CN109266739A - 一种检测脑损伤的miRNA标志物、试剂盒、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开检测脑损伤的miRNA标志物、试剂盒、应用;所述标志物为miR‑9、miR‑124、miR‑128a和miR‑128b中的任意一种或多种;所述试剂盒用于检测脑脊液中microRNA标志物的含量;所述标志物和试剂盒,可用于脑损伤辅助诊断,且易于检测,定量精确,敏感性和特异性佳。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种检测脑损伤的miRNA标志物、试剂盒、应用。
背景技术
创伤性脑损伤(Traumaticbraininjury,TBI)是神经外科最基本的问题之一,也是全球性的公共健康问题一种高致死率、高致残率的疾病。全世界发病率约为每年0.15%~0.45%,通常因交通事故、高空坠落、极限运动等导致头部猛烈撞击而引起短暂失忆、运动和认知功能障碍。若得不到及时诊断、治疗,最终形成不可逆性的神经功能破坏。
目前临床上对于创伤性脑损伤的严重程度和术后恢复情况大多通过影像学观察和行为评分进行评估,缺乏足够的精准性和灵敏度。
发明内容
有鉴于此,本申请提供了一种检测脑损伤的miRNA标志物、试剂盒、应用,所述标志物和试剂盒,可用于脑损伤辅助诊断,且易于检测,定量精确,敏感性和特异性佳。
为解决以上技术问题,本发明提供的技术方案是一种检测脑损伤的miRNA标志物,所述标志物为miR-9、miR-124、miR-128a和miR-128b中的任意一种或多种。
优选的,所述脑损伤为创伤性脑损伤。
优选的,所述标志物为miR-9、miR-124、miR-128a和miR-128b的组合。
本发明还提供了上述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物,所述反转录引物为:
miR-9的反转录引物序列为SEQ ID NO:1所示;
miR-124的反转录引物序列为SEQ ID NO:2所示;
miR-128a的反转录引物序列为SEQ ID NO:3所示;
miR-128b的反转录引物序列为SEQ ID NO:4所示;
所述检测引物为:
miR-9的正向引物序列为SEQ ID NO:5所示;
miR-9的反向引物序列为SEQ ID NO:6所示;
miR-124的正向引物序列为SEQ ID NO:7所示;
miR-124的反向引物序列为SEQ ID NO:8所示;
miR-128a的正向引物序列为SEQ ID NO:9所示;
miR-128a的反向引物序列为SEQ ID NO:10所示;
miR-128b的正向引物序列为SEQ ID NO:11所示;
miR-128b的反向引物序列为SEQ ID NO:12所示。
本发明提供了上述miRNA标志物在制备脑损伤的诊断试剂中的应用。
优选的,所述诊断试剂通过检测被试者生物样品中所述miRNA标志物的含量,并与健康对照人群平均水平相比较来判断脑损伤程度。
优选的,所述生物样品为脑脊液。
本发明提供了上述miRNA标志物的反转录引物、检测引物在制备脑损伤的诊断试剂中的应用。
本发明还提供一种脑损伤的诊断试剂盒,所述试剂盒用于检测脑脊液中microRNA标志物的含量;所述标志物为miR-9、miR-124、miR-128a和miR-128b中的任意一种或多种。
优选的,所述试剂盒包括:所述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物;
所述反转录引物为:
miR-9的反转录引物序列为SEQ ID NO:1所示;
miR-124的反转录引物序列为SEQ ID NO:2所示;
miR-128a的反转录引物序列为SEQ ID NO:3所示;
miR-128b的反转录引物序列为SEQ ID NO:4所示;
所述检测引物为:
miR-9的正向引物序列为SEQ ID NO:5所示;
miR-9的反向引物序列为SEQ ID NO:6所示;
miR-124的正向引物序列为SEQ ID NO:7所示;
miR-124的反向引物序列为SEQ ID NO:8所示;
miR-128a的正向引物序列为SEQ ID NO:9所示;
miR-128a的反向引物序列为SEQ ID NO:10所示;
miR-128b的正向引物序列为SEQ ID NO:11所示;
miR-128b的反向引物序列为SEQ ID NO:12所示。
优选的,所述试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。
优选的,所述试剂盒为基于数字PCR平台的试剂盒。
本申请与现有技术相比,其详细说明如下:
本发明提供的标志物miRNA,微创、易于检测,且定量精确,将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性,该miRNA生物标志物的成功开发有助于脑损伤的辅助诊断,为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。所述标志物为miR-9、miR-124、miR-128a和miR-128b中的任意一种或多种;进一步的,所述标志物为miR-9、miR-124、miR-128a和miR-128b的组合,四种miRNA具有较好的组织特异性,检测的靶点适量,精简和可操作性强。
(2)本发明通过检测脑脊液、脑组织中标志物miRNA的含量,与健康对照人群平均水平相比较来判断脑损伤程度。本发明提供的标志物和试剂盒,可用于脑损伤辅助诊断,有助于反映脑损伤程度和恢复情况,为临床医生快速准确掌握患者病情、时采取更具个性化的防治方案提供支持。
(3)本发明提供的试剂盒为基于数字PCR平台的试剂盒具有更精准和更灵敏的特性。
附图说明
图1为测试1中miR-9在脑外伤病人和健康人的脑脊液中表达水平的分布图;
图2为为测试1中miR-124在脑外伤病人和健康人的脑脊液中表达水平的分布图;
图3为测为测试1中miR-128a在脑外伤病人和健康人的脑脊液中表达水平的分布图;
图4为测为测试1中miR-128b在脑外伤病人和健康人的脑脊液中表达水平的分布图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种脑损伤的诊断试剂盒,包括:microRNA标志物的反转录引物、检测引物;所述试剂盒能检测脑脊液中microRNA标志物miR-9的含量;所述反转录引物为:
miR-9的反转录引物序列为SEQ ID NO:1所示;所述检测引物为:miR-9的正向引物序列为SEQ ID NO:5所示;miR-9的反向引物序列为SEQ ID NO:6所示。
实施例2
一种脑损伤的诊断试剂盒,包括:microRNA标志物的反转录引物、检测引物;所述试剂盒能检测脑脊液中microRNA标志物miR-124的含量;miR-124的反转录引物序列为SEQID NO:2所示;所述检测引物为:miR-124的正向引物序列为SEQ ID NO:7所示;miR-124的反向引物序列为SEQ ID NO:8所示。
实施例3
一种脑损伤的诊断试剂盒,包括:microRNA标志物的反转录引物、检测引物;所述试剂盒能检测脑脊液中microRNA标志物miR-128a的含量;miR-128a的反转录引物序列为SEQ ID NO:3所示;所述检测引物为:miR-128a的正向引物序列为SEQ ID NO:9所示;miR-128a的反向引物序列为SEQ ID NO:10所示。
实施例4
一种脑损伤的诊断试剂盒,包括:microRNA标志物的反转录引物、检测引物;所述试剂盒能检测脑脊液中microRNA标志物miR-128b的含量;miR-128b的反转录引物序列为SEQ ID NO:4所示;所述检测引物为miR-128b的正向引物序列为SEQ ID NO:11所示;miR-128b的反向引物序列为SEQ ID NO:12所示。
实施例5
一种脑损伤的诊断试剂盒,包括:microRNA标志物的反转录引物、检测引物;所述试剂盒能检测脑脊液中microRNA标志物的含量;所述标志物为miR-9、miR-124、miR-128a和miR-128b的组合;
所述反转录引物为:
miR-9的反转录引物序列为SEQ ID NO:1所示;
miR-124的反转录引物序列为SEQ ID NO:2所示;
miR-128a的反转录引物序列为SEQ ID NO:3所示;
miR-128b的反转录引物序列为SEQ ID NO:4所示;
所述检测引物为:
miR-9的正向引物序列为SEQ ID NO:5所示;
miR-9的反向引物序列为SEQ ID NO:6所示;
miR-124的正向引物序列为SEQ ID NO:7所示;
miR-124的反向引物序列为SEQ ID NO:8所示;
miR-128a的正向引物序列为SEQ ID NO:9所示;
miR-128a的反向引物序列为SEQ ID NO:10所示;
miR-128b的正向引物序列为SEQ ID NO:11所示;
miR-128b的反向引物序列为SEQ ID NO:12所示。
实施例6
测试例1
(1)样本采集和处理
采集10例脑外伤病人和10例健康人的脑脊液1ml。转移至新的1.5ml离心管中,4℃8000g离心10min,吸取上清至一新的1.5ml离心管中。使用QIAGEN的miRNeasy Serum/PlasmaKit按照操作说明书进行总miRNA的提取。
(2)使用反转录引物和ABI的反转录试剂盒进行反转录反应得到cDNA,反转录反应体系见表1,按表2条件进行反应,4℃表示反应完成;
其中反转录引物为:
miR-9的反转录引物序列为SEQ ID NO:1所示;
miR-124的反转录引物序列为SEQ ID NO:2所示;
miR-128a的反转录引物序列为SEQ ID NO:3所示;
miR-128b的反转录引物序列为SEQ ID NO:4所示;
表1反转录反应体系
表2反转录反应条件
步骤 | 时间 | 温度 |
1 | 30min | 16℃ |
2 | 30min | 42℃ |
3 | 5min | 85℃ |
4 | Forever | 4℃ |
(3)得到的cDNA使用的检测引物和Bio-rad的数字PCR试剂进行数字PCR反应,数字PCR反应反应体系见表3,按表4条件进行反应,10℃表示反应完成;所述检测引物为:
miR-9的正向引物序列为SEQ ID NO:5所示;
miR-9的反向引物序列为SEQ ID NO:6所示;
miR-124的正向引物序列为SEQ ID NO:7所示;
miR-124的反向引物序列为SEQ ID NO:8所示;
miR-128a的正向引物序列为SEQ ID NO:9所示;
miR-128a的反向引物序列为SEQ ID NO:10所示;
miR-128b的正向引物序列为SEQ ID NO:11所示;
miR-128b的反向引物序列为SEQ ID NO:12所示。
表3数字PCR反应体系
表4反转录反应条件
(4)实验结果:
分布散点图件图1~4,结果表明,与健康人相比,脑外伤病人脑脊液中的miR-9、miR-124、miR-128a和miR-128b总体表达水平均存在较大差异。同时脑外伤病人脑脊液中的miR-9的总体表达水平比健康人的升高了(P<0.05),脑外伤病人脑脊液中的miR-124的总体表达水平比健康人的升高了(P<0.05),脑外伤病人脑脊液中的miR-128a的总体表达水平比健康人的升高了(P<0.05),脑外伤病人脑脊液中的miR-128b的总体表达水平比健康人的升高了(P<0.05)。
测试例2
(1)同样采集10例脑外伤病人和10例健康人的脑脊液样品作为检测样本,每个检测样本3次重复,用实施例1~4的试剂盒按照测试例1的方法测试,结果见表5。
表5脑外伤病人和健康人的测试结果
如表5所示,实施例1的检测试剂盒能够高特异性的检测区分脑外伤病人和健康人。
(2)使用MedCalc软件进行分析,得到检测脑外伤病人对照的ROC曲线,从而确定实施例5的试剂盒检测的准确度,分析结果件表6。
表6
试剂盒 | 敏感度(%) | 特异性(%) | AUC | 95%置信区间 |
实施例5 | 83.8 | 80.2 | 0.88 | 0.83-0.94 |
由表6可知,本发明提供的标志物检测脑损伤具有较高的准确性、灵敏度和特异性,能够应用于制备脑损伤的诊断试剂,辅助评估创伤性脑损伤严重程度和治疗术后恢复。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 成都仕康美生物科技有限公司
<120> 一种检测脑损伤的miRNA标志物、试剂盒、应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcgtatcca gtgcagtgtc agaggtagtc gcactggata cgactcatac ag 52
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcgtatcca gtgcagtgtc agaggtagtc gcactggata cgacggcatt ca 52
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcgtatcca gtgcagtgtc agaggtagtc gcactggata cgacaaagag ac 52
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcgtatcca gtgcagtgtc agaggtagtc gcactggata cgactctcgt ac 52
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgccgtcttt ggttatctag 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagtgcagtg tcagaggtag tcg 23
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgtaaggca cgcgg 15
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagtgcagtg tcagaggtag tcg 23
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggcgtcaca gtgaaccg 18
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagtgcagtg tcagaggtag tcg 23
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aatagggggc cgatacact 19
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagtgcagtg tcagaggtag tcg 23
Claims (10)
1.一种检测脑损伤的miRNA标志物,其特征在于,所述标志物为miR-9、miR-124、miR-128a和miR-128b中的任意一种或多种。
2.根据权利要求1所述的miRNA标志物,其特征在于,所述标志物为miR-9、miR-124、miR-128a和miR-128b的组合。
3.权利要求1所述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物,其特征在于,
所述反转录引物为:
miR-9的反转录引物序列为SEQ ID NO:1所示;
miR-124的反转录引物序列为SEQ ID NO:2所示;
miR-128a的反转录引物序列为SEQ ID NO:3所示;
miR-128b的反转录引物序列为SEQ ID NO:4所示;
所述检测引物为:
miR-9的正向引物序列为SEQ ID NO:5所示;
miR-9的反向引物序列为SEQ ID NO:6所示;
miR-124的正向引物序列为SEQ ID NO:7所示;
miR-124的反向引物序列为SEQ ID NO:8所示;
miR-128a的正向引物序列为SEQ ID NO:9所示;
miR-128a的反向引物序列为SEQ ID NO:10所示;
miR-128b的正向引物序列为SEQ ID NO:11所示;
miR-128b的反向引物序列为SEQ ID NO:12所示。
4.权利要求1所述的miRNA标志物在制备脑损伤的诊断试剂中的应用。
5.根据权利要求4所述应用,其特征在于,所述诊断试剂通过检测被试者生物样品中所述miRNA标志物的含量,并与健康对照人群平均水平相比较来判断脑损伤程度。
6.权利要求3所述的miRNA标志物的反转录引物、检测引物在制备脑损伤的诊断试剂中的应用。
7.一种脑损伤的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒用于检测脑脊液中microRNA标志物的含量;所述标志物为miR-9、miR-124、miR-128a和miR-128b中的任意一种或多种。
8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:所述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物;
所述反转录引物为:
miR-9的反转录引物序列为SEQ ID NO:1所示;
miR-124的反转录引物序列为SEQ ID NO:2所示;
miR-128a的反转录引物序列为SEQ ID NO:3所示;
miR-128b的反转录引物序列为SEQ ID NO:4所示;
所述检测引物为:
miR-9的正向引物序列为SEQ ID NO:5所示;
miR-9的反向引物序列为SEQ ID NO:6所示;
miR-124的正向引物序列为SEQ ID NO:7所示;
miR-124的反向引物序列为SEQ ID NO:8所示;
miR-128a的正向引物序列为SEQ ID NO:9所示;
miR-128a的反向引物序列为SEQ ID NO:10所示;
miR-128b的正向引物序列为SEQ ID NO:11所示;
miR-128b的反向引物序列为SEQ ID NO:12所示。
9.根据权利要求7所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。
10.根据权利要求7所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒为基于数字PCR平台的试剂盒。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190125 |
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