CN100540013C

CN100540013C - 地锦草有效部位及其有效成分在制备抗真菌作用的药物的用途

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Publication number: CN100540013C
Application number: CNB2006101008171A
Authority: CN
Inventors: 斯拉甫·艾白; 古力娜·达吾提; 努尔买买提·艾买提; 艾则孜·亚森
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-06-27
Filing date: 2006-06-27
Publication date: 2009-09-16
Anticipated expiration: 2026-06-27
Also published as: CN1895331A

Abstract

本发明涉及一种地锦草有效部位及其有效成分作为制备抗真菌作用的药物的用途，采用常规的水提法或醇提法或大孔树脂提取或有机溶剂提取得到地锦草有效部位及有效成分。使用地锦草提取物(有效部位及其有效成分)治疗的41例浅表真菌病患者的临床观察结果表明，该制剂显著改善浅表真菌病患者的临床症状和体征，临床总有效率为97.92%，痊愈率为85.92%，有效率为12.0%，无效为2.25%，无明显毒副作用，是治疗浅表真菌病的佳药。

Description

地锦草有效部位及其有效成分在制备抗真菌作用的药物的用途

技术领域

本发明涉及一种地锦草有效部位及其有效成分的药物应用，尤其是抗真菌作用的药物的用途。

背景技术

地锦草为大戟科植物地锦EuphorbiahumifusaWilld.或斑地锦EuphorbiamaculataL.的干燥全草。具有清热解毒、凉血止血之功能，目前临床上多用于治疗菌痢、肠炎、病毒性肝炎、咳血、尿血、便血等。但有关地锦草的有效部位及其有效成分作为制备抗真菌作用的药物用途尚未见报道。

近年来，浅部真菌病的发病率持续性增加，尤其是在边缘地区发病率高，其致病菌种类很多，主要为红色毛癣菌、石膏样毛癣菌等。尽管目前抗真菌新药(内服、外用)较多，但由于浅部真菌对皮肤的高亲和力及耐药菌株的不断出现等因素，浅部真菌仍然是一种顽固难治，易于复发的皮肤病。

据资料显示，在中国真菌病的发病率达78％。真菌病分为浅部真菌病和深部真菌病两大类，浅部真菌感染又称为皮肤癣菌病，是一组常见病和多发病，是一种顽固难治、重新感染率较高的慢性皮肤病，占真菌病总发病率的90％以上。在皮肤浅部真菌感染所引起的癣病中，以足癣的患病率最高，是手癣的10倍，约占癣病的50-60％，给广大患者造成不少的痛苦。临床常用的抗真菌药物以咪唑类为主，包括益康唑、咪康唑、克霉唑及酮康唑等。此外尚有中药治疗，但是未达到预期目的。

本发明在地锦草临床上治疗浅部真菌病有效性的基础上，对地锦草进行了较系统的研究：(1)研制地锦草口服和外用制剂，临床上用于治疗头癣、体癣、足癣、花斑癣等疾病。用地锦草提取物治疗的41例浅表真菌病患者的临床观察结果表明，该药显著改善浅表真菌病患者的临床症状和体征，临床总有效率为97.92％、痊愈率为85.92％，并无明显毒副作用。(2)着眼于地锦草临床有效性，研究地锦草及其有效部位的物质基础，试验结果表明，水煎提取物对大肠杆菌078:K80，沙门氏菌C79-1，金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度分别为10，10，12.5g/L；地锦草提取物对皮肤癣菌的MIC₉₅值为2048ug/ml，对白色念珠菌MIC₉₅值为16384ug/ml。地锦草总黄酮对石膏样毛癣菌MIC₉₀值为139.49ug/ml，对红色毛癣菌MIC₉₀值为110.08ug/ml，对絮状表皮癣菌MIC₉₀值为313.35ug/ml，对石膏样小孢子菌MIC₉₀值为429.54ug/ml。说明地锦草总黄酮的抗真菌作用比地锦草取物更明显。这对地锦草有效部位群总黄酮等制成的抗真菌新药的研究奠定了重要的工作基础。(3)地锦草总黄酮为考察指标，采用正交试验溶剂提取法、大孔树脂法、微波协助萃取法，对提取工艺进行了筛选试验，结果通过大孔树脂富集，在洗脱液干燥后的总固体物中地锦草总黄酮含量大于16％，高于醇提干浸膏的含量(7.61％)，且洗脱率大于93％，这说明采用此法可较好的富集地锦草总黄酮。

地锦草的提取方法很多，采用水提或醇提或大孔树脂提取或有机溶剂提取等常规提取方法即可得到地锦草有效部位群，包括黄酮类、鞣质、有机酸、甾醇、萜和单宁类、香豆素、酚酸及脂溶性成分等，以及有效成分包括鞣花酸、短叶苏木酚、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷、β-谷甾醇、没食子酸、槲皮素、山奈酚，槲皮素-3-O-(2″，3″-二-O-没食子酰)-β-D-吡喃葡萄糖苷、锦草素E(eumaculinE)、eumaculinB、eumaculinD。

发明内容

本发明目的在于，提供一种地锦草有效部位及其有效成分作为制备抗真菌作用的药物的用途。采用常规的水提法或醇提法或大孔树脂提取或有机溶剂提取方法得到地锦草有效部位群，包括黄酮类、鞣质、有机酸、甾醇、萜和单宁类、香豆素、酚酸及脂溶性成分等，以及有效成分包括鞣花酸、短叶苏木酚、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷、β-谷甾醇、没食子酸、槲皮素、山奈酚，槲皮素-3-O-(2″，3″-二-O-没食子酰)-β-D-吡喃葡萄糖苷、锦草素E(eumaculinE)、eumaculinB、eumaculinD等。

按常规方法将提取的地锦草有效部位和地锦草有效成分混合或分别制成口服和外用制剂。该制剂用于治疗真菌病。

地锦草有效部位群抗真菌新药拟利用自然界丰富地锦草药材资源，研制抗真菌维吾尔医药制剂及新药。是从地锦草药材中提取的有效部位群一地锦草总黄酮制成的制剂，临床上用于治疗头癣、体癣、足癣、花斑癣等疾病，临床疗效显著。该制剂将作为治疗浅部真菌感染病的有效药物推广使用，给数万名患者解除病痛，给浅部真菌感染患者带来福音。

具体实施方式

实施例

地锦草有效部位及其有效成分作为制备抗真菌作用的药物的用途，采用常规的水提法或醇提法或大孔树脂提取或有机溶剂提取方法得到地锦草有效部位群，包括黄酮类、鞣质、有机酸、甾醇、萜和单宁类、香豆素、酚酸及脂溶性成分等，以及有效成分包括鞣花酸、短叶苏木酚、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷、β-谷甾醇、没食子酸、槲皮素、山奈酚，槲皮素-3-O-(2″，3″-二-O-没食子酰)-β-D-吡喃葡萄糖苷、锦草素E(eumaculinE)、eumaculinB、eumaculinD等。

按常规方法将提取的地锦草有效部位和地锦草有效成分混合或分别制成口服和外用制剂。

地锦草提取物(有效部位及其有效成分)抗真菌试验：

一、地锦草提取物(有效部位及其有效成分)体外抗真菌作用研究

摘要目的：对地锦草提取物进行体外抗真菌实验，测定其最小抑菌浓度(MIC)值。方法：采用NCCLS《产孢丝状真菌的液基稀释抗真菌药敏试验参考方案》(M-38P)方案测定30株临床常见皮肤癣菌的MIC值。结果：地锦草提取物对真菌中不同菌种的MIC₉₀值范围为110～429ug/ml。结论：地锦草有效部位具有显著的抗真菌作用。

关键词：地锦草提取物；体外抗真菌活性；最低抑菌浓度；

本发明通过对地锦草提取物进行临床常见皮肤癣菌红色毛癣菌、石膏样毛癣菌、石膏样小孢子菌、絮状表皮癣菌的最低抑菌浓度(MIC)，了解并比较其体外抗菌效果。

1.实验仪器与材料

1.1实验仪器：Gilson微量移液器(法国)；OLYMPUS BH2显微镜；LMQ.R-3260B型立式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)；电热恒温培养箱：HH-B11两台；生物安全柜HEAL FORCEHFSafe760S(上海力申科学仪器有限公司)。

1.2实验材料：地锦草有效部位(XTR)由自治区维吾尔医研究所药剂室提供。二甲基亚砜(DMSO)(天津化学试剂有限公司生产)。特比萘芬(TBF)由诺化公司提供。

1.3实验菌种：菌种来源：本实验所采用的菌株均来自新疆医科大一附院真菌中心菌种保藏库(XYZ)。菌种活化：将来自菌种保藏库的菌株挑取直径约为3mm菌丝体内以点接种法接种于新制备的沙保培养基(SDA)试管斜面中央，26℃培养7-14天后进行药敏实验。实验所用菌株：红色毛癣菌(T.rubrum)11株；石膏样毛癣菌(T.mentogrophytes)11株；石膏样小孢子菌(M.gypseum)5株；絮状表皮癣菌(E.floccosum)3株。均由新疆医科大一附院真菌中心菌种保藏库(XYZ)提供。

1.4培养基：沙保培养基(SDA)；RPMI-1640液基。

2.实验方法

根据NCCLS《产孢丝状真菌的液基稀释抗真菌药敏试验参考方案》(M-38P)方案测定雅丽蔓提取物对临床常见皮肤癣菌(30株)的最低抑菌浓度(MIC)。

2.1抗真菌药物稀释液的制备：将地锦草提取物储备液、TBF储备液分别用RPMI-1640液基倍比稀释：地锦草提取物的实验浓度由高向低依次为：1024ug/ml、512ug/ml、256ug/ml、128ug/ml、64ug/ml、32ug/ml、16ug/ml、8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml，TBF的实验浓度由高向低依次为：0.08ug/ml、0.04ug/ml、0.02ug/ml、0.01ug/ml、0.005ug/ml、0.0025ug/ml、0.00125ug/ml、0.000625ug/ml、0.0003125ug/ml、0.000015625ug/ml。

2.2菌悬液的制备：将受试的皮肤癣菌接种于沙保培养基(SDA)上，26℃培养7-14天。吸取灭菌的0.85％NaCI溶液2ml冲洗菌丝表面的菌丝和孢子，将含有菌丝和孢子的冲洗液用血细胞计数板记数，浓度1×10⁵～5×10⁵CFU/ml之间，用RPMI-1640液基稀释50倍至2倍终浓度。

2.3接种：将100ul的2倍终浓度的药液由第1孔至第10孔分别由高浓度到低浓度加入无菌的96孔板中，第11孔为生长对照孔(仅加真菌，不加药物)，第12孔为空白对照孔(真菌，药物都不加，只有培养基)。将调好的菌接种液100ul分别加入相应的微孔内，这将使每一梯度的抗真菌药物和菌悬液(2倍终浓度)分别被1∶1稀释到终浓度。皮肤癣菌：26℃孵育7天读结果。

2.4结果的判定：经恒温培养24，48，72，96，124，和148h观察结果，在不搅动的情况下肉眼判断，溶液清晰透明视为真菌完全不生长，取完全不生长管最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。

3.实验结果

表中可见，地锦草提取物对T.m的MIC₉₀为139.49ug/ml，平均MIC 87.70ug/ml，对T.r的MIC₉₀为110.08ug/ml，平均MIC 68.16ug/ml，对E.f的MIC₉₀为313.35ug/ml，平均MIC 80.63ug/ml，对M.g的MIC₉₀为429.54ug/ml，平均MIC 194.01ug/ml。

特比奈芬(TBF)对T.m的MIC₉₀为0.0236ug/ml，平均MIC 0.007ug/ml，对T.r的MIC₉₀为0.051ug/ml，平均MIC 0.02ug/ml，对E.f的MIC₉₀为0.0176ug/ml，平均

MIC 0.0063ug/ml，对M.g的MIC₉₀为0.0336ug/ml，平均MIC 0.015ug/ml

4.讨论

近年来真菌感染和条件致病菌感染已逐渐增多，迫切需要高效、低毒的抗真菌药物，由于真菌细胞属于真核细胞，寻找一种药物仅对病原真菌有毒性而不累及宿主细胞是困难的，真正能有效用于临床的抗真菌药物极为有限，目前临床应用的抗真菌药物主要是唑类抗生素，然而该类抗生素很易出现耐药性，天然耐药株不断增加，因此从天然药物中寻找低毒高效的抗真菌药物就更显重要。

本发明采用NCCLS《产孢丝状真菌的液基稀释抗真菌药敏试验参考方案》(M-38P)，并以特比奈芬为阳性对照药，研究了地锦草提取物对30株皮肤癣菌的体外抑菌活性，测定了其MIC值，结果显示，地锦草提取物对4种皮肤癣菌的MIC₉₀值范围为110～429ug/ml。由此可见，地锦草有效部位对临床常见的浅部致病真菌具有较强的抑制作用，对T.r最敏感，平均MIC值为68.16ug/ml；其次是E.f、T.m，其平均MIC值分别是80.63ug/ml、87.70ug/ml；最后是M.g，平均MIC值为194ug/ml。地锦草提取物对常见皮肤癣菌中的毛癣菌属的敏感性比小孢子菌属高，抗菌谱由强至弱依次为T.rubrum、E.floccosum、T.mentogrophytes、M.gypseum。

同时测定了阳性对照药特比奈芬对30株皮肤癣菌的体外抗真菌活性，从结果可知，特比奈芬对常见皮肤癣菌的MIC₉₀在0.005-0.08ug/ml之间，平均MIC值0.005-0.08ug/ml之间。

二、地锦草提取物的体外抗真菌作用研究

[摘要]以红色毛癣菌、石膏样毛癣菌、石膏样小孢子菌、絮状表皮癣菌和白色念珠菌为实验菌种，进行试管内(invitro)抗真菌实验。结果表明，地锦草提取物对皮肤癣菌的MIC₉₅值为2048ug/ml；对白色念珠菌MIC₉₅值为16384ug/ml。

[关键词]维药；地锦草提取物；体外抑菌；

地锦草(Euphorbia humifusa Willd)属大戟科大戟属植物，具有清热解毒、凉血止血之功效，其成分主要含有山奈素、斛皮素及葡萄糖甙等多种黄酮类黄酮化合物，另有没食子酸、鞣花酸等多元酚酸类。从目前地锦草的研究状况分析，该药材具有抗氧化、抗菌、止血、保肝等作用。关于地锦草的抗真菌作用研究尚未见报道。本试验通过对地锦草提取物体外抗真菌作用研究，为地锦草制剂的进一步开发利用提供依据。

1.试验材料

1.1地锦草 1997年9月采集于陕西省周至县境内，去根，晒干，粉碎后备用。

1.2试验菌株大肠杆菌078:K80，沙门氏菌C79-1，金黄色葡萄球菌，由西北农业大学流行病教研组提供。

2.试验方法

2.1地锦草提取物的制备：取地锦草药材，加95％乙醇提取2次(分别60min，40min)，合并2次提取液。回收乙醇，浓缩成浸膏，即为地锦草提取物。

2.2地锦草提取物的体外抑菌试验：以红色毛癣菌、石膏样毛癣菌、石膏样小孢子菌、絮状表皮癣菌和白色念珠菌为实验菌种，进行试管内(invitro)抗真菌实验。A.培养基：RPMI1640-麸氨酸，以0.165mol/L MOPS调Ph至7.0。B.受试物：贮备液：将地锦草总黄酮以灭菌蒸馏水稀释成10mg/ml，将灰黄霉素以灭菌蒸馏水稀释成1mg/ml，于-20℃保存待用。C.实验步骤：取上述贮备液加培养基中，而以后各管作倍比稀释，并设细菌对照组(不加药)和阴性对照组(不加细菌)。取实验菌一周后的培养液0.1ml，分别加入除阴性对照外的各试验管的液体培养基中，经26℃恒温培养一周，每日进行观察，观察地锦草总黄酮对红色毛癣菌等皮肤癣菌的抑制或杀灭作用。

3、结果

地锦草提取物对皮肤癣菌的MIC₉₅值为2048ug/ml；对白色念珠菌MIC₉₅值为16384ug/ml。说明该药对皮肤癣菌和白念珠菌具有显著抑制作用，其中对红色毛癣菌、石膏样小孢子菌、石膏样毛癣菌和絮状表皮癣菌等皮肤癣菌的抑制作用较强。

四、地锦草提取物治疗皮肤浅表真菌感染41例的临床观察

地锦草具有清热解毒、凉血止血之功效，经多年的临床实践表明，该药对皮肤浅表真菌感染、过敏性皮炎、神经性皮炎、湿疹、疥疮等皮肤病的疗效显著。使用地锦草提取物治疗的皮肤浅表真菌感染41例，现将结果报告如下：

(1)一般资料

本组41例患者中，男性26例，女性15例，年龄在20岁以下9例，21～30岁14例，31～40岁12例，41～50岁4例，50岁以上2例；病程在1年以内18例，1～2年6例，2～3年4例，3～4年4例，4～5年3例，5～6年2例，6年以上4例。

(2)观察方法

病例选择。临床上确诊为真菌病(头癣、手足癣、甲癣、体癣、股癣、花班癣)的患者，可作为地锦草提取物临床观察对象，凡合并其他严重的、泛发的皮肤病；合并细菌感染；合并严重心、肝、肾病患者和孕妇不作为观察对象。

观察方案。凡人选病例均按观察方案记录症状，体征及检查血、尿常规、肝功、肾功等。其中临床症状和体征均用记分方法填写；无症状及体征记“0”分；出现红斑，丘疹，表面覆盖干燥鳞屑，微痒，真性菌为阳性(+)，记“1”分；出现红斑、丘疹、水疮、剧痒，真菌检查为(++)记“2”分；出现红斑丘疮疹，剧痒，轻度细菌感染，真菌检查为(+++)记“3”分；出现红斑丘疮疹，红肿痛，发烧，头痛，乏力，真菌检查为(++++)记“4”分。

给药方法。地锦草提取物，每次0.5g，每日3次。

疗效评定标准。根据治疗前后症状改善率(治疗前总评分一治疗后总评分/治疗前总评分)判定疗效。痊愈：总症状改善率达100％；显效：总症状改善率≥70％；有效：总症状改善率≥40％；无效：总症状改善率＜40％。痊愈、显效、有效合计为总有效率。

观察结果

(1)地锦草提取物对41例浅表真菌病(头癣、体癣、花班癣、股癣、手足癣)患者症状的影响：表1和表2。

表1地锦草提取物对41例患者症状的影响

表2地锦草提取物治疗前后总计分比较

由表1和表2可见，地锦草提取物能显著改善手足癣等皮肤浅表真菌病患者临床症状和体征。用同体比较(自身对照比较)的“七”检验方法进行统计学处理，治疗前后有非常显著性差异p＜0.001。

表3地锦草提取物临床观察结果

由表3可见，本组浅表真菌病患者中，痊愈占85.92％，有效占12.0％，无效占2.25％，总有效率97.92％。

(2)不良反应41例患者观察结果表明，治疗前后血、尿、肝、肾功均无异常变化，且不见任何毒副作用。

讨论

维吾尔医认为人体四种体液(胆液质、血液质、粘液质、黑胆质)在数量和质量上的异常变化，体液平衡失调等是发生疾病人内在重要因素。

浅表真菌病(头癣、手足癣、甲癣、体癣、花班癣……)是异常粘液质影响下使黑胆质在患者皮肤某处堆积，影响皮肤营养力，导致浅表真菌病的发生。治疗此类疾病，首先必须禁酒，禁食其他刺激性食物，同时，根据患者体内异常体液的情况，服用相应的致病体液成熟化剂和致病体液清除剂，使体液恢复平衡状态，然后恢复患者器官功能的强壮剂等。

地锦草提取物具有清热解毒、凉血止血之功效，使用地锦草提取物治疗的41例浅表真菌病患者的临床观察结果表明，该药显著改善浅表真菌病患者的临床症状和体征，临床总有效率为97.92％，痊愈率为85.92％，有效率为12.0％，无效为2.25％，无明显毒副作用，是治疗浅表真菌病的佳药。

Claims

1、一种地锦草提取物作为唯一的原料药在制备抗浅部真菌的药物中的用途，其特征在于地锦草提取物的制备方法为：取地锦草药材加95％乙醇提取2次，分别为60分钟、40分钟，合并2次提取液，回收乙醇，浓缩成浸膏，即得。