CN109295165A - 一种基于southern blot的端粒长度检测方法 - Google Patents

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顾凯强
葛远龙
李国庆
杨奇飞
黄洪斌
周君
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means

Abstract

本发明公开了一种基于Southern Blot的端粒长度检测方法，所述方法包含步骤：(a)从血液中提取人类基因组DNA，并配置酶切体系，反应条件为37℃水浴孵育16h，(b)将DNA酶切样本放入0.7％琼脂糖凝胶中电泳，反应条件为电压1.5V/cm，时间16h，反应过后修整琼脂糖凝胶，将其放置在干胶仪上，温度50℃，干燥1‑2h，涉及生物技术领域。该基于Southern Blot的端粒长度检测方法，避免了转膜效率对实验结果的影响以及克服了转膜对于DNA片段大小的限制，并且实验多步骤都在同一块凝胶上进行，使得实验操作连贯，实验结果稳定性高。

Description

一种基于southern blot的端粒长度检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种基于Southern Blot的端粒长度检测方法。
背景技术
端粒(telomere)是染色体末端的特定结构，具有防止染色体相互重组、融合以及保护染色体不被核酸酶降解等功能。人类染色体端粒是由数千个TTAGGG的短重复序列组成，总长度一般为5-20kb，但由于DNA复制的原因，细胞每分裂一次，端粒就缩短150bp左右。当端粒缩短到一定程度，细胞将无法继续分裂并进入衰老阶段。为避免这种因为DNA复制而引起的衰老，在一些特定的人体细胞如造血干细胞和生殖细胞内，利用一种被称作端粒酶(telomerase)的成分来延伸端粒序列，使其保持一定长度，从而获得持续分裂的能力。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，主要由RNA(telomeraseRNA component，hTERC)和具有逆转录酶功能的酶(telomerase reverse transcriptase，hTERT)组成，此外还包括一些端粒酶相关蛋白(Dyskerin、NHP2、N0P10、TCABl等)，hTERT能以自身的RNA为模板合成端粒DNA，从而维持端粒长度。因此，对于快速分裂的细胞，其端粒长度处在端粒缩短(正常细胞分裂引起)和端粒增加(端粒酶执行)的动态平衡过程中。但是，在人体出生以后，只有在神经细胞、骨髓干细胞以及生殖细胞中存在端粒酶，而在正常的体细胞内则没有端粒酶表达，因此体细胞在增殖到一定程度就会进入衰老状态，然后由存在于骨髓等处的干细胞增殖分化为新的体细胞补充，完成体细胞的增殖代谢；尽管人体细胞如造血干细胞和生殖细胞内存在端粒酶，但其增加端粒的效能远远抵不上端粒变短的速度，因此随着年龄的增长，端粒逐渐变短，这也可以解释为什么人会逐渐衰老死亡。大量的动物实验以及临床观察证实，端粒缩短至一定程度，机体往往会罹患一些疾病，如癌症(前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌)、恶性血液病(再生障碍性贫血、先天性角化不良、MDS、以及骨髓衰竭等)以及心脑血管系统疾病等。如在一些恶性血液病如再生障碍性贫血病人中，由于存在于端粒酶上的一些突变导致了端粒酶活性下降，导致端粒长度变短，从而导致再生障碍性贫血，最终往往因为骨髓衰竭而死亡。因此，端粒长度已被认为是一个重要的人体机能指标，是重要的“有丝分裂钟”或“分子钟”，端粒的缩短被认为与细胞衰老和癌症等疾病的发生密切相关，因此建立一种通用的高通量端粒长度检测方法，对于预防衰老和癌症都会起到很大的帮助。
自上个世纪80年代开始，学者们就开始研究如何进行端粒长度的测定，并陆续建立起了一系列端粒长度的检测方法，如Southern Blot，FISH，q-FISH，Flow-FISH和Q-PCR。在这些方法中Southern blot比较直观，因此被认为是检测端粒长度的“金标准”检测方法，该技术的原理是将基因组DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上。经碱处理凝胶使DNA变性(使双链DNA变成单链)，通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，经过干燥或紫外线照射处理。单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢牢地固定到转移膜上，转移后的单链DNA分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交。经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。
但是该方法也有一些缺点：
在转膜操作中，膜的摆放位置，是否有气泡存在，盐离子浓度等因素都会对转膜的效率产生影响，从而影响结果的准确性，导致该操作复杂、要求高等；转膜对于DNA的片段大小有限制，当需要进行大片段DNA样本操作时，转膜方法显得不适用；变性、中和、预杂交、杂交等步骤分别在凝胶和滤膜进行，操作没有连贯性，对实验结果稳定性有很大影响。
针对上述的缺点。为此，期望上述改进的检测方法有效地用于端粒长度的检测，因此积极进行了以上研究。
由此可见，即使是端粒长度检测的金标准方法也存在不便和缺陷，而亟待加以进一步改进，发明一种能有效解决这些问题，并且可以继续作为“金标准”的端粒长度检测方法是本领域的重要研发项目。
本发明人开发更好的用于选择针对端粒相关的长度检测方法，且作为结果，已开发出一种基于southern blot的端粒长度检测方法并验证针对端粒相关的长度检测方法，从而完成本发明。与传统的Southern Blot测端粒长度的方法相比，使用干胶仪对琼脂糖凝胶进行干燥脱水处理，达成与转膜一样的功能，避免了转膜效率对实验结果的影响以及克服了转膜对于DNA片段大小的限制，并且实验多步骤都在同一块凝胶上进行，使得实验操作连贯，实验结果稳定性高。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供一种基于southern blot的端粒长度检测方法，使其解决转膜操作对实验产生巨大影响的问题，以及克服转膜对于大片段DNA的限制，使得实验操作都在同一块凝胶上进行，保证实验操作的连贯，实验结果的稳定性。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种基于Southern Blot的端粒长度检测方法，所述方法包含步骤：
(a)从血液中提取人类基因组DNA，并配置酶切体系，反应条件为37℃水浴孵育16h；
(b)将DNA酶切样本放入0.7％琼脂糖凝胶中电泳，反应条件为电压1.5v/cm，时间16h，反应过后修整琼脂糖凝胶，将其放置在干胶仪上，温度50℃，干燥1-2h；
(c)对琼脂糖凝胶进行处理，且处理过程通过以下步骤实现：
(i)取下的琼脂糖凝胶，加入50ml变性液，通过杂交炉42℃，孵育30min；
(ii)倒掉变性液，加入50ml中和液，杂交炉42℃，孵育30min；再倒掉中和液并加入10ml杂交液，杂交炉42℃，并旋转1h；
(iii)倒掉杂交液，加入10ml新的杂交液，且加入5ul P-32标记的探针，杂交炉42℃，旋转时间至少为16h；
(iv)倒掉杂交液，加入100ml Wash I洗液，杂交炉42℃，旋转20min，倒掉Wash I，加入新的100ml Wash I洗液，杂交炉，42℃，旋转20min，之后再重复用Wash I洗涤一次；
(v)倒掉Wash I，加入100ml Wash II，杂交炉42℃，旋转20min。用Wash II重复洗涤三次；
(d)倒掉Wash II，取出琼脂糖凝胶，吸干胶样上的水分，通过保鲜膜包裹好胶样，并放入空白磷屏中，暗室曝光16h至20h，再用磷屏成像仪扫描磷屏，保存图像。
进一步的，所述酶切体系的配置为每40ul体系为4ul的Cut Smart Buffer、3ug的DNA和1ul的5u/ul内切酶。
进一步的，所述内切酶配置为MspI、HinfI和RsaI，且比例为1:1:1。
进一步的，其中步骤(c)的变性液配置体系为0.5mol/L NaOH和1.5mol/L NaCl。
进一步的，其中步骤(c)的中和液配置体系为0.5mol/L Tris-HCl和1.5mol/LNaCl。
进一步的，其中步骤(c)的杂交液配置体系为10*Denhardt‘s solution、5*SCC、0.5％SDS和1*大肠杆菌质粒DNA。
进一步的，其中步骤(c)的Wash I配置体系为2*SCC和0.5％SDS。
进一步的，其中步骤(c)的Wash II配置体系为2*SCC和0.1％SDS。
(三)有益效果
本发明提供了一种基于Southern Blot的端粒长度检测方法。具备以下有益效果：
该基于Southern Blot的端粒长度检测方法，与传统的Southern Blot测端粒长度的方法相比，使用干胶仪对琼脂糖凝胶进行干燥脱水处理，达成与转膜一样的功能，避免了转膜效率对实验结果的影响以及克服了转膜对于DNA片段大小的限制，并且实验多步骤都在同一块凝胶上进行，使得实验操作连贯，实验结果稳定性高。
附图说明
图1为本发明方法流程图；
图2为本发明凝胶电泳分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本发明实施例提供一种技术方案：一种基于Southern Blot的端粒长度检测方法，从血液中提取人类基因组DNA并配置酶切体系，酶切体系的配置为每40ul体系为4ul的Cut Smart Buffer、3ug的DNA和1ul的5u/ul内切酶，内切酶配置为MspI、HinfI和RsaI，且比例为1:1:1，在37℃水浴孵育16h，将DNA酶切样本放入0.7％琼脂糖凝胶中电泳，反应条件为电压1.5V/cm，时间16h，对反应过后的修整琼脂糖凝胶，将其放置在干胶仪上，温度50℃，干燥1-2h，取下琼脂糖凝胶，放入杂交筒，向筒中加入50ml变性液，杂交炉42℃，孵育30min，取下杂交筒，倒掉变性液，变性液配置体系为0.5mol/L NaOH和1.5mol/L NaCl，向筒中加入清水清洗2遍，倒掉清水，向筒中加入50ml中和液，中和液配置体系为0.5mol/LTris-HCl和1.5mol/L NaCl，杂交炉42℃，孵育30min，取下杂交筒，倒掉中和液，向筒中加入10ml杂交液，杂交炉42℃，旋转1h，取下杂交筒，倒掉杂交液，杂交液配置体系为10*Denhardt‘s solution、5*SCC、0.5％SDS和1*大肠杆菌质粒DNA，加入10ml新的杂交液，于安全的防护设施内，向杂交筒中加入5ul P-32标记的探针。杂交炉42℃，旋转16h及以上，取下杂交筒，倒掉杂交液，向筒中加入100ml Wash I洗液，杂交炉42℃，旋转20min，取下杂交筒，倒掉Wash I，再向筒中加入新的100ml Wash I洗液，Wash I配置体系为2*SCC和0.5％SDS，杂交炉，42℃，旋转20min，之后再重复用Wash I洗涤一次，取下杂交筒，倒掉Wash I，向筒中加入100ml Wash II，Wash II配置体系为2*SCC和0.1％SDS，杂交炉42℃，旋转20min。用Wash II重复洗涤三次，取下杂交筒，倒掉Wash II，在安全的设施内，取出琼脂糖凝胶；
取出的琼脂糖凝胶，将凝胶平铺在纸上，吸干胶样上的水分，用保鲜膜包裹好胶样，放入空白磷屏中，暗室曝光16h-20h，用磷屏成像仪扫描磷屏，如图2所示，并保存图像，减少了样本不同实验室间检测数据存在较大的差异，提高了对端粒长度检测方法进行不断的完善和创新，推动端粒基础和流行病学研究及临床应用的进展。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种基于Southern Blot的端粒长度检测方法，所述方法包含步骤：
(a)从血液中提取人类基因组DNA，并配置酶切体系，反应条件为37℃水浴孵育16h；
(b)将DNA酶切样本放入0.7％琼脂糖凝胶中电泳，反应条件为电压1.5V/cm，时间16h，反应过后修整琼脂糖凝胶，将其放置在干胶仪上，温度50℃，干燥1-2h；
(c)对琼脂糖凝胶进行处理，且处理过程通过以下步骤实现：
(i)取下的琼脂糖凝胶，加入50ml变性液，在杂交炉42℃，孵育30min；
(ii)倒掉变性液，加入50ml中和液，杂交炉42℃，孵育30min；再倒掉中和液并加入10ml杂交液，杂交炉42℃，并旋转1h；
(iii)倒掉杂交液，加入10ml新的杂交液，且加入5ul P-32标记的探针，杂交炉42℃，旋转时间至少为16h；
(iv)倒掉杂交液，加入100ml Wash I洗液，通过杂交炉42℃，旋转20min，倒掉Wash I，加入新的100ml Wash I洗液，通过杂交炉，42℃，旋转20min，之后再重复用Wash I洗涤一次；
(v)倒掉Wash I，加入100ml Wash II，杂交炉42℃，旋转20min。用Wash II重复洗涤三次；
(d)倒掉Wash II，取出琼脂糖凝胶，吸干胶样上的水分，通过保鲜膜包裹好胶样，并放入空白磷屏中，暗室曝光16h至20h，再用磷屏成像仪扫描磷屏，保存图像。
2.根据权利要求1所述的一种方法，所述酶切体系的配置为每40ul体系为4ul的CutSmart Buffer、3ug的DNA和1ul的5u/ul内切酶。
3.根据权利要求2所述的一种方法，所述内切酶配置为MspI、HinfI和RsaI，且比例为1:1:1。
4.根据权利要求1所述的一种方法，其中步骤(c)的变性液配置体系为0.5mol/L NaOH和1.5mol/L NaCl。
5.根据权利要求1所述的一种方法，其中步骤(c)的中和液配置体系为0.5mol/L Tris-HCl和1.5mol/L NaCl。
6.根据权利要求1所述的一种方法，其中步骤(c)的杂交液配置体系为10*Denhardt‘ssolution、5*SCC、0.5％SDS和1*大肠杆菌质粒DNA。
7.根据权利要求1所述的一种方法，其中步骤(c)的Wash I配置体系为2*SCC和0.5％SDS。
8.根据权利要求1所述的一种方法，其中步骤(c)的Wash II配置体系为2*SCC和0.1％SDS。
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