CN109266556B - 一种蝉拟青霉的人工培育方法及其培育的镇痛水提物 - Google Patents

一种蝉拟青霉的人工培育方法及其培育的镇痛水提物 Download PDF

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Abstract

一种蝉拟青霉的人工培育方法，包括以下步骤：（1）菌种活化：从自然界分离选育了一株生命力强，镇痛代谢活性物质产量高的蝉拟青霉GZUIFR04606，将菌接种到PDA试管斜面上，25℃恒温培养7d；（2）种子培养：用接种环将已活化的试管斜面菌种接种到装有50mL液体培养基的250mL的三角瓶中，25℃，150r/min，摇床振荡培养72～96h；（3）发酵培养：将种子培养液按5%的接种量即7.5ml接种到装有150mL液体培养基的500mL的三角瓶中，25℃，150r/min，摇床振荡培养72～96h。以该蝉拟青霉为原料，用纯水匀浆，离心，经凝胶柱层析，得到具有活性组分的蝉拟青霉镇痛水提物。该蝉拟青霉镇痛水提物具有明显的镇痛作用，毒副作用小，稳定性好，无成瘾性。

Description

一种蝉拟青霉的人工培育方法及其培育的镇痛水提物
技术领域
本发明属于虫草真菌发酵、有效部位提取及利用技术领域，具体 地涉及一种蝉拟青霉的人工培育方法及其培育的镇痛水提物。
背景技术
蝉拟青霉(Paecilomycescicadae)为大蝉草 (CordycepscicadaeS-hing)的分生孢子无性型阶段。蝉花是蝉在土 中的若虫被蝉拟青霉寄生致死的带菌尸体，在其头部长菌丝形成的孢 梗束似花蕾故名蝉花，由于蝉花生长的地理位置、生态环境的不同， 导致蝉花的形态各异。蝉花被视为“中药八珍”之一，在我国作为药 材使用已有悠久的历史，早在南北朝雷校《雷公炮炙论》就有加工记 载。蝉拟青霉中含有核苷类化合物、虫草多糖、虫草酸、蛋白质、氨 基酸、微量元素、SOD等多种活性物质,具有提高免疫力、抗炎、抗 疲劳、抗氧化、抗衰老、抗突变、抗肿瘤、镇痛、镇静等多种功效。
目前对冬虫夏草、古尼拟青霉、细脚拟青霉等相关研究表明：虫 草属及其无性型真菌对化学刺激引起的疼痛有明显的抑制作用(外周 镇痛作用)，对热刺激引起的疼痛未表现出镇痛作用(中枢镇痛作用)， 且未见成瘾性报道；而蝉花无性型—蝉拟青霉菌丝体的镇痛活性研究 报道较少。据此，本发明研究了蝉拟青霉菌株镇痛水提物的制备方法， 并对镇痛效果进行评价。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蝉拟青霉的人工培育方法及其培育 的镇痛水提物，该方法从自然界分离选育了一株生命力强，镇痛代谢 活性物质产量高的蝉拟青霉GZUIFR04606(CGMCC No.16485)；采用 人工培育的方法进行蝉拟青霉发酵培养，以该蝉拟青霉为原料，用纯 水匀浆，离心，经凝胶柱层析，得到具有活性组分的蝉拟青霉镇痛水 提物。
本发明目的是通过下述方案得以实现：
一种蝉拟青霉的人工培育方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：从自然界分离选育了一株生命力强，镇痛代谢 活性物质产量高的蝉拟青霉GZUIFR04606(菌种保藏的分类命名：蝉 拟青霉(Paecilomyces cicadae)，保藏单位：中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.16485，保藏日期： 2018年9月25，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中 国科学院微生物研究所)；
将菌接种到PDA试管斜面上，25℃恒温培养7d；
(2)种子培养：用接种环将已活化的试管斜面菌种接种到装有 50mL液体培养基的250mL的三角瓶中，25℃，150r/min，摇床振荡 培养72～96h；
(3)发酵培养：将种子培养液按5％的接种量即7.5ml接种到装 有150mL液体培养基的500mL的三角瓶中，25℃，150r/min，摇床振 荡培养72～96h。
上述一种蝉拟青霉的人工培育方法培育的镇痛水提物，其制备包 括以下步骤：
(1)取人工培育的蝉拟青霉发酵产物，4000r/min，离心10-20min， 弃上清，得蝉拟青霉菌丝；
(2)用玻璃匀浆器破碎蝉拟青霉菌丝细胞，分别按菌丝体与超纯 水质量体积比kg：L＝1:4-1：10，在室温下，加入超纯水浸提3-5 次，得水提液；
(3)上述水提液在4000r/min，离心10-20min，取上清液；
(4)上清液经SephadexG-25凝胶柱层析，得到活性组分；
(5)将水提物配制成含活性组分0.1-1.0mg/ml的水溶液，即为 蝉拟青霉镇痛水提物。
上述一种蝉拟青霉的人工培育方法培育的镇痛水提物，其中：
(1)人工培育的蝉拟青霉发酵产物，4000r/min，离心10-20min， 弃上清，得蝉拟青霉菌丝10g；
(2)用玻璃匀浆器破碎蝉拟青霉菌丝细胞，按菌丝体与纯水质量 体积比kg：L比为1:8，加入80ml纯水，在室温下，加入超纯水浸 提5次；
(3)上述水提液在4000r/min，离心10min，取上清液；
(4)上清液经SephadexG-25凝胶柱层析，得到活性组分；
(5)将水提物配制成含活性组分0.40mg/ml±0.02mg/ml的水溶 液。
本发明蝉拟青霉镇痛水提物工艺简单，经动物实验证明蝉拟青霉 镇痛水提物具有明显的镇痛作用，与罗通定作用相当，并确定该水提 物分子量在59622，毒副作用小，稳定性好，无成瘾性，具有较大的 开发应用前景。
附图说明
图1是本发明的SephadexG-25凝胶柱层析图所示的活性组分。
图2是SDS-page电泳图(其中M为标准蛋白，1,2均为样品)。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明，并不因此将本发明限制在所 述的实施例范围之内。
蝉拟青霉菌株的筛选：
24株蝉拟青霉分别采自贵州、四川、重庆、云南、浙江、海南、 陕西、广西及韩国的蝉花，经分离鉴定纯化后，得到蝉拟青霉。采用 小鼠扭体疼痛试验模型，以生理盐水为阴性对照、罗通定为阳性对照， 考察24株蝉拟青霉的菌丝提取液的镇痛作用，筛选出一株云南省墨 江哈尼族自治县的蝉拟青霉GZUIFR04606，其生命力强，镇痛代谢活 性物质产量高。其中：蝉拟青霉GZUIFR04606，其菌种保藏的分类命 名：蝉拟青霉(Paecilomycescicadae)，保藏单位：中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.16485，保藏 日期：2018年9月25，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号中国科学院微生物研究所。
蝉拟青霉进行人工培育：
(1)菌种活化：将菌接种到PDA试管斜面上，25℃恒温培养7d，；
(2)种子培养：用接种环将已活化的试管斜面菌种接种到装有 50mL液体培养基的250mL的三角瓶中，25℃，150r/min，摇床振荡 培养72～96h；
(3)发酵培养：将种子培养液按5％(7.5ml)的接种量接种到装 有150mL液体培养基的500mL的三角瓶中，25℃，150r/min，摇床振 荡培养72～96h。
蝉拟青霉水提物的制备：
(1)取人工培育的蝉拟青霉发酵产物，4000r/min，离心10-20min， 弃上清，得蝉拟青霉菌丝；
(2)用玻璃匀浆器破碎蝉拟青霉菌丝细胞，分别按菌丝体(kg) 与超纯水(L)比1:4-1:10，在室温下，加入超纯水浸提3-5次；
(3)上述水提液在4000r/min，离心10-20min，取上清液；
(4)上清液经SephadexG-25凝胶柱层析，得到活性组分；
(5)将水提物配制成含活性组分0.1-1.0mg/ml的水溶液，即为 本发明的蝉拟青霉镇痛水溶液。
实施例1(最佳参数)：
(1)人工培育的蝉拟青霉发酵产物，4000r/min，离心10-20min， 弃上清，得蝉拟青霉菌丝10g；
(2)用玻璃匀浆器破碎蝉拟青霉菌丝细胞，按菌丝体(kg)与纯 水(L)比1:8，加入80ml纯水，在室温下，加入超纯水浸提5次；
(3)上述水提液在4000r/min，离心10min，取上清液；
(4)上清液经SephadexG-25凝胶柱层析，得到活性组分；如图 1所示凝胶柱层析图所示活性组分。
(5)将水提物配制成含活性组分0.40mg/ml±0.02mg/ml的水溶 液。(该浓度采用中国药典规定Folin酚法测定)
实施例2：
(1)人工培育的蝉拟青霉发酵产物，4000r/min，离心10-20min， 弃上清，得蝉拟青霉菌丝10g；
(2)用玻璃匀浆器破碎蝉拟青霉菌丝细胞，按菌丝体(kg)与纯 水(L)比1:4，加入40ml纯水，在室温下，加入超纯水浸提3次；
(3)上述水提液在4000r/min，离心20min，取上清液；
(4)上清液经SephadexG-25凝胶柱层析，得到活性组分；如图 1所示凝胶柱层析图近似；
(5)将水提物配制成含活性组分0.40mg/ml±0.02mg/ml的水溶 液。
实施例3：
(1)人工培育的蝉拟青霉发酵产物，4000r/min，离心10-20min， 弃上清，得蝉拟青霉菌丝10g；
(2)用玻璃匀浆器破碎蝉拟青霉菌丝细胞，按菌丝体(kg)与纯 水(L)比1:10，加入100ml纯水，在室温下，加入超纯水浸提5次；
(3)上述水提液在4000r/min，离心10min，取上清液；
(4)上清液经SephadexG-25凝胶柱层析，得到活性组分；如图 1所示凝胶柱层析图近似；
(5)将水提物配制成含活性组分0.40mg/ml±0.02mg/ml的水溶 液。
采用醋酸扭体法观察蝉拟青霉水提物的镇痛作用：
1、致痛模型建立：
昆明小白鼠，雌雄各半，体重20±2g，在室温：22±2℃相对湿 度：40～60％条件下适应性饲养3天，给药前禁食不禁水。腹腔注射 0.7％冰醋酸0.1ml/10g，立即计时并观察小鼠疼痛扭体反应的潜伏期 及产生扭体反应后15min内的扭体次数，计算镇痛百分率。因中枢致 痛作用引起小鼠扭体现象出现，疼痛越剧烈，扭体频率越高。
2、动物镇痛试验方法：
(1)蝉拟青霉镇痛水提物给药组：蝉拟青霉镇痛水提物(浓度 为0.40mg/ml)；
(2)罗通定对照组：给药(浓度为3.5％)；
(3)空白对照组：给生理盐水。
取小鼠36只雌雄各半，随机分为3组，每组12只，蝉拟青霉镇 痛水提物给药组、罗通定对照组和空白对照组分别灌服等量蝉拟青霉 镇痛水提物、罗通定和生理盐水，0.2ml/10g/次，1次/d，连续3d； 于末次给药30min后，腹腔注射0.7％冰醋酸，立即计时并观察小鼠疼痛扭体反应的潜伏期及产生扭体反应后15min内的扭体次数，按下 列公式计算镇痛百分率。
镇痛百分率＝(阴性组平均扭体次数-给药组平均扭体次数)/阴性组平均扭体次数)×100％。
Figure BDA0001828437380000041
注：与生理盐水组比较，*P<0.05,**P<0.01
结果表明，蝉拟青霉水提物具有较好的镇痛效果。
限量试验测蝉拟青霉急性毒性：
取小鼠20只，随机分为两组，每组10只，雌雄各半。第一组为 蝉拟青霉组，一次经口给予0.2ml/10g的蝉拟青霉菌丝体水提物(相 当于湿菌丝体1.0g/mL)，剂量为20.0g/kg；第二组为空白对照组， 经口一次给予等体积的生理盐水。连续观察14d，记录染药期间小鼠每天表现并于0d、3d、7d、14d称重，试验结束，后颈椎脱臼处死小 鼠，解剖，称取小鼠脏器重量，计算脏器系数(脏器系数＝脏器质量/ 动物质量×100％)，并观察病理变化。
Figure BDA0001828437380000051
注：与生理盐水组比较，P>0.05
Figure BDA0001828437380000052
注：与生理盐水组比较，P>0.05
结果表明，此次小鼠一次经口给予剂量为20g/kg，是限量试验中 剂量的4倍，表明蝉拟青霉水提物没有急性毒性。
小鼠竖尾试验测蝉拟青霉水提物成瘾性：
(1)蝉拟青霉镇痛水提物给药组：蝉拟青霉镇痛水提物(浓度 为0.40mg/ml)；
(2)罗通定对照组：给药(浓度为3.5％)；
(3)空白对照组：给生理盐水。
取小鼠30只，随机分为3组，每组10只，雌雄各半。分别经口 灌胃蝉拟青霉水提物、罗通定和生理盐水，连续给药15天，每天给 药后15min，观察小鼠是否出现竖尾和不停走动现象。
Figure BDA0001828437380000053
结果表明，本实验使用剂量范围内未见蝉拟青霉镇痛水提物有成 瘾性
本发明的蝉拟青霉镇痛水提物的理化特征：
(1)外观性状：淡黄色澄清溶液
(2)pH值：5-8；
(3)分子量：59622，如图2；
(4)蝉拟青霉水提物浓度为：0.1-1.0mg/ml；最佳浓度为：4.0mg/ml ±2mg/ml；
(5)稳定性：-20℃保存6个月仍有活性。
本发明特点：一、从自然界分离选育了一株生命力强，镇痛代谢 活性物质产量高的蝉拟青霉GZUIFR04606(保藏单位：中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.16485，保藏 日期：2018年9月25)
二、采用人工培育的方法进行蝉拟青霉发酵培养，以该蝉拟青霉 为原料，用纯水匀浆，离心，经凝胶柱层析，得到具有活性组分的蝉 拟青霉镇痛水提物。
三、经动物实验证明蝉拟青霉镇痛水提物具有明显的镇痛作用， 与罗通定作用相当。
四、通过SDS-page确定该水提物分子量在59622，毒副作用小， 稳定性好，无成瘾性。
综上，本发明蝉拟青霉镇痛水提物工艺简单，经动物实验证明蝉 拟青霉镇痛水提物具有明显的镇痛作用，与罗通定作用相当，并确定 该水提物分子量在59622，毒副作用小，稳定性好，无成瘾性，具有 较大的开发应用前景。
参考文献：
[1]谭艾娟,欧翔,刘爱英.蝉拟青霉对小菜蛾致病性的研究[J].现 代农业科技,2009,2009(15):369-369.
[2]徐叔云,卞如濂,陈修等.药理实验方法学(第三版)[M].北京：人 民卫生出版社,2002:228,882-887.
[3]郭尧君.SDS电泳技术的实验考虑及最新进展[J].生物化学与生 物物理进展,1991(1):32-37.
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何 形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术 实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于 本发明技术方案的范围内。

Claims (2)

1.一种蝉拟青霉菌株GZUIFR04606制备的镇痛水提物，其特征在于：该镇痛水提物的理化特征：
（1）外观性状：淡黄色澄清溶液；
（2）pH值：5-8；
（3）活性组分分子量：59622；
（4）蝉拟青霉水提物浓度为：0.1-1.0mg/ml；
（5）稳定性：-20℃保存6个月仍有活性；
它是按如下方法制成的：
一、蝉拟青霉菌株培育制备产物包括以下步骤：
（1）菌种活化：一株生命力强，镇痛代谢活性物质产量高的蝉拟青霉GZUIFR04606，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.16485，保藏日期：2018年9月25；
将菌接种到PDA试管斜面上，25℃恒温培养7d；
（2）种子培养：用接种环将已活化的试管斜面菌种接种到装有50mL液体培养基的250mL的三角瓶中，25℃，150r/min，摇床振荡培养72～96h；
（3）发酵培养：将种子培养液按5%的接种量即7.5ml接种到装有150mL液体培养基的500mL的三角瓶中，25℃，150r/min，摇床振荡培养72～96h；
二、镇痛水提物制备包括以下步骤：
（1）取人工培育的蝉拟青霉发酵产物，4000r/min，离心10-20min，弃上清，得蝉拟青霉菌丝；
（2）用玻璃匀浆器破碎蝉拟青霉菌丝细胞，分别按菌丝体与超纯水质量体积比kg ：L =1:4-1：10，在室温下，加入超纯水浸提3-5次，得水提液；
（3）上述水提液在4000r/min，离心10-20min，取上清液；
（4）上清液经SephadexG-25凝胶柱层析，得到活性组分；
（5）将水提物配制成含活性组分0.1-1.0mg/ml的水溶液，即为蝉拟青霉镇痛水提物。
2.如权利要求1所述的一种蝉拟青霉菌株GZUIFR04606制备的镇痛水提物，其特征在于：步骤二包括以下步骤：（1）人工培育的蝉拟青霉发酵产物，4000r/min，离心10-20min，弃上清，得蝉拟青霉菌丝10g；
（2）用玻璃匀浆器破碎蝉拟青霉菌丝细胞，按菌丝体与纯水质量体积比kg ：L比为1:8，加入80ml纯水，在室温下，加入超纯水浸提5次；
（3）上述水提液在4000r/min，离心10min，取上清液；
（4）上清液经SephadexG-25凝胶柱层析，得到活性组分；
（5）将水提物配制成含活性组分0.40mg/ml±0.02mg/ml的水溶液。
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