CN108771676B - 秦皮素的抗真菌应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的秦皮素的抗真菌应用，属于医药技术领域。本发明通过体外实验表明，秦皮素对真菌有较好的抑制效果，并能使抗真菌药物氟康唑恢复对耐药真菌的作用，因此秦皮素可用作抗真菌药物及抗真菌药物的增效剂。本发明为秦皮素开辟了新的用途，将其用于抗真菌药物及抗真菌药物的增效剂，不仅为真菌治疗提供了新的候选药物，而且提高了现有药物的抗真菌作用，在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，降低了抗真菌药物的用药剂量，从而为患者节省了医疗费用，减少药物的毒副作用。

Description

秦皮素的抗真菌应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及秦皮素的抗真菌应用。
背景技术
秦皮素属于香豆素类化合物，是水犀、喜马白蜡树叶子里含有的有效成分之一。具有抗痢疾杆菌的作用，临床上用于治疗儿童急性菌痢。现代药理研究显示，秦皮素具有抗细菌、抗氧化、抗肿瘤、肝脏保护等药理作用，但是，国内外未见秦皮素抗真菌作用的报道，也未见秦皮素作为抗真菌药物增效剂，与抗真菌唑类药物联合使用治疗真菌病的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供秦皮素的抗真菌应用。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明公开了秦皮素在制备抗真菌药物中的应用。
优选地，所述真菌包括克柔念珠菌(ATCC2340)、光滑念珠菌(ATCC2281)、新生隐球菌(32609)和耐药白色念珠菌(103)。
本发明公开了秦皮素在制备抗真菌药物增效剂中的应用。
优选地，所述抗真菌药物为唑类药物。
优选地，所述真菌包括克柔念珠菌(ATCC2340)、光滑念珠菌(ATCC2281)、新生隐球菌(32609)和耐药白色念珠菌(103)。
本发明还公开了一种抗真菌药物，由秦皮素与可药用辅料制成；其中，秦皮素的MIC值为64μg/mL。
优选地，所述的可药用辅料包括稳定剂、增溶剂、润滑剂和崩解剂中的一种或几种。
本发明还公开了一种抗真菌药物，由秦皮素、唑类药物与可药用辅料制成；其中，唑类药物的MIC值为16μg/mL，秦皮素的MIC值为0.125μg/mL。
优选地，所述唑类药物为咪唑类药物或三唑类药物。
优选地，所述的可药用辅料包括稳定剂、增溶剂、润滑剂和崩解剂中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明为秦皮素开辟了新的用途，将其用于制备抗真菌药物及抗真菌药物的增效剂，不仅为真菌治疗提供了新的候选药物，而且提高了现有药物的抗真菌作用，在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，降低了抗真菌药物的用药剂量，从而为患者节省了医疗费用，减少药物的毒副作用。
本发明通过体外细胞实验表明，秦皮素单独使用对光滑念珠菌、克柔念珠菌和新生隐球菌具有不同程度的抑制作用，当抗真菌药物氟康唑和秦皮素合用时，能明显降低抗真菌药物的用药剂量，并增强对耐药真菌的抑制作用，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用。因此可将秦皮素用作抗真菌药物及抗真菌药物的增效剂。
附图说明
图1为不同浓度的秦皮素与氟康唑合用后对耐药白念珠菌103生长情况的影响图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
一、秦皮素单独使用对不同真菌的作用
1、试药
秦皮素：购于成都德思特生物技术有限公司，纯度≥99％，批号DST170411-006。
氟康唑(FLC))：sigma公司，批号036M4709V。
二甲亚砜：天津市天力化学试剂有限公司。
各试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学检验。
2、菌株
使用的菌株，包括：
1)敏感菌株：敏感白色念珠菌(SC5314)、近平滑念珠菌(22019)和新生隐球菌(32609)；
2)耐药菌株：耐药菌株：耐药白色念珠菌(103)、耐药热带念珠菌、天然耐药克柔念珠菌(ATCC2340)和天然耐药光滑念珠菌(ATCC2281)。
以上均由上海长海医院真菌室提供，分别采自长海医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。
所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)划板活化，白念珠菌、热带念珠菌、新生隐球菌等球状菌于30℃培养2-3天后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。
3、培养液/基
1)RPMI 1640液体培养液
RPMI1640(Gibco BRL)10g，NaHCO3 2.0g，吗啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g(0.165mol)，加三蒸水900mL溶解，1mol/L NaOH调pH至7.0(25℃)，三蒸水定容至1000mL，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。
2)沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(SDA)
蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900mL溶解，加入2mg/mL氯霉素水溶液50mL，调整pH至7.0，以三蒸水定容至1000mL，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。
3)YEPD培养液
酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900mL溶解，加入2mg/mL氯霉素水溶液50mL，三蒸水定容至1000mL，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。
4、仪器设备
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；
THZ－82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；
SW-CT-IF型超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。
5、秦皮素和氟康唑贮备液
将秦皮素和氟康唑分别用DMSO溶解，配成浓度6.4mg/mL，于-20℃保存备用。
6、菌液制备
实验前，用接种圈从4℃保存的SDA培养基上分别挑取白念珠菌、热带念珠菌、新生隐球菌各球状菌少量，分别接种至1mL YEPD培养液，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。然后将各菌液分别加至1mLYEPD培养液中，用上述方法再次活化，培养16h，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液分别调整各菌液浓度至1×103～5×103CFU/mL。
7、药敏板制备：
各菌株分别取无菌96孔板一块，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μL作空白对照；3～12号孔各加上述新鲜配制的菌液100μL；2号孔加菌液198μL；12号孔不含药物，只加菌液100μL作阳性生长对照。在每排的2号孔加母液浓度为6.4mg/mL的秦皮素或氟康唑各2μL。
对2～11号孔进行10级倍比稀释，使各孔的最终秦皮素药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/mL，氟康唑的药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。各孔中DMSO含量均低于1％。将各药敏板于30℃恒温箱培养。
8.MIC值判定：
在30℃恒温箱中，念珠菌培养24h，新生隐球菌培养72h，观察实验结果，并确定其MIC值。观察结束后，放回恒温培养箱中，继续培养。当药物的MIC值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC值高于最高浓度64μg/mL时，计为“>64μg/mL”；MIC值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125μg/mL”。上述实验均平行操作3次，当MIC值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC值；当MIC值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。
实验结果如下表1所示：
表1秦皮素单独使用对各种真菌的MIC值(μg/mL)
Figure BDA0001769153380000051
从表1可以看出，秦皮素单独作用各种真菌24h，对克柔念珠菌、光滑念珠菌和新生隐球菌的MIC值分别32μg/mL、4μg/mL和4μg/mL，药物作用48h后，对克柔念珠菌、光滑念珠菌和新生隐球菌的MIC值分别32μg/mL、8μg/mL和8μg/mL，这显示了秦皮素具有抗真菌作用。
二、秦皮素与氟康唑合用对耐药白色念珠菌的作用
所用药物、菌株及实验材料同上述所示。
取无菌96孔板一块，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μL作空白对照；3～12号孔各加上述新鲜配制的耐药白色念珠菌菌液(1×103～5×103CFU/mL)100μL；2号孔加菌液198μL；12号孔不含药物，只加菌液100μL作阳性生长对照。使各孔的最终秦皮素药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/mL，氟康唑合用的药物浓度为16μg/mL，单用的药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/mL。各孔中DMSO含量均低于1％。将96孔板于30℃恒温箱培养。
在30℃恒温箱中，念珠菌培养24h，观察实验结果。当药物的MIC值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC值高于最高浓度64μg/mL时，计为“>64μg/mL”；MIC值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125μg/mL”。上述实验均平行操作3次，当MIC值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC值；当MIC值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。
实验结果见下表2：
表2秦皮素与氟康唑联合对耐药白色念珠菌的MIC值(μg/mL)
Figure BDA0001769153380000061
由表2可见，秦皮素与抗真菌药物氟康唑联合使用具有抗菌增效作用。氟康唑单用对白色念珠菌103的MIC值为>64μg/mL，秦皮素MIC值为>64μg/mL。两药合用后，氟康唑的MIC值下降到16μg/mL，秦皮素下降至≤0.125μg/mL，显示了秦皮素对氟康唑的增效作用。
三、秦皮素与氟康唑联合对耐药白色念珠菌生长情况的影响
所用药物、菌株及实验材料同上述所示。
将临床耐药白念珠菌103以1：100接种至1mLYEPD培养液，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1mLYEPD培养液中，用上述方法再次活化16h后，稀释调整菌液浓度至1×105～5×105CFU/mL，取1mL新鲜配制的菌液放置于玻璃管中，分别加入秦皮素或氟康唑，药物分组情况为：空白组(不含药)、氟康唑(16μg/mL)、秦皮素(16μg/mL)、氟康唑+秦皮素(16+16)μg/mL、氟康唑+秦皮素(16+32)μg/mL、氟康唑+秦皮素(16+64)μg/mL。
实验结果见图1，由图1可见，秦皮素与氟康唑分别单用时，对耐药白念珠菌103的抑制生长作用很小，菌液浑浊。当秦皮素与氟康唑合用24h和48h后，试管内的培养液均保持澄清。进一步显示了秦皮素对抗真菌药的增效作用。
综上所述，本发明通过体外实验表明，秦皮素对真菌有较好的抑制效果，并能使抗真菌药物氟康唑恢复对耐药真菌的作用，因此秦皮素可用作抗真菌药物及抗真菌药物的增效剂。本发明为秦皮素开辟了新的用途，将其用于抗真菌药物及抗真菌药物的增效剂，不仅为真菌治疗提供了新的候选药物，而且提高了现有药物的抗真菌作用，在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，降低了抗真菌药物的用药剂量，从而为患者节省了医疗费用，减少药物的毒副作用。

Claims (5)

1.秦皮素在制备抗真菌药物中的应用，其特征在于，所述真菌为克柔念珠菌(ATCC2340)、光滑念珠菌(ATCC2281)或新生隐球菌(32609)。
2.秦皮素在制备抗真菌药物增效剂中的应用，其特征在于，所述抗真菌药物为唑类药物；所述真菌为耐药白色念珠菌(103)。
3.一种抗真菌药物，其特征在于，由秦皮素、唑类药物与可药用辅料制成；其中，唑类药物的MIC值为16μg/mL，秦皮素的MIC值为0.125μg/mL。
4.如权利要求3所述的抗真菌药物，其特征在于，所述唑类药物为咪唑类药物或三唑类药物。
5.如权利要求3所述的抗真菌药物，其特征在于，所述的可药用辅料包括稳定剂、增溶剂、润滑剂和崩解剂中的一种或几种。
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