JP6118262B2 - 乾燥試料から遺伝子材料を電気溶出する方法 - Google Patents

Description

本明細書で開示する発明の主題は、生物学的試料由来の遺伝子材料の保存に使用するための固形媒体に関し、より詳細には生物学的試料由来の遺伝子材料を固形媒体から直接電気溶出する方法に関する。

様々な施設（例として研究機関又は医療機関）が、広範囲の供給源（例としてヒト血液、細胞株など）から収集される遺伝子材料（例としてＤＮＡ）の大量のコレクションを保存するシステムを内部に持つ。遺伝子材料は安全、簡便な及び必要とする労力が最小限の手法で、これらの保存システム内に後の分析のために保存される。例えば、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）ＦＴＡ（登録商標）基材などの固形媒体が、組織又は細胞などの様々な生物学的試料由来の遺伝子材料を保存するのに用いられる。しかしながら、固形媒体からの遺伝子材料の抽出は多数の試料を取り扱う場合に付加的な労力、時として多くの労力を伴う。例えば、遺伝子材料の抽出には、洗浄剤の使用又は高温での固形媒体のインキュベーションのいずれかが含まれていることがある。洗浄剤は遺伝子材料の分析を妨害する可能性があり、従って洗浄剤を除去するための付加的な労力が必要になる。また、より高い温度は遺伝子材料を断片化する可能性がある。従って、遺伝子材料の断片化を最小限にしながらも遺伝子材料の抽出に必要とされる作業を低減することへのニーズが存在する。

米国特許第６５０３７１６号

第１の実施形態では、固形媒体上に保存された生物学的試料から遺伝子材料を抽出する方法を提供する。本方法は固形媒体を取得することを含んでおり、生物学的試料は固形媒体上にアプライされ、固形媒体は生物学的試料を溶解して遺伝子材料を保持する化学物質を含む。本方法はまた、遺伝子材料を固形媒体から次の媒体へ直接電気溶出することを含む。

第２の実施形態では、固形媒体上に保存された固定化組織試料から遺伝子材料を抽出する方法を提供する。本方法は固定化組織試料の少なくとも一部を固形媒体にアプライすることを含んでおり、固形媒体は細胞を溶解又は遺伝子材料を保持することができる化学物質を含む。本方法は遺伝子材料を固形媒体から次の媒体へ直接電気溶出することをさらに含む。

第３の実施形態では、セルロース系紙上に保存された生物学的試料からＤＮＡを抽出する方法を提供する。本方法はセルロース系紙を取得することを含んでおり、生物学的試料はセルロース系紙上にアプライされ、セルロース系紙は生物学的試料を溶解してＤＮＡを保持する化学物質を含む。本方法はまた、ＤＮＡをセルロース系紙から電気泳動ゲル中へ直接電気溶出することを含む。

本発明のこれら及び他の特徴、態様及び利点は、添付の図面に関する以下の詳細な説明を読むことでより良く理解されるようになるが、この図中では同種の文字は図面全体を通じて同種の部分を表す。

本開示の態様による、固形媒体上に保存された生物学的試料から遺伝子材料を抽出する方法を説明するフローチャートである。 本開示の態様による、パルスフィールドゲル電気泳動を用いて固形媒体から電気溶出したＤＮＡのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染色電気泳動ゲルを示す図である。 本開示の態様による、アルカリゲル電気泳動を用いて固形媒体から電気溶出したＤＮＡのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染色電気泳動ゲルを示す図である。 本開示の態様による、固形媒体上に保存された固定化組織試料から遺伝子材料を抽出する方法を説明するフローチャートである。 ホルマリン中で固定されＷｈａｔｍａｎ（登録商標）ＦＴＡ（登録商標）紙にアプライされたヒト前立腺試料から抽出されたＤＮＡのマルチプレックスＰＣＲ増幅物についての、垂直ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）システムを用いた、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染色電気泳動ゲルを示す図である。 本開示の態様による、非変性ゲル電気泳動を用いて固形媒体から電気溶出したＤＮＡのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染色電気泳動ゲルを示す図である。 本開示の態様による、非変性ゲル電気泳動を用いて固形媒体から電気溶出したＤＮＡのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染色電気泳動ゲルを示す図である。 本開示の態様による、非変性ゲル電気泳動を用いて固形媒体から電気溶出したＤＮＡのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染色電気泳動ゲルを示す図である。

以下に詳細に論じられるように、本発明の実施形態は、遺伝子材料（例としてＤＮＡ）を固形媒体（例として化学的に処理されたセルロース基材）上に保存された生物学的試料から電気溶出を用いて直接抽出する方法を含む。１つの実施形態では、方法は、予め固形媒体上にアプライされ乾燥された保存生物学的試料を含む固形媒体を取得することを含む。固形媒体は、生物学的試料を溶解して遺伝子材料を保持する化学物質を含む。方法はまた、固形媒体から化学物質を除去した後に遺伝子材料を固形媒体から次の媒体へ直接電気溶出することを含む。次の媒体としては、電気泳動ゲル、溶液又は捕捉表面（例としてブロッティングメンブラン）を挙げることができる。あるいは、固定化細胞又は組織試料を固形媒体にアプライしてもよい。固定された試料を固形媒体へのアプライの前又は後に処理してもよい。例えば、固定された試料の処理としては、固定された試料の再水和及び／又は溶解が挙げられる。固定されてもされなくても、試料を固形媒体へのアプライの後でさらに処理することができる。特に、遺伝子材料が固形媒体上で一定の位置にある間に、遺伝子材料内のニック及び脱塩基部位の修復を行うことができる。上記の方法は、生物学的試料を溶解し、生物学的試料からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡを表面に結合させ、ＤＮＡを洗浄し、及び高分子量（例として１０キロベース以上）であってあまり断片化されていないＤＮＡを溶出するための単一のプラットフォームを提供する。固形媒体から遺伝子材料を直接電気溶出する能力は、ＤＮＡの抽出に通常用いられる洗浄剤の使用を回避し、同様に洗浄剤を除去し、及びＤＮＡをその後の分析のために使用可能にするのに必要な余分の段階を回避する。加えて、高温を用いることなく固形媒体から遺伝子材料を直接電気溶出することで、ＤＮＡの断片化が低減する。本発明より前は、研究者は、固形媒体上に結合したＤＮＡを分析するため、ＤＮＡが置かれた固形媒体をその後の遺伝的分析反応（例としてＰＣＲ）中に直接加えなければならなかった。固形媒体からのＤＮＡの溶出により遺伝子材料の評価を可能にするのはたった１つの反応に限らないことが認識できる。全体として、開示された実施形態は、固形媒体からのＤＮＡの抽出におけるユーザーの作業を低減し、一方でＤＮＡの質及び利用可能性を向上させる。

以下の実施形態では用いられる生物学的試料としては、生理学的／病理学的体液（例として分泌物、排出物、滲出物及び浸出物）又は細胞懸濁物（例として血液、リンパ液、滑液、精液、口腔細胞を含有する唾液、皮膚切屑、毛根細胞など）、ヒト及び動物の細胞懸濁物の液体抽出物又はホモジネート；植物の生理学的／病理学的液体又は細胞懸濁物；細菌、真菌、プラスミド、ウイルスなどの液体生産物、抽出物又は懸濁物；寄生蠕虫、原虫、スピロヘータなどを含む寄生生物の液体生産物、抽出物又は懸濁物；ヒト又は動物の体組織（例として骨、肝臓、腎臓など）；ＤＮＡ又はＲＮＡ合成の媒体；化学的又は生化学的に合成されたＤＮＡ又はＲＮＡの混合物；並びにＤＮＡ及び／又はＲＮＡが液体媒体中に存在又は存在し得る任意の他の供給源を挙げることができる。

ここで図を見ると、図１は固形媒体上に保存された生物学的試料（例として組織、細胞、ウイルス、バクテリオファージ又は核酸を含有する任意の他の試料）から遺伝子材料（例としてＤＮＡ）を抽出する方法１０という実施形態を説明するフローチャートである。生物学的試料を固形媒体にアプライする前に生物学的試料の処理（ブロック１２）を行ってもよい。例えば、以下でさらに詳しく説明する実施形態では、細胞又は組織を含む生物学的試料は固定されてもよい（例としてホルマリン中で）。固定された組織又は細胞の処理としては、固定化細胞若しくは組織の再水和、細胞若しくは組織の溶解（例としてプロテアーゼを使用して）及び／又は遺伝子材料（例としてＤＮＡ）とタンパク質との間の脱架橋を挙げることができる。ある実施形態では、脱架橋などのいくつかの処理は、固定化細胞又は組織を固形媒体にアプライした後に行ってもよい。

所望の生物学的試料の固形媒体へのアプライを次いで行う（ブロック１４）。１つの実施形態では、固形媒体は化学処理された吸収性のセルロース系材料を含む。例えば、固形媒体としてはＷｈａｔｍａｎ（登録商標）ＦＴＡ（登録商標）、又はＦＴＡ（登録商標）Ｅｌｕｔｅ紙（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を挙げることができる。固形媒体は生物学的試料（例として組織又は細胞）を溶解する及び／又は固形媒体上で遺伝子材料を保持する化学物質を含む。実際に、固形媒体及び化学物質の組成は、「Ｄｒｙ Ｓｏｌｉｄ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｓｔｏｒａｇｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌ」と題する米国特許第５９７６５７２号及び「Ｓｏｌｉｄ Ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｓｔｏｒａｇｅ」と題する米国特許第５９８５３２７号公報に詳細に記載されたものであることができ、これらの開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。例えば、固形媒体は、弱塩基（例としてトリス−ヒドロキシメチルメタン（Ｔｒｉｓ））、キレート剤（例としてエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ））、アニオン性界面活性剤若しくは洗浄剤（例としてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））及び／又は尿酸若しくは尿酸塩を含んでいてもよい。固形媒体にアプライされると、化学物質が生物学的試料を溶解し、タンパク質を変性させる。加えて、化学物質はヌクレアーゼ及び病原体を不活性化させ、遺伝子材料の保持及び長期保存を可能にする。アプライの後、アプライされた試料中の液体を蒸発させる。固形媒体上の試料の乾燥（ブロック１６）はアプライの後に行う。例えば、試料を含有する固形媒体はデシケーター中で一晩乾燥させてもよい。ある実施形態では、試料を含有する固形媒体は、遺伝子材料をさらに保持するために保護材料（例としてプラスチックケース）の中に入れてもよい。

所望の乾燥試料を含有する固形媒体を取得したら、試料を含有する固形媒体部分を、その部分から遺伝子材料（例としてＤＮＡ）を電気溶出するために取り出す（ブロック１８）。ある実施形態では、試料全体を用いてもよい。電気溶出の前に、生物学的試料を含有する固形媒体部分を、化学物質を除去するためにすすいでもよい（ブロック２０）。ある実施形態では、試料を含有する固形媒体部分のすすぎとしては、固形媒体部分を緩衝液中に浸漬すること又は緩衝液を固形媒体部分を通して又はその表面に流すことが挙げられる。ある実施形態では、緩衝液としては、少なくともＴｒｉｓ及びＥＤＴＡを含む（例としてＴ．Ｅ．）アルカリ緩衝液（例としてｐＨ８．０）が挙げられる。例えば、試料を有する固形媒体部分は、アルカリ緩衝液中に一定の時間（例として５分間）で１回以上浸漬してもよい。いくつかの実施形態では、緩衝液としてＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＷｈａｔｍａｎ（登録商標）ＦＴＡ（登録商標）精製試薬が挙げられる。例えば、試料を有する固形媒体部分は、ＦＴＡ（登録商標）精製試薬中に一定の時間（例として５分間）で１回以上浸漬してもよい。他の実施形態では、アルカリ緩衝液及びＦＴＡ（登録商標）精製試薬の両方を、試料を含有する固形媒体部分をすすぐために用いてもよい。例えば、試料を含有する固形媒体部分は、アルカリ緩衝液中に一定の時間（例として各浸漬で５分）で２回及びＦＴＡ（登録商標）精製試薬中に一定の時間（例として各浸漬で５分）で２回浸漬してもよい。代替的な実施形態では、試料を含有する固形媒体部分のすすぎとしては、固形媒体部分を水中に浸漬すること又は水を固形媒体部分を通して又はその表面に流すことが挙げられる。例えば、試料を有する固形媒体部分は、水中に一定の時間（例として５分間）で１回以上浸漬してもよい。電気溶出の実施形態（例として透析チューブ中での電気溶出）によっては、試料を含有する固形媒体のすすぎは必要でないこともあり得る。

また、遺伝子材料を、試料を含有する固形媒体部分から電気溶出する前に、非ＤＮＡの汚染物質（例としてタンパク質、脂質、炭水化物など）を低減又は排除するために、試料を有する固形媒体部分を酵素で処理してもよい（ブロック２２）。例えば、酵素溶液はプロテアーゼ、リパーゼ及び／又はグリコシド加水分解酵素などの加水分解酵素を含むことができる。

さらに、遺伝子材料を、試料を含有する固形媒体部分から電気溶出する前に、遺伝子材料（例としてＤＮＡ）を固形媒体上で適所に固定されている間に修復してもよい（ブロック２４）。固形媒体上に保存されたＤＮＡなどの遺伝子材料は、ニック（すなわち、隣接ヌクレオチド間のホスホジエステル結合が欠如したもの）又は脱塩基部位（ＡＰ部位とも呼ばれる、すなわちホスホジエステルリボース骨格の完全性を維持しつつもヌクレオチド中のプリン又はピリミジン塩基が欠如したもの）を含む可能性があるが、これらは予め処理された試料中の固定化剤（例としてホルマリン）又は他の手段によって導入されるものである。ある実施形態では、遺伝子材料の修復としては、ＤＮＡポリメラーゼ（例として大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ）及びＤＮＡリガーゼ（例としてＴ４ ＤＮＡリガーゼ又は細菌のＤＮＡリガーゼ）を少なくとも含有する溶液をアプライしてニック損傷を修復することが挙げられる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ修復の間のプルーフリーディングを仲介する３’→５’エキソヌクレアーゼ活性及びニックトランスレーションを仲介する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の両方に加え、ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む。ＤＮＡポリメラーゼはｄＮＴＰを必要とする。ＤＮＡリガーゼは、隣接ヌクレオチド間にホスホジエステル結合を形成する酵素活性を含む。ＤＮＡリガーゼはｒＡＴＰ又はＮＡＤのいずれかを必要とする。試料を含有する固形媒体部分を、ＤＮＡ修復溶液と共に３７℃で３０分間、次いで６５℃で２０分間インキュベートしてもよい。他の実施形態では、ＤＮＡ修復溶液は同様の又は異なるＤＮＡ修復機構を有する他のＤＮＡ修復酵素を包含してもよい。例えば、ＡＰエンドヌクレアーゼ（例として大腸菌エンドヌクレアーゼＩＶ）を脱塩基部位の除去に用いることも可能である。脱塩基部位はＡＰエンドヌクレアーゼによって切断が可能で、３’水酸基末端及び５’デオキシリボースホスフェート末端が残される。この構造はＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼの組み合わせ作用によりその後に修復することが可能である。

試料を含有する固形媒体を取得した後、遺伝子材料を固形媒体から次の媒体へと直接電気溶出する（ブロック２６）。ある実施形態では、試料を含有する固形媒体部分を電気泳動ゲル（例としてアガロースゲル）のウェル中に直接配置し、ウェルをアガロースで封止し、遺伝子材料を電気泳動ゲルの中に直接電気溶出してもよい（図２及び図３）。他の実施形態では、遺伝子材料を溶液中に電気溶出してもよい。溶液中への電気溶出は種々の方法で行うことができる。例えば、Ｄ−ｔｕｂｅ（商標）透析装置（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．）、透析カセット又は透析チューブ、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）Ｅｌｕｔｒａｐ（登録商標）Ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又は他の装置を、遺伝子材料を固形媒体から溶液へ直接電気溶出するのに用いることができる。さらなる実施形態では、遺伝子材料は固形媒体から捕捉表面上に直接電気溶出してもよい。捕捉表面はブロッティングメンブラン（例としてジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ））上にあり得る。

電気溶出に続き、抽出された遺伝子材料を分析することができる（ブロック２８）。試料を含有する固形媒体から抽出された遺伝子材料は、最適には１０キロベース以上のニックがほとんど存在しない高分子量ＤＮＡを含む。実際、本アプローチによって抽出されたＤＮＡは４０キロベースに達することがある。特にＤＮＡ抽出は、上記の実施形態によれば、洗浄剤なしで行われる。固形媒体からのＤＮＡ抽出に洗浄剤を用いた場合、抽出されたＤＮＡについてその後の分析を行う前に、洗浄剤を除去するための付加的な段階が典型的に実施される。加えて、ＤＮＡを断片化する高温（例として９５℃）でのＤＮＡの抽出は上記の実施形態では回避される。従って、最小限の断片化を有する高分子量ＤＮＡが最小の作業で分析に利用可能となる。抽出されたＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、単一ヌクレオチド多型分析、リアルタイムＰＣＲ及び他の下流のＤＮＡの使用を始めとする様々な分析に用いることができる。

図２及び図３は、試料を含有する固形媒体から電気泳動ゲル中へのＤＮＡの直接的な電気溶出の例を説明する。図２は、パルスフィールドゲル電気泳動を用いて固形媒体から電気溶出したＤＮＡのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染色電気泳動ゲルを示す。電気泳動は１％アガロースゲル、０．５×ＴＥ、ｐＨ８．０中で１８時間、６Ｖ／ｃｍで、スイッチ角度１２０°及びスイッチ時間５０〜９０秒を用いて行われた。２０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞（２×１０⁶細胞／ｍＬで懸濁）を上述のようにＷｈａｔｍａｎ（登録商標）ＦＴＡ（登録商標）又はＦＴＡ（登録商標）Ｅｌｕｔｅ紙のいずれかにアプライして乾燥させた。乾燥したＪｕｒｋａｔ細胞試料の一部をＦＴＡ（登録商標）又はＦＴＡ（登録商標）Ｅｌｕｔｅ紙から取り出し、以下で説明・例示する種々の方法に従って洗浄した。加えて、ロードする前に、試料のいくつかを９５℃の水中に溶出した。Ｊｕｒｋａｔ細胞試料を含む湿った紙の一部を電気泳動ゲルのウェル中に直接置き、アガロースで封止した。図２に示す電気泳動ゲル中に電気溶出した試料は次のとおりである。

レーン１：サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）染色体ＤＮＡのサイズマーカー（ＢｉｏＲａｄ）、レーン３：ＴＥ、ｐＨ８．０中に５分間浸漬したＦＴＡ（登録商標）紙、レーン５：ＦＴＡ（登録商標）精製試薬中に５分間（２回）浸漬し、ＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０中に５分間（２回）浸漬したＦＴＡ（登録商標）紙、レーン７：水中に５分間浸漬したＦＴＡ（登録商標）Ｅｌｕｔｅ紙、レーン９：水中に５分間浸漬し、次いで１５秒間ボルテックスしたＦＴＡ（登録商標）Ｅｌｕｔｅ紙、レーン１１：水中に５分間浸漬し、次いで９５℃の水中で２５分間溶出させたＦＴＡ（登録商標）Ｅｌｕｔｅ紙、レーン１２：水中に５分間浸漬し、次いで９５℃の水中で２５分間溶出させ、６０秒間ボルテックスしたＦＴＡ（登録商標）Ｅｌｕｔｅ紙、及びレーン１４：サッカロマイセス・セレビシエ染色体ＤＮＡのサイズマーカー（ＢｉｏＲａｄ）。パルスフィールドゲル電気泳動の後、ＤＮＡをＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄで染色し、ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ（商標）Ｉｍａｇｅｒ蛍光スキャナー上で撮像した。

図２の結果は、Ｊｕｒｋａｔ細胞試料からの高分子量ＤＮＡの、固形媒体（すなわちＦＴＡ（登録商標）又はＦＴＡ（登録商標）Ｅｌｕｔｅ紙）から電気泳動ゲルの中への直接的な電気溶出を実証する。電気溶出したＤＮＡは２２５キロベース未満であるが、約４０キロベースであると推測される。図２はまた、高温条件下（例として９５℃）でＤＮＡを溶出しようと試みた場合の高分子量ＤＮＡの欠如を実証する。従って、高分子量ＤＮＡを固形媒体から直接電気泳動ゲルの中に電気溶出するためには、緩衝液（例としてＴＥ緩衝液又はＦＴＡ（登録商標）精製試薬）中又は水中での単純なすすぎのみが必要である。

図３はアルカリゲル電気泳動を用いた同様の結果を説明する。図３はアルカリ標準ゲル電気泳動を用いて固形媒体から電気溶出したＤＮＡのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染色電気泳動ゲルを示す。電気泳動は１％アガロースゲル、３０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で２時間、１５０ｍＡで行われた。電気泳動の間、ゲル外への拡散を防止するために、ゲルをガラスプレートで覆った。上記のように、２０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞（２×１０⁶細胞／ｍＬで懸濁）を上述のようにＷｈａｔｍａｎ（登録商標）ＦＴＡ（登録商標）紙にアプライして乾燥させた。乾燥したＪｕｒｋａｔ細胞試料の一部をＦＴＡ（登録商標）紙から取り出し、以下で説明・例示する種々の方法に従って洗浄した。Ｊｕｒｋａｔ細胞試料を含む湿った紙の一部を電気泳動ゲルのウェル中に直接置き、アガロースで封止した。図３に示すレーン１〜８を有する電気泳動ゲル中に電気溶出した試料は次のとおりである。

レーン１：ＴＥ、ｐＨ８．０中に５分間浸漬したＦＴＡ（登録商標）紙、レーン３：ＦＴＡ（登録商標）精製試薬中に５分間（２回）浸漬し、ＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０中に５分間（２回）浸漬したＦＴＡ（登録商標）紙、レーン５：精製ヒトＤＮＡ（男性、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及びレーン７：１ｋｂラダー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。電気泳動の後、ゲルを１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ＝７．７）及び１．５Ｍ ＮａＣｌを含有する溶液中で３０分間中和した。ＤＮＡをＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄで染色し、ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ（商標）Ｉｍａｇｅｒ蛍光スキャナー上で撮像した。

図３の結果もまた、Ｊｕｒｋａｔ細胞試料からの高分子量ＤＮＡの、固形媒体（すなわちＦＴＡ（登録商標）又はＦＴＡ（登録商標）Ｅｌｕｔｅ紙）から電気泳動ゲルの中への直接的な電気溶出を実証する。電気溶出したＤＮＡは１０キロベースより大きいものであった。従って、上記のように、高分子量ＤＮＡを固形媒体から直接電気泳動ゲルの中に電気溶出するためには、緩衝液（例としてＴＥ緩衝液又はＦＴＡ（登録商標）精製試薬）中又は水中での単純なすすぎのみが必要である。大きなＤＮＡはまたアルカリゲル上にも存在するという事実は、電気溶出したＤＮＡがニックをほとんど含有しないことを指し示す。アルカリゲル中のＤＮＡは一本鎖であるので、骨格中のニックはＤＮＡ断片をもたらす。

上で論じられたように、固形媒体からのＤＮＡの直接的な電気溶出は固定化細胞又は組織にも適合する。図４は、固形媒体上に保存された固定化組織試料から遺伝子材料（例としてＤＮＡ）を抽出する方法３０を説明するフローチャートである。方法３０は固定化組織試料の観点から考察されるものであるが、固定化試料はまた固定化細胞（例として組織又は培養細胞株に由来する）を包含してもよい。まず、供給源（例としてマウス又はヒト）から組織を収集する（ブロック３２）。組織の収集に続いて、組織試料をホルマリン、パラホルムアルデヒド又は他の固定化剤などの固定化剤を使用して、当技術分野で公知の方法に従って固定する（ブロック３４）。固定の間、遺伝子材料（例としてＤＮＡ）はタンパク質と架橋を形成する。固定化組織試料のパラフィン中への包埋などのある実施形態では、固定化組織試料をエタノールの濃度を連続的に増加させた一連のエタノール洗浄で脱水することができる（ブロック３６）。脱水された試料を次いでキシレン中で洗浄し、パラフィン中に包埋してもよい。

所望の固定化組織試料を取得した後、試料が予め脱水された場合は、次いで試料を、濃度を連続的に減少させた一連のエタノール洗浄で再水和する（ブロック３８）。例えば、固定化組織試料を１００％エタノール、７５％エタノール、５０％エタノール、２５％エタノール及び蒸留水（又はＴ．Ｅ．）中で各々５分間、連続的に再水和する。固定化組織試料の再水和に続いて、再水和試料を１Ｍのカリウムチオシアネート中で一晩インキュベートしてもよい。固定化組織試料は、再水和されてもされなくても、固形媒体へのアプライの前に例としてプロテアーゼを使用して溶解することができる（ブロック４０）。例えば、固定化組織試料をプロテイナーゼＫ（０．５ｍｇ／ｍＬ）、ｐＨ７．４の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ及び５０ｍＭ ＮａＣｌを含む消化緩衝液中で５５℃、３時間以上溶解することができる。ある実施形態では、固定化組織試料を上述のように固形媒体上に存在する化学物質を介して溶解してもよい。

所望の固定化組織試料の少なくとも一部の固形媒体へのアプライを次いで行う（ブロック４２）。固定化組織試料は、媒体に対して試料を擦る、媒体に対して試料を押し当てるなどといった方法によって固形媒体にアプライされる。固形媒体は上述のようなものである。固形媒体は固形媒体上で遺伝子材料を保持する化学物質を含む。ある実施形態では、試料をアプライした後に固定化組織の溶解が望まれる場合、固形媒体は上述のような固定化組織試料を溶解する化学物質を含む。アプライの後、アプライされた組織試料中の液体を蒸発させる。固形媒体上の試料の乾燥（ブロック４４）はアプライの後に行う。例えば、試料を含有する固形媒体はデシケーター中で一晩乾燥させてもよい。ある実施形態では、試料を含有する固形媒体は、遺伝子材料をさらに保持するために保護材料（例としてプラスチックフィルム）の中に入れてもよい。

所望の乾燥した固定化組織試料を含有する固形媒体を取得したら、試料を含有する固形媒体部分を、その部分から遺伝子材料（例としてＤＮＡ）を電気溶出するために取り出す。ある実施形態では、試料全体を用いてもよい。電気溶出の前に、試料を含有する固形媒体部分を、化学物質を除去するためにすすいでもよい（ブロック４６）。ある実施形態では、試料を含有する固形媒体部分のすすぎとしては、固形媒体部分を緩衝液中に浸漬することが挙げられる。上述のように、緩衝液としてはアルカリ緩衝液（例としてＴＥ）又はＦＴＡ（登録商標）精製試薬を挙げることができる。例えば、試料を含有する固形媒体部分は、ＦＴＡ（登録商標）精製試薬中に一定の時間（例として各浸漬で５分間）で２回浸漬し、アルカリ緩衝液中に一定の時間（例として各浸漬で５分間）で２回浸漬してもよい。しかしながら、ある実施形態では、上述のようにアルカリ緩衝液中でのみ、ＦＴＡ（登録商標）精製試薬中でのみ、又は水中でのみすすぎを行ってもよい。先に言及したように、電気溶出の実施形態（例として透析チューブ中での電気溶出）によっては、試料を含有する固形媒体のすすぎは必要でないこともあり得る。

上で言及したように、遺伝子材料を、試料を含有する固形媒体部分から電気溶出する前に、非ＤＮＡの汚染物質（例としてタンパク質、脂質、炭水化物など）を低減又は排除するために、固定化試料を有する固形媒体部分を酵素で処理してもよい（ブロック４８）。例えば、酵素溶液はプロテアーゼ、リパーゼ及び／又はグリコシド加水分解酵素などの加水分解酵素を含むことができる。

加えて、電気溶出の前に、固定化組織試料を固形媒体にアプライした後で遺伝子材料とタンパク質との間を脱架橋してもよい（ブロック５０）。例えば、一級アミン（例としてビシン、ｐＨ８．５）又は他の求核試薬を含む、ｐＨが７．０より高い（好ましくはｐＨ７．５〜１０の間の）架橋修復緩衝液。脱架橋のため、試料を含有する固形媒体部分を架橋修復緩衝液中でインキュベートする（例として６５℃で２０時間）。一級アミン又は求核試薬は、元々（遺伝子材料及び／又はタンパク質の間の）架橋を形成させたアルデヒドから生ずる架橋の一部と反応し、これらを脱架橋する。あるいは、スルフヒドリル試薬をアミンの代わりに用いることが可能であり、この試薬もアルデヒドに由来する架橋の一部と反応する。この反応は、ｐＨ７未満で実施される場合、アミン系の求核試薬よりもより速く進む。ある実施形態では、上で言及したように、脱架橋は固定化組織試料を固形媒体にアプライする前に行ってもよい。さらに、遺伝子材料を、試料を含有する固形媒体部分から電気溶出する前に、遺伝子材料（例としてＤＮＡ）を上述のように固形媒体上で適所に固定されている間に修復してもよい（ブロック５２）。

固定化組織試料を有する固形媒体部分を取得した後、１０キロベース以上の高分子量ＤＮＡを得るため、上述のように遺伝子材料を固形媒体から次の媒体へと直接電気溶出する（ブロック５４）。抽出された遺伝子材料は次いで、図５中で実証されるように、種々の方法（例としてＰＣＲ）で分析することができる（ブロック５６）。

図５は、上述のような脱架橋及びＤＮＡ修復に続いて固形媒体上でホルマリン固定された組織試料から抽出されたＤＮＡの質を説明する。図５はＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染色電気泳動ゲルを示しており、これは垂直ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）システムを用いた、上述のようにホルマリン中で固定されＷｈａｔｍａｎ（登録商標）ＦＴＡ（登録商標）紙にアプライされたヒト前立腺試料から抽出されたＤＮＡのマルチプレックスＰＣＲ増幅物についての電気泳動ゲルである。電気泳動は６％ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ）−尿素ゲル及び１×ＴＢＥ中で４０分間、１６０Ｖで行われた。固定されたヒト前立腺試料は上述のように処理（例として再水和又は溶解）され、ＦＴＡ（登録商標）紙にアプライされた。ＦＴＡ（登録商標）紙上の試料は次いで脱架橋及び／又はＤＮＡ修復（エンドヌクレアーゼＩＶ（ＥｎｄｏＩＶ）を使用する又は使用しない）に供された。脱架橋及び／又はＤＮＡ修復の後、固形媒体を３セットのＰＣＲプライマーを含有するＰＣＲ反応に直接添加した。プライマーの配列は次のとおりである。５’ＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＡＧＧ３’（プライマー１）、５’ＣＣＴＣＡＡＧＧＧＣＡＣＣＴＴＴＧＣＣＡ３’（プライマー２）、５’ＧＴＣＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＣＣＡＧ３’（プライマー３）及び５’ＧＡＴＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＧ３’（プライマー４）。ＰＣＲプライマーは、高分子量のヒトＤＮＡが存在するならば７８塩基対（プライマー１及び２）、２１８塩基対（プライマー１及び３）及び３８０塩基対（プライマー１及び４）の産物を生産するように設計されている。増幅条件は次のとおりであった。段階１：９５℃で７分間、段階２（１５サイクル）：９５℃で１分間、６９℃で１分間及び７２℃で１分間、段階３（１５サイクル）：９５℃で１分間、６３℃で１分間及び７２℃で１分間、段階４：７２℃で１０分間、次いで段階５：４℃。図５に示す試料は次のとおりである。

レーン１：低分子量ＤＮＡラダー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、レーン３：精製ヒトＤＮＡ（男性、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、レーン４：非ＤＮＡ対照、レーン５：修復反応（ＥｎｄｏＩＶなし）処理された精製ヒトＤＮＡ、レーン６：修復反応（ＥｎｄｏＩＶあり）処理された精製ヒトＤＮＡ、レーン８：脱架橋及び修復反応（ＥｎｄｏＩＶなし）を伴った、ＦＴＡ（登録商標）紙上のホルマリン固定化ヒト前立腺試料、レーン９：修復反応（ＥｎｄｏＩＶあり）のみを伴った、ＦＴＡ（登録商標）紙上のホルマリン固定化ヒト前立腺試料、レーン１０：脱架橋及び修復反応（ＥｎｄｏＩＶあり）を伴った、ＦＴＡ（登録商標）紙上のホルマリン固定化ヒト前立腺試料、レーン１１：修復反応（ＥｎｄｏＩＶあり）のみを伴った、ＦＴＡ（登録商標）紙上のホルマリン固定化ヒト前立腺試料、レーン１２：脱架橋反応のみを伴った、ＦＴＡ（登録商標）紙上のホルマリン固定化ヒト前立腺試料、レーン１３：脱架橋及び修復反応を伴わない、ＦＴＡ（登録商標）紙上のホルマリン固定化ヒト前立腺試料、及びレーン１５：低分子量ＤＮＡラダー。ＰＡＧＥゲル電気泳動の後、ＤＮＡをＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄで染色し、ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ（商標）Ｉｍａｇｅｒ蛍光スキャナー上で撮像した。

図５の結果は、ＦＴＡ（登録商標）紙上の試料が上述のように脱架橋及びＤＮＡ修復のために処理されている場合、より高分子量のＰＣＲ産物（２１８塩基対及び３８０塩基対）の出現を実証する（レーン１０）。全ての他の処理の組み合わせではこれらのより高分子量のＰＣＲ産物を産生できない。本実験におけるＤＮＡはＰＣＲの前にＦＴＡ（登録商標）紙から溶出していないが、ＦＴＡ（登録商標）紙上になお置かれている修復された試料をより高い分子量を標的とするＰＣＲ増幅のために用いることができる場合、この結果は、ＦＴＡ（登録商標）紙からＤＮＡを溶出する能力と組み合わせて、かかる試料に対して実施されるべきより広範囲のＤＮＡ調査実験を可能にするものと認識できる。

図６及び図７は、ＦＴＡ紙から電気溶出する前に固定された試料を再水和することの利益を説明する。図６及び図７は、非変性ゲル電気泳動を用いて固形媒体から電気溶出したＤＮＡのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染色電気泳動ゲルを示す。電気泳動は０．８％アガロースＴＢＥゲル中で、８０分間、１１０ボルトで行われた。図６に示す試料は次のとおりである。レーン１：１ｋｂＤＮＡラダー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、レーン２：ＦＴＡ（登録商標）紙に直接アプライし、乾燥させて水中ですすぎ、電気溶出したホルマリン固定化ヒト前立腺試料の０．５ｍｍ切片、レーン３：ＦＴＡ（登録商標）紙にアプライし、乾燥させて電気溶出した２０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞（２×１０⁶細胞／ｍＬに懸濁）、及びレーン４：精製ヒトＤＮＡ（男性、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。図７に示す電気溶出した試料は次のとおりである。レーン１：精製ヒトＤＮＡ（男性、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、レーン２：ＦＴＡ（登録商標）紙にアプライし、乾燥させた２０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞（２×１０⁶細胞／ｍＬに懸濁）、レーン３：上述のように再水和し、ＦＴＡ（登録商標）紙にアプライし、乾燥させて水中ですすいだホルマリン固定化ヒト前立腺試料の約０．５ｍｍの切片、及びレーン４：パラフィン塊から一連の削り片としてこすり落とし、次いで上述のように再水和し、ＦＴＡ（登録商標）紙にアプライし、乾燥させて水中ですすいだホルマリン固定化ヒト前立腺試料の約０．５ｍｍの切片。ＴＢＥ−ゲル電気泳動の後に、ＤＮＡをＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄで染色し、ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ（商標）Ｉｍａｇｅｒ蛍光スキャナー上で撮像した。

図６及び図７の結果、特に図６のレーン２と図７のレーン３及び４との間の比較は、再水和処理が固定された試料からのＤＮＡ回収を助けることを明確に指し示す。固定及びパラフィン包埋のための調製時に脱水した組織試料を再水和する段階を含んでいると、電気溶出の際の固定化試料からの遺伝子材料の収率を増加させる。

図８は、ＦＴＡ（登録商標）紙から電気溶出した固定化試料から得られるＤＮＡの分子量に対するＤＮＡ修復の効果を説明する。図８は、非変性ゲル電気泳動を用いて固形媒体から電気溶出したＤＮＡのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染色電気泳動ゲルを示す。電気泳動は０．８％アガロースＴＢＥゲル中で、８０分間、１１０ボルトで行われた。ホルマリン固定化ヒト肺（ＩＬＳ１９２７９−Ａ０４）からの試料を上述のようにＦＴＡ（登録商標）紙にアプライした。架橋を上述のようにある試料において１００ｍＭビシンｐＨ９．５中で修復し、及び／又はＤＮＡ修復反応を使用して処理した。試料を異なる反応ステージで停止させた。図８に示す試料は次のとおりである。

レーン１：１ｋｂＤＮＡラダー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、レーン２：再水和（すなわちエタノール及びＴ．Ｅ．洗浄）後、レーン３：ＦＴＡ（登録商標）精製試薬洗浄後、レーン４：プロテイナーゼＫ消化後、レーン５：６５℃で行われる脱架橋反応後、レーン６：室温で行われる脱架橋反応後、レーン７：ＤＮＡ沈殿（＋６５℃で行われる脱架橋反応）後、レーン８：ＤＮＡ沈殿（＋室温で行われる脱架橋反応）後、レーン９：ＤＮＡ修復反応（＋６５℃で行われる脱架橋反応）後、及びレーン１０：ＤＮＡ修復反応（＋室温で行われる脱架橋反応）後。

図８の結果は、レーン９及び１０における高分子量物質（矢印で示す）は、ＦＴＡ（登録商標）紙にまだ付着しているＤＮＡを修復するのにＤＮＡ修復反応が用いられた後にのみ出現することを実証する。ＤＮＡは、ＤＮＡがＦＴＡ（登録商標）紙からのＤＮＡ溶出に伴う力及び溶液中のＤＮＡに適用される力を受ける前の、ＦＴＡ（登録商標）紙にまだ付着している間に修復される。このことは、互いに比較的近くに、しかし反対側に配置されるニックを含有するＤＮＡ鎖が分離するのを防ぐ。これらの高度にニック及びギャップを有する鎖を修復することにより、これらの鎖が二本鎖切断になることが防止され、結果として得られる産物はより高分子量のＤＮＡである。分子量の増加は、ＤＮＡ修復反応がＤＮＡ中のニック及びギャップを修復可能であったことの証拠を提供する。

開示された実施形態の技術的効果は、電気溶出によって遺伝子材料（例として１０キロベース以上の高分子量ＤＮＡ）を直接固形媒体から抽出することを含む。遺伝子材料の抽出は洗浄剤なしで行われ、従ってその後の遺伝子材料分析の前の、洗浄剤を除去するのに必要な付加的な段階を排除する。また、遺伝子材料の抽出は高温（例として９５℃）の使用を回避し、従って断片化が最小限であるＤＮＡの抽出を可能にする。固形媒体からの直接的な電気溶出を介した遺伝子材料の抽出は、固定された及び固定されていない試料の両方に適合する。さらに、遺伝子材料は固形媒体上になおある間に処理することができる。例えば、遺伝子材料を修復してもよく、及び／又は遺伝子材料とタンパク質との間を固定化細胞内で脱架橋してもよい。従って、固形媒体は、遺伝子材料の抽出及びユーザーの作業を最小限にする関連した処理（例としてＤＮＡ修復）のための単一のプラットフォームを提供する。

この明細書は、ベストモードを含む本発明を開示するため、また当業者に本発明を実施可能にするためにも例を使用し、任意の装置又はシステムを作成すること及び使用すること並びに組み込まれた方法を実施することを含む。本発明の特許を受けることができる範囲は特許請求の範囲により定義され、当業者が想到する他の例を包含し得る。かかる他の例は、それらの例が特許請求の範囲の文言と異ならない構造的要素を持つ場合、又はそれらの例が特許請求の範囲の文言とは実質的に差のない均等な構造的要素を含む場合、特許請求の範囲内であると意図される。

Claims (23)

1. 固形媒体上に保存された生物学的試料から遺伝子材料を抽出する方法であって、
   生物学的試料を溶解して遺伝子材料を保持する化学物質であってタンパク質変成剤及びキレート剤を含む化学物質とセルロース系の紙とを含む固形媒体上に生物学的試料がアプライされた固形媒体を取得すること、及び
   遺伝子材料を固形媒体から次の媒体へ直接電気溶出すること
   を含む、方法。
2. 電気溶出の前に固形媒体をすすぐことを含む、請求項１記載の方法。
3. 固形媒体のすすぎが固形媒体を緩衝液中に浸漬すること又は固形媒体を通して又はその表面に緩衝液を流すことを含む、請求項２記載の方法。
4. 固形媒体のすすぎが固形媒体を水中に浸漬すること又は固形媒体を通して又はその表面に水を流すことを含む、請求項２記載の方法。
5. 電気溶出の前に遺伝子材料を修復することをさらに含む、請求項２記載の方法。
6. 遺伝子材料の修復がＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼを少なくとも含有する溶液をアプライすることを含む、請求項５記載の方法。
7. ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼ活性、プルーフリーディングのための３’→５’エキソヌクレアーゼ活性及びニックトランスレーションのための５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含む、請求項６記載の方法。
8. 遺伝子材料の修復が、脱塩基部位に隣接するＤＮＡにニックを入れるエンドヌクレアーゼを少なくとも含有する溶液をアプライすることを含む、請求項５記載の方法。
9. 生物学的試料が、固定化細胞を含む、請求項１記載の方法。
10. 固形媒体から電気溶出する前に固定化細胞を処理することを含み、処理が固定化細胞を再水和すること、固定化細胞をプロテアーゼ処理すること又は脱架橋することを含む、請求項９記載の方法。
11. 次の媒体が電気泳動ゲル、溶液又は捕捉表面を含む、請求項１記載の方法。
12. 固形媒体上に保存された固定化組織試料から遺伝子材料を抽出する方法であって、
    組織試料を溶解して遺伝子材料を保持することができる化学物質であってタンパク質変成剤及びキレート剤を含む化学物質とセルロース系の紙とを含む固形媒体上に、固定化組織試料の少なくとも一部をアプライすること、及び
    遺伝子材料を固形媒体から次の媒体へ直接電気溶出すること
    を含む、方法。
13. 固形媒体がＦＴＡ（登録商標）紙を含む、請求項１２記載の方法。
14. 固定化組織試料を固形媒体にアプライする前又は後に固定化組織試料をプロテアーゼで処理することを含む、請求項１２記載の方法。
15. 固形媒体が固定化組織試料を溶解する化学物質を含む、請求項１２記載の方法。
16. 固定化組織試料を固形媒体にアプライする前に固定化組織試料を再水和することを含む、請求項１２記載の方法。
17. 固定化組織試料を固形媒体にアプライする前に又はその後に遺伝子材料とタンパク質との間を脱架橋することを含む、請求項１６記載の方法。
18. 脱架橋が求核試薬を含むｐＨが７．０以外の架橋修復緩衝液をアプライすることを含む、請求項１７記載の方法。
19. 電気溶出の前に遺伝子材料を修復することを含む、請求項１２記載の方法。
20. 遺伝子材料の修復がＤＮＡポリメラーゼＩ及びＤＮＡリガーゼを少なくとも含有する溶液をアプライすることを含む、請求項１９記載の方法。
21. 遺伝子材料の修復が、脱塩基部位に隣接するＤＮＡにニックを入れるエンドヌクレアーゼを少なくとも含有する溶液をアプライすることを含む、請求項１９記載の方法。
22. 次の媒体が電気泳動ゲル、溶液又は捕捉表面を含む、請求項１２記載の方法。
23. セルロース系紙上に保存された生物学的試料からＤＮＡを抽出する方法であって、
    生物学的試料を溶解してＤＮＡを保持する化学物質であってタンパク質変成剤及びキレート剤を含む化学物質を含むセルロース系紙上に生物学的試料がアプライされたセルロース系紙を取得すること、
    セルロース系紙上でＤＮＡを修復すること、及び
    ＤＮＡをセルロース系紙から電気泳動ゲル中へ直接電気溶出すること
    を含む、方法。