CN109700858B

CN109700858B - 红三七在制备抗真菌药物及其增效剂中的应用

Info

Publication number: CN109700858B
Application number: CN201910188992.8A
Authority: CN
Inventors: 刘伟; 杨曼曼; 孙宝政; 王胜正; 张子悦
Original assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Current assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Priority date: 2019-03-13
Filing date: 2019-03-13
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2039-03-13
Also published as: CN109700858A

Abstract

本发明公开的红三七用于制备抗真菌药物及其增效剂的用途，属于医药技术领域。体外细胞实验表明，红三七对红三七对耐药白色念珠菌103、敏感白色念珠菌SC5314、新生隐球菌32609、天然耐药克柔念珠菌ATCC2340、近平滑念珠菌22019、天然耐药光滑念珠菌ATCC2281、耐药热带念珠菌具有不同程度的抗真菌甚至是杀真菌作用，因此可将红三七用作抗真菌药物及其增效剂。本发明为红三七开辟了新的用途，将其用于制备抗真菌药物，为真菌感染治疗提供了新的候选药物。

Description

红三七在制备抗真菌药物及其增效剂中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及红三七在制备抗真菌药物及其增效剂中的应用。

背景技术

红三七属于秦岭七药的一种，此药为蓼科植物支柱蓼Polygonumsuffultum Maxim的根茎。因其根茎结节状，形如算盘，故名“算盘七”。该药可收敛止血、止痛生肌，主治跌打损伤、外伤出血、便血、崩漏、痢疾、脱肛，亦可治疗吐血、血崩、痨伤淤血、红白痢、慢性咽炎、劳伤、白带等。

但是目前，国内外未见红三七抗真菌作用和其增效作用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供红三七在制备抗真菌药物及其增效剂中的应用。

本发明公开了红三七在制备抗真菌药物中的应用。

优选的，选用红三七的干燥根及根茎作为制备抗真菌药物的原料。

优选的，所述真菌包括敏感真菌菌株和耐药真菌菌株。

进一步的，所述敏感真菌菌株包括：敏感白色念珠菌SC5314、近平滑念珠菌22019和新生隐球菌32609；所述耐药真菌菌株包括：耐药白色念珠菌103、耐药热带念珠菌、天然耐药克柔念珠菌ATCC2340和天然耐药光滑念珠菌ATCC2281。

本发明还公开了红三七在制备抗真菌药物增效剂中的应用。

优选的，抗真菌药物为氟康唑。

本发明还公开一种抗真菌药物，由红三七醇提物与药用辅料制成，剂型为片剂、胶囊剂或注射剂。

优选的，红三七醇提物的制备方法如下：

将红三七干燥根及根茎粉碎成粉末，用乙醇溶液冷凝回流提取，放冷、过滤除去残渣，将药液浓缩干燥制得。

优选的，所述的药用辅料包括稳定剂、增溶剂、润滑剂和崩解剂中的一种或几种。

本发明还公开了一种抗真菌药物组合物，包括红三七醇提物和氟康唑。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开的红三七用于制备抗真菌药物及其增效剂的用途，通过体外细胞实验表明，红三七对耐药白色念珠菌103、敏感白色念珠菌SC5314、新生隐球菌32609、天然耐药克柔念珠菌ATCC2340、近平滑念珠菌22019、天然耐药光滑念珠菌ATCC2281、耐药热带念珠菌具有不同程度的抗真菌作用，且与抗真菌药物合用能明显降低药物浓度，表现协同抗真菌作用，因此可将红三七用作抗真菌药物及其增效剂，为红三七开辟了新的用途，将其用于制备抗真菌药物，为真菌感染治疗提供了新的候选药物。目前临床上抗真菌谱广且具有杀真菌活性的药物非常少，在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，红三七的抗真菌谱广且杀真菌活性的特点，为临床高效治疗真菌甚至是耐药真菌的感染，提供新的治疗途径。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

一、材料准备

1、试药

红三七：购于德尔康医药连锁(槐芽第四连锁店)。

氟康唑(FLC)：sigma公司，批号036M4709V。

二甲亚砜：天津市天力化学试剂有限公司。

各试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学检验。

2、菌株

使用的菌株，包括：

1)敏感菌株：敏感白色念珠菌SC5314、近平滑念珠菌22019和新生隐球菌32609；

2)耐药菌株：耐药白色念珠菌103、耐药热带念珠菌、天然耐药克柔念珠菌ATCC2340和天然耐药光滑念珠菌ATCC2281。

以上均由上海长海医院真菌室提供，分别采自长海医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。

所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)划板活化，白念珠菌、热带念珠菌、新生隐球菌等球状菌于30℃培养2-3天后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。

3、培养液/基

1)RPMI 1640液体培养液

RPMI1640(Gibco BRL)10g，NaHCO₃ 2.0g，吗啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g(0.165mol)，加三蒸水900mL溶解，1mol/L NaOH调pH至7.0(25℃)，三蒸水定容至1000mL，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。

2)沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(SDA)

蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900mL溶解，加入2mg/mL氯霉素水溶液50mL，调整pH至7.0，以三蒸水定容至1000mL，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。

3)YEPD培养液

酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900mL溶解，加入2mg/mL氯霉素水溶液50mL，三蒸水定容至1000mL，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。

4、仪器设备

隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；

THZ－82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；

SW-CT-IF型超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

5、红三七和氟康唑贮备液

将购买的红三七，粉碎成细粉末，称取5g，用20倍体积(100mL)75％的乙醇，冷凝回流提取2小时，放冷，过滤除去残渣，将药液旋转浓缩至干燥，取15mLDMSO溶解完全，配制母液浓度为0.333g/mL，分装，-20℃保存待用。

将市售的氟康唑用DMSO溶解，配成浓度为6.4mg/mL，于-20℃保存备用。

6、菌液制备

实验前，用接种圈从4℃保存的SDA培养基上分别挑取各球状真菌少量，分别接种至1mL YEPD培养液，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。然后将各菌液分别加至1mLYEPD培养液中，用上述方法再次活化，培养16h，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液分别调整各菌液浓度至1×10³～5×10³CFU/mL。

二、红三七单独使用对不同真菌的作用

1、药敏板制备：

各菌株分别取无菌96孔板一块，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μL作空白对照；3～12号孔各加上述新鲜配制的菌液100μL；2号孔加菌液198μL；12号孔不含药物，只加菌液100μL作阳性生长对照。在每排的2～11号孔各加母液浓度为0.3333g/mL的红三七2μL。

对2～11号孔进行10级倍比稀释，使各孔的最终红三七药物浓度分别为3330μg/mL、1665μg/mL、832.5μg/mL、416.3μg/mL、208.1μg/mL、104.1μg/mL、52.0μg/mL、26.0μg/mL、13.0μg/mL和6.5μg/mL。各孔中DMSO含量均低于1％。将各药敏板于30℃恒温箱培养。

2、MIC值判定：

在30℃恒温箱中，菌液培养24h，观察实验结果，并确定其MIC值。观察结束后，放回恒温培养箱中继续培养，菌液培养48h时再次观察实验结果并确定其MIC值。当药物的MIC值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC值高于最高浓度3330μg/mL时，计为“>3330μg/mL”；MIC值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤6.5μg/mL”。上述实验均平行操作3次，当MIC值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC值；当MIC值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。

实验结果如下表1所示：

表1红三七单独使用对各种真菌的MIC值(μg/mL)

从表1可以看出，红三七单独作用各种真菌24h后，对天然耐药克柔念珠菌ATCC2340、天然耐药光滑念珠菌ATCC2281、新生隐球菌32609和耐药热带念珠菌的MIC值分别6.5μg/mL、6.5μg/mL、13.0μg/mL和832.5μg/mL，药物作用48h后，对天然耐药克柔念珠菌ATCC2340、天然耐药光滑念珠菌ATCC2281、新生隐球菌32609和耐药热带念珠菌的MIC值分别为26μg/mL、104.1μg/mL、26.0μg/mL和1665.0μg/mL，这显示了红三七具有抗真菌作用。

三、红三七与氟康唑合用对各菌的作用

1、药敏板制备：

取无菌96孔板七块，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μL作空白对照；3～12号孔各加上述新鲜配制的各菌菌液(1×10³～5×10³CFU/mL)100μL；2号孔加菌液198μL；12号孔不含药物，只加菌液100μL作阳性生长对照。对2～11号孔加药，使2～11号孔最终氟康唑药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/mL，红三七合用的药物浓度分别为832、416、208、104、52μg/mL，单用的药物浓度分别为3330、1665、832.5、416.3、208.1、104.1、52.0、26.0、13.0、和6.5μg/mL。各孔中DMSO含量均低于1％。将96孔板于30℃恒温箱培养。

2、MIC值判定：

在30℃恒温箱中，各菌培养24h，观察实验结果，并确定MIC值。当药物的MIC值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC值高于最高浓度64μg/mL时，计为“>64μg/mL”；MIC值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125μg/mL”。上述实验均平行操作3次，当MIC值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC值；当MIC值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。

实验结果见下表2：

表2红三七与氟康唑联合对各真菌的MIC值(μg/mL)

注：FIC index for combination意思是组合指数，Mode of Interaction意思是相互作用模式。

由表2可见，红三七与抗真菌药物氟康唑联合使用对部分菌具有抗菌增效作用。氟康唑单用对耐药白色念珠菌103、敏感白色念珠菌SC5314、耐药热带念珠菌的MIC值均为>64μg/mL，红三七MIC值均为832.5μg/mL。两药合用后，氟康唑的MIC值分别下降到0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.5μg/mL，红三七下降至52μg/mL，显示了红三七对氟康唑的增效作用。氟康唑单用对近平滑念珠菌22019的MIC值为4μg/mL，红三七MIC值为832.5μg/mL。两药合用后，氟康唑的MIC值下降至2μg/mL，红三七下降至52μg/mL，显示了红三七和氟康唑的相加作用。

综上所述，本发明通过体外实验表明，红三七对真菌有较好的抑制效果，并能使抗真菌药物氟康唑恢复对耐药真菌的作用，因此红三七可用作抗真菌药物及抗真菌药物的增效剂。本发明为红三七开辟了新的用途，将其用于抗真菌药物及抗真菌药物的增效剂，不仅为真菌治疗提供了新的候选药物，而且提高了现有药物的抗真菌作用，在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，降低了抗真菌药物的用药剂量，从而为患者节省了医疗费用，减少药物的毒副作用。

Claims

1.红三七在制备抗真菌药物增效剂中的应用，其特征在于，所述抗真菌药物为氟康唑；所述真菌为耐药白色念珠菌103、敏感白色念珠菌SC5314或耐药热带念珠菌。

2.一种抗真菌药物组合物，其特征在于，包括红三七醇提物和氟康唑；所述真菌为耐药白色念珠菌103、敏感白色念珠菌SC5314或耐药热带念珠菌。