CN102533772A - 一种抗hbv诱饵适体及其筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明利用体外SELEX筛选技术，以人HBV中特异性P-ε相互作用为靶标，筛选获得抗HBV诱饵适体，具体是：体外制备上茎23个核苷酸随机化的εRNA文库，利用SELEX技术从该文库中富集、筛选与目的蛋白HBVminiP高亲和的适体RNAs；然后手工测序获得10个适体RNAs的序列信息并依据二级结构的相似性分组，从与野生型εRNA二级结构相似的组中挑选有代表性的适体S3、S6、S9进行定性；通过细胞转染实验证实了S9具有抗HBV生物学功能。本发明提供的诱饵适体S9，能够在细胞内通过竞争性结合作用有效抑制野生型P-ε复合物的形成，达到抑制HBV复制的效果。
Description
技术领域
本发明涉及分子病毒学技术领域，具体涉及一种基于体外SELEX筛选技术的抗HBV诱饵适体的获得。
背景技术
SELEX技术即“指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX)”。该技术是建立在随机寡聚核苷酸文库的基础上通过重复地进行多轮分离和扩增，从而得到能与各种靶分子特异性高亲和结合的寡聚核苷酸片段的组合化学技术，筛选所得的高亲和寡聚核苷酸片段被称作适体(aptamer)。
作为高通量的文库筛选策略，SELEX技术能够在较短的时间内得到一大批与靶蛋白高亲和的适体。和传统的抗体比较，适体除了具备高亲和性和特异性以外，还有诸如高稳定性、易于修饰和标记、制备方法简单且质量优等一些独特的优点，并且其筛选过程在体外完成，选择条件可变且易于控制，这些优点不仅使SELEX技术广泛应用于各类靶标的适体筛选，也使得适体在新型药物开发、临床诊断和治疗等方面得以较好地应用。
以人乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)为代表的嗜肝DNA病毒科在复制过程的早期阶段，其反转录酶(P蛋白)与pgRNA 5’末端61nt茎环结构εRNA之间的相互作用不仅具有高度的特异性，同时也启动了HBV复制循环早期的两个关键步骤：基于蛋白质引发(priming)的反转录起始和核衣壳组装。因此，P-ε间的相互作用为乙肝的抗病毒研究和临床治疗策略提供了一个极具吸引力和应用前景的药物靶点。针对人HBVP-ε相互作用，新近建立的依赖于Hsp90等分子伴侣复合物的体外重建系统成功实现了二者之间的物理结合，尽管缺乏后续的priming过程，但是为本发明提供了必要的体外筛选的技术平台。在此基础上，本发明结合SELEX技术筛选得到和miniP蛋白高亲和结合的一批适体RNAs，通过对挑选的适体在细胞内抗HBV生物学功能的综合验证，获得用于抗HBV研究的诱饵适体小分子RNA-S9。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种抗HBV诱饵适体及其筛选方法，该诱饵适体能够在体外以及细胞内通过竞争性结合作用有效抑制野生型P-ε复合物的形成，达到抑制HBV复制的效果。该诱饵适体利用SELEX技术筛选方法获得。
本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：
本发明提供的抗HBV诱饵适体，其能竞争性抑制人HBV中特异性P-ε相互作用，是通过SELEX技术筛选获得的，具体是：体外制备ε上茎23个核苷酸随机化的εRNA文库，利用SELEX技术经多轮筛选，从该εRNA文库中富集、筛选与目的蛋白HBV miniP高亲和的适体RNAs；然后手工测序获得10个适体RNAs的序列信息，并依据二级结构的相似性分组，从与野生型εRNA二级结构相似的组中挑选有代表性的适体S3、S6、S9进行定性；对于具有高亲和性和高结合特异性的适体S9，通过细胞转染实验证实了其抗HBV生物学功能；所述S9的序列为：
5’-UGUUCAUGUCCUACUGUUCAAACAAAAAAACUGUGCACAAAAAUAAAUUGGGGCAUGGACA-3’。
本发明提供的上述抗HBV诱饵适体是采用以下筛选方法获得，其步骤包括：
(1)体外制备εRNA突变文库(上茎23个核苷酸随机化)用于SELEX筛选：
设计并合成用于体外制备随机化εRNA突变文库的92-mer寡聚核苷酸引物DepsNuppS(-)，该模板包含61nt的εRNA的序列信息，其中与ε上茎序列对应的23个核苷酸序列全部随机化，在εRNA序列信息的3’下游包含与T7启动子序列互补的序列信息，在εRNA的上下游还分别包含限制性内切酶位点序列，以便进行体外转录和后续克隆；此外，还合成了包含T7启动子序列的22-mer引物T7promOligo(+)；
以上二种引物经体外粘连杂交后，形成完整的T7启动子，利用T7转录试剂盒(Ambion)体外转录合成获得初始εRNA文库，用于SELEX筛选；
(2)体外SELEX筛选获得与miniP高亲和的适体RNAs：
将100ng纯化的miniP蛋白与以上终浓度1μM初始εRNA文库在30μl伴侣分子体外结合系统中30℃孵育2hr，随后加入含Ni2+-NTA球珠的预冷结合缓冲液，低温孵育1hr，利用miniP蛋白的组氨酸标签将所形成的miniP-εRNA文库复合物吸附到Ni2+-NTA球珠上，先后以预冷结合缓冲液和TMK缓冲液洗去反应体系中未结合或弱结合的适体RNAs。miniP-εRNA复合物经苯酚抽提、无水乙醇沉淀后，分离结合的RNAs；该RNAs经RT-PCR扩增富集后得到的cDNA产物，用作下一轮SELEX筛选的RNAs转录模板；
(3)手工测序获得适体RNAs的序列信息并依据二级结构的相似性分组：
将经过3轮SELEX筛选分离的适体RNAs经RT-PCR扩增后克隆到pUC19载体中，重组载体经Kpn I线性化后，凝胶回收线性化DNA用作测序模板，以32P标记的包含T7启动子的寡聚核苷酸T7RTDepsOligo(+)为测序引物，按Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit(USB)操作说明进行手工测序；利用在线Mfold软件对所分离的10个具有不同上茎序列的适体RNAs的理论二级结构进行预测，并依据二级结构的相似性分组，从与野生型εRNA二级结构相似的组中挑选3个有代表性的适体S3、S6、S9进行定性；
(4)对代表性适体与miniP的亲和力和结合特异性进行定性：
利用凝胶迁移率移动实验(EMSA)评价诱饵适体与目的蛋白miniP的亲和力；利用竞争性EMSA实验评价适体与miniP的结合特异性；
(5)检测高亲和力、高结合特异性的适体S9在细胞内的抗HBV能力：
构建包含S9序列的重组载体pSUPER-S9，将其转染HBV持续复制细胞系-HepG2.2.15。Southern blotting分析细胞中新生的病毒核衣壳内DNA合成能力，所得数据用OptiQuant 5.0software定量；作为内参，Western blotting检测管家基因β-actin的表达，结果和对照组相比较，校正样品间差异。用MTT法比较各处理组之间的活细胞差异，排除非特异性的细胞毒作用。
同时，将含HBV全长基因组的pCH-9/3091与pSUPER-S9以1∶1比例共转染HepG2细胞系。Southern blotting和Northern blotting分析细胞中病毒核衣壳内DNA合成能力和pgRNA含量，所得数据用OptiQuant 5.0software定量；利用非变性Western blotting检测细胞中病毒核衣壳装配情况是否受到影响；Western blotting检测管家基因β-actin的表达，结果和对照组相比较，校正样品间差异。用MTT法比较各处理组之间的活细胞差异，排除非特异性的细胞毒作用。
经过上述步骤，确立S9作为用于抗HBV的诱饵适体，该S9的序列为：
5’-UGUUCAUGUCCUACUGUUCAAACAAAAAAACUGUGCACAAAAAUAAAUUGGGGCAUGGACA-3’。
上述步骤(1)中，所述92-mer寡聚核苷酸引物DepsNuppS(-)序列为：
5’-GGTACCTGTCCATGCCCCA(N)12GCACAG(N)11GAACAGTAGGACATGAACAGCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTC-3’，
随机化序列以N标注；
所述22-mer的T7promOligo(+)序列为：5’-GAATTAATACGACTCACTATAG-3’。
上述步骤(2)中，伴侣分子体外结合系统由10μg Hsp70(Biovision)、1μg Hsp90b(Abcam)、0.6μg Hdj1(Biovision)、1.2μg Hop(Biovision)、0.3μg p23(Abcam)组成。
上述步骤(2)中，所述预冷结合缓冲液由0.1MNa2HPO4/NaH2PO4[pH7.4]、150mMNaCl、20mM Imidazol、0.1％(V/V)NP-40及100μg/ml酵母tRNA组成。
上述步骤(2)中，所述TMK缓冲液由50mM Tris/HCl[pH7.5]，10mM MgCl2，40mMKCl，100μg/ml酵母tRNA组成。
上述步骤(2)中，SELEX筛选中RT-PCR所应用的引物序列为：
RTDepsOl iogo(-)：5’-CAATCTGCAGTCTAGATAAGGTACCTGTCCATGCCCCA-3’
T7RTDepsOligo(+)：5’-CCCCGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGTTCATGT-3’
其中，T7RTDepsOligo(+)也是步骤(3)中所述的测序引物。
上述步骤(2)中，所有PCR循环都被限制在15-18个循环，以避免RT-PCR扩增过程中出现过量的非特异性产物。
上述步骤(4)中，可以采用以下方法评价适体与目的蛋白miniP的亲和力：
将适体RNA或野生型εRNA 5’末端去磷酸化后，以3000Ci/mmol γ-32P-ATP和T4磷酸化激酶对RNA 5’末端放射性磷酸化标记，标记RNA利用Quick Spin columns进行纯化；
在miniP-ε直接结合实验中，采用了由pH7.5的20mM Tris/HCl，2mM MgCl2，15mM NaCl，20mM KCl和4mM dithiothreitol组成的TMNK反应缓冲液；每10μl TMNK反应缓冲液中含20ng的miniP，终浓度为50nM的γ-32P-εRNA，6μg酵母tRNA，由3μgHsp70、360ng Hsp90、200ng Hdj1、375ng Hop和100ng p23组成的分子伴侣蛋白体系，40u/μl的RNase酶抑制剂，以及1片/次的蛋白酶抑制剂cocktail；
反应体系30℃孵育2hr后，经5％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，真空干胶并压制磷屏底片，放射强度经Perkin Elmer C431200磷屏仪检测后，利用OptiQuant 5.0 software对RNP复合物进行定量分析。
上述步骤(4)中，可以采用以下方法评价适体与miniP的结合特异性：
在miniP-ε竞争性结合实验中，利用5’末端32P标记的野生型εRNA和20倍过量浓度的未标记适体RNA混合，测试它们竞争MiniP蛋白的能力，从而确定适体对MiniP的结合特异性。采用了由pH7.5的20mM Tris/HCl，2mM MgCl2，15mM NaCl，20mM KCl和4mM dithiothreitol组成的TMNK反应缓冲液；每10μl TMNK反应缓冲液中含20ng的miniP，终浓度为50nM的γ-32P-εRNA，1μM未标记的适体RNAs，6μg酵母tRNA，由3μgHsp70、360ng Hsp90、200ngHdj1、375ng Hop和100ng p23组成的分子伴侣体系，40u/μl的RNase酶抑制剂，以及1片/次的蛋白酶抑制剂cocktail；
反应体系30℃孵育2hr后，经5％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，真空干胶并压制磷屏底片，放射强度经Perkin Elmer C431200磷屏仪检测后，利用OptiQuant 5.0 software对RNP复合物进行定量分析。
上述步骤(5)中，可以采用以下方法检测适体S9在HepG2.2.15细胞内对HBV复制的影响：构建包含S9序列的重组载体pSUPER-S9，利用LipofectomineTM2000(Invitrogen)，按操作说明将pSUPER-S9(24μg)瞬时转染HepG2.2.15细胞(10cm细胞培养皿)，48hr后用1ml NP40裂解液(10mM Tris-HCl[pH8.0]、50mM NaCl、1mM EDTA)裂解细胞并收获细胞裂解液，Southern blotting检测适体S9的引入对细胞中病毒核衣壳内DNA合成的影响，所得数据用OptiQuant 5.0software定量；作为内参，Western blotting检测管家基因β-actin的表达，并与对照组比较，以校正各处理组之间的样品误差。
上述步骤(5)中，可以采用以下方法检测适体S9在HepG2细胞内对HBV复制的影响：
pSUPER-S9重组载体与含HBV基因组表达载体pCH-9/3091以1∶1比例共瞬时转染HepG2细胞，48hr后收集细胞，纯化胞内HBV核衣壳。其中，1/3用来抽提核衣壳内的HBV复制中间体DNA，1/3用来抽提核衣壳内的pgRNA，并用32P标记的HBV特异基因片段为探针分别做Southern blotting和Northern blotting，分析引入S9对病毒核衣壳内DNA合成和核衣壳内pgRNA含量的影响，所得数据用OptiQuant 5.0 software定量；剩余1/3用非变性Westernblotting检测对病毒核衣壳装配的影响。Western blotting检测管家基因β-actin的表达，并与对照组比较，以校正各处理组之间的样品误差。
上述步骤(5)中，可以采用MTT法比较各处理组之间的活细胞差异：瞬时转染HepG2.215或HepG2细胞系24小时后，将实验组(转染pSUPER-S9)和对照组(无质粒转染、转染pSUPER-siRNA、转染pSUPER-mutε(P蛋白结合缺陷突变ε)、转染空载体pSUPER)10em细胞培养皿的细胞用胰酶消化后取1/10细胞重悬于1mL DMEM中，再将细胞悬液接种到96孔板每空孔100μl(约104个细胞)，按照
MTT Cell Proliferation Assay Kit(Invitrogen)操作说明进行定量分析，排除S9对细胞内HBV复制的影响是由于非特异性的细胞毒作用造成。
本发明提供的上述诱饵适体，其作用机理是：通过自身与目标靶蛋白之间更高的亲和力实现阻碍野生型ε结合到目标靶蛋白的特异性反应，该作用既不同于干扰素的抗病毒和免疫调节作用机制，又区别于核苷(酸)类似物通过与天然核苷酸竞争参与并终止HBV DNA合成的作用机制。可见，诱饵适体在保证特异针对HBV P-ε相互作用靶标的同时，又不直接参与病毒的复制过程，从而抑制其复制。
本发明鉴于目前使用的抗HBV临床治疗药物的缺陷性，所提供的诱饵适体-S9有以下的主要突出效果和优点：
其一.运用体外SELEX筛选技术，以HBV P-ε为靶标，从体外制备的上茎23nt随机化的εRNA文库中筛选与miniP蛋白高亲和、特异性结合的适体RNAs，通过验证适体的生物学功能，成功获得有效抑制HBV复制的诱饵适体。
其二.经检测证实能在细胞内通过竞争性结合作用抑制胞内野生型P-ε复合物的形成，从而达到抑制胞内HBV复制水平的效果，该诱饵适体为有效阻断HBV复制过程提供了一种新颖的抑制剂。
其三.目前处于临床前研究的抗HBV shRNA药物在肝细胞内抗病毒特异性不强，存在脱靶效应，限制了该药物的进一步运用。相反，本发明筛选得到的诱饵适体S9具有抗HBV的高特异性。
其四.相比于传统的抗HBV shRNA药物，本发明诱饵适体有望解决当前慢性乙肝临床治疗中出现的低应答率、副作用和病毒逃逸形成耐药突变株等实际难题。
附图说明
图1是SELEX筛选示意图。
图2是野生型εRNA示意图。
图3是随机化εRNA文库示意图。
图4是适体S3、S6和S9的手工测序分析图。
图5-图7分别是适体S3、S6和S9的理论二级结构图。
图8是用EMSA测定三种适体与目的蛋白的亲和力并对其相对结合强度进行定量的示意图。
图9是用竞争性EMSA测定三种适体的竞争性结合能力并对其竞争强度定量的示意图。
图10是将50nM放射标记的wt εRNA和逐渐递减浓度的适体竞争剂(S6、S9)混合后，用竞争性EMSA测定适体竞争强度的示意图。
图11是适体S9导入HepG2.2.15细胞系后，用Southern Blotting测定细胞内病毒核衣壳内DNA合成的分析图。
图12是适体S9导入HepG2细胞系后，用Southern Blotting和Northern blotting测定细胞内病毒核衣壳内DNA和pgRNA，用Western Blotting测定细胞内HBV核衣壳装配的分析图。
图13是诱饵适体抑制HBV复制的作用机理示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。
本发明提供的是一种利用体外SELEX筛选技术，以人HBV中特异性P-ε相互作用为靶标，筛选获得的抗HBV诱饵适体。诱饵适体的获得包括以下步骤：
1.体外SELEX筛选与miniP高亲和的适体RNAs：
(1)设计并合成用于体外制备εRNA突变文库的寡聚核苷酸模板：
为体外制备εRNA文库，设计并合成92-mer寡聚核苷酸引物DepsNuppS(-)，该模板包含61nt εRNA的序列信息，其中ε上茎的23个核苷酸序列全部随机化，在εRNA序列信息的3’下游包含与T7启动子序列互补的序列信息，在εRNA的上下游还分别包含限制性内切酶位点序列，以便进行体外转录和后续克隆。此外，还合成了包含T7启动子序列的22-mer引物T7promOligo(+)。以上二种引物经体外粘连杂交后，形成完整的T7启动子，利用AmbionT7转录试剂盒体外转录合成获得初始εRNA文库，经OD260值和12％变性聚丙烯酰胺凝胶检测得以验证，用于SELEX筛选；
(2)适体RNAs的获得：
将miniP蛋白与初始εRNA文库在伴侣分子体外结合系统中30℃孵育2hr，随后加入含Ni2+-NTA球珠的预冷结合缓冲液(0.1M Na2HPO4/NaH2PO4[pH7.4]，150mM NaCl，20mMImidazol，0.1％(v/v)NP-40，100μg/ml yeast tRNA)低温孵育1hr，利用miniP蛋白的组氨酸标签将所形成的miniP-随机化εRNA复合物吸附到Ni2+-NTA球珠上，先后以预冷的结合缓冲液和TMK缓冲液(50mM Tris/HCl[pH7.5]，10mM MgCl2，40mM KCl，100μg/ml yeast tRNA)洗去反应体系中未结合或弱结合的适体RNAs，得到的混合物再经苯酚抽提、无水乙醇沉淀后分离后得到RNAs。
所得RNAs经RT-PCR扩增富集后得到的cDNA产物用作下一轮SELEX筛选所需的随机化RNA库的体外转录模板，为了避免扩增过程中出现过量的非特异性产物，所有PCR循环都被限制在15个循环。
2.分离适体RNAs并测定其序列信息：
将上述步骤中第3轮筛选所得适体RNAs经RT-PCR扩增后的cDNA产物利用EcoR I和Xba I克隆到pUC19载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，随机挑选单克隆并抽提质粒以酶切分析检出阳性克隆，所得阳性克隆子经Kpn I内切酶线性化后，用于适体RNAs的手工测序以获得所分离适体RNAs的序列信息。
3.适体RNAs的理论二级结构预测及候选诱饵适体的挑选：
利用在线Mfold软件(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/RNA-Folding-Form)对所分离适体RNAs的理论二级结构进行预测，并依据二级结构的相似性分为三组，从与野生型εRNA结构相似的组中挑选3个有代表性的候选诱饵适体S3、S6、S9进行定性。
4.对代表性适体与miniP的亲和力和结合特异性进行定性：
利用凝胶迁移率移动实验(EMSA)评价诱饵适体与目的蛋白miniP的亲和力：将适体RNA或野生εRNA 5’末端去磷酸化后，以放射性同位素(γ-32P ATP，3000Ci/mmol)和T4磷酸化激酶对RNA进行末端磷酸化标记，标记RNA利用Quick Spin columns(Roche)进行纯化。在miniP-ε直接结合实验中，每10μl TMNK反应缓冲液(20mM Tris/HCl[pH7.5]，2mM MgCl2，15mMNaCl，20mM KCl，4mM dithiothreitol)中含miniP(20ng)，γ-32P-适体RNA(终浓度50nM)，酵母tRNA(6μg)，分子伴侣蛋白体系(3μg Hsp70、360ng Hsp90、200ng Hdj1、375ng Hop、100ng p23)，RNase酶抑制剂(40u/μl，Takara)及蛋白酶抑制剂cocktail(1片/次，Roche)。反应体系30℃孵育2hr后，经5％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，真空干胶并压制磷屏底片，放射强度经Perkin Elmer C431200磷屏仪检测后，利用OptiQuant 5.0 software对RNP复合物进行定量分析。
利用竞争性EMSA实验评价适体与miniP的结合特异性：在miniP-ε竞争性结合实验中，每10μl TMNK反应缓冲液(20mM Tris/HCl[pH7.5]，2mM MgCl2，15mM NaCl，20mM KCl，4mMdithiothreitol)中含miniP(20ng)，γ-32P-εRNA(终浓度50nM)，适体RNAs(如果未加特别说明，作为竞争剂的未标记适体RNA终浓度均为1μM)，酵母tRNA(6μg)，分子伴侣体系(3μg Hsp70、360ng Hsp90、200ng Hdj1、375ng Hop、100ng p23)，RNase酶抑制剂(40u/μl，Takara)及蛋白酶抑制剂cocktail(1片/次，Roche)。反应体系30℃孵育2hr后，经5％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，真空干胶并压制磷屏底片，放射强度经Perkin ElmerC431200磷屏仪检测后，利用OptiQuant 5.0software对RNP复合物进行定量分析。
5.检测候选诱饵适体S9的抗HBV生物学功能：
将S9序列导入含H1启动子的pSuper载体中，构建成重组载体pSUPER-S9，利用LipofectomineTM2000试剂盒(Invitrogen)，按操作说明每次在10cm直径的皿中将24μg的pSUPER-S9转染HepG2.2.15细胞系，48hr后用1ml NP40缓冲液(10mM Tris-HCl[pH8.0]、50mM NaCl、1mM EDTA)裂解细胞并收获细胞裂解液，Southern blotting检测细胞中病毒核衣壳内DNA合成能力，所得数据用OptiQuant 5.0software定量；Western blotting检测管家基因β-actin的表达，结果和对照组相比较，以校正各处理组之间的样品误差。
利用含HBV全长基因组的pCH-9/3091与能转录产生S9RNA的pSUPER-S9这二个质粒，以1∶1比例共转染HepG2，Southern blotting和Northern blotting分别分析细胞中病毒核衣壳内DNA合成能力和pgRNA含量，所得数据用OptiQuant 5.0software定量；利用非变性Western blotting检测细胞中病毒核衣壳装配情况是否受到影响；作为内参，利用Westernblotting检测管家基因β-actin的表达，发现和对照组相比无变化，从而排除了样品差异。
以上二组瞬时转染实验中，均采用MTT法分析细胞毒性。转染HepG2.215细胞系和HepG2细胞系24小时后，将实验组(转染pSUPER-S9)和对照组(无质粒转染、转染pSUPER-siRNA、转染pSUPER-mutε、转染pSUPER)的10cm细胞培养皿的细胞用胰酶消化后取1/10细胞重悬于1mL DMEM中，再将细胞悬液接种到96孔板每空孔100μl(约104个细胞)，按照
MTT Cell Proliferation Assay Kit(Invitrogen)操作说明进行定量分析，发现实验组与对照组间活细胞数量无显著性差异(P＞0.05)，排除S9对细胞内HBV复制的影响是因为非特异性的细胞毒作用造成。
6.结果分析：
(1)体外SELEX筛选与miniP高亲和的适体RNAs，说明如下：
随机化εRNA文库-S文库，包含εRNA上茎结构中23个核苷酸位点的随机化(比较图2与图3)，按照T7体外转录试剂盒(Ambion)操作说明制备S文库，经OD260值和12％变性聚丙烯酰胺凝胶检测后用于体外SELEX筛选。本发明按照图1所示步骤进行了连续三轮体外SELEX筛选，随后检测了所筛选适体RNAs与目的蛋白miniP蛋白的亲和力、竞争性结合能力，证明适体RNAs-miniP蛋白的结合位点与野生型HBV εRNA-miniP蛋白的结合位点相同；又将SELEX筛选过程中的RT-PCR扩增产物用作测序模板，以包含T7启动子的寡聚核苷酸为测序引物，按Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit(USB)操作说明进行手工测序，借此追踪每一轮筛选产物在随机化位点的核苷酸富集趋势以评价SELEX筛选的进程，经过3轮筛选后发现，富集趋势已相当明显，提示已经获得与miniP高亲和的适体RNAs。
(2)分离适体RNAs并测定其序列信息，结果说明如下：
三轮SELEX筛选后，将第3轮筛选所得适体RNAs经RT-PCR扩增后的cDNA产物利用EcoRI和XbaI克隆到pUC19载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，随机挑选10个单克隆抽提质粒，经验证全部为阳性克隆，所得重组质粒经KpnI线性化后，用于适体RNAs的手工测序以获得所分离、挑选适体RNAs的序列信息，图4是部分测序结果显示适体S3、S6、S9的序列信息。
(3)适体RNAs的理论二级结构预测及候选诱饵适体的挑选，结果说明如下：
利用在线Mfold软件(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/RNA-Folding-Form)对所分离适体RNAs的理论二级结构进行预测，并依据二级结构的相似性分组，从与野生型εRNA二级结构相似的组中挑选3个有代表性的适体-S3，S6和S9进一步定性，研究它们与miniP的亲和力和结合特异性，三种适体理论二级结构见图5至图7。
所得适体的序列信息为：
S3：5’-UGUUCAUGUCCUACUGUUCAAAAACAUGCCCUGUGCCAAAGCAAAAAUUGGGGCAUGGACA-3’。
S6：5’-UGUUCAUGUCCUACUGUUCACAGAAAAUAGCUGUGCAAAAAAAAAAGAUGGGGCAUGGACA-3’。
S9：5’-UGUUCAUGUCCUACUGUUCAAACAAAAAAACUGUGCACAAAAAUAAAUUGGGGCAUGGACA-3’。
(4)对三种适体的进一步定性，说明如下：
适体与目的蛋白的亲和力经EMSA测定并计量其相对结合强度(图8)，结果表明，适体S3的蛋白结合活性与wt εRNA相当，S6的蛋白结合能力要强于wt εRNA，是wt εRNA蛋白结合能力的2.1倍；S9的蛋白结合活性最强，是wt εRNA蛋白结合能力的7.5倍，该结果证实本研究中分离并挑选的适体具备较强的P蛋白结合能力。
适体的竞争性结合能力经竞争性EMSA测定并计量其相对结合强度(图9)，结果表明，过量(20倍于标记探针)的未标记适体RNA的存在使得32P-wt εRNA与MiniP的结合信号降低了至少90％，表明它们能竞争抑制wt εRNA与miniP蛋白之间的结合，证明它们识别并结合位于P蛋白上的相同的ε结合位点。为进一步验证该结论，随后挑选竞争性结合效果类似但蛋白结合能力不同的S6和S9，将50nM 32P标记的wt εRNA探针和逐渐递减浓度的未标记适体竞争剂混合后与目的蛋白MiniP孵育(图10)，结果表明，与MiniP蛋白结合能力稍弱的S6在0.25μM几乎没有表现出竞争性效果(S6 vs无竞争子的对照组＝95％ vs 100％)；当其浓度达到0.5μM时，32P-wt εRNA探针与P蛋白之间的结合能力下降到68％；而当S6的摩尔浓度达到绝对过量(1μM，20倍于标记探针)时，32P-wt εRNA与P蛋白结合信号仅12％，显示抑制效果达到顶峰。相比之下，S9在0.25μM、0.5μM、1μM表现出更强的竞争力，信号分别衰减为71％、39％和9％。该结果证明了适体RNAs是通过结合到相同于wt ε结合位点来发挥其抑制效果，它们在体外能够发挥其竞争性结合的生物学功能，有发展为诱饵适体的潜能。
由于适体S9与miniP的亲和力比wt εRNA与后者高约7.5倍(图8)，且该适体在三个适体中具有最佳的与目的蛋白MiniP的结合特异性(图10)，我们构建重组载体pSUPER-S9，利用LipofectomineTM2000(Invitrogen)转染HBV稳定表达细胞系-HepG2.2.15，Southernblotting检测胞内病毒核衣壳内HBV复制中间体DNA。结果表明：虽然S9抑制HBV复制的效果要稍逊于一种特异性针对HBV基因组DR1 region(1826-1845nt)的shRNA(56±2.5vs 40±3.2)，相比转染pSuper空载体的对照组依然明显压抑胞内核衣壳中的HBV DNA合成(56±2.5vs 100±0.0)；而转染P蛋白结合缺陷RNA(mut ε)的对照组在病毒DNA合成水平上则与转染pSuper空载体的对照组几乎没有差异(103±2.1vs 100±0.0)；作为内参，Western blotting检测管家基因β-actin的表达，各处理组之间无样品差异，表明适体S9抑制HepG2.2.15胞内病毒核衣壳中DNA的合成是特异性的(图11)。
同时，我们也对诱饵适体S9在瞬时HBV表达细胞系HepG2中干扰HBV复制的情况进行了分析，见图12，共转染结果表明：1)胞内核衣壳中HBV复制中间体DNA水平明显被引入的诱饵适体S9抑制，抑制效果和shRNA进行了比较。尽管适体S9对HBV复制水平的抑制效果要稍逊于shRNA(20±2.7vs 11±2.0)，但病毒核壳体内DNA合成能力下降到20％；而转染一个P蛋白结合缺陷体RNA(mut ε)的对照组在病毒DNA合成水平上则与转染pSuper空载体的对照组没有差异(99±3.5vs 100±0.0)；2)与shRNA类似，适体S9的引入明显压抑了胞内核衣壳中的pgRNA含量(32±6.3vs 100±0.0)；3)不同于shRNA明显压抑胞内特异性核衣壳装配，适体S9的引入对胞内核衣壳的装配并无明显影响。
最后，我们利用MTT实验证明诱饵适体S9的引入并未对宿主细胞产生明显的细胞毒作用(表1)。表1中：实验结果表示为平均吸光度490nm±标准差，数值来自于三次独立实验的平均值，每次实验设三个重复，各组间统计学上无显著差异性P＞0.05。
上述结果表明：诱饵适体S9在细胞内能够通过竞争性结合作用抑制HBV P-ε复合物的形成，从而起到抑制HBV复制的作用，其作用机理如图13所示，由于诱饵适体S9和shRNA相比抗病毒特异性高，而且后者在肝细胞内因诱导干扰素和脱靶效应产生细胞毒作用，因而抗HBV的RNA诱饵药物具有更为优越的应用前景。
附表
表1诱饵适体S9在瞬时转染HepaG2.2.15和HepG2二种细胞系后的细胞毒作用
Claims (10)
1.一种抗HBV诱饵适体，其特征是该适体能竞争性抑制人HBV中特异性P-ε相互作用，是通过SELEX技术筛选获得的，具体是：体外制备ε上茎23个核苷酸随机化的εRNA文库，利用SELEX技术经多轮筛选，从该εRNA文库中富集、筛选与目的蛋白HBV miniP高亲和的适体RNAs；然后手工测序获得10个适体RNAs的序列信息，并依据二级结构的相似性分组，从与野生型εRNA二级结构相似的组中挑选有代表性的适体S3、S6、S9进行定性；对于具有高亲和性和高结合特异性的适体S9，通过细胞转染实验证实了其抗HBV生物学功能；所述S9的序列为：
5’-UGUUCAUGUCCUACUGUUCAAACAAAAAAACUGUGCACAAAAAUAAAUUGGGGCAUGGACA-3’。
2.一种抗HBV诱饵适体的筛选方法，其特征在于采用以下步骤进行适体的体外SELEX筛选：
(1)体外制备εRNA突变文库用于SELEX筛选：
为体外制备εRNA突变文库，设计并合成92-mer寡聚核苷酸引物DepsNuppS(-)，该模板包含61nt的εRNA的序列信息，其中ε上茎的23个核苷酸序列全部随机化，在εRNA序列信息的3’下游包含与T7启动子序列互补的序列信息，在εRNA的上下游还分别包含限制性内切酶位点序列，以便进行体外转录和后续克隆；此外，还合成了包含T7启动子序列的22-mer引物T7promOligo(+)，
以上二种引物经体外粘连杂交后，形成完整的T7启动子，利用T7转录试剂盒体外转录合成获得初始εRNA文库，用于SELEX筛选；
(2)体外SELEX筛选获得与miniP高亲和的适体RNAs：
将100ng纯化的miniP蛋白与以上终浓度1μM初始εRNA文库在30μl伴侣分子体外结合系统中30℃孵育2hr，随后加入含Ni2+-NTA球珠的预冷结合缓冲液，低温孵育1hr，利用miniP蛋白的组氨酸标签将所形成的miniP-εRNA文库复合物吸附到Ni2+-NTA球珠上，先后以预冷结合缓冲液和TMK缓冲液洗去反应体系中未结合或弱结合的适体RNAs；miniP-εRNA复合物经苯酚抽提、无水乙醇沉淀后，分离结合的RNAs；该RNAs经RT-PCR扩增富集后得到的cDNA产物，用作下一轮SELEX筛选的RNAs转录模板；
(3)手工测序获得适体RNAs的序列信息并依据二级结构的相似性分组：
将经过3轮SELEX筛选分离的适体RNAs经RT-PCR扩增后克隆到pUC19载体中，重组载体经Kpn I线性化后，凝胶回收线性化DNA用作测序模板，以32P标记的包含T7启动子的寡聚核苷酸T7RTDepsOligo(+)为测序引物，按Thermo Sequenase CycleSequencing Kit(USB)操作说明进行手工测序；利用在线Mfold软件对所分离的10个具有不同上茎序列的适体RNAs的理论二级结构进行预测，并依据二级结构的相似性分组，从与野生型εRNA二级结构相似的组中挑选3个有代表性的适体S3、S6、S9进行定性；
(4)对代表性适体与miniP的亲和力和结合特异性进行定性：
利用凝胶迁移率移动实验EMSA评价诱饵适体与目的蛋白miniP的亲和力；利用竞争性EMSA实验评价适体与miniP的结合特异性；
(5)检测高亲和力、高结合特异性的适体S9在细胞内的抗HBV能力：
构建包含S9序列的重组载体pSUPER-S9，将其转染HBV持续复制细胞系-HepG2.2.15；Southern blotting分析细胞中新生的病毒核衣壳内DNA合成能力，所得数据用OptiQuant 5.0 software定量；作为内参，Western blotting检测管家基因β-actin的表达，结果和对照组相比较，校正样品间差异；用MTT法比较各处理组之间的活细胞差异，排除非特异性的细胞毒作用；
同时，将含HBV全长基因组的pCH-9/3091与pSUPER-S9以1∶1比例共转染HepG2细胞系；Southern blotting和Northern blotting分析细胞中病毒核衣壳内DNA合成能力和pgRNA含量，所得数据用OptiQuant 5.0software定量；利用非变性Western blotting检测细胞中病毒核衣壳装配情况是否受到影响；Western blotting检测管家基因β-actin的表达，结果和对照组相比较，校正样品间差异；用MTT法比较各处理组之间的活细胞差异，排除非特异性的细胞毒作用；
经过上述步骤，确立S9作为用于抗HBV的诱饵适体，该S9的序列为：
5’-UGUUCAUGUCCUACUGUUCAAACAAAAAAACUGUGCACAAAAAUAAAUUGGGGCAUGGACA-3’。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(1)中，所述92-mer寡聚核苷酸引物DepsNuppS(-)的序列为：
5’-GGTACCTGTCCATGCCCCA(N)12GCACAG(N)11GAACAGTAGGACATGAACAGCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTC-3’，
随机化序列以N标注；
所述22-mer的T7promOligo(+)序列为：5’-GAATTAATACGACTCACTATAG-3’。
4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(2)中，
所述伴侣分子体外结合系统由10μg Hsp70、1μg Hsp90b、0.6μg Hdj1、1.2μg Hop、0.3μgp23组成；
所述预冷结合缓冲液由0.1M Na2HPO4/NaH2PO4[pH7.4]、150mM NaCl、20mMImidazol、0.1％(V/V)NP-40及100μg/ml酵母tRNA组成；
所述TMK缓冲液由pH7.5的50mM Tris/HCl，10mM MgCl2，40mM KCl，100μg/ml酵母tRNA组成。
5.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(2)中，SELEX筛选中RT-PCR所应用的引物序列为：
RTDepsOliogo(-)：5’-CAATCTGCAGTCTAGATAAGGTACCTGTCCATGCCCCA-3’
T7RTDepsOligo(+)：5’-CCCCGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGTTCATGT-3’
其中，T7RTDepsOligo(+)也是步骤(3)中所述的测序引物。
6.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(2)中，所有PCR循环都被限制在15-18个循环，以避免RT-PCR扩增过程中出现过量的非特异性产物。
7.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(4)中，
(1)采用以下方法评价适体与目的蛋白miniP的亲和力：
将适体RNA或野生型εRNA 5’末端去磷酸化后，以3000 Ci/mmol γ-32P-ATP和T4磷酸化激酶对RNA 5’末端放射性磷酸化标记，标记RNA利用Quick Spin columns进行纯化；
在miniP-ε直接结合实验中，采用了由pH7.5的20mM Tris/HCl，2mM MgCl2，15mM NaCl，20mM KCl和4mM dithiothreitol组成的TMNK反应缓冲液；每10μl TMNK反应缓冲液中含20ng的miniP，终浓度为50nM的γ-32P-εRNA，6μg酵母tRNA，由3μgHsp70、360ng Hsp90、200ng Hdj1、375ng Hop和100ng p23组成的分子伴侣蛋白体系，40u/μl的RNase酶抑制剂，以及1片/次的蛋白酶抑制剂cocktail；
反应体系30℃孵育2hr后，经5％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，真空干胶并压制磷屏底片，放射强度经Perkin Elmer C431200磷屏仪检测后，利用OptiQuant 5.0software对RNP复合物进行定量分析；
(2)采用以下方法评价适体与miniP的结合特异性：
在miniP-ε竞争性结合实验中，利用5’末端32P标记的野生型εRNA和20倍过量浓度的未标记适体RNA混合，测试它们竞争MiniP蛋白的能力，从而确定适体对MiniP的结合特异性；采用了由pH7.5的20mM Tris/HCl，2mM MgCl2，15mM NaCl，20mM KCl和4mM dithiothreitol组成的TMNK反应缓冲液；每10μl TMNK反应缓冲液中含20ng的miniP，终浓度为50nM的γ-32P-εRNA，1μM未标记的适体RNAs，6μg酵母tRNA，由3μgHsp70、360ng Hsp90、200ng Hdj1、375ng Hop和100ng p23组成的分子伴侣体系，40u/μl的RNase酶抑制剂，以及1片/次的蛋白酶抑制剂cocktail；
反应体系30℃孵育2hr后，经5％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，真空干胶并压制磷屏底片，放射强度经Perkin Elmer C431200磷屏仪检测后，利用OptiQuant 5.0 software对RNP复合物进行定量分析。
8.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(5)中，采用以下方法检测适体S9在HepG2.2.15细胞内对HBV复制的影响：构建包含S9序列的重组载体pSUPER-S9，利用LipofectomineTM2000，按操作说明将24μg的pSUPER-S9瞬时转染10cm细胞培养皿中的HepG2.2.15细胞，48hr后用一种由10mM Tris-HCl[pH8.0]、50mM NaCl、1mM EDTA组成的1ml NP40裂解液裂解细胞并收获细胞裂解液，Southern blotting检测适体S9的引入对细胞中病毒核衣壳内DNA合成的影响，所得数据用OptiQuant 5.0 software定量；作为内参，Western blotting检测管家基因β-actin的表达，并与对照组比较，以校正各处理组之间的样品误差。
9.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(5)中，采用以下方法检测适体S9在HepG2细胞内对HBV复制的影响：
pSUPER-S9重组载体与含HBV基因组表达载体pCH-9/3091以1∶1比例共瞬时转染HepG2细胞，48hr后收集细胞，纯化胞内HBV核衣壳；其中，1/3用来抽提核衣壳内的HBV复制中间体DNA，1/3用来抽提核衣壳内的pgRNA，并用32P标记的HBV特异基因片段为探针分别做Southern blotting和Northern blotting，分析引入S9对病毒核衣壳内DNA合成和核衣壳内pgRNA含量的影响，所得数据用OptiQuant 5.0 software定量；剩余1/3用非变性Western blotting检测对病毒核衣壳装配的影响；
Western blotting检测管家基因β-actin的表达，并与对照组比较，以校正各处理组之间的样品误差。
10.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(5)中，采用MTT法比较各处理组之间的活细胞差异：瞬时转染HepG2.215或HepG2细胞系24hr后，将实验组和对照组10cm细胞培养皿的细胞用胰酶消化后取1/10细胞重悬于1mL DMEM中，再将细胞悬液接种到96孔板，每空孔100μl，按照
MTT Cell Proliferation Assay Kit操作说明进行定量分析，排除S9对细胞内HBV复制的影响是由于非特异性的细胞毒作用造成；所述实验组是指转染pSUPER-S9的实验组，所述对照组是指包括无质粒转染、转染pSUPER-siRNA、转染pSUPER-mutε、转染空载体pSUPER的对照组。
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