CN107137442A - 一种小蓟三氯甲烷提取物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种小蓟三氯甲烷提取物，它是由小蓟粗粉或乙醇提取物，加入石油醚提取后，再依次用三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水提取相应溶剂部位提取物，收集三氯甲烷部位提取物，即得。本发明还提供了该小蓟三氯甲烷溶剂提取物的用途。本发明采用两种系统溶剂法提取制备的小蓟三氯甲烷提取物，最低杀菌浓度分别为0.63、0.63mg/ml，经实验测定小蓟三氯甲烷提取物的MIC值分别是100ug/ml，MBC值分别是400ug/ml，对结核分枝杆菌标准菌株H37RV有较好的抑杀作用。

Description

一种小蓟三氯甲烷提取物及其用途

技术领域

本发明涉及一种小蓟三氯甲烷提取物，属于药物领域。

背景技术

结核病是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的人畜共患的一种慢性、消耗性传染病。结核病与艾滋病、疟疾一同仍然是人类健康的主要威胁，尤其是在发展中国家。据世界卫生组织报道，全球约1/3人口感染过结核分枝杆菌，其中结核病病人约2000万，每年新发结核病病人870万，每年约有300万人死于该病，超过了艾滋病、疟疾、腹泻等传染病死亡人数的总和，其死亡率在全球单一细菌性病原体感染导致疾病中最高，结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要原因之一。

数十年来，国际上针对结核菌已开发出近二十种药物，但均存在副作用大，易产生耐药性等缺点，特别是近年来耐药及多重耐药菌株(Multiple drugs resistant-bacillustuberculosis，MDR-TB)的出现，更是对现有的抗结核药物提出了严重挑战，使原有的抗结核病治疗方案(即一线抗痨药，二线抗痨药的方案)失去了应有的作用。耐多药结核是指结核分枝杆菌至少同时耐异烟肼和利福平，亦有人认为，只要是耐异烟肼(INH)、利福平(RFP)、吡嗪酰胺(PZA)、乙胺丁醇(EMB)和链霉素(SM)中两种或两种以上者均属于耐多药范畴。世界卫生组织估计，全球可能有5000万人已被感染耐一药以上的结核分枝杆菌，当今世界约有三分之二的结核病人处于发生耐多药的危险之中。同时，从化学合成物中寻找有效药物的难度日益增大。中国传统中医药自2000多年前即有关于抗结核治疗的记载。因此，近年来国内外从中国丰富的植物资源中寻找有效的抗结核药物，已引起越来越广泛的重视。

小蓟(Herba cirsii)是菊科植物刺儿菜的干燥地上部分，俗称刺角芽、刺角等。一般生长于荒地、草丛、灌丛、田间等，我国主要分布于安徽、山东、江苏等地，小蓟中主要含有黄酮、三萜、甾醇、有机酸等化学成分。

小蓟的主要药理作用：①抗菌作用：小蓟具有很好的抗菌作用，有实验表明，小蓟提取物对黑曲霉(Aspergillus niger)、青霉(Penicillium notatum)、绵霉(Achlya spp)等3种常见果蔬致病真菌均具有较好的抑制作用，抑制效果从大到小依次是青霉、绵霉、黑曲霉，此外，实验还发现小蓟的水提物对青霉的抑制效果最好，小蓟的乙醇提取物对绵霉和黑曲霉抑制效果最好。采用超临界CO₂萃取法，鉴定小蓟花、茎、叶中挥发油中的化学成份，共鉴定出166个化合物，且实验发现，不同萃取挥发油对特定的病原微生物具有特殊的抑菌效果。另有实验发现，乙醇浸剂1：30000时可以抑制人型结核杆菌，且小蓟水煎剂对结核杆菌的抑制浓度比小蓟乙醇浸剂大300倍。此外，有实验研究发现，小蓟等多种中药的醇提物对耐甲氧西林奥球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus,MRS)都有不同程度的抑制作用。②其他药理作用：小蓟除了具有良好的抗菌作用以外，小蓟还具有降血糖的作用，有实验表明，将小蓟鲜叶的正己烷、三氯甲烷、甲醇的提取液来进行动物实验，实验结果表明，小蓟的正己烷提取液对正常小鼠和糖尿病模型小鼠均具有显著的降血糖功效，而三氯甲烷和甲醇提取液则降血糖功效不明显。此外，有实验证明，小蓟的乙酸乙酯部位能够明显减轻由于二甲苯所导致的小鼠炎症，且该部位对小鼠的凝血、止血等具有明显的作用。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种小蓟三氯甲烷提取物。本发明另一技术方案是提供了该提取物的用途。

本发明提供了一种小蓟三氯甲烷提取物，它是由小蓟粗粉或乙醇提取物，加入石油醚提取后，再依次用三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水提取相应溶剂部位提取物，收集三氯甲烷部位提取物，即得。

其中，所述的提取方法为溶剂萃取法、回流或超声提取法。

其中，所述的溶剂萃取法包括如下步骤：

a、取小蓟，粉碎；加入95％乙醇浸泡；

b、浸泡后的粗粉超声提取，提取液过滤，浓缩、真空干燥，得冻干粉；

c、取b步骤制备的小蓟乙醇提取物冻干粉，加水分散；

d、加入石油醚萃取，石油醚萃取后，再按顺序萃取小蓟乙醇提取物水溶液的三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇部位，收集三氯甲烷溶剂部位，浓缩，即得小蓟三氯甲烷提取物。

其中，b步骤所述的超声提取功率为400w，提取时间30min。

其中，d步骤所述的浓缩温度为60℃。

其中，所述的回流或超声提取方法包括如下步骤：

取小蓟粗粉，加入石油醚回流或超声提取后，药渣再依次用三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水回流或超声提取，收集三氯甲烷提取物，即得。

本发明提供了所述的小蓟三氯甲烷提取物在制备抑制人型结核杆菌的药物中的用途。

进一步优选地，所述的药物是治疗结核病的药物。

更进一步优选地，所述的药物是治疗耐药结核病的药物。

本发明采用两种系统溶剂法提取制备的小蓟三氯甲烷提取物，最低杀菌浓度分别为0.63、0.63mg/ml，经实验测定小蓟三氯甲烷提取物的MIC值分别是100ug/ml，MBC值分别是400ug/ml，对结核分枝杆菌标准菌株H37RV有较好的抑杀作用。

附图说明

图1小蓟三氯甲烷溶剂部位提取物对结核杆菌的抑制曲线

具体实施方式

实施例1本发明小蓟三氯甲烷提取物的制备方法

取小蓟500g,用粉碎机进行粉碎制成粗粉，粗粉过药典三号筛。然后将小蓟粗粉用95％乙醇浸泡24h，浸泡后的粗粉分别用超声波提取仪提取两次，超声功率为400W，每次30min，合并提取液并过滤，滤液由旋转蒸发仪60℃减压浓缩成浸膏，置于烘箱中烘干，即得到粗提物，真空干燥得到冻干粉，称重即可得出提取率。

准确称取小蓟乙醇提取物冻干粉100g，分别分散于蒸馏水500ml中，按乙醇提取物水溶液与石油醚比例为1:2的比例加入石油醚，置于2000ml分液漏斗中，充分摇匀，静置于铁架台上，进行萃取。静置2小时后，收集石油醚层提取液，然后再按乙醇提取物水溶液与石油醚体积比为1：2的比例加入石油醚，充分摇匀后静置于铁架台上2小时，然后收集石油醚层萃取液，重复上述过程，直到石油醚层无色为止，收集所有石油醚萃取液。将小蓟的石油醚萃取液分别用旋转蒸发仪50℃条件下减压浓缩成浸膏，将浸膏放入鼓风干燥箱中，将制得的浸膏中残留的有机溶剂充分蒸发干后，再将浸膏进行真空干燥得到提取物冻干粉，称重，并计算出提取率。石油醚部位萃取完之后，分别再依次按顺序萃取小蓟乙醇提取物水溶液的三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇部位，萃取方法与小蓟石油醚溶剂部位相同。三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取液旋转蒸发仪减压浓缩成浸膏的温度条件分别是60℃、80℃、90℃。提取了中药的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇这4个溶剂部位之后，每种中药乙醇提取物水溶剩余的溶液部位即水溶剂部位的提取液，剩余残渣弃之不要。使用旋转蒸发仪100℃条件下减压浓缩成浸膏，真空干燥得到冻干粉，称重，计算提取率。

实验结果：

表1小蓟不同溶剂部位提取物提取率的测定结果

实施例2本发明小蓟三氯甲烷提取物的制备

准确称取小蓟药材粗粉100g，装入100ml圆底烧瓶中，首先加溶剂石油醚使其浸过药面1cm～2cm高，超声提取30min，提取2次，收集石油醚提取液，将提取物使用旋转蒸发仪50℃左右减压浓缩成浸膏，将浸膏用油浴把制得的浸膏中残留的有机溶剂充分蒸发干后，再将浸膏进行真空干燥得到提取物，称重，并计算出提取率。石油醚部位提取完之后，分别再依次按三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水的顺序，超声提取相应溶剂的中药溶剂部位提取物，分别得到白及的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水溶剂部位提取物。

实验结果：

表2小蓟不同溶剂部位提取物提取率的测定结果

以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。

试验例1抗结核中药小蓟不同溶剂部位提取物体外抗结核作用

1、实验材料

实验药品为小蓟的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物(实施例1制备)。

2、实验方法

将适量结核分歧杆菌标准菌株H37RV分别接种于小蓟的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水这五个溶剂部位不同含药浓度的改良罗氏培养基中，通过绝对浓度法，分别研究小蓟不同溶剂部位提取物对结核分歧杆菌标准菌株H37RV的体外抑制作用，同时设置有空白对照与利福平阳性对照，分别筛选出小蓟体外抑菌效果最好的溶剂部位。本实验在四川省疾病控制中心结核所生物安全二级+(BSL-2+)实验室进行。

2.1培养基的配制：

空白培养基、利福平阳性培养基配制方法同上

2.2小蓟各溶剂部位提取物含药培养基的配制：

取实施例1提取的小蓟石油醚部位提取物冻干粉，将其溶解于含有2％吐温-80的空白培养基，配制成含有小蓟石油醚提取物2.5mg/ml的含药培养基，取含有小蓟乙醇提取物2.5mg/ml的含药培养基4ml，加入到不含吐温-80的空白培养基4ml中，混合均匀即可得到含小蓟乙醇提取物1.25mg/ml的含药培养基，同法，依次可以得到含小蓟乙醇提取物0.63、0.32、0.16mg/ml的含药培养基。因此，可分别制得含小蓟石油醚溶剂部位提取物2.5、1.25、0.63、0.31、0.15mg/ml5个浓度的含药培养基，每个浓度装3只无菌培养管，每管约8ml，制作成斜面培养基备用。若需调节含药培养基的浓度，即称取该浓度对应溶剂部位提取物冻干粉重量，同法配制即可。小蓟三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水溶剂部位提取物培养基的配制方法相同。

结核分歧杆菌标准菌株H37RV菌液的配制、接种培养与观察、结果判断标准、统计学分析等均同上。

2.3实验结果：小蓟不同溶剂部位提取物体外抑菌实验结果

对小蓟石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水五个溶剂部位提取物进行体外抑制结核分歧杆菌标准菌株H37RV实验研究，根据对小蓟乙醇提取物体外抑菌的含药浓度的初步探索，将含药培养基制作成含药浓度分别为2.5、1.25、0.63、0.32、0.16mg/ml的5个浓度梯度的培养基，同时设置空白培养基和利福平阳性培养基。该抑菌实验重复3次，培养四周，分别观察药敏实验结果，具体结果见表3-表7：

表3实验前三周小蓟石油醚溶剂部位提取物对H37RV体外抑制作用实验结果(n＝3,x±s)

注：与空白组比较：*P＜0.05，差异显著**P＜0.01，差异极显著

表4实验前三周小蓟三氯甲烷溶剂部位提取物对H37RV体外抑制作用实验结果(n＝3,x±s)

注：与空白组比较：*P＜0.05，差异显著**P＜0.01，差异极显著

表5实验前三周小蓟乙酸乙酯溶剂部位提取物对H37RV体外抑制作用实验结果(n＝3,x±s)

注：与空白组比较：*P＜0.05，差异显著**P＜0.01，差异极显著

表6实验前三周小蓟正丁醇溶剂部位提取物对H37RV体外抑制作用实验结果(n＝3,x±s)(n＝3,x±s)

注：与空白组比较：*P＜0.05，差异显著**P＜0.01，差异极显著

表7实验前三周小蓟水溶剂部位提取物对H37RV体外抑制作用实验结果(n＝3,x±s)

注：与空白组比较：*P＜0.05，差异显著**P＜0.01，差异极显著

由表3-表7可知：

①小蓟各溶剂部位提取物的各个浓度培养基，培养一周以后，均未发现有结核杆菌生长；

②小蓟石油醚溶剂部位提取物，培养两、三周以后，各实验组对标准菌株H37RV的抑杀作用和空白组比有极显著差异(P＜0.01)，当含药浓度是2.5mg/ml时，与利福平阳性对照组比无统计学意义(P＞0.05)，其余浓度与利福平阳性组比有极显著差异(P＜0.01)。

③小蓟三氯甲烷溶剂部位提取物，培养两、三周以后，实验组各浓度对标准菌株H37RV的抑杀作用和空白组比有极显著差异(P＜0.01)，当含药浓度是2.5、1.25mg/ml时，与利福平阳性对照组比无统计学意义(P＞0.05)，其余浓度与利福平阳性组比有极显著差异(P＜0.01)。

④小蓟乙酸乙酯溶剂部位提取物，培养两、三周以后，当实验组药物浓度为2.5、1.25、0.63时对标准菌株H37RV的抑杀作用和空白组比有极显著差异(P＜0.01)，其余浓度与空白组比无统计学意义(P＞0.05)，各浓度与利福平阳性对照组比均具有极显著差异(P＜0.01)。

⑤小蓟正丁醇溶剂部位提取物，培养二周以后，当药物浓度是0.32、0.16mg/ml时，其对标准菌株H37RV的抑杀作用与空白组比无统计学意义(P＞0.05)，其余浓度与空白组比均具有极显著差异(P＜0.01)。各浓度组与利福平组比均具有极显著差异(P＜0.01)；培养三周以后，当药物浓度是1.25、0.63、0.32、0.16mg/ml时，其抑杀作用与空白组比无统计学意义(P＞0.05)，药物浓度为2.5mg/ml时与空白组比均具有极显著差异(P＜0.01)。各浓度组与利福平组比均具有极显著差异(P＜0.01)。

⑥小蓟水溶剂部位提取物，培养两、三周以后，实验组药物浓度为1.25、0.63、0.32、0.16mg/ml时，对标准菌株H37RV的抑杀作用与空白组比无统计学意义(P＞0.05)，实验组药物浓度为2.5mg/ml时与空白组比有显著差异(P＜0.05),各浓度组与利福平组比均具有极显著差异(P＜0.01)。

表8实验第四周小蓟不同溶剂部位提取物对H37RV体外抑制作用实验结果

由表8可知，培养四周以后，小蓟石油醚溶剂部位提取物培养基含药浓度在2.5mg/ml时，有杀菌效果，在设置的浓度梯度中，最低杀菌浓度为2.5mg/ml；小蓟三氯甲烷提取物培养基在2.5、1.25、0.63均具有杀菌效果，最低杀菌浓度为0.63mg/ml；乙酸乙酯部位在浓度为2.5、1.25、0.63时具有一定的抑菌效果，最低抑菌浓度0.63mg/ml；正丁醇部位提取物最低抑菌浓度1.25mg/ml；而小蓟水部位提取物从结果看来，无抑制结核杆菌的作用。

3、小结

通过本实验部分对筛选出来的小蓟经系统溶剂法(萃取法)制备出石油醚部位、三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位提取物，用制备出来的五个不同的溶剂部位进行进一步的体外抑制结合分歧杆菌标准菌株H37RV的实验研究，以筛选出体外抑制标准菌株H37RV的有效溶剂部位。通过体外抑菌实验结果，发现小蓟三氯甲烷溶剂部位相比该种中药的其他四种溶剂部位，具有更好的抑制H37RV的效果。由于萃取的系统溶剂法操作起来有可能会存在有机溶剂与水相没有充分震荡、中药乙醇提取物没有充分分散于水中等问题，从而影响萃取效果。为了筛选出更加准确的抑制H37RV的有效溶剂部位，再进行一次系统溶剂法(超声提取法)制备小蓟的不同溶剂部位，并对每一种部位进行体外抗结核作用研究。

试验例2抗结核中药小蓟不同溶剂部位提取物体外抗结核作用

1、实验材料

实验药品为小蓟的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物(实施例2制备)

2、实验方法

本实验在四川省疾病控制中心结核所生物安全二级+(BSL-2+)实验室进行操作。

3实验结果：小蓟不同溶剂部位提取物体外抑菌实验结果

对小蓟石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水五个溶剂部位提取物分别进行体外抑制结核杆菌的实验研究，根据对小蓟乙醇提取物体外抑制结核杆菌的含药浓度的初步探索，将含药培养基制作成含药浓度分别为2.5、1.25、0.63、0.32、0.16mg/ml的5个浓度梯度的培养基，同时设置空白培养基和利福平阳性培养基。该抑菌实验重复3次，培养四周，分别观察药敏实验结果，具体结果见表9-表13。

表9实验前三周小蓟石油醚溶剂部位提取物对H37RV体外抑制作用实验结果(n＝3,x±s)

注：与空白组比较：*P＜0.05，差异显著**P＜0.01，差异极显著

表10实验前三周小蓟三氯甲烷溶剂部位提取物对H37RV体外抑制作用实验结果(n＝3,x±s)

注：与空白组比较：*P＜0.05，差异显著**P＜0.01，差异极显著

表11实验前三周小蓟乙酸乙酯溶剂部位提取物对H37RV体外抑制作用实验结果(n＝3,x±s)

注：与空白组比较：*P＜0.05，差异显著**P＜0.01，差异极显著

表12实验前三周小蓟正丁醇溶剂部位提取物对H37RV体外抑制作用实验结果(n＝3,x±s)

注：与空白组比较：*P＜0.05，差异显著**P＜0.01，差异极显著

表13实验前三周小蓟水溶剂部位提取物对H37RV体外抑制作用实验结果(n＝3,x±s)

注：与空白组比较：*P＜0.05，差异显著**P＜0.01，差异极显著

由表9-表13可知：

①小蓟各溶剂部位的各个浓度培养基，培养一周以后，均未发现有结核杆菌生长；

②小蓟石油醚部位，培养两周、三周以后，各浓度组与空白组比均具有极显著差异(P＜0.01)。含药浓度为2.5、1.25、0.63mg/ml时对H37RV标准菌株的抑杀作用和利福平组比无统计学意义(P＞0.05)，浓度为0.32、0.16mg/ml时与利福平组具有极显著差异(P＜0.01)。

③小蓟三氯甲烷部位，培养两、三周以后，各浓度组与空白组比均具有极显著差异(P＜0.01)。含药浓度为2.5、1.25、0.63mg/ml时对H37RV标准菌株的抑杀作用和利福平组比无统计学意义(P＞0.05)，浓度为0.32、0.16mg/ml时与利福平组具有极显著差异(P＜0.01)。

④小蓟乙酸乙酯部位，培养两、三周以后，当药物浓度是0.15mg/ml时，其抑杀作用与空白组比无统计学意义(P＞0.05)，其余浓度与空白组比均具有极显著差异(P＜0.01)。各浓度组与利福平组比均具有极显著差异(P＜0.01)。

⑤小蓟正丁醇部位，培养两、三周以后，当药物浓度是0.15mg/ml时，其抑杀作用与空白组比无统计学意义(P＞0.05)，其余浓度与空白组比均具有极显著差异(P＜0.01)。各浓度组与利福平组比均具有极显著差异(P＜0.01)。

⑥小蓟水部位，培养两周后，当药物浓度是1.25、0.63、0.32、0.16mg/ml时，其抑杀作用与空白组比无统计学意义(P＞0.05)，当药物浓度是2.5mg/ml时，与空白组比均具有极显著差异(P＜0.01)。各浓度组与利福平组比均具有极显著差异(P＜0.01)；培养三周后，当药物浓度是1.25、0.63、0.32、0.16mg/ml时，其抑杀作用与空白组比无统计学意义(P＞0.05)，当药物浓度是2.5mg/ml时，与空白组比均具有显著差异(P＜0.05)，各浓度组与利福平组比均具有极显著差异(P＜0.01)。

表14实验第四周小蓟不同溶剂部位提取物对H37RV体外抑制作用实验结果

由表14可知，培养四周以后，小蓟石油醚部位培养基含药浓度在设置的浓度梯度中，最低杀菌浓度为0.63mg/ml；小蓟三氯甲烷部位含药培养基在2.5、1.25、0.63、0.32mg/ml均具有杀菌效果，最低杀菌浓度为0.32mg/ml。乙酸乙酯和正丁醇部位在浓度为2.5、1.25、0.64、0.32mg/ml时具有较轻微的抑菌效果，最低抑菌浓度0.32mg/ml；小蓟正水部位含药培养基从结果看来，无抑制结核杆菌的作用。与萃取法系统溶剂法相比，超声法系统溶剂法制得的中药部位，石油醚部位杀菌效果更好，三氯甲烷部位最低抑菌浓度更低，乙酸乙酯和正丁醇的抑菌效果较微弱，但比萃取法制得的中药部位效果好一些。小蓟水部位无抑菌效果。

4小结

通过本实验部分对筛选出来的小蓟经系统溶剂法(超声提取法)制备出新的石油醚部位、三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水溶剂部位提取物，并用制备出来的五个不同的溶剂部位提取物进行新一轮的体外抑制结核分歧杆菌标准菌株H37RV的实验研究，筛选出抑菌效果最好的中药溶剂部位提取物，即小蓟抑制H37RV的有效溶剂部位。通过比较萃取与超声两种不同的系统溶剂法提取物对标准菌株H37RV的体外抑制作用，选择一种效果更好的系统溶剂法。实验结果表明，超声提取法制得的溶剂部位提取物仍然是小蓟三氯甲烷部位抑菌效果最好，但最低杀菌浓度有所不同，超声法提取的溶剂部位最低杀菌浓度更低，表现出更好的抑菌活性。使用萃取法与超声提取法两种不同方法提取的溶剂部位提取物，小蓟三氯甲烷溶剂部位最低杀菌浓度分别是0.63、0.32mg/ml。探究了小蓟的有效抑菌溶剂部位，并对有效抑菌溶剂部位的抗菌浓度做了初步探究，后续实验将有效部位通过色谱法分成不同溶剂片段，通过抑菌研究，确定有效溶剂片段，再将有效溶剂片段进行药化研究，确定其化学组成，并对其进行检测、鉴定其有效成分以及稳定性的研究。本实验部分为后续实验进行初步探索，打下实验基础。

试验例3抗结核中药有效溶剂部位最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定

1、抗结核中药有效溶剂部位MIC、MBC的测定(一)

1.1材料与设备

(1)实验材料

标准菌株(H37RV)：由四川省疾控中心实验室提供

(2)实验试剂

Middlebrook 7H9培养基美国BD公司

Middlebrook 7H10培养基美国BD公司

小蓟三氯甲烷溶剂部位(由实施例1制备)

⑶器材

96孔板

生物安全柜：生物安全柜：型号：AC2-S，厂家：成都东方锐进科技有限公司；电热恒温培养箱：型号：KF-2020A，厂家：南京肯凡电子科技有限公司；

1.2实验方法

采用96孔板二倍稀释法测定提取物对人型结核杆菌的最低抑菌浓度(minimalinhibitory concentration，MIC)，以肉眼未见细菌生长的药物浓度为MIC(Nash et al,1986)，取96孔微孔板，灭菌后，每孔加入200ul灭菌去离子水以防止培养过程中各实验孔成分蒸发。取改良罗氏培养基上生长良好的人型结核杆菌标准菌株，以Middlebrook 7H9培养基调节浓度至OD＝0.1(约1×107CFU/ml)，并稀释至细菌浓度约为1×105CFU/ml。在微孔板第2列孔B-G内，加198ul上述菌液和2ul初始浓度为50mg/ml的小蓟石油醚溶剂部位或小蓟三氯甲烷溶剂部分。其余列孔B3-G11加入100ul菌液。待第二列微孔B-G中液体充分混匀后，取出100ul添加到下一个孔中，以此类推。加到G10时，取出100ul弃掉。G11为不加提取物的空白对照。同一药物的稀释浓度同时设3个平行对照组。37℃培养2周，肉眼在显微镜下观察的未见细菌生长的微孔最低浓度为该提取物的MIC，并从肉眼未见到细菌生长孔取培养物涂布在Middlebrook 7H10-ADC平板上，37℃培养20-30d，仔细观察细菌生长情况，以没有细菌生长对应孔的浓度的最低浓度为该提取物的最低杀菌浓度(minimal bactericidalconcentration,MBC)(Dubuisson et al,2010)。稀释后的终浓度为：500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.9、1.95ug/ml。

本部分实验在四川省疾病控制中心结核所生物安全二级+(BSL-2+)实验室进行操作。

1.3实验结果

采用96孔板法测定小蓟三氯甲烷溶剂部位对人型结核杆菌标准菌H37RV的MIC和MBC值，结果显示，小蓟三氯甲烷溶剂部位对H37RV的MIC为62.5mg/ml，MBC为500mg/ml。

表15MIC、MBC的测定结果(一)

1.4小结

对小蓟乙醇提取物的抑菌浓度进行了初步的探索，并筛选出了小蓟三氯甲烷溶剂部位为该种中药体外抑菌效果最好的溶剂部位。在设定的5个浓度梯度含药培养基抑菌实验中，大致找出了抑菌与杀菌的浓度范围，采用采用96孔板二倍稀释法进行小蓟有效溶剂部位的MIC与MBC测定。由于采用二倍稀释法测定，所以测定浓度区间较大。下面采用苏通培养基稀释法缩短测定浓度区间，测定小蓟三氯甲烷溶剂部位的MIC与MBC值。

2、抗结核中药有效溶剂部位MIC、MBC的测定(二)

2.1实验材料

(1)材料

实验菌株:人型结核杆菌标准菌株(由四川省疾控中心实验室提供)

小蓟三氯甲烷溶剂部位(由实施例1制备)

(2)试剂

二甲基亚砜(DMSO)：分子量：78.13，纯度：分析纯，规格：500ml，厂家：天津市致远化学试剂有限公司；

Middlebrook 7H11培养基：美国BD公司

天门冬酰胺：分子量：132.12，纯度：分析纯，规格：500g，厂家：天津市致远化学试剂有限公司；

磷酸氢二钾：分子量：136.09，纯度：分析纯，规格：500g，厂家：天津市致远化学试剂有限公司；

柠檬酸镁：分子量：703.40，纯度：分析纯，规格：500g，厂家：天津市致远化学试剂有限公司；

硫酸镁：分子量：246.47，纯度：分析纯，规格：500g，厂家：广东光华科技股份有限公司；

枸橼酸铁铵：分子量：488.16，纯度：分析纯，规格：500g，厂家：天津市致远化学试剂有限公司；

丙三醇：分子量：92.09，纯度：分析纯，规格：500ml，厂家：天津市津东天正精细化学试剂厂；

蒸馏水

(3)器材

生物安全柜：生物安全柜：型号：AC2-S，厂家：成都东方锐进科技有限公司；

电热恒温培养箱：型号：KF-2020A，厂家：南京肯凡电子科技有限公司；

2.2实验方法

(1)苏通培养基的配制：

准确称取上述各种成分，溶解于100ml无菌蒸馏水中，即可得到苏通液体培养基。

(2)菌液的稀释配制

用无菌接种环刮取少量在改良罗氏培养基上生长良好的菌龄3周左右的结核分歧杆菌标准菌株H37RV，置于装有2-3ml生理盐水的已高压灭菌的磨菌管中进行研磨，用无菌吸管吸取少量研磨均匀的菌液于装有生理盐水的比浊管中，摇晃均匀，用生理盐水调节菌液浓度，直至麦氏比浊仪测定菌液浓度为1×107CFU/ml，用移液枪吸取20ul菌液于2ml生理盐水中，稀释菌液浓度为1×105CFU/ml，用于接种。每管培养基接种10ul。

(3)小蓟三氯甲烷部位供试液的制备

称取各溶剂部位冻干粉，用DMSO进行溶解，将其溶解于含有2％DMSO的苏通培养基，对含有DMSO的苏通培养基依次稀释，最终使药物浓度分别为500、450、400、350、300、250、200、150、100、50ug/ml的十个浓度梯度。

(4)药敏实验

分别测试小蓟三氯甲烷溶剂部位的最低抑菌浓度(MIC)与最低杀菌浓度(MBC)，培养基采用配制的苏通培养基，每只培养管盛装3ml培养基，再加入不同稀释度溶剂部位药液3ml，接种结核杆菌标准菌株培养4周后观察结果，若肉眼观察培养基液体为浑浊则代表有结核杆菌菌落生长，澄清管的最低药物浓度为该药物的最低抑菌浓度(MIC)，将未见菌落生长的澄清管各取100ul培养基液，接种于Middlebrook 7H11琼脂板上，37℃条件下培养4周，以未见菌落生长的最低浓度确定为该药物的最低杀菌浓度。

2.3实验结果

表16MIC、MBC的测定结果(二)

由表16可知，小蓟三氯甲烷部位提取物的MIC值分别是100，MBC值分别是400ug/ml，对结核分枝杆菌标准菌株H37RV有较好的抑杀作用。

2.4小结

本实验部分通过苏通培养基试管稀释法较为精确的测定了小蓟三氯甲烷有效溶剂部位提取物的MIC和MBC值，实验结果表明小蓟三氯甲烷有效溶剂提取物均具有较好的抑菌活性。为后面结核分歧杆菌标准菌株H37RV和耐药菌株的IC50的测定提供浓度设定依据，同时为整个研究课题打下实验基础。

试验例4抗结核中药小蓟有效溶剂部位对H37RV与耐药菌株IC50的测定

1、实验材料

菌种及来源：

标准菌株人型结核分歧杆菌H37RV：来源于四川省疾控中心结核所实验室

耐药结核分歧杆菌临床分离株NO.23592(耐利福平、异烟肼)：来源于四川省疾控中心结核所实验室

实验药品：

实施例1制备的小蓟三氯甲烷溶剂部位。

2、实验方法

对小蓟有效抗结核杆菌溶剂部位提取物MIC与MBC的测定，将含有小蓟三氯甲烷溶剂部位提取物的培养基含药浓度梯度调至450、400、350、300、250、200、150、100ug/ml的8个浓度，分别接种标准菌株H37RV和耐药菌株以观察药物对这两种结核分歧杆菌的抑制情况的差异，同时设置三组平行实验。设置空白培养基，不设置利福平阳性对照组。培养基配制方法同上。菌液的稀释、接种、以及培养方法均同上。培养3周以后，分别数出每一个培养基上生长的菌落数，并计算出抑制率。本部分实验在四川省疾病控制中心结核所生物安全二级+(BSL-2+)实验室进行操作。

A1为空白培养基上的菌落生长数

A2为含药培养基上的菌落生长数

A1、A2均为三组平行实验的平均数

3实验结果：小蓟三氯甲烷溶剂部位对标准菌株H37RV的IC50测定结果

对小蓟三氯甲烷溶剂部位提取物MIC与MBC值得测定，将小蓟三氯甲烷溶剂部位提取物制作成含药浓度分别是450、400、350、300、250、200、150、100ug/ml的含药培养基，分别接种标准菌株H37RV和耐药菌株，同时做三组平行实验，放入37℃恒温培养箱中培养，连续观察3周，3周后记录培养基表面的标准菌株H37Rv和耐药菌株生长情况及菌落数，菌落数结果用三组平行实验的平均数表示，并计算出抑制率，制作出IC50曲线图。实验结果见表17、图1。

表17小蓟三氯甲烷不同浓度溶剂部位提取物对H37RV和耐药菌株的抑制作用

不同浓度的小蓟三氯甲烷溶剂部位提取物对结核分歧杆菌标准菌株H37RV与耐药菌株的抑制率见表17，由表可见，随着培养基中含药浓度的增加，对两种菌株的抑制率逐渐增大，当药物浓度是450ug/ml时，抑菌率达到了100％，当药物浓度是100ug/ml时，无抑制效果。根据表17的实验结果，以小蓟三氯甲烷溶剂部位提取物含药浓度为横坐标，药物对菌株生长的抑制率为纵坐标，得到小蓟三氯甲烷溶剂部位提取物对H37RV和耐药菌株的抑制曲线，结果见图1，由图可知，随着药物浓度的增大，对菌株的抑制率逐渐增大，呈现量效关系。小蓟三氯甲烷溶剂部位提取物对H37RV和耐药菌株的抑制曲线基本重合，使用SPSS软件计算得出药物对H37RV和耐药菌株的IC50值分别301.597、315.289ug/ml，表明该提取物对两种菌株的抑制效果差别不大。

4小结

小蓟不同溶剂部位提取物体外抗结核作用，以及对抗结核中药有效部位MBC、MIC的测定等试验研究中，考虑到安全性问题，均采用的结核分歧杆菌标准菌株H37RV。在本实验中药有效部位抑制结核杆菌的量效关系时采用同时使用标准菌株H37RV与耐药菌株，比较前面筛选出来的抗结核中药有效溶剂部位对两种菌株的抑制作用与量效关系，结果表明，抗结核中药对标准菌株与耐药菌株的抑制效果相差不大。

目前我国耐药结核病发病率不断升高，临床上治疗耐药结核病的化疗方案用药的种类多、剂量较大，不良反应发生率较高。如果引入中药治疗结核病，即便是中药联合用药，也能较好地治疗耐药结核病，并且能减轻副作用，提高病人接受程度，对于我国或全球结核病控制具有巨大的社会意义和应用前景。

Claims (9)

1.一种小蓟三氯甲烷提取物，其特征在于：它是由小蓟粗粉或乙醇提取物，加入石油醚提取后，再依次用三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水提取相应溶剂部位提取物，收集三氯甲烷部位提取物，即得。

2.根据权利要求1所述的小蓟三氯甲烷提取物，其特征在于：所述的提取方法为溶剂萃取法、回流或超声提取法。

3.根据权利要求2的所述的小蓟三氯甲烷提取物，其特征在于：所述的溶剂萃取法包括如下步骤：

a、取小蓟，粉碎；加入95％乙醇浸泡；

b、浸泡后的粗粉超声提取，提取液过滤，浓缩、真空干燥，得冻干粉；

c、取b步骤制备的小蓟乙醇提取物冻干粉，加水分散；

d、加入石油醚萃取，石油醚萃取后，再按顺序萃取小蓟乙醇提取物水溶液的三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇部位，收集三氯甲烷溶剂部位，浓缩，即得小蓟三氯甲烷提取物。

4.根据权利要求3所述的小蓟三氯甲烷提取物，其特征在于：b步骤所述的超声提取功率为400w，提取时间30min。

5.根据权利要求3所述的小蓟三氯甲烷提取物，其特征在于：d步骤所述的浓缩温度为60℃。

6.根据权利要求2所述的小蓟三氯甲烷提取物，其特征在于：所述的回流或超声提取方法包括如下步骤：

取小蓟粗粉，加入石油醚回流或超声提取后，药渣再依次用三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水回流或超声提取，收集三氯甲烷提取物，即得。

7.权利要求1－4任意一项所述的小蓟三氯甲烷提取物在制备抑制人型结核杆菌的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗结核病的药物。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗耐药结核病的药物。