CN103623105A - 花椒提取物在制备调节胆固醇代谢药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属制药领域，涉及花椒提取物在制备调节胆固醇代谢药物中的用途。具体涉及石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物在高胆固醇和炎症的状态下对胆固醇代谢的调节。体外实验证明在高胆固醇状态下，所述萃取物能降低总胆固醇的含量及载脂蛋白B的分泌，抑制细胞中胆固醇生物合成途径中相关基因和蛋白表达，提高细胞中胆固醇逆转运过程中的相关基因或蛋白表达；体内实验证明乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物具有抗炎活性，并通过影响肝X受体-α和ATP转运盒结合子1基因表达改善炎症诱导的肝脏内胆固醇的聚积；本发明进一步提供从正丁醇萃取物中分离到单体(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-葡萄糖苷及其调节胆固醇代谢的用途。

Description

花椒提取物在制备调节胆固醇代谢药物中的用途
技术领域
本发明属制药领域，涉及花椒醇提物的药物新用途。具体涉及花椒提取物在制备调节胆固醇代谢药物中的用途。
背景技术
据报道，生活的改善和城市化建设的推进在一定程度上导致了亚洲心血管疾病发展率增长迅速。研究显示，胆固醇过高往往会引起动脉粥样硬化，导致临床上产生冠心病、高血压，以后可发生心肌梗死、脑卒中等致命疾患。随着研究的深入，炎症在动脉粥样硬化发病过程中的作用也被发现和阐明，研究认为感染和炎症都会引起脂质和脂蛋白代谢的紊乱，因此，研制既具有抗炎活性又具有改善胆固醇代谢的药物将可能有效的预防动脉粥样硬化疾病的发生、发展。
花椒属于芸香科植物，在《药性论》和《别录》两部经典著作中有花椒破血、去老血通血脉的记载，现代药理研究发现其具有较强的抗氧化、抗炎的作用，酰胺类和黄酮类物质在体外也有抗血小板凝聚、抗脂质过氧化损伤的作用，也有研究报道花椒挥发油能改善豚鼠肝脏胆固醇和脂蛋白代谢，但其它部位是否对胆固醇代谢调节有改善作用尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供花椒醇提物的药物新用途。具体涉及花椒提取物在制备调节胆固醇代谢药物中的用途。尤其是花椒提取物在改善高胆固醇和炎症导致的胆固醇代谢紊乱中的用途。
本发明的花椒醇提取物包括石油醚萃取部位（PE）、乙酸乙酯萃取部位（EtOAc）和正丁醇萃取部位（BuOH）三个不同极性的部位，即：石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。
本发明所述的有效部位分别通过下述石油醚萃、乙酸乙酯萃取或正丁醇萃取制得：取大红袍花椒果实（购自四川省汉源市），投入加热提取罐，加入3倍体积的95%乙醇，50℃加热30分钟，使其可溶性成分溶解于提取罐内的乙醇中；然后将提取液经抽滤管抽入浓缩罐，60℃，真空度-0.05到-0.08MPA，二次蒸汽变成的冷凝液回流至提取罐，作为新溶剂回流提取，至浓缩成需要的比重药膏；提取罐内的乙醇可反复回流提取浓缩三次，最后得粗提物浸膏；将粗提物浸膏加入水使其悬浮，加入石油醚萃取5次，减压浓缩，得到石油醚部位（PE）；萃余物加入乙酸乙酯萃取4次，减压浓缩，得到乙酸乙酯部（EtOAc）；萃余的部分再加入正丁醇萃取4次，减压浓缩，得到正丁醇部位（BuOH）。
本发明对所述的花椒提取物进行了体内、外的试验，包括石油醚萃取部位（PE）、乙酸乙酯萃取部位（EtOAc）和正丁醇萃取部位（BuOH）在高胆固醇状态下和炎症状态下对胆固醇代谢的调节：
通过胆固醇+25-羟胆固醇诱导的HepG2细胞高胆固醇模型，观察了花椒的三种萃取物对所述模型的总胆固醇的影响，并检测了培养上清中的载脂蛋白B水平；以及甾醇调控元件结合蛋白-2、羟甲基戊二酰辅酶A、胆固醇27α羟化酶和ATP转运盒结合子1的mRNA表达；胆固醇酰基转移酶和低密度脂蛋白受体的蛋白水平。结果显示，其中，花椒石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物能降低HepG2细胞内总胆固醇内含量以及培养上清中的载脂蛋白B水平，抑制胆固醇酰基转移酶、甾醇调控元件结合蛋白-1和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的表达；提高低密度脂蛋白受体、ATP转运盒结合子1和胆固醇27α羟化酶的水平；
通过脂多糖（LPS）诱导的C57BL\6小鼠炎症模型，研究了花椒石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对所述模型血清中肿瘤坏死因子-α的影响，结果显示，其中的乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物能降低血清和肝脏中肿瘤坏死因子-α的水平，以及肝脏中白介素-6、环氧合酶-2和诱导型一氧化氮合酶的水平，并通过激活肝X受体-α和ATP转运盒结合子1的mRNA表达从而改善炎症引起的肝脏胆固醇聚积；经药理活性的试验，结果显示，其中的正丁醇萃取部位活性最佳；
进一步，本发明通过活性追踪及分离纯化，将花椒正丁醇萃取物进行硅胶柱色谱分离，以丙酮和甲醇(50:1到0:1)梯度洗脱，得到19个组分，第17组分经LH-20凝胶柱色谱，氯仿：甲醇（1：1）洗脱，得到17-1到17-5组分，第17-2组分经硅胶柱色谱分离，然后经HPLC半制备柱纯化，（甲醇/水20：80，3ml/min，tR=6min）得到式（Ⅰ）化合物(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-葡萄糖苷，并经氢谱和质谱数据与文献对比确认。
Figure BDA00002057451800031
实验结果证实，所述的花椒萃取物对胆固醇诱导的HepG2细胞内胆固醇代谢紊乱具有明显的保护作用；所述的花椒萃取物对炎症诱导的C57BL\6小鼠肝脏胆固醇代谢紊乱具有明显的保护作用；本发明的花椒提取物能改善高胆固醇和炎症导致的胆固醇代谢紊乱，其中有效部位可作为药物有效成分制备改善高胆固醇和炎症导致的胆固醇代谢紊乱的药物，尤其是从正丁醇萃取物中得到化合物(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-葡萄糖苷可制备改善高胆固醇和炎症导致的胆固醇代谢紊乱的药物。
附图说明
图1花椒提取物对DPPH的清除率
其中，数据以means±SD表示，PE：石油醚萃取物；EtOAc：乙酸乙酯萃取物；BuOH：正丁醇萃取物；BHA：丁基羟基茴香醚。
图2花椒提取物降低HepG2细胞内总胆固醇含量
其中，数据以means±SD表示，sim：辛伐他汀；ctrl：对照组；cho：胆固醇；25-OH cho：25-羟胆固醇；＊P＜0.05，＊＊P＜0.01：给药组vs对照组；##P＜0.01：正常细胞vs胆固醇+25-羟胆固醇刺激细胞。
图3花椒提取物降低细胞培养上清中载脂蛋白B的水平
其中，数据以means±SD表示，ApoB：载脂蛋白B；＊P＜0.05，＊＊P＜0.01：给药组vs对照组；##P＜0.01：正常细胞vs胆固醇+25-羟胆固醇刺激细胞。
图4花椒提取物抑制HepG2细胞中甾醇调控元件结合蛋白-2、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶及胆固醇酰基转移酶的表达
其中，数据以means±SD表示，SREBP-2：甾醇调控元件结合蛋白-2，HMGCR：羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，ACAT：胆固醇酰基转移酶；＊P<0.05，＊＊P＜0.01：给药组vs对照组；#P<0.05，##P＜0.01：正常细胞vs胆固醇+25-羟胆固醇刺激细胞；A：甾醇调控元件结合蛋白-2；B：羟甲基戊二酰辅酶A还原酶；C：胆固醇酰基转移酶。
图5花椒提取物提高HepG2细胞中胆固醇27α羟化酶、ATP转运盒结合子1及低密度脂蛋白受体的表达
数据以means±SD表示，CYP27A1：胆固醇27α羟化酶＊P<0.05，ABCA1：ATP转运盒结合子1；LDLR：低密度脂蛋白受体；＊＊P＜0.01：给药组vs对照组；#P<0.05，##P＜0.01：正常细胞vs胆固醇+25-羟胆固醇刺激细胞；A：胆固醇27α羟化酶；B：ATP转运盒结合子1；C：低密度脂蛋白受体。
图6花椒提取物抑制脂多糖诱导的C57BL\6小鼠肝脏炎症细胞因子的转录
数据以means±SD表示，TNF-α：肝脏肿瘤坏死因子-α，IL-6：白介素-6；iNOS：诱导型一氧化氮合酶，COX-2：环氧合酶-2；＊P<0.05，＊＊P＜0.01：给药组vs模型组。#P<0.05，##P＜0.01：模型组vs对照组；数据以means±SD表示，＊P<0.05，＊＊P＜0.01：给药组vs模型组；#P<0.05，##P＜0.01：模型组vs对照组；A：肝脏肿瘤坏死因子-α；B：肝脏白介素-6；C：肝脏诱导型一氧化氮合酶；D：肝脏环氧合酶-2；E：血清肿瘤坏死因子-α。
图7花椒提取物改善脂多糖诱导的C57BL\6小鼠肝脏胆固醇积聚以及促进胆固醇外流基因的表达
数据以means±SD表示，LXR：肝X受体；＊P<0.05，＊＊P＜0.01：给药组vs模型组；#P<0.05，##P＜0.01：模型组vs对照组；A：肝脏总胆固醇；B：肝X受体；C：肝ATP转运盒结合子1。
具体实施方式
实施例1  制备花椒有效部位
大红袍花椒果实（购自四川省汉源市）15kg，投入加热提取浓缩机组的提取罐内，每次投3kg，加入3倍体积的95％乙醇，开启提取罐加热系统，50℃加热30分钟，使其可溶性成分溶解于提取罐内的乙醇中；然后将提取液经抽滤管抽入浓缩罐，开启浓缩罐系统与加热系统，使浓缩汁温度保持在60℃左右，真空度保持在-0.05到-0.08MPA，浓缩时产生的二次蒸汽经过冷凝器与冷却器，变成冷凝液回流至提取罐，作为新溶剂加入药里，新溶剂由上而下通过药材层到提取罐底部，形成新溶剂回流提取，直至浓缩成需要的比重药膏。提取罐内的乙醇可下次复用。每批反复回流提取浓缩三次，最后得粗提物浸膏5kg。将粗提物浸膏加入水使其悬浮，加入石油醚萃取5次，减压浓缩，得到石油醚部位400g（PE）。萃余物加入乙酸乙酯萃取4次，减压浓缩，得到乙酸乙酯部2.5kg（EtOAc）。萃余的部分再加入正丁醇萃取4次，减压浓缩，得到正丁醇部位1.8kg（BuOH）。
实施例2  花椒提取物对体外HepG2细胞胆固醇代谢的影响
分组：HepG2细胞复苏后，用含10％ FBS的DMEM（高糖）培养液转入培养皿中，在37℃、5％ CO2条件下培养，细胞同步化6-12h，随机分成6组，即：①正常对照组；②模型组：胆固醇10ug/mL+25-羟胆固醇1ug/mL；③阳性对照组：辛伐他汀0.2ug/ml；④石油醚萃取物组0.05mg/ml；⑤乙酸乙酯萃取物组0.05mg/ml；⑥正丁醇萃取物组0.05mg/ml；另外每组设未加胆固醇和25-羟胆固醇处理的自身对照。给药：换无血清培养基同步化12h后，正常对照组和模型组加入无水乙醇5ul，给药组分别预给药12h，然后模型组、阳性对照组和给药组加入或不加入胆固醇10ug/mL+25-羟胆固醇1ug/mL，作用24h后，吸去培养基，停止刺激，进行相关检测。测定的相关指标：细胞总胆固醇含量，细胞上清载脂蛋白B水平，甾醇调控元件结合蛋白-2、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、胆固醇27A羟化酶和ATP转运盒结合子1的mRNA表达，以及胆固醇酰基转移酶和低密度脂蛋白受体的蛋白表达。实验数据进行单因素方差分析，p＜0.05，结果显示花椒各萃取物能降低细胞内总胆固醇含量和培养上清载脂蛋白B水平，抑制甾醇调控元件结合蛋白-2、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶和胆固醇酰基转移酶的mRNA或蛋白水平，激活胆固醇27α羟化酶、ATP转运盒结合子1和低密度脂蛋白受体的mRNA或蛋白表达。
实验结果证明，所述的花椒萃取物对胆固醇诱导的HepG2细胞内胆固醇代谢紊乱具有明显的保护作用。
实施例3  花椒提取物对C57BL\6小鼠胆固醇代谢的影响
分组：36只C57BL\6小鼠随机分为6组：①正常对照组（n=6），②模型组（n=6）；③阳性药组（地塞米松，5mg/kg，n=6）；④石油醚萃取物组（400mg/kg，n=6）；⑤乙酸乙酯萃取物组（400mg/kg，n=6）；⑥正丁醇萃取物组（400mg/kg，n=6）。给药：花椒提取物用50%大豆油溶解，混匀，制成乳浊液，每天灌胃给药一次，模型组和正常对照组小鼠按同等体积灌胃50%大豆油乳浊液。7天之后，阳性药组腹腔注射地塞米松5mg/kg，2h之后，除正常对照小鼠外，所有组小鼠均腹腔注射LPS 0.2mg/kg。2h后，摘眼球取血，血液样品以3000g，4℃，离心6min，收集血浆样品以检测相关血浆指标。迅速分离肝脏、心脏、肾脏、脾脏、肺，立即放入-80℃保存。测定的相关指标：血清中肿瘤坏死因子-α水平，肝脏中总胆固醇含量，肝脏中的炎症因子肿瘤坏死因子-α、白介素-6、诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶-2的mRNA表达，肝脏中胆固醇外流调控基因肝X受体-α和ATP转运盒结合子1水平。实验数据进行单因素方差分析，p＜0.05，结果显示花椒乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物能降低血清肿瘤坏死因子-α水平，并能抑制肝脏中炎症因子肿瘤坏死因子-α、白介素-6、诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶-2的mRNA表达，此外，正丁醇萃取物能降低肝脏中总胆固醇的含量，并能激活肝X受体-α和ATP转运盒结合子1的基因表达。
实验结果证明，所述的花椒萃取物对炎症诱导的C57BL\6小鼠肝脏胆固醇代谢紊乱具有明显的保护作用。
实施例4  制备化合物(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-葡萄糖苷
将花椒正丁醇萃取物50mg进行硅胶柱色谱分离，以丙酮和甲醇50:1到0:1梯度洗脱，得到19个组分(B1-B19)，第17组分经LH-20凝胶柱色谱，氯仿：甲醇（1：1）洗脱，得到17-1到17-5组分，第17-2组分经硅胶柱色谱分离，然后经HPLC半制备柱纯化，（甲醇/水 20：80，3ml/min，tR=6min）得到式（Ⅰ）化合物(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-葡萄糖苷3mg。
Figure BDA00002057451800061

Claims (8)

1.花椒提取物在制备调节胆固醇代谢药物中的用途，所述的花椒提取物包括石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物以及单体(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-葡萄糖苷。
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，其中的花椒提取物用于改善HepG2细胞和C57BL小鼠在高胆固醇和炎症状态下胆固醇的代谢。
3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，其中的花椒提取物用于降低正常HepG2细胞和高胆固醇状态下HepG2细胞内总胆固醇的含量，抑制其载脂蛋白B的分泌。
4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，其中的花椒提取物通过抑制胆固醇酰基转移酶、甾醇调控元件结合蛋白-2和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的mRNA表达抑制胆固醇的生物合成。
5.按权利要求1所述的用途，其特征在于，其中的花椒提取物通过升高胆固醇27α羟化酶、ATP转运盒结合子1和低密度脂蛋白受体的表达增加胆固醇的逆转运。
6.按权利要求1所述的用途，其特征在于，其中的花椒提取物通过抑制小鼠肝脏中炎症相关的蛋白和基因表达发挥抗炎作用。
7.按权利要求1所述的用途，其特征在于，其中的花椒提取物通过激活小鼠肝脏中的肝X受体-α和ATP转运盒结合子1的基因表达改善炎症导致的小鼠肝脏内胆固醇聚积。
8.式（Ⅰ）化合物(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-葡萄糖苷在制备调节胆固醇代谢药物中的用途，
Figure FDA00002057451700021
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