KR20140114902A

KR20140114902A - 리튬 시약 조성물, 이것을 사용한 리튬 이온 측정 방법 및 측정 장치

Info

Publication number: KR20140114902A
Application number: KR1020147024338A
Authority: KR
Inventors: 다쿠야 이와부치; 쓰기카쓰 오다시마
Original assignee: 메탈로제닉스 가부시키가이샤
Priority date: 2012-04-06
Filing date: 2012-04-25
Publication date: 2014-09-29
Also published as: EP2835637A4; EP3179246B1; AU2012376362B2; US20170102371A1; SG11201406329XA; TWI531574B; EP3179246A1; JP5100903B1; CA2869125C; CN104520705B; WO2013150663A1; RU2571073C1; CN104520705A; AU2012376362A1; US9562886B2; KR101499603B1; TW201348237A; US20150079687A1; ES2628313T3; US10690648B2

Abstract

[과제] 생체 시료나 환경 시료 등의 수용액 중의 리튬을 간편한 비색계(比色計)나 자외-가시 분광 광도계에 의해 즉시 정량(定量) 측정할 수 있고, 또한 육안으로 판정을 가능하게 하는 리튬 농도 정량을 위한 리튬 시약 조성물, 이것을 사용한 리튬 이온 측정 방법 및 측정 장치를 제공한다.
[해결 수단] F28 테트라페닐포르피린을 킬레이트제로 하여, 여기에 물에 혼합될 수 있는 유기용제와 pH 조절제와 안정제를 포함하는 리튬 시약 조성물, 이것을 사용한 리튬 이온 측정 방법 및 측정 장치이다.

Description

리튬 시약 조성물, 이것을 사용한 리튬 이온 측정 방법 및 측정 장치{LITHIUM REAGENT COMPOSITION, AND METHOD AND DEVICE FOR DETERMINING LITHIUM ION AMOUNT USING SAME}

본 발명은, 생체 시료나 환경 시료 등의 수용액 중의 리튬의 정량 측정에 사용하는 리튬 시약 조성물, 이것을 사용한 리튬 이온 측정 방법 및 측정 장치에 관한 것이다.

종래부터 리튬이 함유된 기분 안정약·항우울증약이 유효하기 때문에 많이 사용되고 있지만, 투여 시에는 혈청 중의 리튬 농도를 적정 범위로 컨트롤할 필요가 있다.

액체 중의 리튬의 정량(定量) 측정에 사용되는 리튬 시약 조성물로서, 일반적으로는, 쌍극성(極性)장애(조우울증)의 치료약, 또는 항우울증약과 함께 기분 안정약으로서 탄산 리튬정(경구 투여)가 널리 처방되고 있다. 탄산 리튬(Li₂CO₃)은 리튬 중독이 되는 혈중 농도 부근까지 처방하지 않으면 투여 효과가 나타나지 않는 특징을 가지고 있고, 치료역과 중독역이 극히 가까우므로, 약물 혈중 농도 모니터링이 필요 항목(TDM)으로 지정되어 있다.

더욱 상세하게는, 항상, 투약 환자의 시료 혈장 내의 리튬 농도가 0.6∼1.2 mEq/L로 되도록 조절하지 않으면 안되며, 이는 혈청 중의 리튬 농도가 0.6 mEq/L 이하로 지나치게 적으면 항울 효과가 없고, 반대로, 일반적으로 혈장 농도가 1.5 mEq/L를 넘어 과잉으로 투여되어 농도가 커져서 리튬 중독을 일으켜 과량 복용이 치명적이 되는 경우가 있으며, 진전(tremor), 구어 장애, 안진, 신장 장애, 경련을 포함하는 중독 증상이 나타난다. 만약 잠재적으로 위험한 이러한 징조가 관찰될 때에는, 치료를 중지하고, 혈장 농도를 재측정하고, 리튬의 중독을 완화하는 조치를 행하지 않으면 안된다.

이와 같이, 리튬염의 항우울증약은 우울증 환자의 치료 등에 효과가 있지만, 과잉 투여의 경우에는 중대한 장애가 생기므로, 리튬 함유의 항우울증약을 투여하는 경우에는, 항상 혈청 중의 리튬 농도가 0.6∼1.2 mEq/L가 되도록 감시하는 것이 필수 사항이다.

따라서, 종래, 혈청 중의 리튬의 정량 측정이 필요하게 되어 리튬의 비색 측정을 가능하게 하는 임상 검사용 액상(液狀) 시약 조성물의 개발이 진행되고 있다.

이 선행 기술로서, 특허 문헌 1에는 원색체 크립탄드이노포어를 사용한 생물학적 검체 중의 리튬 농도를 측정하는 시약 조성물에 대하여 개시되어 있다.

또한, 특허 문헌 2에는, 피롤환을 가지는 대환상(大環狀) 화합물로서, 피롤환의 β 위치에 8개의 브롬(Br) 원자를 결합시켜, 리튬 이온과 반응하는 분석 시약에 대해 기재되어 있다.

그리고, 비특허 문헌 1로서, 테트라페닐포르피린의 탄소에 결합되어 있는 수소를 전부 불소로 치환한 화합물에 의해, 리튬 이온의 검출·분리할 수 있는 것에 대해 개시되어 있다.

일본공개특허 평7-113807호 공보 유럽 특허 1283986호 공보(B1)

분석 화학 Vol.51, No.9, PP.803-807(2002)[F28 테트라페닐포르피린의 합성과 리튬 이온의 분리·검출로의 응용] 코야나기 켄지·타바타 마사아키

종래의 리튬 시약 조성물로서 몇 가지 알려져 있지만, 그 조성이 독극물이거나 원약의 공급이 불안정하며 고가이고, 대부분의 원약이 물에 용해되지 않거나, 또는 물에 용해되면 실활하여 발색하지 않고, 발색 반응이 늦다.

이러한 점을 극복했다고 하는 특허 문헌 2에 개시된 기술은, 발색법을 가능하게 하고 있지만, 발색 감도가 지나치게 크기 때문에 검체의 희석 처리가 필요하며, 시약 조성물의 사양이 pH 11 이상이므로, 공기 중의 CO₂에 의해 변질되기 쉽고, 측정 데이터가 불안정하고, 또한 pH 11 이상이 되면, 수산화 나트륨이나 수산화 칼륨과 같이 농후한 수산화물 용액 밖에 사용할 수 없기 때문에 pH를 일정하게 유지하지 못하고, 또한, 이들은 극물이므로, 사용자에게도 기피적인 것이며 취급하기 번거로우며 실제 보존에는 범용이 아닌 전용 용기가 필요하며, 이러한 결함을 보충하기 위해 기계적 설비가 대형이면서 전용 기기가 필요하며 범용성이 부족한 문제점이 있었다. 이 때문에, 온 사이트 모니터링, POCT(Point Of Care Testing)에 적용시키는 것이 곤란한 문제점도 있었다.

그런데, 전술한 특허 문헌 1의 리튬의 정량을 목적으로 하는 시약 조성물은, 본 발명과는 전혀 상이한 화합물을 사용하고 있지만, pH 12에서 밖에 사용할 수 없으므로, 전술한 바와 같이, pH 11 이상이 되면, 수산화 나트륨이나 수산화 칼륨과 같이 농후한 수산화물 용액 밖에 사용하지 못하며, 이들은 극물이므로, 사용자에게도 취급하기 번거로우며, 또한 이들을 보충하기 위해서 대형의 전용 기기가 필요하며, 범용성이 부족한 문제점이 있었다.

또한, 비특허 문헌 1인 코야나기 등의 논문은, F28 테트라페닐포르피린을 사용하여 리튬 이온의 분리·검출할 수 있는 것에 대하여 개시되어 있지만, 유성이면서, 또한 독극물인 클로로포름을 사용한 용매 추출을 행하지 않으면, 리튬의 검출·분리는 행할 수 없었다. 무엇보다도, 수용액 중의 리튬을 번거로운 전처리(前處理)없이 직접 정량하지 못하고, 특히, 혈청 중의 리튬 이온을 신속하면서, 또한 정량적으로 측정할 수 없는 문제점이 있었다. 이와 같이, F28 테트라페닐포르피린을 사용하여 수용액 중의 리튬 이온을 검출하기는 곤란하며, 정량적으로 농도를 측정하는 것은 곤란하여 지금까지 실현되지 않았다.

본 발명은, 전술한 문제점을 해결하기 위해 행해진 것이며, 생체 시료나 환경 시료 등의 수용액 중의 리튬의 농도(정량)를 측정할 수 있는 리튬 시약 조성물, 이것을 사용한 리튬 이온 측정 방법 및 측정 장치를 제공하도록 하는 것이며, 또한 간편한 비색계에 의해 즉시 리튬의 농도를 측정할 수 있고, 또한 육안에 의해 스크리닝 판정이 가능한 리튬 시약 조성물, 이것을 사용한 리튬 이온 측정 방법 및 측정 장치를 제공하도록 하는 것이다.

상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은, 테트라페닐포르피린의 탄소에 결합되어 있는 수소를 전부 불소로 치환한 구조식

[화학식 1]

으로 표시되는 화합물과 물에 혼합될 수 있는 유기용제와, pH 조절제를 포함하는 것을 특징으로 하는 리튬 시약 조성물이다.

생체 시료나 환경 시료 등의 수용액 중의 리튬이 상기 리튬 시약 조성물, 특히 테트라페닐포르피린의 탄소에 결합되어 있는 수소를 전부 불소로 치환한 화합물이 킬레이트제(발색제)가 되어 발색한다.

F28 테트라페닐포르피린 화합물과 리튬 이온과의 발색 반응인 황색으로부터 적색으로의 정색(呈色) 변화를 얻는 것은 어렵지만, 혈청의 리튬 농도가 0.6 mg/dL∼2.0 mg/dL(0.9 mM∼3 mM)의 범위에 있어서 정량값의 정확성이 요구되고 있으므로, 본 발명의 실시예에서는, 상기한 리튬의 농도 범위에 있어서는, F28 테트라페닐포르피린의 화합물의 농도를 0.1∼1.0 g/L로 하고, 바람직하게는, 0.5 g/L로 하면 정확하게 측정할 수 있는 것도 발견하였다.

본 발명의 pH 조절제에 대하여, 그것이, pH 5.0 미만의 산성 측에서는, 본 발명의 발색제(킬레이트제)인 F28 테트라페닐포르피린 화합물과 리튬 이온은 결합하지 않기 때문에, 정색 변화가 일어나지 않아, 리튬의 정량은 곤란하다. 또한, pH가 5∼7의 사이에서는 상기 발색제와 리튬 이온은 특이적으로 반응하지만, 발색 속도가 완만하다. 한편, pH 8∼11에서는 상기 발색제와 리튬 이온은 신속하게 반응하고, 또한 안정적인 발색 착체를 얻을 수 있다. pH 11을 초과하는 알칼리성 측에서는, 상기 킬레이트제, 생성한 발색 착체의 색조의 경시적(經時的)인 안정성이 좋지 못하다. 이는, 공기 중의 이산화탄소를 흡수하는 것에 의한 pH의 변동이 쉽게 생기기는 것에 기인한다. 따라서, 리튬 시약 조성물의 pH 조절제로서는 pH를 7 내지 12의 범위로 하는 pH 조절제, 또는 pH 조절제로서의 pH 완충제가 필요하며, 더욱 바람직하게는, pH 8∼11이 되도록 하는 pH 조절제, pH 완충제의 사용이 필요하다.

상기 pH 조절제는, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 암모니아를 포함하는 알칼리제, 아세트산, 인산, 시트르산, 탄산, 중탄산, 옥살산, 염산, 질산을 포함하는 산제, 및 이들의 염류로부터 선택되는 것을 사용하고, 상기 pH 조절제는 pH 완충제라도 되고, 시트르산, 탄산, 중탄산, 인산, 숙신산, 프탈산, 염화 암모늄, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 굿 완충제(good buffer)로서 MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, 트리신(Tricine), 바이신(Bicine), TAPS, CHES, CAPSO, CAPS, 및 이들의 염류로부터 선택되는 것을 사용한다.

이들의 함유에 의해 상기 리튬 시약 조성물은, pH 5로부터 pH 12의 범위에서 리튬에 대하여, 특이적인 발색 반응이 가능하다.

본 발명의 용제(극성 용매)는, 물에 혼합될 수 있는 유기용제인 것이 필수적이지만, 피검체인 혈청, 혈장, 용출액 등의 수용액과 균일하게 혼합될 수 있으면, 유기용매를 주로 한 용액이라도 되고, 또는 유기용매가 첨 된 수용액이라도 된다. 이는, 범용형 자동 분석 장치, 자외 가시 분광 광도계에 의해 검체 중의 리튬 농도를 측정하는 경우에는 그 피검체가 수용액이므로, 그 시약 조성물도 마찬가지로 수용액인 것이 바람직하기 때문이다.

상기 유기용제는, 디메틸술폭시드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드(DMA)로부터 선택된다.

본 발명의 시약 조성물에 있어서, 실제 제품에서는 안정제를 혼입시키지만, 본 발명에서는 안정제로서 계면활성제를 사용하고 있다. 이 계면활성제는 F28 테트라페닐포르피린의 분산성을 높이고, 또한 발색 반응 시의 시료로부터 유래하는 현탁을 방지시키는 작용이 있으므로, 이러한 작용을 얻기 위해 안정제를 혼입하는 것이 필요하다.

이들 안정제는, 비이온성 계면활성제 또는 음이온성 계면활성제이며, 비이온성 계면활성제는, 소르비탄 지방산 에스테르, 펜타에리트리톨 지방산 부분 에스테르, 프로필렌글리콜 모노 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 모노에스테르, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌 지방산 부분 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 부분 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 지방산 디에탄올아미드, 지방산 모노에탄올아미드, 폴리옥시에틸렌 지방산 아미드, 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르(등록상표: TritonX-100), p-노닐페녹시폴리글리시돌 및 이들의 염류로부터 선택되는 것을 사용한다.

바람직한 비이온성 계면활성제로서는, 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르(Triton X-100(등록상표) 등), p-노닐페녹시폴리글리시돌 등이다.

또한, 안정제로서의 음이온성 계면활성제는, 알킬 황산 에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산 에스테르염, 폴리옥시에틸렌페닐에테르 황산 에스테르염, 알킬벤젠술폰산염, 알칸 술폰산염 등이 있다. 대표적인 것으로서, 도데실 황산 나트륨, 도데실벤젠술폰산 나트륨, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 황산 에스테르 나트륨 및 이들의 염류로부터 선택되는 것을 사용한다.

본 발명의 리튬 시약 조성물은, 시료 중에 공존하는 리튬 이외의 이온에 의해 리튬 농도의 측정이 방해되는 것을 회피하고, 또는 시약 조성물의 산화를 억제하며, 그 보존 안정성을 부여하기 위해 마스킹제를 1 종류, 또는 복수 종류를 함유시킬 수도 있다. 다만, 리튬 이외의 이온이 적으면, 반드시 포함할 필요는 없다.

이들 리튬 시약 조성물에 가하는 마스킹제로서는, 트리에탄올아민, 에틸렌디아민, N,N,N',N'-테트라키스(2-피리딜메틸)에틸렌디아민(TPEN), 피리딘, 2,2-비피리딘, 프로필렌디아민, 디에틸렌트리아민, 디에틸렌트리아민-N,N,N',N",N"-5아세트산(DTPA), 트리에틸렌테트라아민, 트리에틸렌테트라민-N,N,N',N",N"',N"'-6아세트산(TTHA), 1,10-페난트롤린, 에틸렌디아민4아세트산(EDTA), O,O'-비스(2-아미노페닐)에틸렌글리콜-N,N,N',N'-4아세트산(BAPTA), N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신(Bicine), 트랜스-1,2-디아미노시클로헥산-N,N,N',N'-4아세트산(CyDTA), O,O'-비스(2-아미노에틸)에틸렌글리콜-N,N,N',N'-4아세트산(EGTA), N-(2-하이드록실)이미노2아세트산(HIDA), 이미노2아세트산(IDA), 니트릴로3아세트산(NTA), 니트릴로트리스메틸인산(NTPO) 및 이들의 염류로부터 선택되는 것을 사용한다. 이 중에서 트리에탄올아민이 가장 바람직하다.

본 발명의 리튬 시약 조성물은, 미생물에 의한 열화를 방지하기 위해 방부제를 포함할 수도 있다. 방부제는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 아지화 나트륨, Procline(등록상표) 등을 사용할 수 있다. 방부제의 농도도 특별히 한정되지 않고, 아지화 나트륨을 사용하는 경우, 일반적으로 방부제로서 사용되는 농도, 예를 들면, 반응 용액에 대하여 0.1 질량% 정도이면 된다. 장기 보존을 목적으로 한 제품으로 하는 경우에는, 일반적으로 방부제가 처방된다.

또한, 리튬 시약 조성물의 기능을 장기 보존 가능하게 하기 위하여, 본 발명의 리튬 시약 조성물의 조성 중, 안정제와 pH 조절제 및 pH 완충제를 포함하는 제1 시약과, 테트라페닐포르피린의 화합물과 물에 혼합될 수 있는 유기용제와 안정제와 pH 조절제 및 pH 완충제를 포함하는 제2 시약을 세퍼레이트에 보존하고, 측정 직전에 양쪽 시약을 혼합하여 제1항에 기재된 리튬 시약 조성물로서 사용하는 리튬 측정 시약 키트로 만들 수 있다.

본 발명의 리튬 시약 조성물의 사용 시에는, 혈청 및 혈장 시험 시료를 전술한 리튬 시약 조성물과 접촉 분해하고, 리튬 착체의 발색, 흡광도, 및 그 스펙트럼을 측정하고, 마찬가지로 농도가 이미 알려진 리튬 표준 시료의 그것을 기준 농도로 하여 미지 시료의 정량값을 산출하는 것을 특징으로 한다.

리튬 착체의 발색, 및 그 스펙트럼에 있어서, 파장 550 ㎚, 또는 그 근방의 파장 530 ㎚로부터 560 ㎚의 파장대를 측정 파장으로 하여 그 감도를 측정하거나, 또는 파장 570 ㎚, 또는 그 근방의 파장 565 ㎚로부터 650 ㎚의 파장대의 감도를 측정하여 리튬의 농도를 산출하는 것이 바람직하다. 이 경우의 감도는 자외 가시 분광 광도계에서의 흡광도, 또는 흡광도차로 해도 무방하다.

측정 장치로서는, 혈청 및 혈장 시험 시료를 전술한 리튬 시약 조성물과 접촉 분해하고, 리튬 착체의 발색, 및 그 흡광도, 또는 그 스펙트럼을 측정하여, 그 스펙트럼에 있어서 파장 550 ㎚, 또는 그 근방의 파장 530 ㎚로부터 560 ㎚의 파장대를 측정 파장으로 하여 그 감도를 측정하거나, 또는 파장 570 ㎚, 또는 그 근방의 파장 565 ㎚로부터 650 ㎚의 파장대의 감도를 측정하여 리튬의 정량값을 산출하는 것이 바람직하다.

본 발명의 리튬 시약 조성물, 이것을 사용한 리튬 이온 측정 방법 및 측정 장치에 의하면, 생체 시료나 환경 시료 등의 수용액 중의 리튬의 농도를 측정할 수 있고, 제1항 내지 제13항의 리튬 시약 조성물에 의한 검량선은, 리튬 농도가 0.6∼1.2 mEq/L의 실용 영역에 있어서 직선적이고, 비색계나 자외 가시 분광 광도계의 수치를 사용하여 간단한 연산으로 농도를 구할 수 있다. 그러므로, 보급형 분광 광도계로 생체 시료인 혈청 검체의 리튬 농도를 신속하게 정량할 수 있고, 그 정보를 예를 들면, TDM 치료의 관리 지표로 할 수도 있다. 또한, 임상 화학 자동 분석 장치를 응용하여 다검체를 단시간에 정량 분석할 수도 있다.

또한, 리튬 시약 조성물의 pH를 pH 5 내지 pH 12의 범위로 조절함으로써, 분광 측정을 가능하게 하고 있지만, pH 5 미만의 산성 측에서는 본 발명의 킬레이트제(F28 테트라페닐포르피린)와 리튬 이온은 결합하지 않고, 그 리튬 농도에 의존적인 정색 변화는 일어나지 않는다. pH 12를 초과하는 알칼리성 측에서는, 상기 킬레이트제, 생성한 발색 착체의 색조의 안정성이 좋지 못하다. 또한, 공기 중의 이산화탄소를 흡수하는 것에 의한 pH의 변동이 생기기 쉽고, 이것도 색조의 안정성에 악영향을 미친다. pH가 5∼7의 사이에서는 상기 킬레이트제와 리튬 이온은 결합하고, 리튬 착체로서 특이적으로 발색하지만, 발색 속도가 완만하고, pH 8∼11에서는 상기 킬레이트제와 리튬 이온은 신속하게 결합하고, 특이적이면서, 또한 안정적으로 발색한다. 따라서, 더욱 바람직하게는, pH 8∼11이다.

또한, 테트라페닐포르피린 금속 착체는 소레트 밴드(Soret band)로 불리는 최대 감도를 얻을 수 있는 380 ㎚ 내지 460 ㎚ 근방의 전형적인 스펙트럼 영역이 있으며, 이것을 측광 파장으로 하는 것도 가능하지만, 임상적 의의가 있는 혈청 검체 중 리튬 농도 범위에 대하여 감도가 지나치게 크기 때문에, 시료의 희석 조작이 필요하며, 이에 따른 조작의 번잡화, 희석 장치 등의 증설에 의한 측정 장치의 대형화를 수반한다.

한편, 본 발명은 상기 소레트 밴드 파장보다 수배 감도가 낮은 파장인 550 ㎚, 또는 그 근방의 530 ㎚로부터 560 ㎚의 파장대를 측광 파장으로 함으로써, 검체에 포함되는 농도에 대하여 최적 감도를 얻을 수 있으므로, 희석 조작, 또는 희석 장치 등의 번거로운 조작, 그에 따른 관련 설비가 불필요하게 된다. 또한, 본 발명인 상기 파장대는 소레트 밴드를 측광 파장으로 한 경우보다 검량선의 직선성이 양호하므로, 간단한 비색계, 자외 가시 분광 광도계에 의한 측정값으로부터의 농도의 연산이 용이하며, 색조가 황색으로부터 적색으로 선명하게 변화하므로, 육안에 의한 농도 레벨 판정도 가능하다.

또한, 소레트 밴드를 측광 파장으로 한 경우에는 그 파장대의 색조와 중첩되는 다른 유기물이나 착색 성분, 예를 들면, 질산 이온, 크레아티니, 빌리루빈, 빌리베르딘, 용혈 헤모글로빈 등으로부터 기인하는 리튬 정량값에 대한 영향이 우려되지만, 본 발명에 따른 파장대를 측광 파장으로 한 경우에는 그 영향이 적고, 보다 정확한 리튬 농도를 구할 수 있다.

따라서, 종래의 리튬 농도의 측정에는 대형의 전용 기기를 필요로 하지만, 본 발명에 의해 휴대형 비색계로 리튬 농도를 계측할 수 있고, POCT 키트로서 구성할 수도 있다.

도 1은 본 발명의 F28 테트라포르피린의 적량 농도의 참고 계산표의 도면이다.
도 2는 본 발명에 실시예 1의 자외-가시 분광 광도계에서의 실험 결과의 그래프 도면이다.
도 3은 본 발명에 실시예 1에서의 측광 파장별의 리튬 농도 검량선의 그래프 도면이다.
도 4는 본 발명에 실시예 1에서의 F28 테트라페닐포르피린-리튬 착체 생성의 스펙트럼 변화(발색 반응)의 그래프이다.
도 5는 본 발명에 실시예 1의 혈청 시료 측정값과 원자 흡광법(종래법) 측정값과의 상관 시험 결과의 그래프이다.
도 6은 본 발명에 관리 혈청을 시료로 한 자동 분석 장치에 의한 측정값의 비교의 [표 1]의 도면이다.
도 7은 본 발명의 육안에 의한 리튬 검출의 [표 2]의 도면이다.
도 8은 본 발명에 실시예 1에서의 흡광도의 스펙트럼의 그래프의 도면이다.
도 9는 본 발명의 유기용제의 차이에 의한 측정값의 비교의 [표 3]의 도면이다.
도 10은 본 발명에 안정제의 차이에 의한 측정값의 비교의 [표 4]의 도면이다.
도 11은 본 발명에 마스킹제의 차이에 의한 측정값의 비교의 [표 5]의 도면이다.

본 발명자들은, 혈청 및 혈장 중의 리튬 농도를 더욱 간단하게 정량 측정할 수 있는 리튬 시약 조성물을 예의(銳意) 연구하고, 전술한 비특허 문헌 1에 제법이 개시된, 피롤환을 가지는 대환형 화합물을 사용하고, 테트라페닐포르피린의 탄소에 결합되어 있는 수소를 전부 불소로 치환하여 불소를 28개로 한 하기 구조식(이하, F28 테트라페닐포르피린으로 칭함)에 착안하여, 본 발명에 도달하였다.

[화학식 1]

피롤환을 가지는 대환형 화합물을 이용한 리튬 시약 조성물로서 전술한 특허 문헌 2, 3에, 피롤환을 가지는 대환형 화합물로서 피롤환의 β 위치에 8개의 브롬(Br) 원자를 결합시키고, 리튬 이온과 반응하는 분석 시약이 개발되어 있지만, pH 11 이상의 알칼리성이 아니면 리튬 이온과 반응하기 곤란하지만, F28 테트라페닐포르피린이면, pH 5 내지 pH 12에서도 반응하므로, 본 발명은, 이 F28 테트라페닐포르피린을 킬레이트제로 하여, 수용액계에서의 리튬 이온의 정량 측정에 사용할 수 있도록 한 것이며 있어, 리튬 정량 측정 시약으로서, 이하에서, 본 발명의 리튬 시약 조성물의 실시예에 대하여 설명한다.

실시예 1

실시예 1(시료 1)

실시예 1에서는 pH 완충액으로서의 제1 시약을 제작하고, 발색 시액(試液)으로서 제2 시약을 제작하고, 측정 직전에 양쪽 액을 혼합하여 리튬 시약 조성물을 제작하였다. 이는, 양쪽 액을 처음부터 제작해 두어도 되지만, 장시간의 보존에 의해 시약이 열화되는 것을 회피하기 위해서이다.

여기서, 시약 조성물의 제작 방법을 설명한다.

먼저, 주로, pH 완충액으로서의 제1 시약을 제작하지만, 그 조성은 하기와 같다.

[실시예 1]

(1) 제1 시약(안정제·완충액으로서)

킬레이트제: 없음

유기용제: 없음

안정제(분산제: 비이온성 계면활성제):

TritonX-100(등록상표)

(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 1.0 중량%

마스킹제: 트리에탄올아민 10 mM

이상으로, 7 중량%의 염화 암모늄을 가하여 pH 10으로 조절하고 정제수로 1 L로 만들어 범용 보존 용기에 보관했다.

그리고, TritonX-100(등록상표)(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르)을 1.0 중량%로 하였으나, 지나치게 적으면 측정 시에 드물게 탁함이 발생하고, 지나치게 많으면, 반응 용기 내에서 거품이 발생하며, 양쪽 요인 모두 재현성에 영향을 미칠 가능성이 있으므로, 0.1∼5.0 중량%의 범위가 바람직하고, 바람직하게는, 1.0 중량%이다.

또한, 마스킹제는 트리에탄올아민을 10 mM로 하였으나, 지나치게 적으면 리튬 이온 이외의 협잡(挾雜) 이온이 과잉으로 포함된 시료에 있어서 그 마스킹 효과가 저하되고, 지나치게 많으면 리튬 이온 자체를 마스킹하거나 측정 오차의 원인이 될 수 있기 때문에, 1.0∼100 mM의 범위가 좋으며, 바람직하게는, 10 mM이다

다음으로, 주로, 발색 시액으로서의 제2 시약을 제작하지만, 그 조성은 하기와 같다.

(2) 제2 시약(발색 시액으로서)

킬레이트제: F28 테트라페닐포르피린 0.5 g/L

유기용제: 디메틸술폭시드(DMSO) 20 중량%

안정제(분산제: 비이온성 계면활성제): TritonX-100(등록상표)

(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 1.0 중량%

마스킹제: 트리에탄올아민 10 mM

여기에, 0.05 M(mol/L)이 되도록 MOPS(굿 완충제)를 가하여 pH 7.0으로 조절하고, 정제수로 1 L로 만들어 범용 보존 용기에 보관했다.

그런데, 본 실시예 1에서는, F28 테트라페닐포르피린 화합물의 발색 반응을 얻기는 곤란하지만, 임상 검사에서의 혈청 중의 리튬 정량에 있어서, 그 농도가 넓게는 0.6 mM∼3 mM의 범위에서의 정확성이 요구되고 있다. 본 발명의 실시예에서는, 상기한 리튬의 농도 범위에 있어서는, F28 테트라페닐포르피린의 화합물의 농도를, 0.1∼1.0 g/L로 하면, 바람직하게는, 0.5 g/L로 하면 정확하게 측정할 수 있는 것도 발견하였다.

리튬 농도가 0.6 mM∼3 mM의 범위에서는, F28 테트라페닐포르피린을 최종적인 시약 조성물에서의 농도를 1 L 당 0.1∼1.0 g/L의 범위에서 측정 가능하며, 0.5 g/L가 바람직하다. 지나치게 적으면 F28 테트라페닐포르피린과리튬 이온과의 반응이 충분히 일어나지 않고, 지나치게 많으면, F28 테트라페닐포르피린 유래의 블랭크의 흡광도가 증가하는 문제가 생기므로, 바람직하게는 0.5 g/L이다.

이 점을 더욱 상세하게 설명하면, F28 테트라페닐포르피린과 리튬 이온은 몰비로 1:1의 킬레이트 착체를 형성하는 반응이다. 여기서, 검체 중의 리튬 농도가 3 mM 포함된 검체를, 본시약 조성물을 사용한 실시예 1의 조건 하에서 반응시키는 경우에는, 그 반응계에서의 리튬 농도는 약 0.02 mM이 된다. 따라서, 1:1로 반응하는F28 테트라포르피린 농도도 반응계 내에서 0.02 mM 이상 존재하고 있지 않으면, 검체 중의 리튬을 과부족없이 반응시킬 수 없다.

일반적으로, 킬레이트제와 금속 이온과의 착체 형성 반응(발색 반응)은 피 반응 물질(리튬)에 대하여 등 배∼10배의 몰 농도의 킬레이트제(F28 테트라포르피린)가 필요하며, 도 1의 F28 테트라포르피린의 적량 농도의 참고 계산표의 도면에 나타낸 바와 같이, 반응 시의 F28 테트라포르피린의 농도를 등배로부터 10배로 되도록 시약 조성물을 구성하게 되지만, 현실적으로 시약 조성물의 첨가량, 검체량의 이른바 측정 반응 시의 용량에서의 파라미터는, 그 측광 기종이나 목적으로 하는 임계값에 따라 약간의 차이가 있으므로, 그 시약 조성물에서의 킬레이트제 농도는 등배인 0.1 g/L보다 5 배량인 0.5 g/L 쪽이 보다 넓은 측정 조건에 견딜 수 있다. 예를 들면, 검체량의 미량화 기술이 낮은 기종에서의 측정의 경우, 검체량을 실시예 1의 그것에 비해 2배∼5배 정도 증량하는 것이 예상되므로, 사전에 5 배량으로 시약 조성물을 0.5 g/L로 해 두면 충분하다. 한편, 킬레이트제를 몰비로 10배 이상 투입해도 발색 반응에 미치는 속도론적인 유의성은 없으며, 시약 블랭크 값의 증대가 염려될 뿐이며, 이것을 채용하는 장점은 없다.

이상과 같이, 킬레이트제와 리튬과의 반응 몰비의 조건만 달성할 수 있으면 되므로, 예를 들면, 제2 시약의 킬레이트제(F28 테트라포르피린)의 농도를 1.0 g/L로 한 경우에는 반응 시의 제2 시약 첨가량을 절반의 양으로 할 수 있다. 또는, 그 검체량을 반감시킨 경우에는 마찬가지로 킬레이트제 농도를 절반의 양으로 할 수도 있다.

이와 같이, 본 실시예 1에서는, F28 테트라페닐포르피린을 0.5 g/L로 하였으나, 반응 몰량을 만족시키고, 또한 시약 블랭크 값을 최소한으로 하는 것을 고려한 결과, 0.1∼1.0 g/L의 범위가 최적이다.

또한, 디메틸술폭시드(DMSO)는 5∼30 중량%로 하였으나, 지나치게 적으면 F28 테트라페닐포르피린의 용액 중에서의 분산성이 저하되고, 지나치게 많으면 시약 조성물 중에서의 유기용매의 비율이 증가하므로, 바람직하게는, 20 중량%이다.

여기서, 본 실시예에서의 F28 테트라페닐포르피린은, 테트라페닐포르피린의 탄소에 결합되어 있는 수소를 전부 불소로 치환한 하기에 나타낸 바와 같은 구조식이다.

[화학식 1]

(3) 상기한 제1 시약과 제2 시약을 혼합한 리튬 시약에서의 리튬 농도가 이미 알려진 시료를 사용한 검량선의 작성을 설명한다.

실시예 1에서는, 시료 6μL에 제1 시약(완충액) 720μL, 제2 시약(발색 시액) 240μL를 가하였다. 이 경우에 제1 시약은 pH 10에서의 완충능이 있으며, 시험시의 제1 시약, 제2 시약, 시료를 혼합한 때의 시험액의 pH는 대략 pH=10이 된다.

이와 같이, 킬레이트제로서 F28 테트라페닐포르피린을 사용함으로써, pH 5∼10의 범위에서 발색 반응을 달성할 수 있으므로, pH 10 이하의 강한 pH 완충 작용을 가지는 리튬 측정 시약을 구성하므로, 공기 중의 CO₂의 흡수에 의한 pH 변동을 감소시킬 수 있고, 그 결과 측정값에 대한 악영향을 회피할 수 있다. 또한, 이로써, 범용의 용기에 보존 가능하게 되었다.

그리고, 제1 시약과 제2 시약은 사용 직전에 동일한 비율로 혼합하고, 혼합액을 시료에 동일한 용량으로 첨가해도 되고, 이 경우에는, 시료 6μL에 혼합액 940μL를 부가하여 측정 대상의 시험액으로 할 수도 있다.

이 혼합 시약에 시료를 가한 pH 10의 시험액을, 상온에서 10분간 반응시킨 후, 자외-가시 분광 광도계(히타치 U-3900형)를 사용하여 시약 블랭크를 대조로 하여 550 ㎚의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 2의 Li 농도 mg/dL와 흡광도의 그래프, 및 도 4의 F28 테트라페닐포르피린-리튬 착체 생성에서의 가시부의 스펙트럼 변화의 그래프에 나타낸다.

테트라페닐포르피린 금속 착체에 전형적인 소레트 밴드(380 ㎚로부터 460 ㎚ 근방)로 불리는 최대 감도를 얻을 수 있는 파장이 아닌, 혈청 검체 중 리튬 농도 범위에 대하여 최적 감도를 얻을 수 있는 파장 550 ㎚, 또는 그 근방의 파장 530 ㎚로부터 560 ㎚의 파장대를 측광 파장으로 함으로써, 희석 조작, 또는 희석 장치 등의 번거로운 조작, 그에 따른 관련 설비가 불필요하게 된다.

또한, 도 3의 Li 농도 mg/dL와 흡광도의 그래프(광파 장 *405 ㎚, ×415 ㎚, ●550 ㎚)에 나타낸 바와 같이, 전술한 파장 550 ㎚, 또는 그 근방의 파장 530 ㎚로부터 560 ㎚의 파장대는 소레트 밴드를 측광 파장으로 한 경우보다 검량선의 직선성이 양호하므로, 간단한 비색계나 분광 광도계에서의 농도의 연산이 용이하며, 색조가 황색으로부터 적색으로 선명하게 변화하므로, 육안에 의한 농도 레벨 판정도 가능하다. 따라서, 종래의 리튬 농도의 측정에는 대형의 전용 기기를 필요로 하지만, 본 발명에 의해 휴대형 비색계나 범용되고 있는 자외 가시 분광 광도계로 리튬 농도를 계측할 수 있어 POCT 키트로서 구성할 수도 있다.

다만, 도 3의 그래프에서는, 파장 ●550 ㎚는 실시예 1 그 자체이며, 소레트 밴드의 측광 파장인 *405 ㎚, ×415 ㎚는, 실시예 1과 마찬가지로 제1 시약, 제2 시약을 첨가하였지만, 감도가 지나치게 높기 때문에, 시료를 5배로 희석하여 측정 반응을 실시하고, 405 ㎚와 415 ㎚의 파장을 사용하였다. 도 3의 그래프로부터 알 수 있는 바와 같이, 405 ㎚와 415 ㎚의 파장의 검량선은 직선이 되지는 않지만, 본 실시예의 550 ㎚를 측광 파장으로 한 경우에는, 직선성이 양호한 검량선을 얻을 수 있다.

또한, 도 4에 나타낸 F28 테트라페닐포르피린-리튬 착체 생성의 스펙트럼 변화의 그래프와 같이, 리튬의 농도 0.6 mg/dL, 1.2 mg/dL, 1.8 mg/dL, 2.4 mg/dL, 3.0 mg/dL로 흡광도가 직선적으로 증가하고 있는 것을, 매우 명료하게 확인할 수 있다. 리튬 농도에 비례하여, 포르피린-금속 착체에 전형적인 415 ㎚(소레트 밴드)의 피크와 도면 중에 나타내는 550 ㎚의 흡수 피크가 증대하고, 570 ㎚의 흡수 피크가 감소하므로, 모두 측광 파장으로서 흡광도차를 구하는 것이 가능하지만, 전술한 바와 같이 직선성이 양호한 검량선을 얻을 수 있으므로, 550 ㎚를 측광 파장으로 하는 것이 바람직하다.

본 실시예 1에서는 550 ㎚의 흡광도로 하였으나, 파장 540 ㎚ 내지 560 ㎚의 파장대를 측광 범위로 할 수도 있다. 이는, 측정 기기에 따라서는 550 ㎚의 측광 필터가 없는 경우가 있으며, 이 경우에는 그 근방으로서 감도가 생기고 있는 540 ㎚나 560 ㎚를 측광 파장으로 설정하면 된다. 도 4의 실시예 1에서의 리튬 농도에 의한 흡광도의 그래프에 나타낸 바와 같이, 570 ㎚의 감도의 감소도 리튬 농도에 대하여 정량적이므로, 이것도 시약 블랭크를 대조로 하여 흡광도차(ΔAbs)를 구하는 것이 가능하며, 측광 파장으로서 이용할 수 있다.

또한, 드물게 환자 검체의 시료에 따라서는, 파장 550 ㎚에 간섭하는 협잡물질이 생기고, 550 ㎚ 파장에서는 데이터에 오차가 생기는 경우에는, 그것을 회피하기 위해 파장 570 ㎚, 또는 그 근방의 565 ㎚ 내지 650 ㎚의 범위로부터 측광 파장을 선택하고, 감도의 감소를 흡광도차로서 사용하여 리튬 농도를 산출할 수도 있다.

이하의 실험 결과로부터, 본 발명의 실시예 1의 리튬 시약으로 거의 정확하게 리튬 농도를 측정할 수 있는 것에 대하여 설명한다.

[자외-가시 분광 광도계(히타치 U-3900형)에서의 실험 결과]

도 2의 그래프는, 자외-가시 분광 광도계(히타치 U-3900형)에서의 측정 시험 결과이다. 가로축 X에 사전에 조제한 이미 알려진 리튬 이온 농도(Li 농도 mg/dL), 세로축 Y는 자외 가시 분광 광도계에 의한 550 ㎚의 흡광도차를 플롯팅하여, 직선 회귀한 결과이다.

도 2의 그래프로부터 알 수 있는 바와 같이, 얻어진 흡광도는 리튬 농도에 비례하여, 직선성이 양호한 검량선이 도시되어 있다.

[혈청을 시료로 한 경우의 원자 흡광법(종래법)과 본 발명에 의한 방법과의 상관 관계 시험 결과]

도 5의 그래프는, 도 2에 설명한 실시예 1에서의 측정법, 동일한 혈청을 시료로 한 종래의 원자 흡광법(종래법)에서의 리튬 농도 측정값과의 상관 시험 결과이다. 세로축 Y는 본 발명에 의한 리튬 농도 측정값이며, 가로축 X는 원자 흡광법(종래법)에 따른 리튬 농도 측정값이지만, 도 2에 나타낸 회귀선으로부터 양 측정값은 95% 이상이 양호한 상관 관계를 나타낸다. 따라서, 동일한 혈청 시료에 대하여 본 발명의 시약 조성물에 의한 자외-가시 흡광 광도 정량법에서도, 정확하게 혈청 시료 중의 리튬을 정량되어 있는 것을 나타낸다.

[관리 혈청을 시료로 한 자동 분석에 의한 측정값의 비교]

리튬 농도의 값이 부여된 관리 혈청으로서 프레치노름 U(PrecinormU)(로슈 제조), 프레치패스 U(PrecipathU)(로슈 제조), 파소노름 H(PathonormH)(SERO AS 제조), 오토노름(Auto norm)(SERO AS 제조)을 시료로 하여 생화학 자동 분석 장치(히타치 H-7700형)에 의해 546 ㎚(550 ㎚에 가까운 파장으로 본기에 실장되어 있는 파장)를 측광 파장으로 하여 1포인트 엔드법에 의해 측정하였다.

(장치 파라미터)

시약: 0.24 mL

시료: 0.005 mL

측광 파장(주(main)/부(sub)): 546 ㎚/700 ㎚

측광 시간: 10 분

온도: 37℃

1포인트 엔드·증가법

상기한 설정 조건 하에서의 실험 결과를 도 6의 [표 1]에 나타내며, 본 발명의 실시예에서의 측정값이, 보증값에 대하여 양호하게 일치하고 있고, 임상 검사용 자동 분석 장치라도 혈청중 리튬을 충분히 측정할 수 있는 것을 알 수 있다.

[육안에 의한 리튬 검출 방법]

측정 대상의 시험액의 육안에 의해 관찰한 결과를 도 7의 [표 2]에 나타낸다.

시료 8μL에 제1 시약과 제2 시약을 혼합한 발색 시액 920μL를 가하여, 상온에서 10분간 반응시킨 후, 그 정색을 육안에 의해 관측하였다. 시료는 색조 견본으로서 소정 농도의 리튬 표준액, 농도 레벨 다른 관리 혈청을 사용하여 비교했다.

각각의 농도역에 있어서 황색으로부터 적색으로 정색 변화가 확인되었고, 관리 혈청의 정색은 색조 견본과도 양호한 일치를 나타낸다. 특별한 장치를 이용하지 않아도 신속하고 간편하게 혈청 중의 리튬 농도를 판정할 수 있는 것을 알 수 있다.

이상과 같이, 본 발명의 실시예 1의 리튬 시약으로 거의 정확하게 리튬 농도를 측정할 수 있는 것을 알 수 있다.

실시예 2

다음으로, 실시예 1과 조성은 동일하며, 조제 방법도 기본적으로 동일하지만, 리튬 시약 조성에 있어서 제1 시약을 0.1 M(mol/L)이 되도록 MOPS를 가하여 pH 8.0로 조제하고 정제수로 1 L로 만든 것을 사용하였다. 즉, 시험 시의 제1 시약, 제2 시약, 시약을 혼합한 시험액의 pH가 대략 pH=8이 되도록 조절하였다.

[실시예 2]

(1) 제1 시약(안정제·완충액으로서)

킬레이트제: 없음

유기용제: 없음

안정제(분산제: 비이온성 계면활성제): TritonX-100(등록상표)

(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 1.0 중량%

마스킹제: 트리에탄올아민 10 mM

이상으로, 0.1 M이 되도록 MOPS를 가하여 pH 8러 조절하고 정제수로 1 L로 만들어 범용 보존 용기에 보관했다.

(2) 제2 시약(발색 시액으로서)

킬레이트제: F28 테트라페닐포르피린 0.5 g/L

유기용제: 디메틸술폭시드(DMSO) 20 중량%

안정제(분산제: 비이온성 계면활성제): TritonX-100(등록상표)

(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 1.0 중량%

마스킹제: 트리에탄올아민 10 mM

여기에, 0.05 M이 되도록 MOPS(완충제)를 가하여, pH 7.0으로 조절하고, 정제수로 1 L로 만들어 범용 보존 용기에 보관했다.

리튬 농도의 측정에는, 실시예 1과 동일하게 시료 6μL에 제1 시약(완충액) 720 μL, 제2 시약(발색 시액) 240μL를 가하여, 상온에서 10분간 반응시킨 후, 자외 가시 분광 광도계(히타치 U-3900형)를 사용하여 시약 블랭크를 대조로 하여 파장 550 ㎚의 흡광도를 측정하였다.

[자외-가시 분광 광도계(히타치 U-3900형)에서의 실험 결과]

도 8의 그래프는, 자외-가시 분광 광도계(히타치 U-3900형)에서의 실험 결과이며, 가로축 X에 사전에 조제한 이미 알려진 리튬 이온 농도(Li 농도 mg/dL), 세로축 Y는 자외 가시 분광 광도계의 550 ㎚에서의 흡광도차를 플롯팅하여 직선 회귀한 결과이다.

도 8의 그래프로부터 알 수 있는 바와 같이, pH 8로 구성된 시약 조성물, 즉 pH 8의 측정 조건으로 해도 얻어지는 흡광도차는 리튬 농도에 의존적으로 비례하고, 직선성이 양호한 검량선이 되어 있다.

다만, pH 8의 측정 조건 하에서는 약간 반응 속도가 늦어지며, 정량적으로는 10분∼20분 정도에서 안정화된다. 한편, pH 10으로 한 경우에는 10분 이내에 반응이 완결된다. 따라서, 본 발명의 리튬 시약 조성물의 완충계의 pH를 5∼10의 범위로 하면, pH 11 이상인 경우와 같이 수산화 나트륨이나 수산화 칼륨과 같이 농후한 수산화물 용액을 주로 한 완충계를 사용할 필요는 없고, 취급도 간편하다. pH의 설정은, 사용자의 요구에 따라 다르지만, pH 10이면 반응 속도도 빠르고, 완충력을 충분히 유지할 수 있는 굿 완충제, 염화 암모늄계, 탄산계를 사용할 수 있다. 실용성을 고려하면, 신속하면서, 또한 정확하게 반응하고 있는 실시예 1의 pH 10의 완충계에서 행하는 것이 바람직하다.

이와 같이, 본 발명의 리튬 시약 조성물의 pH 조절제로서는 pH를 7 내지 12의 범위로 하는 pH 조절제, 또는 pH 조절제로서의 pH 완충제가 필요하며, pH 8∼11이 되도록 하는 pH 조절제, pH 완충제를 사용하는 것이 보다 바람직하며, pH 10 전후가 되도록 하는 pH 조절제, pH 완충제를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

실시예 3

다음으로, 물에 혼합될 수 있는 유기용제의 선택에 대하여 설명하지만, 본 발명의 용제는, 물에 혼합될 수 있는 유기용제인 것이 중요하며, 이는 측정 시의 반응 용액은 혈청 등의 통상적인 수용액이므로, 시약 조성물 중의 성분이 수용액으로서 안정화된 액상(液狀)이면, 유기용매를 주로 한 액체라도 되고, 또는 유기용매가 첨가된 수용액이라도 된다. 특히, 범용형의 자동 분석 장치, 자외 가시 분광 광도계에 의해 검체 중의 리튬 농도를 측정하는 경우, 기본적으로는 유기용매가 첨가 된 수용액인 것이 바람직하다.

이에, 실시예 1, 3과는 상이한 물에 혼합될 수 있는 유기용제를 실시예 3에서 설명한다. 실시예 3은, 기본적으로 실시예 1과 조제 방법은 동일하지만, 하기와 같이 리튬 시약에 있어서 제2 시약의 유기용제를 디메틸술폭시드(DMSO)(20 중량%)가 아닌 디메틸포름아미드(DMF)(20 중량%)로 한 점이 상이하다.

[실시예 3]

(1) 제1 시약(완충액으로서)

킬레이트제: 없음

유기용제: 없음

안정제(분산제: 비이온성 계면활성제): TritonX-100(등록상표)

(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 1.0 중량%

마스킹제: 트리에탄올아민 10 mM

이상에, 7 중량%의 염화 암모늄을 가하여 pH 10으로 조절하고 정제수로 1 L로 만들어 범용 보존 용기에 보관했다.

(2) 제2 시약(발색 시액으로서)

킬레이트제: F28 테트라페닐포르피린 0.5 g/L

유기용제: 디메틸포름아미드(DMF) 20 중량%

안정제(분산제: 비이온성 계면활성제): TritonX-100(등록상표)

(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 1.0 중량%

마스킹제: 트리에탄올아민 10 mM

여기에, 0.05 M이 되도록 MOPS(완충제)를 가하여, pH 7.0으로 조정하고, 정제수로 1 L로 만들어 범용 보존 용기에 보관했다.

실시예 4

또한, 실시예 1의 물에 혼합될 수 있는 유기용제를 디메틸술폭시드(DMSO)(20 중량%)에, 실시예 3에서는 디메틸포름아미드(DMF)(20 중량%)로 하였으나, 실시예 4에서는 물에 혼합될 수 있는 유기용제로서 디메틸아세트아미드(DMA)(20 중량%)를 혼입한 리튬 시약 조성물로서, 리튬 이온 농도를 측정하였다.

[실시예 4]

(1) 제1 시약(완충액으로서)

킬레이트제: 없음

유기용제: 없음

안정제(분산제: 비이온성 계면활성제): TritonX-100(등록상표)

(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 1.0 중량%

마스킹제: 트리에탄올아민 10 mM

이상으로, 7 중량%의 염화 암모늄을 가하여 pH 10으로 조정하고 정제수로 1 L로 만들어 범용 보존 용기에 보관했다.

(2) 제2 시약(발색 시액으로서)

킬레이트제: F28 테트라페닐포르피린 0.5 g/L

유기용제: 디메틸아세트아미드(DMA) 20 중량% 안정제(분산제: 비이온성 계면활성제): TritonX-100(등록상표)

(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 1.0 중량%

마스킹제: 트리에탄올아민 10 mM

이상과 같이, 실시예 1의 리튬 시약 중에 있어서 디메틸술폭시드를, 실시예 3에서는 디메틸포름아미드(DMF)로 변경하고, 실시예 4에서는 디메틸아세트아미드(DMA)로 변경한 시약 조성물을 조제하고, 실시예 1과 동일한 수순에 의해, 도 9에 나타낸 바와 같이, 관리 혈청 시료 중의 리튬을 정량하고, 도 9의 [표 3]에 나타낸 바와 같이, 본 측정 방법과 종래의 측정 방법에서 그 측정값을 비교했다.

도 9의 [본 발명의 유기용제의 차이에 의한 측정값의 비교]의 [표 3]의 결과로부터, 본 실시예 1의 물에 혼합될 수 있는 유기용제인 디메틸술폭시드(DMSO) 20 중량% 조성에 의한 측정값은 0.83 mM(㎜ol/L)이며, 본 실시예 3의 물에 혼합될 수 있는 유기용제인 디메틸포름아미드(DMF) 20 중량% 조성에 의한 측정값은 0.81 mM이며, 실시예 4의 디메틸포름아미드(DMF) 20 중량% 조성에 의한 측정값은 0.82 mM이며, 원자 흡광 광도법에 의한 측정값의 0.82 mM와 95% 이상 일치한다. 따라서, 이들 유기용매에 의해 F28 테트라페닐포르피린을 균일하게 분산시켜, 액상 시약 조성물로서 구성하고, 혈청과 같은 수용액 시료 중의 리튬을 정확하게 정량할 수 있다.

실시예 5

다음으로, 리튬 시약 조성물의 안정제의 선택에 대하여 실험 결과에 기초하여 설명한다. 실시예 5로부터 실시예 7은 리튬 시약 조의 안정제는, 기본적으로 실시예 1과 조제 방법은 동일하지만, 하기와 같이, 안정제를 비이온성 계면활성제만 사용한 경우(실시예 5), 음이온성 계면활성제만 사용한 경우(실시예 6), 또는 양쪽을 병용한 경우(실시예 7)를 실험했다.

먼저, 실시예 5의 비이온성 계면활성제(TritonX-100(등록상표)(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르)만의 경우(실시예 5, 조성 자체는 실시예 1과 동일함)의 조성에 대하여 설명한다.

[실시예 5]

(1) 제1 시약(완충액으로서)

킬레이트제: 없음

유기용제: 없음

안정제(분산제: 비이온 계면활성제): TritonX-100(등록상표)

(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 1.0 중량%

마스킹제: 트리에탄올아민 10 mM

여기에, 7 중량%의 염화 암모늄을 가하여 pH 10으로 조절하고 정제수로 1 L로 만들어 범용 보존 용기에 보관했다.

(2) 제2 시약(발색 시액으로서)

킬레이트제: F28 테트라페닐포르피린 0.5 g/L

유기용제: 디메틸술폭시드(DMSO) 20 중량%

안정제(분산제: 비이온성 계면활성제): TritonX-100(등록상표)

(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 1.0 중량%

마스킹제: 트리에탄올아민 10 mM

실시예 6

실시예 6은, 음이온성 계면활성제(도데실 황산나트륨(와코순약 제조)만의 경우(실시예 6)의 조성을 설명한다.

[실시예 6]

(1) 제1 시약(완충액으로서)

킬레이트제: 없음

유기용제: 없음

안정제(분산제: 음이온 계면활성제만):

도데실 황산나트륨(와코순약 제조) 1.0 중량%

마스킹제: 트리에탄올아민 10 mM

여기에, 7 중량%의 염화 암모늄을 가하여 pH 10으로 조정하고 정제수로 1 L로 만들어 범용 보존 용기에 보관했다.

(2) 제2 시약(발색 시액으로서)

킬레이트제: F28 테트라페닐포르피린 0.5 g/L

유기용제: 디메틸술폭시드(DMSO) 20 중량%

안정제(분산제: 음이온성 계면활성제)

도데실 황산나트륨(와코순약 제조) 1.0 중량%

마스킹제: 트리에탄올아민 10 mM

실시예 7

실시예 7은, 리튬 시약 조성물의 안정제를 비이온성 계면활성제와 음이온성 계면활성제의 양쪽을 병용한 경우(실시예 7)의 조성에 대하여 설명한다.

[실시예 7]

(1) 제1 시약(완충액으로서)

킬레이트제: 없음

유기용제: 없음

안정제(분산제: 비이온성 계면활성제와 음이온성 계면활성제):

(a) 비이온성 계면활성제: Triton-X100(등록상표)

(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 1.0 중량%

(b) 음이온성 계면활성제:

도데실 황산나트륨(와코순약 제조) 1.0 중량%

마스킹제: 트리에탄올아민 10 mM

(2) 제2 시약(발색 시액으로서)

킬레이트제: F28 테트라페닐포르피린 0.5 g/L

유기용제: 디메틸술폭시드(DMSO) 20 중량%

(a) 비이온성 계면활성제: Triton-X100(등록상표)

(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 1.0 중량%

(b) 음이온성 계면활성제:

도데실 황산나트륨(와코순약 제조) 1.0 중량%

마스킹제: 트리에탄올아민 10 mM

전술한 실시예 5, 실시예 6, 실시예 7을 사용하여, 실시예 1과 동일한 수순으로 관리 혈청 시료 중의 리튬 농도를 정량했다. 그 실험 결과를 도 10의 [본 발명에 안정제의 차이에 의한 측정값의 비교]의 [표 4]에 나타내어 설명한다.

도 10의 [표 4]의 실험 결과에 의해, 비이온성 계면활성제 만의 측정값(0.82 mM), 음이온성 계면활성제 만의 측정값(0.83 mM), 양쪽 안정제를 병용한 경우의 측정값(0.82 mM)은 95% 이상 일치하는 것을 알 수 있고, 계면활성제의 종류, 병용의 방법에 관계없이, 그 측정값은 거의 일치하므로, 현탁이 우려되는 시료의 경우에는 이들 계면활성제를 병용해도 무방한 것을 알 수 있다.

다음으로, 리튬 시약 조성물의 마스킹제의 선택에 대하여 설명한다.

리튬 시약 조성물의 마스킹제로서, 전술한 실시예는 트리에탄올아민 만의 경우를 설명하였으나 에틸렌디아민4아세트산(EDTA)도 사용 가능한 점에 대하여 설명한다.

비교 대상으로서 트리에탄올아민 만의 경우에는, 실시예 5의 리튬 시약 조성물로 하고, 에틸렌디아민4아세트산(EDTA) 만의 경우(실시예 8)와 양쪽 마스킹제를 병용한 경우(실시예 9)의 조성에 대하여 설명한다.

실시예 8

[실시예 8]

마스킹제로서 에틸렌디아민4아세트산 2칼륨(EDTA·2K(칼륨)) 만의 경우.

(1) 제1 시약(완충액으로서)

킬레이트제: 없음

유기용제: 없음

안정제: Triton-X100(등록상표)

(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 1.0 중량%

마스킹제: 에틸렌디아민4아세트산 2칼륨

(EDTA·2K, 도진 화학 제조) 10 mM

(2) 제2 시약(발색 시액으로서)

킬레이트제: F28 테트라페닐포르피린 0.5 g/L

유기용제: 디메틸술폭시드(DMSO) 20 중량%

안정제: Triton-X100(등록상표)

(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 1.0 중량%

마스킹제: 에틸렌디아민4아세트산 2칼륨

(EDTA·2K, 도진 화학 제조) 10 mM

실시예 9

[실시예 9]

마스킹제로서 트리에탄올아민과 에틸렌디아민4아세트산 2칼륨(EDTA·2K(칼륨))을 병용한 경우.

(1) 제1 시약(완충액으로서)

킬레이트제: 없음

유기용제: 없음

안정제: Triton-X100(등록상표)

(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 1.0 중량%

마스킹제: 트리에탄올아민 10 mM

에틸렌디아민4아세트산 2칼륨

(EDTA·2K, 도진 화학 제조) 0.1 mM

(2) 제2 시약(발색 시액으로서)

킬레이트제: F28 테트라페닐포르피린 0.5 g/L

유기용제: 디메틸술폭시드(DMSO) 20 중량%

안정제: Triton-X100(등록상표)

(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 1.0 중량%

마스킹제: 트리에탄올아민 10 mM

에틸렌디아민4아세트산 2칼륨

(EDTA·2K, 도진 화학 제조) 0.1 mM

전술한 실시예 8, 실시예 9를 사용하여, 실시예 1과 동일한 수순으로 관리 혈청 시료 중의 리튬 농도를 정량했다. 그 실험 결과를 도 11의 [본 발명에 마스킹제의 차이에 의한 측정값의 비교]의 [표 5]에 나타내어 설명한다.

도 11의 [표 5]의 실험 결과로부터, 트리에탄올아민 만의 측정값(0.83 mM), 에틸렌디아민4아세트산 2칼륨(EDTA·2K, 도진 화학 제조) 만의 측정값(0.83 mM), 양쪽 마스킹제를 병용한 경우의 측정값(0.82 mM)은 95% 이상 일치하는 것을 알 수 있고, 주된 마스킹제의 종류나 병용의 방법에 관계없이, 그 측정값은 대략 일치하므로, 보존 시약 중에 약간 혼입되어 있는 미량 금속 이온이 원인으로 일어나는 시약의 열화 방지나, 시료 중의 협잡 이온의 종류가 과잉인 경우에 대응하여, 이들 마스킹제를 적절하게 사용해도 무방한 것을 알 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 각각의 실시예에 따르면, 생체 시료나 환경 시료 등의 수용액 중의 리튬의 정량을, 간편한 비색계에 의해 즉시 리튬 농도를 측정할 수 있고, 또한 육안에 의해 판정이 가능하다.

그리고, 본 발명의 특징을 손상시키지 않으면, 상기한 각각의 실시예로 한정되는 것은 아닌 것은 물론이다. 예를 들면, 실시예 1 내지 실시예 9에서는 리튬 농도 측정을 위한 시약 조성물을 제1 시약, 제2 시약으로 세퍼레이트하여 장기 보존을 가능하게 하였으나, 단기간에 측정하는 것이면, 처음부터 제1 시약, 제2 시약을 혼합한 단일 시약을 조제하여 사용해도 되는 것은 물론이다.

Claims

테트라페닐포르피린의 탄소에 결합되어 있는 수소를 전부 불소로 치환한 구조식
[화학식 1]

으로 표시되는 화합물;
물에 혼합될 수 있는 유기용제; 및
pH 조절제
를 포함하는, 리튬 시약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 물에 혼합될 수 있는 유기용제는, 디메틸술폭시드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드(DMA)로부터 선택되는, 리튬 시약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 pH 조절제는, 염산, 질산, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 암모니아를 포함하는 알칼리제, 아세트산, 인산, 시트르산, 탄산, 중탄산, 옥살산, 염산을 포함하는 산제, 및 이들의 염류로부터 선택되는, 리튬 시약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 pH 조절제는 pH 완충제인, 리튬 시약 조성물.
제4항에 있어서,
상기 pH 완충제는, 시트르산, 탄산, 중탄산, 인산, 숙신산, 프탈산, 염화 암모늄, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 굿 완충제(good buffer)로서 MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, 트리신(Tricine), 바이신(Bicine), TAPS, CHES, CAPSO, CAPS, 및 이들의 염류로부터 선택되는, 리튬 시약 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리튬 시약 조성물은, pH 5로부터 pH 12의 범위에서의 리튬에 대하여, 발색(發色) 가능한, 리튬 시약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 리튬 시약 조성물에 안정제를 포함시킨, 리튬 시약 조성물.
제7항에 있어서,
상기 안정제는, 비이온성 계면활성제 및/또는 음이온성 계면활성제인, 리튬 시약 조성물.
제8항에 있어서,
상기 비이온성 계면활성제는, 소르비탄 지방산 에스테르, 펜타에리트리톨 지방산 부분 에스테르, 프로필렌글리콜 모노 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 모노에스테르, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌 지방산 부분 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 부분 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 지방산 디에탄올아미드, 지방산 모노에탄올아미드, 폴리옥시에틸렌 지방산 아미드, 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르(등록상표: TritonX-100), p-노닐페녹시폴리글리시돌 및 이들의 염류로부터 선택되는, 리튬 시약 조성물.
제8항에 있어서,
상기 음이온성 계면활성제는, 알킬 황산 에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산 에스테르염, 폴리옥시에틸렌페닐에테르 황산 에스테르염, 알킬벤젠술폰산염, 알칸술폰산염 등이 있으며, 대표적인 것으로서, 도데실 황산 나트륨, 도데실벤젠술폰산 나트륨, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 황산 에스테르나트륨 및 이들의 염류로부터 선택되는, 리튬 시약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 리튬 시약 조성물에 마스킹제를 포함시키는, 리튬 시약 조성물.
제11항에 있어서,
상기 마스킹제는, 트리에탄올아민, 에틸렌디아민, N,N,N',N'-테트라키스(2-피리딜메틸)에틸렌디아민(TPEN), 피리딘, 2,2-비피리딘, 프로필렌디아민, 디에틸렌트리아민, 디에틸렌트리아민-N,N,N',N",N"-5아세트산(DTPA), 트리에틸렌테트라아민, 트리에틸렌테트라민-N,N,N',N",N"',N"'-6아세트산(TTHA), 1,10-페난트롤린, 에틸렌디아민4아세트산(EDTA), O,O'-비스(2-아미노페닐)에틸렌글리콜-N,N,N',N'-4아세트산(BAPTA), N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신(Bicine), 트랜스-1,2-디아미노시클로헥산-N,N,N',N'-4아세트산(CyDTA), O,O'-비스(2-아미노에틸)에틸렌글리콜-N,N,N',N'-4아세트산(EGTA), N-(2-하이드록실)이미노2아세트산(HIDA), 이미노2아세트산(IDA), 니트릴로3아세트산(NTA), 니트릴로트리스메틸인산(NTPO) 및 이들의 염류로부터 선택되는, 리튬 시약 조성물.
제1항에 기재된 리튬 시약 조성물의 조성 중, 상기 안정제와 상기 pH 조절제를 포함하는 제1 시약으로 하고, 상기 테트라페닐포르피린의 탄소에 결합되어 있는 수소를 전부 불소로 치환한 구조식
[화학식 1]

으로 표시되는 화합물과, 상기 물에 혼합될 수 있는 유기용제와 상기 안정제와 상기 pH 조절제를 포함하는 제2 시약으로 하고, 상기 제1 시약 및 상기 제2 시약을 세퍼레이트로 하여 보존하고, 측정 직전에 상기 제1 시약 및 상기 제2 시약을 혼합하여 제1항에 기재된 리튬 시약 조성물로서 사용하는, 리튬 시약 키트.
혈청 및 혈장 시험 시료를 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 리튬 시약 조성물과 접촉 분해하고, 리튬 착체의 발색, 및 그 스펙트럼을 측정하여, 리튬의 정량값을 산출하는 혈청 시험 시료 중의 리튬 이온을 측정하는, 리튬 이온 측정 방법.
제14항에 있어서,
상기 리튬 착체의 발색, 및 그 스펙트럼에 있어서, 파장 550 ㎚, 또는 그 근방의 파장 530 ㎚로부터 560 ㎚의 파장대를 측정 파장으로 하여, 그 감도를 측정하는, 리튬 이온 측정 방법.
제14항에 있어서,
상기 리튬 착체의 발색, 및 그 스펙트럼에 있어서, 파장 570 ㎚, 또는 그 근방의 파장 565 ㎚로부터 650 ㎚의 파장대를 측정 파장으로 하여, 그 감도를 측정하는, 리튬 이온 측정 방법.
혈청 및 혈장 시험 시료를 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 리튬 시약 조성물과 접촉 분해하고, 리튬 착체의 발색, 및 그 스펙트럼을 측정하여, 상기 스펙트럼에 있어서, 파장 550 ㎚, 또는 그 근방의 파장 530 ㎚로부터 560 ㎚의 파장대를 측정 파장으로 하여 그 감도를 측정하거나, 또는 파장 570 ㎚, 또는 그 근방의 파장 565 ㎚로부터 650 ㎚의 파장대의 감도를 측정하여 리튬의 정량값을 산출하는, 혈청 및 혈장 시험 시료 중의 리튬 이온을 측정하는 리튬 이온 측정 장치.