CN111905018B - 毛刺花椒提取物的制备方法及其用途 - Google Patents
毛刺花椒提取物的制备方法及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供毛刺花椒提取物的制备方法及其用途,毛刺花椒提取物的用途,用于制备抗菌药物。本发明利用毛刺花椒树皮的甲醇总提取物、石油醚萃取物及正丁醇萃取物具有一定的抗假丝酵母菌活性,为进一步探索毛刺花椒中具有药效活性的物质基础,为合理开发利用这一植物资源提供依据,同时为制备抗菌药物提供一种新的来源。
Description
技术领域
本发明属于中草药技术领域,具体涉及一种毛刺花椒提取物的制备方法及其用途。
背景技术
假丝酵母菌属(Candida species)广泛存在于人体和环境中,是人体正常寄生的菌群之一,可定植于健康人体的皮肤、阴道、口腔及消化道等部位。当在人体免疫力正常时,假丝酵母菌定植在浅表皮肤和黏膜,不致病;在某些特定条件如应激、严重感染、大量使用激素或免疫抑制剂、艾滋病而导致免疫功能下降时,假丝酵母菌可侵袭人体,引起皮肤、黏膜甚至深部器官真菌感染。假丝酵母菌属是条件致病真菌中最常见者,居院内感染的首位。感染可能是表面的,影响皮肤、头发、指甲和粘膜,或全身性的,累及主要的身体器官。
与抗生素相比,抗真菌药物的发展相对有限。传统抗真菌药物主要包括唑类、多烯类及棘白菌素类抗真菌药。唑类抗真菌药物对假丝酵母菌为抑菌而非杀菌作用,临床中应用最为广泛,大量应用导致其耐药性的产生,目前唑类药物的耐药率也在逐年上升。多烯类抗真菌药以两性霉素B为代表,其抗菌机制是与真菌细胞膜上的麦角甾醇结合,使胞膜形成微孔,从而增加真菌细胞膜通透性,引起细胞内物质外渗,导致真菌死亡。目前临床中多烯类药物应用效果较好,但是考虑到长期使用会对机体造成肝、肾毒性,因此临床中不适用于长期使用。棘白菌素抗真菌药物主要包括卡泊芬净、米卡芬净等。其是通过非竞争性抑制β-1,3-D-葡萄糖合成酶,干扰真菌细胞壁β-1,3-D-葡萄糖的合成,造成真菌细胞壁渗透性改变,从而起到杀灭真菌的作用。总之,传统抗真菌药物种类少,长期使用多具有肝、肾毒性等副作用。目前临床上假丝酵母菌对三唑类、多烯类以及棘白菌素药物均呈现出不同程度的耐药,尤其唑类药物的耐药率更高、更普遍。另外如棘白菌素类等抗真菌药物价格较高,给临床中应用带来困难。抗真菌药物对人体的毒副作用导致对其的研发相对落后。
寻找和开发高效低毒的新型抗真菌药物成为近几年的研究热点。我国中草药历史发展悠久,有丰富的中草药资源,尤其云南省地处高原,植被丰富,已有大量文献报道中草药有抗真菌的作用,而且中草药价格低廉,较少出现耐药,因此有关中草药的研究前景广阔。迄今人们已发现了上百种中草药具有不同程度的抗真菌作用。卢祥婷等通过微量液基稀释法探究10种中药提取物对假丝酵母菌的抗菌作用,该研究发现三七总皂甙、人参茎叶皂甙、柠檬酸和麝香草酚对假丝酵母菌具有一定的抗菌活性。杨晓伟等研究发现蜂胶、狼毒、苦参、白鲜皮和土荆皮醇提取物对3种皮肤癣菌均有良好的抑菌作用。王柱华等研究表明黄连乙醇提取物对白假丝酵母菌有较强的抑制作用,且其MIC值为1mg/ml。
花椒属植物属芸香科灌木,全世界约有250种,分布于热带和亚热带地区。我国约有39种14变种。相关研究表明,花椒属植物中的生物碱类成分具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、抗病毒、抗血小板凝结、抗菌和抗氧化等活性。花椒属植物的化学成分主要包括挥发油、生物碱、酰、香豆素、木质素、脂肪酸等,其生理活性成分主要集中在挥发油、生物碱、酰胺这三类物质上。刺花椒是芸香科花椒属的一种常绿小乔木,分布于印度北部以及中国的云南和四川、缅甸、柬埔寨、越南、马来西亚等亚洲东南部。毛刺花椒,又名狗花椒,是芸香科花椒属植物刺花椒的变种,产广西西部、云南南部、四川西南部、西藏东南部。但目前国内外对毛刺花椒研究较少。
发明内容
针对上述技术问题,本发明提供一种毛刺花椒提取物的制备方法及其用途。
具体技术方案为:
毛刺花椒提取物的用途,用于制备抗菌药物。
所述的毛刺花椒提取物为毛刺花椒的甲醇总提取物、石油醚萃取物和正丁醇萃取物。
毛刺花椒提取物的制备方法,包括以下步骤:
将干燥、粉碎过的毛刺花椒树皮用体积浓度为90%的甲醇进行热回流提取3次,每次4小时,将提取液减压浓缩成甲醇浸膏,即为甲醇总提取物;
取适量甲醇总提取物用水搅拌混悬,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取;每种溶剂各萃取四次,减压回收溶剂后得到四部分萃取物,分别为石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和残留水相。
本发明利用毛刺花椒树皮的甲醇总提取物、石油醚萃取物及正丁醇萃取物具有一定的抗假丝酵母菌活性,为进一步探索毛刺花椒中具有药效活性的物质基础,为合理开发利用这一植物资源提供依据,同时为制备抗菌药物提供一种新的来源。
附图说明
图1为实施例的毛刺花椒提取物制备流程图;
图2为实施例的毛刺花椒正丁醇提取物抗假丝酵母菌的药敏实验结果图。
具体实施方式
结合实施例说明本发明的具体技术方案。
(1)毛刺花椒提取物的制备
如图1所示,将干燥、粉碎过的毛刺花椒树皮用90%的甲醇进行热回流提取三次,每次四小时,将提取液减压浓缩成甲醇浸膏M,取适量浸膏M(10kg)用水搅拌溶解,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取。每种溶剂各萃取四次,减压回收溶剂后得到四部分萃取物,分别为石油醚萃取物P(3.133kg)、乙酸乙酯萃取物E(2.63kg)、正丁醇萃取物B(2kg)和残留水相部分。将甲醇总提取物、石油醚萃取物和正丁醇萃取物进行体外抗假丝酵母菌的药敏实验,从中找到具有良好抗菌作用的提/萃取物(E之前通过预实验证明无抗菌活性)。
(2)抗真菌中药贮存液的制备:
①取毛刺花椒M、P及B先予二甲其亚砜溶解,再用液体培养基稀释,使药液浓度为此药物浓度为20000μg/ml(药液浓度为4倍终浓度)。DMSO的终浓度<1%,经对照试验,此浓度不能抑制真菌的生长。分装密封后存于-20℃温度,直至使用当日取出。
②氟康唑为水溶性,易溶于水,在无菌操作下用灭菌蒸馏水配制成浓度为5280μg/ml的药物贮存液,伊曲康唑、两性霉素B均为脂溶性,难溶于水,先用二甲基亚讽(DMSO)充分溶解后再加入灭菌蒸馏水稀释配制成浓度为1280μg/ml的药物贮存液(保证DMSO在最终检测的药物溶液中浓度不能超过1%,避免溶媒影响受试药物的抑菌作用)。分装于5ml离心管中(避免贮存液的反复冻融影响受试药物的抗菌效果),密封后-20℃低温保存备用。实验时将药液解冻后用RPMI-1640液体培养基倍比稀释。
(3)菌悬液的制备
实验菌株为光滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、热带假丝酵母菌及部分白假丝酵母菌,取实验菌株接种于沙氏培养基斜面上,连续传代培养2次以活化菌种,第二次传代后32℃培养5天后,使之处于指数生长期后期。用接种环(酒精灯外焰)灼烧后,取1-2个直径1mm的菌落,在1ml无菌生理盐水中制备菌悬液,振荡器上振荡15秒分散真菌菌块,用麦氏比浊管调整为0.5个麦氏单位(即1~5×106CFΜ/ml),血平板计数法验证CFΜ,加样时用RPMI-1640液体培养基将菌悬液浓度稀释1000倍,使其浓度为1~5×103CFΜ/ml。
(4)抗真菌中药浓度梯度
①将前述配制好的中药贮存液解冻后用RPMI-1640液体培养基在加样槽中进行稀释,用倍比稀释的方法在加样槽中把中药药液分别稀释质量浓度为10000μg/ml、5000μg/ml、2500μg/ml、1250μg/ml、625μg/ml、312.5μg/ml、156.25μg/ml、78.125μg/ml、39.063μg/ml、19.53μg/ml共10个浓度。
②将前述配制好的氟康唑、伊曲康唑及两性霉素B贮存液用RPMI-1640液体培养基在加样槽中进行稀释,其中氟康唑稀释为128μg/ml,伊曲康唑、两性霉素B稀释为32μg/ml。然后用倍比稀释的方法在加样槽中把药液分别稀释为10个浓度:128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml(氟康唑),32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml(伊曲康唑、两性霉素B)。
(5)加样
①96孔U型平底药敏板,1~10列每孔加入100μl已稀释好的药液,浓度由高至低,第11列为阳性对照,每空加入RPMI-1640液体培养基100μl,第12列为阴性对照,每孔加入200μl的RPMI-1640液体培养基。
②1~12列每孔加入100μl已制备好的2倍终浓度的菌悬液,使最终接种浓度为0.5~2.5×103CFΜ/ml。如此原第1~10列微孔中的相应的药液被稀释为9.8μg/ml-5000μg/ml。
③1~12列每孔加20μl的Alamar blue,并在每孔中加入1-2滴石蜡油封盖微孔。
④将96孔药敏板置于微量震荡板上震荡3分钟,使各液充分混合后,于35℃温箱中保持不摇动孵育,24小时后观察结果。
每株菌每次实验设2个复孔,上述实验重复操作三次,若准确重复或只差一个浓度梯度时方可,并以较高浓度作为最终MIC值。
(6)数据处理和统计学分析
(7)结果判读
最低抑菌浓度(minimal inhibitory Concentration,MIC值)判定:微孔内若有菌生长,则Alamar blue指示剂将从蓝色变为粉红色,生长抑制者保持蓝色,以微孔内指示剂的蓝色变为粉红色孔为判读终点,对应的最低药物浓度为最低抑菌浓度。观察结果时阴性对照孔需全部保持蓝色不变,阳性对照孔需全部变为红色,如图2。上述实验平行操作三次,当能准确重复或只差一个浓度梯度时才被接受,并以较高浓度作为MIC值。
(8)质控方法
本实施例采用光滑念珠菌ATCC 2001为质控菌株,每次试验的同时,以同样的方法进行质控菌的敏感性测定,每次结果显示其值总介于同一范围,且各药物每次测定的值波动不超过一个稀释度,方认为试验操作准确无误。见表1。
表1质量控制的参考菌株MIC
本发明的效果:
(1)毛刺花椒M(甲醇提取物)对假丝酵母菌的药敏结果
毛刺花椒M(甲醇提取物)对白假丝酵母菌的MIC值范围为312.5-1250μg/ml,对光滑假丝酵母菌的MIC值范围为1250-2500μg/ml,对克柔假丝酵母菌的MIC值范围为625-2500μg/ml,对热带假丝酵母菌的MIC值范围为625-1250μg/ml。详见表2。
表2毛刺花椒M对假丝酵母菌的药敏结果
(2)毛刺花椒P(石油醚提取物)对假丝酵母菌的药敏结果
毛刺花椒P(石油醚提取物)对白假丝酵母菌的MIC值范围为625-2500μg/ml,对光滑假丝酵母菌的MIC值范围为625-1250μg/ml,对克柔假丝酵母菌的MIC值范围为625-1250μg/ml,对热带假丝酵母菌的MIC值范围为625-1250μg/ml。详见表3。
表3毛刺花椒P对假丝酵母菌的药敏结果
(3)毛刺花椒B(正丁醇提取物)对假丝酵母菌的药敏结果
毛刺花椒B(正丁醇提取物)对白假丝酵母菌的MIC值范围为78-312.5μg/ml,对光滑假丝酵母菌的MIC值范围为156-312.5μg/ml,对克柔假丝酵母菌的MIC值范围为39-78μg/ml,对热带假丝酵母菌的MIC值范围为78-156μg/ml。详见表4。
表4毛刺花椒B对假丝酵母菌的药敏结果
实验的验证:
本实施例采用了NCCLS M27-A2方案的微量液基稀释法测定了3种毛刺花椒提取物对4种临床常见念珠菌的MIC值,并以光滑假丝酵母菌的标准株作为质控菌株。本实验中3次重复药敏测定结果波动范围均不超过1个药物质量浓度梯度,且标准株测定的MIC值均在的NCCLS M27-A2公布的标准范围内,以上证实了本次实验结果稳定、可靠。
(1)3种毛刺花椒提取物对白假丝酵母菌MIC值的分布
毛刺花椒提取物M(甲醇提取物)对白假丝酵母菌MIC值主要分布在625μg/ml,毛刺花椒提取物P(石油醚提取物)对白假丝酵母菌MIC值主要分布在1250μg/ml,毛刺花椒提取物B(正丁醇提取物)对白假丝酵母菌MIC值主要分布在78μg/ml,因此毛刺花椒提取物B对白假丝酵母菌MIC值最低。详见表5。
表5 3种毛刺花椒提取物对白假丝酵母菌MIC值的分布
(2)毛刺花椒3种提取物两两间抗真菌活性的比较
以所有实验菌株(白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌及热带假丝酵母菌)为一整体,进行3种毛刺花椒提取物两两间抗真菌活性的比较,各组间MIC值经配对t检验两两比较后,结果:毛刺花椒M(甲醇提取物)和毛刺花椒P(石油醚提取物)组间比较t=2.243,P=0.032(<0.05),差异有统计学差异(表3);毛刺花椒M(甲醇提取物)和毛刺花椒B(正丁醇提取物)组间比较t=8.262,P<0.001(<0.05),差异有统计学差异(表4);毛刺花椒P(石油醚提取物)和毛刺花椒B(正丁醇提取物)组间比较t=11.18,P<0.001(<0.05),差异有统计学差异(表5)。因此三种毛刺花椒提取物对假丝酵母菌的抗菌活性均不同,其中毛刺花椒B(正丁醇提取物)对假丝酵母菌的抗菌作用最强。详见表6-8。
表6毛刺花椒M和毛刺花椒P两组间MIC值的比较(μg/ml)
注:*P<0.05,差异有统计学意义
表7毛刺花椒M和毛刺花椒B两组间MIC值的比较(μg/ml)
注:*P<0.05,差异有统计学意义
表8毛刺花椒P和毛刺花椒B两组间MIC值的比较(μg/ml)
注:*P<0.05,差异有统计学意义
本实验结果表明,3种毛刺花椒提取物即毛刺花椒M(甲醇提取物)、毛刺花椒P(石油醚提取物)及毛刺花椒B(正丁醇提取物)对白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌及热带假丝酵母菌4种假丝酵母菌均有抗真菌作用,且毛刺花椒不同提取物抗真菌作用不同(P值均<0.05,差异有统计学意义),3种毛刺花椒提取物中毛刺花椒B的抗真菌作用最强。其中毛刺花椒B对白假丝酵母菌的MIC值范围为78-312.5μg/ml,对光滑假丝酵母菌的MIC值范围为156-312.5μg/ml,对克柔假丝酵母菌的MIC值范围为39-78μg/ml,对热带假丝酵母菌的MIC值范围为78-156μg/ml,毛刺花椒B有较强的抗真菌作用。
Claims (1)
1.毛刺花椒提取物的用途,其特征在于,用于制备抗菌药物;所述的毛刺花椒提取物为毛刺花椒树皮的甲醇总提取物、石油醚萃取物和正丁醇萃取物,所述的菌为假丝酵母菌;
所述的甲醇总提取物、石油醚萃取物和正丁醇萃取物的制备方法,包括以下步骤:
将干燥、粉碎过的毛刺花椒树皮用体积浓度为90%的甲醇进行热回流提取3次,每次4小时,将提取液减压浓缩成甲醇浸膏,即为甲醇总提取物;
取适量甲醇总提取物用水搅拌混悬,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取;每种溶剂各萃取四次,每次4小时,减压回收溶剂后得到四部分萃取物,分别为石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和残留水相。
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