CN109358152A - 一种l-2-氨基-5-胍基戊酸原料中氨基酸杂质的薄层色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种L‑2‑氨基‑5‑胍基戊酸原料中氨基酸杂质的薄层色谱检测方法，包括溶液的制备、薄层层析检测，以及结果的判定；其中，薄层层析检测包括氨基酸杂质的薄层层析检测；薄层色谱检测采用硅胶G薄层板，展开剂为丙醇和浓氨溶液的混合溶液；展开环境为温度为26～40℃，相对湿度为75%～90%。本发明具有分离度好、灵敏度高、检测时间短、检测成本低、操作简单、设备简单、显色容易、结果直观可靠等优点，适合工业上用于L‑2‑氨基‑5‑胍基戊酸原料中其他氨基酸杂质的检测及质量控制，为合理的质量标准制定提供依据，以便更好控制和掌握产品质量，确保临床用药的安全性。
Description
技术领域
本发明属于食品和药物分析技术领域，具体涉及一种L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中氨基酸杂质的薄层色谱检测方法。
背景技术
L-2-氨基-5-胍基戊酸（CAS登录号为74-79-3）属于氨基酸类化合物，具有重要的生理功能，常作为营养补充剂，也是氨基酸胶囊和输液的重要成分。L-2-氨基-5-胍基戊酸可有效提高免疫力、促进免疫系统分泌内生性物质，有利于对抗癌细胞及预防病毒感染；有利于严重外伤、烧伤等需要大量组织修护患者的康护。临床上，L-2-氨基-5-胍基戊酸适用于血氨增高的肝昏迷，特别是伴有碱中毒的患者；用于辅助测定脑垂体功能；用于精液分泌不足和精子缺乏引起的男性不育症；用于婴幼儿补充L-2-氨基-5-胍基戊酸缺乏。
目前，L-2-氨基-5-胍基戊酸主要采用微生物发酵法生产，其代谢过程中会产生大量氨基酸类同系物，并且发酵原料也包含多种氨基酸组分，这成为L-2-氨基-5-胍基戊酸原料其他氨基酸杂质的主要来源。微生物发酵生产L-2-氨基-5-胍基戊酸的主要氨基酸类同系物杂质，主要包括L-2,5-二氨基戊酸、L-2,5-二氨基戊酸、（S）-2-氨基-5-脲基戊酸、L-2-氨基戊二酸、（S）-2-乙酰氨基-5-氨基戊酸、L-2-氨基丁二酸等，由于大都与L-2-氨基-5-胍基戊酸性质极其相近，彻底分离纯化清除较为困难，易于残留于L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中，影响产品质量。现行版各国药典收载的L-2-氨基-5-胍基戊酸均设有其他氨基酸检查项，中国药典规定不超过0.4%，欧洲药典规定不超过0.5%，美国药典规定不超过2.0%，而日本药典规定不超过0.2%。
薄层色谱（Thin Layer Chromatography，TLC），是一种层析分离技术。具有操作方便、设备简单、显色容易、结果直观、展开速率快、兼具分离和鉴定双重功能，以及节省时间、成本低、检测手段多、信息来源广等优点，广泛应用于药物的杂质控制。现行中国、美国、日本等国家药典收载的L-2-氨基-5-胍基戊酸的其他氨基酸检查均采用TLC法，选用L-2,6-二氨基己酸作为系统适用性评价的参照物，以评价L-2-氨基-5-胍基戊酸与其他氨基酸杂质的分离效果。然而，微生物发酵法生产的L-2-氨基-5-胍基戊酸原料，其中同系物L-2,5-二氨基戊酸与L-2-氨基-5-胍基戊酸的性质最相近，采用各国药典的TLC法均难以实现有效分离，并且药典TLC法的灵敏度较低，难以检出低于0.2%的L-2-氨基丁二酸同系物，因此，非常有必要开发分离效果更好、灵敏度更高的L-2-氨基-5-胍基戊酸原料其他氨基酸杂质的TLC检测方法，以提高L-2-氨基-5-胍基戊酸原料的产品质量，满足其他氨基酸杂质限度不超过0.2%的更高要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中其他氨基酸杂质的薄层色谱分析检测方法，解决现有TLC法存在L-2-氨基-5-胍基戊酸与其它氨基酸杂质的分离效果差和灵敏度较低的问题，通过建立和实施该检测方法，为L-2-氨基-5-胍基戊酸原料的质量标准制定提供依据，以便更好控制产品质量，确保食用和药用安全。
本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。
一种L-2-氨基-5-胍基戊酸原料其他氨基酸杂质的薄层色谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：溶液的制备、薄层层析检测、以及结果的判定；
其中，溶液的制备包括供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、系统适用性溶液的制备、稀释液的制备、展开剂的制备；
薄层层析检测包括其他氨基酸杂质的薄层层析检测、检视；薄层色谱检测采用硅胶G薄层板，展开剂为丙醇和浓氨溶液的混合溶液；薄层色谱的展开环境为温度为26～40℃，相对湿度为75%～90%。
进一步，所述供试品溶液可分为第一供试品溶液和第二供试品溶液，第一供试品溶液与第二供试品溶液的L-2-氨基-5-胍基戊酸浓度之比为1：2～4；所述对照品溶液与第一或/和第二供试品溶液的L-2-氨基-5-胍基戊酸浓度之比为1：300～1500。
所述展开剂的丙醇选自正丙醇、异丙醇的一种或两种，优选异丙醇；所述温度优选为28～35℃，相对湿度为75%～85%。
进一步，所述供试品溶液和系统适用性溶液制备所用溶剂为水；所述对照品溶液的制备所用溶剂为稀释液；所述展开剂的丙醇和浓氨溶液体积比为6～8 : 3，优选7 : 3；所述薄层色谱检测方法的显色剂为1%茚三酮的正丁醇溶液。
进一步，所述供试品溶液的L-2-氨基-5-胍基戊酸浓度为10～60mg/mL；所述对照品溶液选自L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液、L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液与L-2-氨基丁二酸混合溶液的一种，其中L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度为0.04mg/mL，L-2-氨基丁二酸的浓度为0.08mg/mL；所述系统适用性溶液由L-2-氨基-5-胍基戊酸和L-2,5-二氨基戊酸组成，其中L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度为20mg/mL，L-2,5-二氨基戊酸的浓度为0.04mg/mL。
进一步，所述系统适用性溶液除包含L-2-氨基-5-胍基戊酸和L-2,5-二氨基戊酸外，还可添加（S）-2-氨基-5-脲基戊酸、L-2-氨基戊二酸、（S）-2-乙酰氨基-5-氨基戊酸、L-2-氨基丁二酸等的一种或多种；所述稀释液为pH值10.0～12.0的水溶液。
进一步，所述薄层色谱检测方法还包括点样、层析、晾干、干燥、显色、检视、结果判定等步骤：
1）取相同体积的试品溶液、对照品溶液和系统适用性溶液，分别点样于同一硅胶G薄层板上，点样量选自5～20µL；
2）将薄层板置于层析缸中，于26～40℃、70%～90%相对湿度环境中展开约10cm，取出晾干；
3）将硅胶板置于80℃干燥约30分钟，取出放冷；
4）用1%茚三酮的正丁醇溶液喷洒硅胶板，在80℃加热10分钟显色，立即检视；
5）结果判定：
①系统适用性试验：如果对照品溶液的薄层色谱图中显示两个清晰的斑点，系统适用性溶液的薄层色谱图中显示六个完全分离的清晰斑点，则系统适用性试验符合要求；否则系统适用性试验不符合要求。
②样品检测：如果供试品溶液显示杂质斑点不超过1个，并且其颜色不深于对照品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的其他氨基酸含量低于千分之二；如果供试品溶液显示杂质斑点超过1个，则视为L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的其他氨基酸含量高于千分之二；如果供试品溶液只显示1个杂质斑点，但其颜色深于对照品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的其他氨基酸含量高于千分之二。
L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中氨基酸杂质的薄层色谱检测方法，具体包括以下步骤：
1）供试品溶液的制备：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸原料，加水溶解分别得到浓度不同的第一供试品溶液和第二供试品溶液；
2）对照品溶液的制备：称取L-2-氨基丁二酸加入稀释液充分溶解，再加入L-2-氨基-5-胍基戊酸原料溶解，得到对照品溶液；所述对照品溶液与供试品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度比为1 : 300～1500；
3）系统适用性溶液：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸和L-2,5-二氨基戊酸溶于水，得到系统适用性溶液；
4）薄层色谱检测：将上述制备的供试品溶液、对照品溶液和系统适用性溶液取样进行薄层色谱检测，置于温度为32～35℃和相对湿度为80%～85%环境中，展开约10cm后，晾干、干燥、喷显色剂、加热显色，立即检视；
5）结果判定：
系统适用性判定：如果对照品溶液的薄层色谱图中显示两个清晰的斑点，系统适用性溶液的薄层色谱图中显示两个完全分离的清晰斑点，则系统适用性试验符合要求；否则系统适用性试验不符合要求；
样品检测判定：如果第一供试品溶液和第二供试品溶液显示的杂质斑点均不超过1个，其颜色不深于对照品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的氨基酸杂质含量低于千分之二；如果第一供试品溶液或第二供试品溶液显示的杂质斑点超过1个，则视为L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的氨基酸杂质含量高于千分之二；如果第一供试品溶液或第二供试品溶液只显示1个杂质斑点，但其颜色深于对照品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的氨基酸杂质含量高于千分之二。
优选的，L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中氨基酸杂质的薄层色谱检测方法，其步骤包括：
1）供试品溶液的制备：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸原料适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含20mg和40mg的溶液，分别作为第一供试品溶液和第二供试品溶液；
2）稀释液的制备：用氢氧化钠溶液调节pH值至10.0～12.0的水溶液，作为稀释液；
3）对照品贮备液的制备：精密称取L-2-氨基丁二酸对照品，加稀释液溶解并稀释配制成浓度为0.8mg/mL的溶液，作为L-2-氨基丁二酸对照品贮备液；
4）对照品溶液的制备：精密量取第一供试品溶液1ml，置于50ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml和对照品贮备液1ml，置于同一10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
5）系统适应性溶液的制备：分别称取L-2-氨基-5-胍基戊酸、L-2,5-二氨基戊酸、（S）-2-氨基-5-脲基戊酸、L-2-氨基戊二酸、（S）-2-乙酰氨基-5-氨基戊酸、L-2-氨基丁二酸对照品各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中分别约含L-2-氨基-5-胍基戊酸20mg、L-2,5-二氨基戊酸0.04mg、（S）-2-氨基-5-脲基戊酸0.04mg、L-2-氨基戊二酸0.04mg、（S）-2-乙酰氨基-5-氨基戊酸0.04mg和L-2-氨基丁二酸0.08mg的溶液，作为系统适用性溶液；
6）L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中其他氨基酸的测定：取步骤1）、4）和5）制备的第一供试品溶液、第二供试品溶液、对照品溶液和系统适用性溶液各5µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异丙醇-浓氨溶液（7：3）为展开剂，置温度为32～35℃和相对湿度为80%～85%环境中，展开约10cm后，晾干，在80℃干燥约30分钟，放冷，喷以1%茚三酮的正丁醇溶液，在80℃加热10分钟，立即检视。
7）结果判定：
①系统适用性试验：如果对照品溶液的薄层色谱图中显示两个清晰的斑点，系统适用性溶液的薄层色谱图中显示六个完全分离的清晰斑点，则系统适用性试验符合要求；否则系统适用性试验不符合要求。
②样品检测：如果第一供试品溶液显示杂质斑点不超过1个，其颜色不深于对照品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的斑点，并且第二供试品溶液显示的L-2-氨基丁二酸斑点颜色不深于对照品溶液中L-2-氨基丁二酸的斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的其他氨基酸含量低于千分之二；如果第一供试品溶液显示杂质斑点超过1个，则视为L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的其他氨基酸含量高于千分之二；如果供第一试品溶液只显示1个杂质斑点，但其颜色深于对照品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的其他氨基酸含量高于千分之二。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明最突出的特点之一是解决了L-2-氨基-5-胍基戊酸与氨基酸类同系物杂质L-2,5-二氨基戊酸的分离度问题。研究发现，采用各国药典收载的TLC法，难以实现L-2-氨基-5-胍基戊酸与关键同系物杂质L-2,5-二氨基戊酸的有效分离。为此，本发明通过层析条件优化，获得了促进L-2-氨基-5-胍基戊酸与L-2,5-二氨基戊酸分离的适宜温度和适宜相对湿度，解决了L-2-氨基-5-胍基戊酸原料其他氨基酸杂质测定的有效分离问题。
2、本发明最突出的特点之二是解决了L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中多种氨基酸类同系物杂质的同时检测问题。微生物发酵法生产的L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中可能含有多种氨基酸类同系物，要实现同时检测是比较困难的，本发明实现了5种以上氨基酸类同系物杂质的同时检测。
3、本发明最突出的特点之三是解决了L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中氨基酸类同系物杂质的检测灵敏度问题，尤其是同系物杂质L-2-氨基丁二酸的显色弱问题。现行各国药典收载的L-2-氨基-5-胍基戊酸标准的其他氨基酸检查项薄层色谱法的供试品溶液的浓度均为10mg/mL，检测灵敏度较低，难于检出0.2%的其他氨基酸杂质，为此，本发明采用不低于20mg/mL L-2-氨基-5-胍基戊酸的更高浓度的第一供试品溶液，解决了检测灵敏度问题。针对同系物杂质L-2-氨基丁二酸显色斑点的颜色远浅其他同系物杂质的斑点颜色，致使其检测灵敏度较低问题，本发明针对性采用第二供试品溶液和对照品溶液中L-2-氨基丁二酸的特殊浓度等手段，有效解决了L-2-氨基丁二酸显色弱而导致的灵敏度低问题。
4、本发明的检测方法通过对展开的温度和相对湿度的探究，实现了L-2-氨基-5-胍基戊酸原料与同系物氨基酸的分离，解决了L-2-氨基-5-胍基戊酸与其它氨基酸杂质的分离效果差的问题，其检测灵敏度高达0.1%，该检验方法具有灵敏度高、检测时间短、检测成本低、操作简单、设备简单、显色容易、结果直观可靠等优点，能有效准确的检测出L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中存在的氨基酸杂质，为L-2-氨基-5-胍基戊酸原料的质量标准制定提供理论指导和技术支持，以便更好控制和掌握产品质量，确保食用和药用安全，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为L-2-氨基-5-胍基戊酸检测灵敏度检测的色谱图；
图2为L-2-氨基-5-胍基戊酸同系物杂质的定位的色谱图；
图3为同系物L-2-氨基丁二酸的浓度和配制方法确定的色谱图；
图4为L-2-氨基-5-胍基戊酸浓度优化的色谱图；
图5为相对湿度为62%对L-2-氨基-5-胍基戊酸同系物分离度影响的色谱图；
图6为相对湿度为80对L-2-氨基-5-胍基戊酸同系物分离度影响的色谱图；
图7为温度和湿度对L-2-氨基-5-胍基戊酸同系物分离度影响的色谱图；
图（1）温度为20℃，相对湿度82%；图（2）温度为室温，相对湿度70%；图（3）温度为室温，相对湿度76%；图（4）温度为30℃，相对湿度80%；图（5）温度为35℃，相对湿度85%；
图8为对不同批次L-2-氨基-5-胍基戊酸原料进行检测的色谱图。
具体实施方案
下面通过具体实施例方式对本发明作进一步详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
本发明检测方法包括如下步骤：
（1）材料准备：① 试剂：L-2-氨基-5-胍基戊酸、L-2,5-二氨基戊酸、（S）-2-氨基-5-脲基戊酸、L-2-氨基戊二酸、（S）-2-乙酰氨基-5-氨基戊酸、L-2-氨基丁二酸，纯度大于99%；正丁醇、异丙醇、正丙醇、氨水、茚三酮，均为分析纯。② 耗材和装置：硅胶G薄层板、薄层层析缸、硬质中性玻璃管、喷雾瓶；③ 仪器：电热恒温干燥箱。
（2）溶液配制：第一供试品溶液、第二供试品溶液、对照品贮备液、对照品溶液、系统适用性溶液、稀释液、展开剂、显色液。
（3）TLC检测：分别吸取第一供试品溶液、第二供试品溶液、对照品溶液和系统适用性溶液各适量，分别用硬质中性玻璃管点样于同一硅胶G薄层板上，将点样后的硅胶板放入层析缸中，加入适量展开剂，加盖密闭，在适宜温度和湿度环境中展开至溶剂前沿接近薄层板上沿，取出晾干，高温干燥，放冷，喷显色液，加热显色，立即检视。
（4）结果判定：①根据系统适用性试验结果判定检测结果的有效性：如果对照品溶液的薄层色谱图中显示两个清晰的斑点，系统适用性溶液的薄层色谱图中L-2-氨基-5-胍基戊酸与L-2,5-二氨基戊酸显示出两个完全分离的清晰斑点，则系统适用性试验符合要求；否则系统适用性试验不符合要求。②样品检测：如果第一供试品溶液显示杂质斑点不超过1个，其颜色不深于对照品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的斑点，并且第二供试品溶液显示的L-2-氨基丁二酸斑点颜色不深于对照品溶液中L-2-氨基丁二酸的斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的其他氨基酸含量合格；如果第一供试品溶液显示杂质斑点超过1个，则视为L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的其他氨基酸含量不合格；如果第一供试品溶液只显示1个杂质斑点，但其颜色深于对照品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的其他氨基酸含量不合格。
实施例1：L-2-氨基-5-胍基戊酸检测灵敏度检测
1、样品溶液配制：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸0.1g溶解于10mL水中，取1mL该溶液加水稀释至50mL待用。分别取该溶液0.5、1.0、1.5、2.0和2.5mL，置于10mL量瓶中，分别加水至刻度，配制成0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液。
2、薄层色谱检测：分别用硬质中性玻璃管取步骤1制备的不同浓度L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液5μL，点样于同一硅胶G薄层板上；然后将点样的薄层板置于层析缸中，加入异丙醇-浓氨溶液展开剂（7:3），在室温26℃和相对湿度74%环境中展开约10cm后，取出晾干；再将薄层板置于80℃下干燥30min，放冷，喷以1%茚三酮的正丁醇溶液，再置于80℃加热10min，立即检视。
3、结果分析：如图1所示，除0.1%的L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液无法观察到明显的斑点外，其它浓度的L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液均能观察到明显的斑点，且斑点颜色随浓度呈线性加深趋势。
实施例2：L-2-氨基-5-胍基戊酸同系物杂质的定位
1、溶液配制：
（1）同系物溶液：分别称取L-2-氨基丁二酸、L-2,5-二氨基戊酸、（S）-2-氨基-5-脲基戊酸、（S）-2-乙酰氨基-5-氨基戊酸、（S）-2-乙酰氨基戊二酸各2mg置于不同容量瓶中，加水溶解并定容至10mL，，得到浓度均为0.2mg/mL的同系物溶液，分别记为溶液A2、溶液B2、溶液C2、溶液D2、溶液E2。
（2）系统适用性溶液：精密称取L-2-氨基-5-胍基戊酸和L-2,6-二氨基己酸对照品，用水稀释制成每l mL中分别约含L-2-氨基-5-胍基戊酸20 mg和L-2,6-二氨基己酸0.4mg的溶液，记为溶液F2。
2、薄层色谱检测：分别用硬质中性玻璃管取5μL步骤1制备的各同系物溶液和系统适用性溶液，点样于同一硅胶G薄层板上；然后将点样的薄层板置于层析缸中，加入异丙醇-浓氨溶液展开剂（7:3），在室温27℃和相对湿度80%环境中展开约10cm后，取出晾干；再将薄层板置于80℃下干燥30min，放冷，喷以1%茚三酮的正丁醇溶液，再置于80℃加热10min，立即检视。
3、结果分析：如图2所示，系统适用性溶液呈现出分离良好的两个褐色斑点，系统适用性试验符合要求；L-2,5-二氨基戊酸、（S）-2-氨基-5-脲基戊酸、（S）-2-乙酰氨基-5-氨基戊酸和（S）-2-乙酰氨基戊二酸在TLC图谱中均呈现出较强的清晰褐色斑点，而L-2-氨基丁二酸呈现出较弱的蓝色斑点。
实施例3：同系物L-2-氨基丁二酸的浓度和配制方法确定
1、溶液配制：
（1）用水配制L-2-氨基丁二酸溶液：精密称取L-2-氨基丁二酸10mg，用稀磷酸溶解后加水定容至10mL，作为溶液1；分别量取1mL、0.8mL、0.6mL、0.4mL、0.2mL溶液1，置于不同容量瓶中，加水稀释定容至10mL，获得浓度为0.10mg/mL、0.08mg/mL、0.06mg/mL、0.04mg/mL、0.02mg/mL的L-2-氨基丁二酸溶液，分别记为溶液A3、溶液B3、溶液C3、溶液D3、溶液E3。
（2）用稀释液配制L-2-氨基丁二酸溶液：以氢氧化钠溶液调节pH值至10.0～12.0的水溶液为稀释液。精密称取L-2-氨基丁二酸10mg，用稀释液溶解并定容至10mL，作为溶液1；分别量取1mL、0.8mL、0.6mL、0.4mL、0.2mL溶液1，置于不同容量瓶中，加水稀释定容至10mL，获得浓度为0.10mg/mL、0.08mg/mL、0.06mg/mL、0.04mg/mL、0.02mg/mL的L-2-氨基丁二酸溶液，分别记为溶液G3、溶液H3、溶液I3、溶液J3、溶液K3。
（3）系统适用性溶液：精密称取L-2-氨基-5-胍基戊酸和L-2,5-二氨基戊酸对照品，用水稀释制成每lmL中分别约含L-2-氨基-5-胍基戊酸20 mg和L-2,5-二氨基戊酸0.1mg的溶液，记为溶液F3。
2、薄层色谱检测：分别用硬质中性玻璃管取5μL步骤1制备的各同系物溶液和系统适用性溶液，点样于同一硅胶G薄层板上；然后将点样的薄层板置于层析缸中，加入异丙醇-浓氨溶液展开剂（7:3），在室温26℃和相对湿度75%环境中展开约10cm后，取出晾干；再将薄层板置于80℃下干燥30min，放冷，喷以1%茚三酮的正丁醇溶液，再置于80℃加热10min，立即检视。
3、结果分析：如图3所示，系统适用性溶液（F3）呈现出分离良好的两个褐色斑点，系统适用性试验符合要求；用水配制的L-2-氨基丁二酸对照品溶液和稀释液配制的L-2-氨基丁二酸对照品溶液点样，前者斑点扩散严重，后者可获得清晰的淡蓝色斑点，并且淡蓝色斑点的可辨识度随其浓度增加呈良好的比例关系；当L-2-氨基丁二酸对照品溶液的浓度为0.08 mg/mL时，得到的淡蓝色斑点清晰易分辨，将该浓度定为 L-2-氨基丁二酸溶液的标准斑点浓度。
实施例4：L-2-氨基-5-胍基戊酸浓度优化
1、溶液配制：精密称取L-2,5-二氨基戊酸10mg，加水溶解定容至10mL，作为溶液1； 分别称取L-2-氨基-5-胍基戊酸200mg、300mg、400mg和500mg置于不同容量瓶中，分别加入取1mL溶液1，用水稀释制成每lmL中分别约含L-2-氨基-5-胍基戊酸20mg、30mg、40mg和50mg以及L-2,5-二氨基戊酸0.1mg的溶液，分别记为溶液A4、溶液B4、溶液C4、溶液D4。
2、薄层色谱检测：分别用硬质中性玻璃管取5μL步骤1制备的各混合溶液，点样于同一硅胶G薄层板上；然后将点样的薄层板置于层析缸中，加入异丙醇-浓氨溶液展开剂（7:3），在室温25℃和相对湿度79%环境中展开约10cm后，取出晾干；再将薄层板置于80℃下干燥30min，放冷，喷以1%茚三酮的正丁醇溶液，再置于80℃加热10min，立即检视。
3、结果分析：如图4所示，当混合溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸浓度为20mg/mL（A4）或30mg/mL（B4）时，可以实现与L-2,5-二氨基戊酸的良好分离，当混合溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸浓度超过40mg/mL（C4）时，就难以实现与L-2,5-二氨基戊酸的良好分离。
实施例5：相对湿度对L-2-氨基-5-胍基戊酸同系物分离度影响
1、溶液配制：
（1）系统适用性溶液1：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸200mg，精密量取1mg/mL L-2,5-二氨基戊酸溶液1mL，用水稀释制成每lmL中分别约含L-2-氨基-5-胍基戊酸20mg和L-2,5-二氨基戊酸0.1mg的溶液，记为溶液A5；
（2）同系物溶液：分别量取1mg/mL的L-2,5-二氨基戊酸溶液、（S）-2-氨基-5-脲基戊酸溶液、L-2-氨基戊二酸溶液、（S）-2-乙酰氨基-5-氨基戊酸溶液各0.4mL，加水稀释并定容至10mL，分别记为溶液B5、溶液C5、溶液D5、溶液E5；
（3）L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液：量取20mg/mLL-2-氨基-5-胍基戊酸溶液1mL，加水稀释并定容至50mL，从中量取1mL加水定容至10mL，记为溶液F5；
（4）L-2-氨基丁二酸溶液：精密量取0.1mg/mL L-2-氨基丁二酸贮备液8mL，用稀释液定容至10mL，记为溶液G5；
系统适用性溶液2：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸200mg，分别精密量取1.0mg/mL L-2,5-二氨基戊酸、（S）-2-氨基-5-脲基戊酸、L-2-氨基戊二酸、（S）-2-乙酰氨基-5-氨基戊酸溶液各0.4mL，以及0.1mg/mL L-2-氨基丁二酸贮备液8mL，制成每l mL中分别约含L-2-氨基-5-胍基戊酸20mg和L-2,5-二氨基戊酸0.04mg、（S）-2-氨基-5-脲基戊酸0.04mg、L-2-氨基戊二酸0.04mg、（S）-2-乙酰氨基-5-氨基戊酸0.04mg、L-2-氨基丁二酸0.08mg的溶液，记为溶液H5；
系统适用性溶液3：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸400mg，量取0.1mg/mL L-2-氨基丁二酸贮备液8mL，用水稀释制成每lmL中分别约含L-2-氨基-5-胍基戊酸40mg和L-2-氨基丁二酸0.08mg的溶液，记为溶液I5。
2、薄层色谱检测：分别用硬质中性玻璃管取5μL步骤1制备的各同系物溶液和系统适用性溶液，点样于同一硅胶G薄层板上；然后将点样的薄层板置于层析缸中，加入异丙醇-浓氨溶液展开剂（7:3），分别在室温25℃和相对湿度62%或恒温25℃和相对湿度80%的环境中展开约10cm后，取出晾干；再将薄层板置于80℃下干燥30min，放冷，喷以1%茚三酮的正丁醇溶液，再置于80℃加热10min，立即检视。
3、结果分析：结果如图5（室温25℃和相对湿度62%）和图6（恒温25℃和相对湿度80%）所示。在室温25℃和相对湿度62%环境下展开，L-2-氨基-5-胍基戊酸和L-2,5-二氨基戊酸不能有效分离，然而，在恒温25℃和相对湿度80%环境下展开，L-2-氨基-5-胍基戊酸和L-2,5-二氨基戊酸具有良好的分离效果。
实施例6：温度和湿度对L-2-氨基-5-胍基戊酸同系物分离度影响试验
1、溶液配制：
（1）系统适应性溶液1：精密称取L-2-氨基-5-胍基戊酸和L-2,5-二氨基戊酸溶于水得到混合溶液，其中L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度为20mg/mL，L-2,5-二氨基戊酸浓度为0.1mg/mL，记为溶液A6、D6、H6或K6。
（2）系统适应性溶液2：精密称取L-2-氨基-5-胍基戊酸、L-2,5-二氨基戊酸和L-2-氨基丁二酸溶于水，得到混合溶液，其中L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度为20mg/mL，L-2,5-二氨基戊酸的浓度为0.04mg/mL ，L-2-氨基丁二酸的浓度为0.08mg/mL，记为溶液N6。
（3）系统适应性溶液3：20mg/mL L-2-氨基-5-胍基戊酸，L-2,5-二氨基戊酸、L-2-氨基戊二酸、（S）-2-乙酰氨基-5-氨基戊酸和（S）-2-氨基-5-脲基戊酸分别为0.04mg/mL，0.08mg/mL L-2-氨基丁二酸，记为溶液C6、G6、J6、M6或Q6。
（4）称取L-2,5-二氨基戊酸溶于水，配制浓度为0.1mg/mL的 L-2,5-二氨基戊酸溶液，记为溶液B6、E6、I6、L6或P6；称取L-2-氨基-5-胍基戊酸溶于水，配制浓度为40mg/mL的L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液，记为溶液O6；称取L-2,5-二氨基戊酸，配制浓度为0.04mg/mL的L-2,5-二氨基戊酸溶液，记为溶液F6。
2、薄层色谱检测：分别用硬质中性玻璃管取5μL步骤1制备的各同系物溶液和系统适用性溶液，点样于同一硅胶G薄层板上；然后将点样的薄层板置于层析缸中，加入异丙醇-浓氨溶液展开剂（7:3），在相应试验温度和相对湿度环境中展开约10cm后，取出晾干；再将薄层板置于80℃下干燥30min，放冷，喷以1%茚三酮的正丁醇溶液，再置于80℃加热10min，立即检视。
3、结果分析：结果如图7所示，在不同温度和相对湿度环境下展开，L-2-氨基-5-胍基戊酸和L-2,5-二氨基戊酸有不同的分离效果，同时也会影响斑点的形状。在温度为25～40℃，相对湿度为75%～90%环境下展开，L-2-氨基-5-胍基戊酸和L-2,5-二氨基戊酸具有良好的分离效果。
实施例7：对不同批次L-2-氨基-5-胍基戊酸原料进行检测
1、溶液配制：
（1）系统适应性溶液1：精密称取L-2-氨基-5-胍基戊酸、L-2,5-二氨基戊酸和L-2-氨基丁二酸溶于水，得到混合溶液，其中L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度为20mg/mL，L-2,5-二氨基戊酸的浓度为0.04mg/mL，L-2-氨基丁二酸的浓度为0.08mg/mL，记为溶液A7。
（2）对照品溶液：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸和L-2-氨基丁二酸溶于水，使L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度为0.04mg/mL，L-2-氨基丁二酸的浓度为0.08mg/mL，记为溶液B7；
（3）第一供试品溶液：分别取3个同批次的L-2-氨基-5-胍基戊酸原料（批号0501、0502和0601）溶于水，使L-2-氨基-5-胍基戊酸得浓度为20mg/mL，分别记为溶液C7、溶液E7、溶液G7。
（4）第二供试品溶液：分别取3个同批次的L-2-氨基-5-胍基戊酸原料（批号0501、0502和0601）溶于水，使L-2-氨基-5-胍基戊酸得浓度为40mg/mL，分别记为溶液D7、溶液F7、溶液H7。
（5）系统适应性溶液2：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸、L-2,5-二氨基戊酸、L-2,5-二氨基戊酸、L-2-氨基戊二酸、（S）-2-乙酰氨基-5-氨基戊酸和（S）-2-氨基-5-脲基戊酸溶于水，使L-2-氨基-5-胍基戊酸得浓度为20mg/mL，L-2,5-二氨基戊酸、L-2-氨基戊二酸、（S）-2-乙酰氨基-5-氨基戊酸和（S）-2-氨基-5-脲基戊酸的浓度均为0.04mg/mL，L-2-氨基丁二酸的浓度为0.08mg/mL，记为溶液I7。
2、薄层色谱检测：分别用硬质中性玻璃管取5μL步骤1制备的各同系物溶液和系统适用性溶液，点样于同一硅胶G薄层板上；然后将点样的薄层板置于层析缸中，加入异丙醇-浓氨溶液展开剂（7:3），在室温32℃和相对湿度85%环境中展开约10cm后，取出晾干；再将薄层板置于80℃下干燥30min，放冷，喷以1%茚三酮的正丁醇溶液，再置于80℃加热10min，立即检视。
3、结果分析：结果如图8所示。可见，L-2-氨基-5-胍基戊酸与其同系物杂质分离良好，各组分斑点清晰。
4、结果判定：
①系统适用性试验：对照品溶液的薄层色谱图中显示两个清晰的斑点，系统适用性溶液的薄层色谱图中显示六个完全分离的清晰斑点，因此，系统适用性试验符合要求。
②样品检测：0501、0502和0601三批样品的第一供试品溶液未显示杂质斑点，并且第二供试品溶液也未显示L-2-氨基丁二酸斑点，因此，三批L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的其他氨基酸含量低于千分之二（0.2%）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中氨基酸杂质的薄层色谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：溶液的制备、薄层层析检测、以及结果的判定；
其中，溶液的制备包括供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、系统适用性溶液的制备、稀释液的制备和展开剂的制备；
薄层层析检测包括氨基酸杂质的薄层层析检测、检视；薄层色谱检测采用硅胶G薄层板，展开剂为丙醇和浓氨溶液的混合溶液；薄层色谱的展开环境的温度为26～40℃，相对湿度为75%～90%。
2.根据权利要求1所述L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中氨基酸杂质的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述供试品溶液可分为第一供试品溶液和第二供试品溶液，第一供试品溶液与第二供试品溶液的L-2-氨基-5-胍基戊酸浓度之比为1：2～4；所述展开剂的丙醇选自正丙醇和异丙醇中的一种或两种；所述展开环境的温度为28～35℃，相对湿度为75%～85%。
3.根据权利要求1所述L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中氨基酸杂质的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述对照品溶液与第一供试品溶液或/和第二供试品溶液中的L-2-氨基-5-胍基戊酸浓度之比为1：300～1500。
4.根据权利要求1所述L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中氨基酸杂质的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述供试品溶液和系统适用性溶液的溶剂为水；所述对照品溶液的溶剂为稀释液；所述展开剂中丙醇与浓氨溶液的体积比为6～8：3；所述薄层色谱检测方法的显色剂为1%茚三酮的正丁醇溶液；所述稀释液为pH值10.0～12.0的水溶液。
5.根据权利要求1所述L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中氨基酸杂质的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述供试品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度为10～60mg/mL；所述对照品溶液为L-2-氨基-5-胍基戊酸溶液与L-2-氨基丁二酸混合溶液，其中L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度为0.04mg/mL，L-2-氨基丁二酸的浓度为0.08mg/mL；所述系统适用性溶液由L-2-氨基-5-胍基戊酸和L-2,5-二氨基戊酸组成，其中L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度为20mg/mL，L-2,5-二氨基戊酸的浓度为0.04mg/mL。
6.根据权利要求5所述L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中氨基酸杂质的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述系统适用性溶液还包括（S）-2-氨基-5-脲基戊酸、L-2-氨基戊二酸、（S）-2-乙酰氨基-5-氨基戊酸和L-2-氨基丁二酸中的一种或多种。
7.根据权利要求1～6任一所述L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中氨基酸杂质的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述薄层色谱检测方法还包括点样、层析、晾干、干燥、显色、检视、和结果判定，具体包括以下步骤：
1）取相同体积的试品溶液、对照品溶液和系统适用性溶液，分别点样于同一硅胶G薄层板上，点样量选自5～20µL；
2）将薄层板置于层析缸中，于26～40℃、75%～90%相对湿度环境中展开约10cm，取出晾干；
3）将硅胶板置于80℃干燥约30分钟，取出放冷；
4）用1%茚三酮的正丁醇溶液喷洒硅胶板，在80℃加热10分钟显色，立即检视；
5）结果判定：
①系统适用性试验：如果对照品溶液的薄层色谱图中显示两个清晰的斑点，系统适用性溶液的薄层色谱图中显示六个完全分离的清晰斑点，则系统适用性试验符合要求；否则系统适用性试验不符合要求。
②样品检测：如果供试品溶液显示杂质斑点不超过1个，并且其颜色不深于对照品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的氨基酸杂质含量低于千分之二；如果供试品溶液显示杂质斑点超过1个，则视为L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的氨基酸杂质含量高于千分之二；如果供试品溶液只显示1个杂质斑点，但其颜色深于对照品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的氨基酸杂质含量高于千分之二。
8.根据权利要求1所述L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中氨基酸杂质的薄层色谱检测方法，其特征在于，具体步骤包括：
S1:供试品溶液的制备：称取L-2-氨基-5-胍基戊酸原料适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含20mg和40mg的溶液，分别作为第一供试品溶液和第二供试品溶液；
S2:稀释液的制备：用氢氧化钠溶液调节pH值至10.0～12.0的水溶液，作为稀释液；
S3:对照品贮备液的制备：精密称取L-2-氨基丁二酸对照品，加稀释液溶解并稀释配制成浓度为0.8mg/mL的溶液，作为L-2-氨基丁二酸对照品贮备液；
S4:对照品溶液的制备：精密量取第一供试品溶液1ml，置于50ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml和对照品贮备液1ml，置于同一10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
S5:系统适应性溶液的制备：分别称取L-2-氨基-5-胍基戊酸、L-2,5-二氨基戊酸、（S）-2-氨基-5-脲基戊酸、L-2-氨基戊二酸、（S）-2-乙酰氨基-5-氨基戊酸、L-2-氨基丁二酸对照品各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中分别约含L-2-氨基-5-胍基戊酸20mg、L-2,5-二氨基戊酸0.04mg、（S）-2-氨基-5-脲基戊酸0.04mg、L-2-氨基戊二酸0.04mg、（S）-2-乙酰氨基-5-氨基戊酸0.04mg和L-2-氨基丁二酸0.08mg的溶液，作为系统适用性溶液；
S6:L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中氨基酸杂质的测定：取步骤S1、S4和S5制备的第一供试品溶液、第二供试品溶液、对照品溶液和系统适用性溶液各5µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异丙醇和浓氨溶液体积比为7：3作为展开剂，置温度为32～35℃和相对湿度为80%～85%环境中，展开约10cm后，晾干，在80℃干燥约30分钟，放冷，喷以1%茚三酮的正丁醇溶液，在80℃加热10分钟，立即检视；
7）结果判定：
①系统适用性试验：如果对照品溶液的薄层色谱图中显示两个清晰的斑点，系统适用性溶液的薄层色谱图中显示六个完全分离的清晰斑点，则系统适用性试验符合要求；否则系统适用性试验不符合要求。
②样品检测：如果第一供试品溶液显示杂质斑点不超过1个，其颜色不深于对照品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的斑点，并且第二供试品溶液显示的L-2-氨基丁二酸斑点颜色不深于对照品溶液中L-2-氨基丁二酸的斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的氨基酸杂质含量低于千分之二；如果第一供试品溶液显示杂质斑点超过1个，则视为L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的氨基酸杂质含量高于千分之二；如果第一供试品溶液只显示1个杂质斑点，但其颜色深于对照品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的斑点，则L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中的氨基酸杂质含量高于千分之二。
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| CN109358152B (zh) | 2020-11-24 |
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