SU1686373A1 - Способ определени активности орнитиндекарбоксилазы в ткан х животных - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биохимии и может быть использовано дл  определени  активности орнитиндекарбоксилазы в ткан х животных. Цель изобретени  - повышение точности способа. Способ заключаетс  в том, что препарат ткани инкубируют с ор- нитином и пиридоксальфосфатом, осаждают белки, к супернатанту добавл ют дансилхлорид и провод т с ним инкубацию не менее 18 ч. Затем окрашенный продукт экстрагируют бензолом, вз тым при объемном соотношении к раствору окрашенного комплекса 1:(1,3-1,5). Полученный осадок дансилпутресцина раствор ют в ацетоне, провод т восход щую хроматографию в тонком слое силикагел  в системе растворителей бензол:триэтаноламин (5.0-5,5): 1 и вы вл ют индивидуальную фракцию дансилпутресцина , количество которого определ ют флюориметрически. Способ позвол ет повысить точность определени  орнитиндекарбоксилазы в 2-6 раз. со С

Description

Изобретение относитс  к биохимии, а именно к энзимологии, и может быть использовано дл  определени  активности орнитиндекарбоксилазы (ОДК) в ткан х животных.

Цель изобретени  - повышение точности способа.

Способ осуществл ют следующим образом .

В качестве источника фермента используют супернатант 33%-ного гомогената, полученный центрифугированием при 20 000 g в течение 20 мин. Инкубац-ию пробы, содержащей в 0,4 мл конечного объема 4 ммоль орнитина, 20 мкмоль пиридок- сальфосфата, 5 мкмоль дитиотреитола, 5 ммоль K-Na-фосфатного буфера и 9.5+0,7 мг

белка (источник фермента), при 37°С прекращают через 1 ч добавлением 0,1 мл 0,2 М HCI04 Осадок отдел ют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 5 мин. Данси- лирование провод т, добавл   к 0,1 мл супернатанта 0,3 мл раствора дансилхлори- да в ацетоне (4 мг/мл) и 6 мг Ма2СОзЮН20. Пробы инкубируют не менее 18 ч в темноте при комнатной температуре. Продукты реакции экстрагируют бензолом в объемном соотношении 1:(1,3-1,5). Органический слой выпаривают, сухой осадок раствор ют в 20 мкл ацетона и нанос т на пластины Силуфол UV-254. Одномерно восход щую хроматографию провод т двукратно в системе бен- зол-триэтиламин в соотношении (5,0-5,5): 1. Интенсивность флуоресценции дансилпуто

00

Оч

со VI

CJ

ресцина измер ют на микроскопе ПРОТВА- С при 488 нм. Длина волны возбуждени  365 нм.

За единицу активности ОДК принимают 1 катал. Удельную активность фермента вы- ражают в п каталах, отнесенных к 1 мг белка .

Пример Работу выполн ют на самцах беспородных крыс и мышей линии СЗПА гепатомы 48 и Г-27. Исследуют также малиг- низирущую, регенерирующую и нормальную печень. Ткань гомогенизируют в 0,5 мМ фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 0.1 мМ дитиотреитол и 0,4 мл пиридоксальфос- фат. Дальнейшее определение активности ОДК провод т по предлагаемому способу Численные данные опытов подвергают статистической обработке. Различи  между средними величинами (X) расценивают как статистически достоверные при значении р 0,05.

Апробацию данного метода осуществл ют в исследовани х уровн  активности ОДК в печени интактных животных и ткан х с усиленной клеточной пролиферацией. Об- наружено статистически достоверное увеличение активности ОДК в регенерирующей и малигнизирующей печени а также в ткани гепатом Г-27 и 48.

Активность ОДК(п каталов на 1 мг белка ) в гепатомах Г-27 и 48 и в ткани нормальной и регенерирующей печени интактных и получавших НДЭА животных приведена в табл.1.

Данные, приведенные в табл 2 и 3, показывают преимущества предлагаемого способа перед известным.

Активность ОДК (п каталов на 1 мг бел- ка) из печени интактных животных перевивных гепатом приведена в табл. 2

Из табл.2 видно, что активность ОДК в одном и том же объекте в 2-8 раз выше, когда определение провод т по предлагав-

MOMV способу Кроме того, точность анализа также выше в 2 4 раза

В табл 3 приведены данные сравнитель ной оценки достоверности результатов анализа активности ОДК известным и предлагаемым способами.

Из табл 3 видно что величина удельной активности ОДК из нормальной печени крыс, определенна  предлагаемым способом , в 2 раза выше, чем определенна  по известному способу Надежность точность и воспроизводимость результатов также вы ше в 2-6 раза.

Представленные численные данные доказывают положительный эффект способа, заключающийс  в повышении его чувствительности определени  в 23 раза, а также в повышении точности, воспроизводимости и надежности способа в 2-6 раз по сравнению с известным.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ определени  активности орни тиндекарбоксилазы в ткан х животных включающий гомогенизацию ткани центрифугирование получение супернатанта, инкубацию с субстратом, осаждение белка защелачивание среды добавление реагента , образование окрашенного комплекса с путресцином, экстрагирование комплекса органическими растворител ми с последующей регистрацией окрашенного комплекса отличающийс  тем, что, с целью повышени  точности способа, в качестве реагента используют дансилхлорид инкубацию с которым провод т не менее 18 ч, экстрагирование производ т бензолом, вз тым в объемном соотношении к раствору окрашенного комплекса 1.(1,3 1,5), полученный осадок дансилпутресцина раствор ют в ацетоне, провод т восход щую хроматографию в тонком слое силикагел  в системе растворителей бензол - триэтанола- мин (5,0-5,5). 1 и вы вл ют индивидуальную фракцию дансилпутресцина, количество которого определ ют флуориметрически

   Т а б л и ц а 1

   Продолжение табл.1

   Примечание: х - выборочное среднее

   Sx - стандартное отклонение среднего результата. Р - уровень доверительной веро тности.

   Основные метрологические

   характеристики

   Выборочное среднее (х)

   Стандартное отклонение

   среднего результата (±)

   Абсолютна  вопроизводимость:

   Среднее отклонение от среднего

   Стандартное отклонение Относительна  воспроизводимость , %

   Относительное среднее отклонение (Ех ) Относительное стандартное отклонение

   Таблица2

   Табл ицаЗ

   Способ определени 

   Известный

   Предлагаемый

   0.09

   ±0,01

   0,18 ±0,003

   0,02 0,03

   0,007

   0,003

   22,22 33,33

   3,89 5.0