CN109342606A - 一种水产品中甘氨酸甜菜碱的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水产品中甘氨酸甜菜碱的检测方法,通过特定的预处理方法,并选择特定的高效液相色谱条件,采用通用的高效液相色谱设备实现了水产品中甘氨酸甜菜碱的定量检测,填补了水产品中甘氨酸甜菜碱检测方法的空白,而且相较于先前的比色法检测甘氨酸甜菜碱的方法,本发明的检测方法更高效、灵敏度高、适于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及甘氨酸甜菜碱检测领域,尤其涉及一种水产品中甘氨酸甜菜碱的检测方法。
背景技术
甘氨酸甜菜碱(glycine betaine)是甜菜碱类化合物中的一种,分子式为(CH3)3NCH2COO。甘氨酸甜菜碱在虾、蟹、贝类等水产品肌肉中含量丰富,是这些水产品的主要呈味物质之一,也是提供甜味的主要成分。已有研究表明,甘氨酸甜菜碱的含量对相关水产品的口味差异起明显作用。
目前,对甘氨酸甜菜碱含量的检测方法大多采用比色法,该法虽操作简单,但是受干扰严重,灵敏度低,检测效果不佳。此外,水产品(包括蟹、虾、贝类等)不像枸杞、甜菜等属于高纯度、高浓度甜菜碱含量的单一基质产品,其基质较为复杂,检测难度大,目前尚无针对这种复杂基质中甘氨酸甜菜碱进行检测的良好方法。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足,本发明提供一种能够利用高效液相色谱分析法,进行高效、快速测定,且灵敏度高、适于推广应用的水产品中甘氨酸甜菜碱的检测方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种水产品中甘氨酸甜菜碱的检测方法,包括以下步骤:
1)制备至少6种不同浓度的标准溶液并进行液相色谱法检测,测定不同浓度的标准溶液对应的色谱峰面积值,得到标准色谱图;
2)根据步骤1)获得的标准色谱图制作成甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的关系曲线图;
3)对待检测的水产品样品进行预处理得到待测样液;
4)使用高效液相色谱仪对步骤3)得到的待测样液进行检测,测得待测样液的色谱峰面积,其中色谱条件如下:
色谱柱为亲水相互作用色谱柱;
流动相为水和乙腈的混合溶液,等度洗脱;
检测器为荧光检测器;
5)根据步骤2)得到的甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的关系曲线图,计算得到待测样品的甘氨酸甜菜碱含量。
所述的步骤4)中色谱条件具体如下:
a)色谱柱:粒径为2.5μm,规格为4.6×150mm的BEH HILIC色谱柱或者柱效相当的色谱柱;
b)柱温:20~25℃;
c)流动相:水∶乙腈(V∶V)=40∶60~10∶90的混合溶液,等度洗脱;
d)流动相流速:0.6~1.0mL/min;
e)进样体积:5~10μL;
f)检测器类型:荧光检测器;
g)检测波长:195nm。
所述的步骤1)的具体内容为:
称取甘氨酸甜菜碱标准品并用乙腈溶液逐级稀释,分别稀释成至少6种不同浓度的标准溶液,将不同浓度的标准溶液分别用高效液相色谱仪进行检测并得到对应浓度的标准色谱图,测定相应的色谱峰面积值,其中色谱条件为:
a)色谱柱:粒径为2.5μm,规格为4.6×150mm的BEH HILIC色谱柱或者柱效相当的色谱柱;
b)柱温:20~25℃;
c)流动相:水∶乙腈(V∶V)=40∶60~10∶90的混合溶液,等度洗脱;
d)流动相流速:0.6~1.0mL/min;
e)进样体积:5~10μL;
f)检测器类型:荧光检测器;
g)检测波长:195nm。
所述的步骤2)的具体内容为:
根据步骤1)获得的标准色谱图,以标准溶液中甘氨酸甜菜碱的质量浓度为横坐标,以色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得到甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的关系曲线图,即甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的对应函数关系。
所述的步骤3)中预处理具体包括:
在待检测的水产品样品中加入有机溶剂,室温下涡旋振荡30min后,3500~4500r/min离心5~8min,过滤取上清液,重复上述步骤提取三次后,合并上清液,将合并后的上清液过0.22μm滤膜得到待测样液。
所述的步骤3)中加入的有机溶剂为95%甲醇,具体操作为:准确称取0.5g待检测的水产品样品于50mL离心管中,往离心管中加入10mL95%甲醇。
所述的待检测的水产品样品为新鲜水产品样品或者冷冻水产品样品。
与现有技术相比,本发明的优点在于:通过特定的预处理方法,并选择特定的高效液相色谱条件,采用通用的高效液相色谱设备实现了水产品中甘氨酸甜菜碱的定量检测,填补了水产品中甘氨酸甜菜碱检测方法的空白,而且相较于先前的比色法检测甘氨酸甜菜碱的方法,本发明的检测方法更高效、灵敏度高、适于推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例1的方法得到的甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的关系曲线图,图中横坐标为浓度,单位是μg/mL,纵坐标为峰面积,单位是μV/s;
图2为本发明实施例1的方法测得的甘氨酸甜菜碱标准溶液的标准色谱图,图中横坐标为时间,单位是分钟,纵坐标为电信号;
图3为本发明实施例4的方法测得的梭子蟹样品的色谱图,图中横坐标为时间,单位是分钟,纵坐标为电信号;
图4为本发明实施例5的方法测得的对虾样品的色谱图,图中横坐标为时间,单位是分钟,纵坐标为电信号;
图5为本发明实施例6的方法测得的花蛤样品的色谱图,图中横坐标为时间,单位是分钟,纵坐标为电信号。
具体实施方式
以下结合附图对本发明一种水产品中甘氨酸甜菜碱的检测方法作进一步详细说明,但不作为对本发明的限定。
实施例1:一种水产品中甘氨酸甜菜碱的检测方法,包括以下步骤:
1)称取甘氨酸甜菜碱标准品并用乙腈溶液逐级稀释,分别稀释成6种不同浓度(10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、60μg/mL、100μg/mL、200μg/mL浓度)的标准溶液,将该6种不同浓度的标准溶液分别用高效液相色谱仪(waters e2695)进行液相色谱法检测,测定不同浓度的标准溶液对应的色谱峰面积值,得到标准色谱图,其中色谱条件为:
a)色谱柱:粒径为2.5μm,规格为4.6×150mm的BEH HILIC色谱柱;
b)柱温:25℃;
c)流动相:水∶乙腈(V∶V)=20∶80的混合溶液,等度洗脱;
d)流动相流速:0.7mL/min;
e)进样体积:10μL;
f)检测器类型:荧光检测器;
g)检测波长:195nm;
2)根据步骤1)获得的标准色谱图,以标准溶液中甘氨酸甜菜碱的质量浓度为横坐标,以色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得到甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的关系曲线图,即甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的对应函数关系,线性回归方程为:Y=2.45e+3X-2.19e+2,R2=0.9999,结果表明甘氨酸甜菜碱在0~200μg/mL的浓度范围内,色谱峰面积与浓度呈良好的线性相关性;
3)准确称取0.5g待检测的水产品样品于50mL离心管中,往离心管中加入10mL95%甲醇,室温下涡旋振荡30min后,4000r/min离心5min,过滤取上清液,重复上述步骤提取三次后,合并上清液,将合并后的上清液过0.22μm滤膜得到待测样液;
4)使用高效液相色谱仪(waters e2695)对步骤3)得到的待测样液进行检测,测得待测样液的色谱峰面积,其中色谱条件如下:
a)色谱柱:粒径为2.5μm,规格为4.6×150mm的BEH HILIC色谱柱;
b)柱温:25℃;
c)流动相:水∶乙腈(V∶V)=20∶80的混合溶液,等度洗脱;
d)流动相流速:0.7mL/min;
e)进样体积:10μL;
f)检测器类型:荧光检测器;
g)检测波长:195nm;
5)根据步骤2)得到的甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的关系曲线图,计算得到待测样品的甘氨酸甜菜碱含量。
实施例2:其它内容均与实施例1相同,不同之处在于步骤1)和步骤4)中的色谱条件为:
a)色谱柱:粒径为2.5μm,规格为4.6×150mm的BEH HILIC色谱柱;
b)柱温:20℃;
c)流动相:水∶乙腈(V∶V)=40∶60的混合溶液,等度洗脱;
d)流动相流速:0.6mL/min;
e)进样体积:5μL;
f)检测器类型:荧光检测器;
g)检测波长:195nm。
以及步骤3)中室温下涡旋振荡30min后,3500r/min离心8min,过滤取上清液,反复提取三次,合并上清液,将合并后的上清液过0.22μm滤膜得到待测样液。
实施例3:其它内容均与实施例1相同,不同之处在于步骤1)和步骤4)中的色谱条件为:
a)色谱柱:粒径为2.5μm,规格为4.6×150mm的BEH HILIC色谱柱;
b)柱温:22℃;
c)流动相:水∶乙腈(V∶V)=10∶90的混合溶液,等度洗脱;
d)流动相流速:1.0mL/min;
e)进样体积:8μL;
f)检测器类型:荧光检测器;
g)检测波长:195nm。
以及步骤3)中室温下涡旋振荡30min后,4500r/min离心6min,过滤取上清液,反复提取三次,合并上清液,将合并后的上清液过0.22μm滤膜得到待测样液。
实施例4:梭子蟹样品中甘氨酸甜菜碱的检测方法,包括以下步骤:
1)称取甘氨酸甜菜碱标准品并用乙腈溶液逐级稀释,分别稀释成6种不同浓度(10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、60μg/mL、100μg/mL、200μg/mL浓度)的标准溶液,将该6种不同浓度的标准溶液分别用高效液相色谱仪(waters e2695)进行液相色谱法检测,测定不同浓度的标准溶液对应的色谱峰面积值,得到标准色谱图,其中色谱条件为:
a)色谱柱:粒径为2.5μm,规格为4.6×150mm的BEH HILIC色谱柱;
b)柱温:25℃;
c)流动相:水∶乙腈(V∶V)=20∶80的混合溶液,等度洗脱;
d)流动相流速:0.7mL/min;
e)进样体积:10μL;
f)检测器类型:荧光检测器;
g)检测波长:195nm;
2)根据步骤1)获得的标准色谱图,以标准溶液中甘氨酸甜菜碱的质量浓度为横坐标,以色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得到甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的关系曲线图,即甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的对应函数关系;
3)分别准确称取3份梭子蟹样品(0.5g/份)于50mL离心管中,分别往3份离心管中加入10mL95%甲醇,均在室温下涡旋振荡30min后,4000r/min离心5min,过滤取上清液。合并上述3份上清液,将合并后的上清液过0.22μm滤膜得到待测样液;
4)使用高效液相色谱仪(waters e2695)对步骤3)得到的待测样液进行检测,测得待测样液的色谱峰面积,其中色谱条件如下:
a)色谱柱:粒径为2.5μm,规格为4.6×150mm的BEH HILIC色谱柱;
b)柱温:25℃;
c)流动相:水∶乙腈(V∶V)=20∶80的混合溶液,等度洗脱;
d)流动相流速:0.7mL/min;
e)进样体积:10μL;
f)检测器类型:荧光检测器;
g)检测波长:195nm;
5)根据步骤2)得到的甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的关系曲线图,计算得到梭子蟹样品的甘氨酸甜菜碱含量,结果如表1所示。
表1梭子蟹样品中甘氨酸甜菜碱含量
实施例5:其它内容均与实施例4相同,不同之处在于步骤3)中分别准确称取的是3份对虾样品(0.5g/份)于50mL离心管中,分别往3份离心管中加入10mL95%甲醇,均在室温下涡旋振荡30min后,4000r/min离心5min,过滤取上清液。合并上述3份上清液,将合并后的上清液过0.22μm滤膜得到待测样液。
5)根据步骤2)得到的甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的关系曲线图,计算得到对虾样品的甘氨酸甜菜碱含量,结果如表2所示。
表2对虾样品中甘氨酸甜菜碱含量
实施例6:其它内容均与实施例4相同,不同之处在于步骤3)中分别准确称取的是3份花蛤样品(0.5g/份)于50mL离心管中,分别往3份离心管中加入10mL95%甲醇,均在室温下涡旋振荡30min后,4000r/min离心5min,过滤取上清液。合并上述3份上清液,将合并后的上清液过0.22μm滤膜得到待测样液。
5)根据步骤2)得到的甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的关系曲线图,计算得到花蛤样品的甘氨酸甜菜碱含量,结果如表3所示。
表3花蛤样品中甘氨酸甜菜碱含量
对甘氨酸甜菜碱对照品进行加标回收率实验(方法准确度验证):量取3份浓度为100μg/ml的对照液各0.5ml,分别加入浓度为200μg/ml的对照液,测定峰面积响应值,计算回收率,其具体实验参数及测定结果如表4所示。
表4回收率实验结果
实验结果表明:利用本发明色谱条件进行水产品(包括蟹、虾、贝类)中甘氨酸甜菜碱含量测定的方法,所测得的甘氨酸甜菜碱含量的回收率高,也就是表明在测定过程中,在本发明色谱条件下其有效成分可以完全分离,高效回收,更有利于对水产品中甘氨酸甜菜碱含量的测定。其中,本发明采用亲水相互作用色谱柱为固定相,水和乙腈的混合溶液为流动相,甘氨酸甜菜碱具有强亲水性,使用亲水相互作用色谱柱可以改善甜菜碱保留差的问题;采用乙腈与水作为流动相有利于提高柱效,采用该特定的流动相比例和流速,能够使杂质峰对目标峰的干扰小,目标峰出峰时间稳定,分离效果好;采用高效液相色谱与荧光检测器相结合的方法,对水产品中甘氨酸甜菜碱检测的灵敏度提高,采用195nm检测波长,为甘氨酸甜菜碱的最大吸收波长,吸光度最大。
本发明一种水产品中甘氨酸甜菜碱的检测方法,通过特定的样品预处理,并选择特定的高效液相色谱条件,采用通用的高效液相色谱设备实现了水产品中甘氨酸甜菜碱的定量检测,填补了水产品中甘氨酸甜菜碱检测方法的空白,而且相较于先前的比色法检测甘氨酸甜菜碱的方法,本发明的检测方法更高效、灵敏度高、适于推广应用。
值得注意的是,以上所述仅为本发明的较佳实施例,并非因此限定本发明的专利保护范围,本发明还可以对上述各种零部件的构造进行材料和结构的改进,或者是采用技术等同物进行替换。故凡运用本发明的说明书及图示内容所作的等效结构变化,或直接或间接运用于其他相关技术领域均同理皆包含于本发明所涵盖的范围内。
Claims (7)
1.一种水产品中甘氨酸甜菜碱的检测方法,其特征在于包括以下步骤:
1)制备至少6种不同浓度的标准溶液并进行液相色谱法检测,测定不同浓度的标准溶液对应的色谱峰面积值,得到标准色谱图;
2)根据步骤1)获得的标准色谱图制作成甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的关系曲线图;
3)对待检测的水产品样品进行预处理得到待测样液;
4)使用高效液相色谱仪对步骤3)得到的待测样液进行检测,测得待测样液的色谱峰面积,其中色谱条件如下:
色谱柱为亲水相互作用色谱柱;
流动相为水和乙腈的混合溶液,等度洗脱;
检测器为荧光检测器;
5)根据步骤2)得到的甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的关系曲线图,计算得到待测样品的甘氨酸甜菜碱含量。
2.根据权利要求1所述的一种水产品中甘氨酸甜菜碱的检测方法,其特征在于所述的步骤4)中色谱条件具体如下:
a) 色谱柱:粒径为2.5μm,规格为4.6×150mm的BEH HILIC色谱柱或者柱效相当的色谱柱;
b) 柱温:20~25℃;
c) 流动相:水∶乙腈(V∶V)=40∶60~10∶90的混合溶液,等度洗脱;
d) 流动相流速:0.6~1.0mL/min;
e) 进样体积:5~10μL;
f)检测器类型:荧光检测器;
g)检测波长:195nm。
3.根据权利要求1或2所述的一种水产品中甘氨酸甜菜碱的检测方法,其特征在于所述的步骤1)的具体内容为:
称取甘氨酸甜菜碱标准品并用乙腈溶液逐级稀释,分别稀释成至少6种不同浓度的标准溶液,将不同浓度的标准溶液分别用高效液相色谱仪进行检测并得到对应浓度的标准色谱图,测定相应的色谱峰面积值,其中色谱条件为:
a) 色谱柱:粒径为2.5μm,规格为4.6×150mm的BEH HILIC色谱柱或者柱效相当的色谱柱;
b) 柱温:20~25℃;
c) 流动相:水∶乙腈(V∶V)=40∶60~10∶90的混合溶液,等度洗脱;
d) 流动相流速:0.6~1.0mL/min;
e) 进样体积:5~10μL;
f)检测器类型:荧光检测器;
g)检测波长:195nm。
4.根据权利要求1或2所述的一种水产品中甘氨酸甜菜碱的检测方法,其特征在于所述的步骤2)的具体内容为:
根据步骤1)获得的标准色谱图,以标准溶液中甘氨酸甜菜碱的质量浓度为横坐标,以色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得到甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的关系曲线图,即甘氨酸甜菜碱浓度与色谱峰面积的对应函数关系。
5.根据权利要求1或2所述的一种水产品中甘氨酸甜菜碱的检测方法,其特征在于所述的步骤3)中预处理具体包括:
在待检测的水产品样品中加入有机溶剂,室温下涡旋振荡30min后,3500~4500r/min离心5~8min,过滤取上清液,重复上述步骤提取三次后,合并上清液,将合并后的上清液过0.22μm滤膜得到待测样液。
6.根据权利要求5所述的一种水产品中甘氨酸甜菜碱的检测方法,其特征在于所述的步骤3)中加入的有机溶剂为95%甲醇,具体操作为:准确称取0.5g待检测的水产品样品于50mL离心管中,往离心管中加入10mL95%甲醇。
7.根据权利要求1所述的一种水产品中甘氨酸甜菜碱的检测方法,其特征在于所述的待检测的水产品样品为新鲜水产品样品或者冷冻水产品样品。
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CN109342606B (zh) | 2021-11-02 |
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