH seleccionado de acido cftrico, acido carbonico, acido bicarbonico, acido fosforico, acido succfnico, acido ftalico, cloruro de amonio, hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, MES como tampon de Good, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricina, Bicina, TAPS, CHES, CAPSO, CAPS y sus sales.
4. Uso de la composicion acuosa de reactivo de litio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la composicion de reactivo desarrolla una reaccion de color para litio en un intervalo desde pH 5 a pH 11, preferentemente en un intervalo desde pH 8 a pH 11.
5. Uso de la composicion acuosa de reactivo de litio de la reivindicacion 1, que incluye un estabilizante.
6. Uso de la composicion acuosa de reactivo de litio de la reivindicacion 5, en el que dicho estabilizante es un tensioactivo no ionico y/o un tensioactivo anionico.
7. Uso de la composicion acuosa de reactivo de litio para litio de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que dicho tensioactivo no ionico se selecciona de esteres de acido graso de sorbitano, esteres parciales de acido graso de pentaeritritol, esteres de acido graso de propilenglicol, monoester de acido graso de glicerina, polioxietilen alquil eter, polioxietilen alquil fenil eter, polioxietileno polioxipropilenglicol, esteres parciales de acido graso de polioxietileno, esteres parciales de acido graso de polioxietilen sorbitol, esteres de acido graso de polioxietileno, dietanolamida de acido graso, monoetanolamida de acido graso, amida de acido graso de polioxietileno, polioxietilen octilfenil eter, p- nonil fenoxipoliglicidol y sus sales y dicho tensioactivo anionico es una sal de ester alquilsulfato que incluye dodecilsulfato de sodio, sal de sulfato de polioxietilen alquil eter que incluye sulfato de sodio de polioxietilen alquil fenil eter, sales de alquilbencenosulfonato incluyendo dodecilbencenosulfonato de sodio y alcanosulfonato.
8. Uso de la composicion acuosa de reactivo de litio para litio de acuerdo con la reivindicacion 1, que incluye un reactivo de enmascaramiento.
9. Uso de la composicion acuosa de reactivo de litio para litio de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que dicho reactivo de enmascaramiento se elige de trietanolamina, etilendiamina, N,N,N',N'-tetraquis-2- (piridilmetil)etilendiamina (TPEN), piridina, 2,2-bipiridina, propilendiamina, dietilentriamina, dietilentriamino- N,N,N',N",N"-pentaacetato (DTPA), trietilentetramina, trietilentetramino-N,N,N',N",N",N"-hexaacetato (TTHA), 1,10- fenantrolina, etilendiaminotetraacetato (EDTA), O,O'-bis(2-aminofenil)etilenglicol-N,N,N',N'-tetraacetato (BAPTA), N,N-bis(2-hidroxietil)glicina (Bicina), trans-1,2-diaminociclohexano-N,N,N',N'-tetraacetato (CyDTA), O,O'-bis(2- aminoetil)etilenglicol-N,N',N'-tetraacetato (EGTA), N-(2-hidroxil)iminodiacetato (HIDA), acido iminodiacetico (IDA) acido nitrilotriacetico (NTA), trimetilfosfonato de nitrilo (NTPO) y sus sales.

5

10

15

20

25

30

35

40

45
10. Uso de la composicion acuosa de reactivo de litio para litio de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentracion de dicha F28 tetrafenilporfirina en la composicion de reactivo de litio varfa desde 0,1 a 1,0 g/l, y es preferentemente 0,5 g/l.
11. Un kit de reactivo de litio para formar una composicion acuosa de reactivo de litio como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 5 a 10, que comprende:

un primer reactivo que comprende el estabilizante y el modificador de pH, y

un segundo reactivo que incluye el compuesto que tiene la estructura representada por la formula (I):

imagen2

en la que todos los hidrogenos unidos a carbonos de una tetrafenilporfirina estan reemplazados por atomos de fluor (F28 tetrafenilporfirina) como se define en la reivindicacion 1, el disolvente organico soluble en agua elegido de dimetilsulfoxido (DMSO), dimetilformamida (DMF) y dimetilacetamida (DMA), el estabilizante y el modificador de pH,

estando almacenados por separado dichos primer y segundo reactivos y mezclados justo antes de la operacion de medicion o se almacenan en forma de mezcla, para formar dicha composicion acuosa de reactivo de litio que puede desarrollar una reaccion de color para litio en un pH que varfa desde 5 a 12.
12. Un kit de reactivo de litio de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que la concentracion de dicha F28 tetrafenilporfirina en la composicion acuosa de reactivo de litio despues de la mezcla de dicho primer reactivo y de dicho segundo reactivo varfa desde 0,1 a 1,0 g/l y es preferentemente 0,5 g/l.
13. Un metodo para determinar la cantidad de iones litio en plasma sangufneo o suero en una muestra de prueba, caracterizado por:

poner en contacto la muestra de prueba con una composicion acuosa de reactivo de litio obtenida a partir del kit de reactivo de litio de acuerdo con la reivindicacion 11 o la reivindicacion 12,

medir la coloracion del complejo de litio resultante por la sensibilidad en el espectro a una longitud de onda que varfa desde 530 nm a 560 nm, preferentemente en la proximidad de una longitud de onda de 550 nm o a una longitud de onda que varfa desde 565 nm a 650 nm, preferentemente en la proximidad de una longitud de onda de 570 nm, y

calcular la cantidad de litio del espectro resultante.
14. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 13, en el que dicha composicion acuosa de reactivo de litio se obtiene mezclando dichos primer y segundo reactivos del kit de reactivo de litio justo antes de la operacion de medicion o dichos primer y segundo reactivos del kit de reactivo de litio se almacenan en forma de mezcla.
15. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 13 o la reivindicacion 14, en el que la concentracion de dicha F28 tetrafenilporfirina en la composicion acuosa de reactivo de litio varfa desde 0,1 a 1,0 g/l, y es preferentemente 0,5 g/l.
16. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 13 a 15, en el que la composicion de reactivo desarrolla una reaccion de color para litio en un intervalo desde pH 5 a pH 11, preferentemente en un intervalo desde pH 8 a pH 11.