CN109091670A - 一种禽流感病毒h9亚型二价灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种禽流感病毒h9亚型二价灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种禽流感病毒H9亚型二价灭活疫苗及其制备方法，属于疫苗制备领域。所述疫苗是用保藏编号为CCTCC NO：V201804的H9亚型禽流感病毒QC株和保藏编号为CCTCC NO：V201805的H9亚型禽流感病毒WT株作为抗原灭活后制备得到。本发明的禽流感病毒H9亚型二价灭活疫苗，为双毒株的疫苗，为市场上首创。其中，QC株属于A抗原群，WT株属于B抗原群，具有明显的抗原群代表性，它们对本群其他毒株具有较高的中和效价。本发明双毒株的疫苗彼此不影响抗体的产生，且在一定程度上提高的抗体效价，能在较长时间内维持抗体处于较高水平，对流行毒株的保护率为100％。

Description

一种禽流感病毒H9亚型二价灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于疫苗制备领域，具体涉及一种禽流感病毒H9亚型二价灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
我国自1994年首次报道从鸡群分离到H9N2亚型禽流感病毒以来，该亚型流感病毒一直在我国的一些主要养禽地区传播和流行，并形成地方流行性疾病。H9亚型禽流感病毒感染家禽后可造成死亡、产蛋下降等，并且与其它病原共感染时导致高死亡率，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。同时，H9亚型禽流感病毒可以感染人、猪等哺乳动物，在公共卫生上具有重要意义。
根据WHO和国内部分实验室对H9亚型禽流感病毒抗原变异的划分及分析标准，结果显示：近年来我国部分地区(华南、华中、华东、华北、东北等)流行株主要处在h9.4.2分支(BJ/94-like或Y280/G9-like)中h9.4.2.5分支，并且h9.4.2.5分支病毒逐渐成为了主要的流行进化分支，因此h9.4.2.5分支禽流感病毒已经成为了我国H9亚型禽流感防控的新难点。从血清交叉试验、鸡胚中和试验及攻毒保护试验结果表明，在当前流行的h9.4.2.5分支内部存在A、B两大抗原群，两个抗原群间的抗原差异可达16～64倍；鸡胚中和试验结果表明，A、B抗原群毒株间的中和效价也存在较大的差异，现有的H9亚型疫苗已不能起完全保护作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种覆盖了h9.4.2.5分支的A抗原群的QC株和覆盖了h9.4.2.5分支的B抗原群的WT株作为抗原制备得到的禽流感病毒H9亚型二价灭活疫苗及其制备方法。所述毒株具有明显的抗原群代表性，对本群其他毒株均具有较高的中和效价，所得疫苗可以更好、更全面的保护禽类对抗禽流感病毒。
本发明所采取的技术方案是：
一种H9亚型禽流感病毒，该H9亚型禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒QC株，保藏编号为CCTCC NO：V201804；或该H9亚型禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒WT株，保藏编号为CCTCC NO：V201805。
本发明公开的H9亚型禽流感病毒QC株，于2018年2月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO：V201804，分类命名为A/Chicken/Shangdong/QC/2016。保藏中心于2018年2月12日鉴定菌株是存活的。
本发明公开的H9亚型禽流感病毒WT株，于2018年2月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO：V201805，分类命名为A/Chicken/Guangdong/WT/2016。保藏中心于2018年2月12日鉴定菌株是存活的。
上述所述的H9亚型禽流感病毒在制备防控禽流感的药物中的应用。
优选的，所述的药物为疫苗。
优选的，所述的疫苗为减毒疫苗或灭活疫苗。
一种疫苗，所述的疫苗的抗原包括保藏编号为CCTCC NO：V201804的H9亚型禽流感病毒QC株或保藏编号为CCTCC NO：V201805的H9亚型禽流感病毒WT株中的至少一种。
优选的，所述的疫苗为减毒疫苗或灭活疫苗。
优选的，所述疫苗可以根据需要加入更多的抗原。
一种禽流感病毒H9亚型二价灭活疫苗，所述的疫苗是用保藏编号为CCTCC NO：V201804的H9亚型禽流感病毒QC株和保藏编号为CCTCC NO：V201805的H9亚型禽流感病毒WT株作为抗原灭活后制备得到。
一种禽流感病毒H9亚型二价灭活疫苗的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将上述所述的H9亚型禽流感病毒QC株和H9亚型禽流感病毒WT株分别扩大培养，收获扩大培养后的病毒液；
(2)测定EID50，并将病毒液适应性稀释和/或浓缩至每0.1ml病毒液中病毒含量≥107.0EID50；
(3)分别灭活病毒液；
(4)将H9亚型禽流感病毒QC株和H9亚型禽流感病毒WT株灭活病毒液按照体积比1:1进行混合，加入2～4倍体积的吐温-80，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解，得到水相；
(5)将白油和司本-80按照体积比(92～94)：(6～8)混合，充分混匀，得到油相；
(6)将水相与油相按1:(1.0～2.5)的体积比混合，乳化，制备得到疫苗。
本发明的有益效果是：
本发明公开的疫苗为禽流感病毒H9亚型二价灭活疫苗，为双毒株的疫苗，为市场上首创产品。
本发明公开的疫苗中的抗原为H9亚型禽流感病毒QC株和WT株，它们均为近年来流行的毒株，属于当前流行的h9.4.2.5分支，其中QC株属于h9.4.2.5分支的A抗原群，WT株属于h9.4.2.5分支的B抗原群。近年来的流调分析的血清交叉结果和鸡胚中和试验来看，在当前流行的h9.4.2.5分支内部存在A、B两大抗原群，这两个抗原群间的抗原差异可达16～64倍。也即，本发明的疫苗可以覆盖h9.4.2.5分支的A抗原群和h9.4.2.5分支的B抗原群，可以更好、更全面的保护禽类对抗禽流感病毒。发明人通过血清交叉试验和鸡胚中和试验验证，QC株所在的A抗原群毒株、WT株所在的B抗原群毒株间的中和效价也存在较大的差异，提示该两个毒株具有明显的抗原群代表性，具备作为候选疫苗毒株的可行性。此外，A抗原群QC株和B抗原群中的WT株对本群其他毒株均具有较高的中和效价，中和效价在1：1339～1：4898之间，保护力更好。
本发明双毒株的疫苗彼此不影响抗体的产生，且在一定程度上提高的抗体效价，能在较长时间内维持抗体处于较高水平(见实验8)，对流行毒株的保护率均为100％，说明两毒株的免疫原性均良好。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。
实施例1
实验1：H9亚型毒株的筛选
我国自1994年首次报道从鸡群分离到H9N2亚型禽流感病毒以来，该亚型禽流感病毒一直在我国的一些主要养禽地区传播和流行，并形成地方流行性疾病。H9亚型禽流感病毒感染家禽后可造成死亡、产蛋下降等，并且与其它病原共感染时导致高死亡率，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。同时，H9亚型禽流感病毒可以感染人、猪等哺乳动物，在公共卫生上具有重要意义。在不断的进化过程中，我国的H9亚型禽流感病毒的HA基因主要为两个分支，其代表株分别为CK/BJ/1/94和Qa/HK/G1/97，而内部基因形成更多分支，组成不同的基因型。由于禽流感病毒基因组为8节段的负链RNA，很容易发生基因突变和重排现象，因此有必要定期对H9亚型禽流感病毒进行流行病学调查和遗传进化分析。
(1)病毒的分离及鉴定
①病毒分离
将采集的病料、喉拭子、泄殖腔拭子等样品无菌处理后，接种11日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.2ml，37℃孵化，弃去24小时内死亡鸡胚，72小时后，收集鸡胚尿囊液，测定血凝价，-70℃保存备用。
②病毒的分型
将分离获得的禽流感病毒QC株和WT株分别与禽流感标准分型血清H1～H15、N1～N9进行HI和NI试验，结果表明QC株和WT株均为H9N2亚型，结果详见表1、表2。
表1禽流感病毒H亚型鉴定结果
表2禽流感病毒N亚型鉴定结果
注：“+”表示分离株的NA亚型与标准毒株相同；“-”表示不同。
③病毒的特异性
将有血凝活性的鸡胚尿囊液分别与新城疫病毒、减蛋综合症病毒、H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒的标准阳性血清进行血凝抑制(HI)实验，结果发现，病毒QC株和WT株与新城疫病毒、减蛋综合症病毒、H5亚型、H7亚型禽流感病毒标准阳性血清呈阴性反应，与H9禽流感病毒的标准阳性血清呈阳性反应。
④符合制苗的特征
经序列测定及分析，H9N2亚型禽流感病毒QC株和WT株的HA基因裂解位点处的氨基酸残基均为RSSR↓GLF，都是非连续碱性氨基酸，符合低致病性禽流感病毒的特征。
实验2：疫苗株的筛选
根据WHO和国内部分实验室对H9亚型禽流感病毒抗原变异的划分及分析标准，结果显示：近年来我国部分地区(华南、华中、华东、华北、东北等)流行株主要处在h9.4.2分支(BJ/94-like或Y280/G9-like)中h9.4.2.5分支，并且h9.4.2.5分支病毒逐渐成为了主要的流行进化分支，因此h9.4.2.5分支禽流感病毒已经成为了我国H9亚型禽流感防控的新难点。
本发明获得H9亚型禽流感病毒QC株和WT株均为近年来流行的毒株，属于当前流行的h9.4.2.5分支，其中QC株属于h9.4.2.5分支的A抗原群，WT株属于h9.4.2.5分支的B抗原群。近年来的流调分析的血清交叉结果和鸡胚中和试验来看，在当前流行的h9.4.2.5分支内部存在A、B两大抗原群，这两个抗原群间的抗原差异可达16～64倍。发明人通过后续的鸡胚中和试验验证，QC株所在的A抗原群毒株、WT株所在的B抗原群毒株间的中和效价也存在较大的差异，其中A抗原群QC株和B抗原群中的WT株对本群其他毒株均具有较高的中和效价，中和效价在1：1339～1：4898之间，提示该两个毒株具有明显的抗原群代表性，具备作为候选疫苗毒株的可行性。
实验3：毒种的培养条件及灭活工艺
(一)最佳接种日龄的选择 分别取9日龄、10日龄、11日龄SPF鸡胚各10枚，各经尿囊腔接种10-4倍稀释的H9亚型禽流感病毒生产用种毒，0.2ml/枚，置37℃孵育，24小时死亡的鸡胚为非特异性死亡，废弃不计，培养72小时后将所有鸡胚冻存，测定HA效价，确定其最适培养日龄。
(二)最佳接种浓度的选择 取11日龄SPF鸡胚随机分成三组，10枚/组，分别经尿囊腔内接种10-3、10-4和10-5倍稀释的H9亚型禽流感病毒生产用种毒，0.2ml/枚，置37℃孵育，24小时死亡的鸡胚为非特异性死亡，废弃不计，培养72小时后将所有鸡胚冻存，测定HA效价，确定其最适接种浓度。
(三)最佳培养温度的选择 取20枚11日龄SPF鸡胚分别经尿囊腔接种10-4倍稀释的H9亚型禽流感病毒生产用种毒，0.2ml/枚，接种后随机分成2组，10枚/组，分别置37℃和35℃条件下培养72小时，将不同组别鸡胚逐胚测定尿囊液的HA效价，确定其最适培养温度。
(四)最佳收获时间的选择 取40枚11日龄SPF鸡胚分别经尿囊腔接种10-4倍稀释的H9亚型禽流感病毒生产用种毒，0.2ml/枚，接种后随机分成4组，10枚/组，4组鸡胚置37℃分别培养24小时、48小时、72小时和96小时后收毒，将不同组别鸡胚逐胚测定尿囊液的HA效价、收获量及病毒含量，确定其最佳收获时间。
(五)最佳灭活时间及灭活浓度 将两种病毒液分别分成A、B、C三个组。其中A组按终浓度0.05％加入甲醛溶液；B组按终浓度0.1％加入甲醛溶液；C组按终浓度0.2％加入甲醛溶液；混匀后置37℃恒温条件下灭活；分别于灭活后12小时、16小时、20小时、24小时和30小时，取样品分别接种11日龄SPF鸡胚10枚，0.2ml/枚，37℃孵育72小时后逐胚测定鸡胚尿囊液HA效价，若HA检测为阴性，需盲传一代，仍为阴性者，判断灭活完全，从而确定其最佳灭活时间及灭活浓度。
实验4：疫苗制造与半成品检验
1生产用毒种的制备
1.1 QC株毒种的制备
1.1.1毒种繁殖 将QC株毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(如10-2至10-4稀释)，尿囊腔内接种11日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置37℃继续孵育至72小时。接种后24小时内死胚弃去，测定每胚HA效价。将HA效价不低于1:512(微量法)的鸡胚液混合，定量分装于安瓿瓶中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次。
1.2 WT株毒种的制备
1.2.1毒种繁殖 将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(如10-2至10-4稀释)，尿囊腔内接种11日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置37℃继续孵育至72小时。接种后24小时内死胚弃去，测定培养72小时后的HA效价。将HA效价不低于1:512(微量法)的鸡胚液混合，定量分装于安瓿瓶中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次。
2制苗材料的选择 选用发育良好的10～11日龄易感鸡胚作为制苗材料。
2.1制苗用毒液的制备
2.1.1 QC株病毒液的制备
2.1.1.1接种 取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10-2至10-4稀释)，每胚尿囊腔内接种0.2ml，密封针孔，置36～37℃继续孵育。
2.1.1.2孵育和观察 接种后48小时内，每日照蛋1次，将48小时内死胚弃去。此后，每4～6小时照蛋1次，将死亡的鸡胚随时取出，直至72小时，无论死亡与否，将全部鸡胚取出，气室向上直立，置2～8℃冷却4～24小时。
2.1.1.3收获 将冷却的鸡胚取出，消毒气室部位卵壳，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，吸取胚液。对每枚鸡胚在吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干枚鸡胚分成一组，吸取胚液放于同一灭菌的容器内，2～8℃以下保存备用。
2.1.2 WT株病毒液的制备
2.1.2.1接种 取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10-2至10-4稀释)，每胚尿囊腔内接种0.2ml，密封针孔，置36～37℃继续孵育。
2.1.2.2孵育和观察 接种后48小时内，每日照蛋1次，将48小时内死胚弃去。此后，每4～6小时照蛋1次，将死亡的鸡胚随时取出，直至72小时，无论死亡与否，将全部鸡胚取出，气室向上直立，置2～8℃冷却4～24小时。
2.1.2.3收获 将冷却的鸡胚取出，消毒气室部位卵壳，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，吸取胚液。对每枚鸡胚在吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干枚鸡胚分成一组，吸取胚液放于同一灭菌的容器内，2～8℃以下保存备用。
2.2病毒液的浓缩 将收获的QC株病毒液和WT株病毒液分别使用超滤浓缩设备进行2倍浓缩。
2.3灭活
2.3.1 QC株病毒液的灭活 将检验合格的QC株浓缩病毒液加入甲醛溶液，使其终浓度为0.2％，37℃条件下灭活20小时。灭活完毕后，取样进行灭活检验。灭活后的病毒液置2～8℃保存，应不超过1个月。
2.3.2 WT株病毒液的灭活 将检验合格的WT株浓缩病毒液加入甲醛溶液，使其终浓度为0.2％，37℃条件下灭活20小时。灭活完毕后，取样进行灭活检验。灭活后的病毒液置2～8℃保存，应不超过1个月。
2.4半成品检验
2.4.1病毒含量的测定 将浓缩后的QC株和WT株病毒分别使用灭菌生理盐水进行2倍稀释，再10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9共4个稀释度，各尿囊腔内接种11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置37℃孵育72小时。24小时以前死亡的鸡胚弃去，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价；以红细胞凝集价不低于1:16(微量法)者判为感染，按Reed-Muench法计算EID50，每0.1ml病毒含量应≥107.5EID50。
2.4.2无菌检验 分别取浓缩后灭活的QC株和WT株病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
2.4.3红细胞凝集价 将灭活完全的QC株和WT株浓缩病毒液按现行《中国兽药典》附录进行测定，对鸡红细胞凝集价应不低于1:512(2×256)(微量法)。
2.4.4灭活检验 分别取灭活后的QC株和WT株浓缩病毒液，尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，37℃继续孵育，剔除24小时内死亡鸡胚，观察3日，鸡胚非特异死亡不应超过2枚。收获所有鸡胚的胚液，测定血凝价，应全部为阴性。将收获的鸡胚液混合，以上述相同方法进行盲传，取传代鸡胚的胚液进行HA试验，应全部为阴性。
2.5灭活疫苗的配制
2.5.1油相的配制 取优质注射用白油，加入司本-80，其中白油和司本-80的体积比为(92～94)：(6-8)，充分混匀，灭菌备用。
2.5.2水相的配制 取灭活后QC株抗原液和WT株抗原液按1：1的体积比充分混合，加入2～4倍体积的灭菌的吐温-80，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解。
2.5.3乳化 水相与油相按1:(1.0-2.5)的体积比，先将油相输入乳化罐中搅拌，再缓慢加入水相，继续搅拌使油相与水相充分混匀，然后通过剪切机在线乳化。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3500r/min离心15min，应不出现分层。
2.6分装 将乳化好的疫苗定量分装，加盖密封，并粘贴标签。置2～8℃保存。
实验5：疫苗的安全性试验
对SPF鸡各种接种途径的一次单剂量接种的安全试验
取20只21日龄SPF鸡，随机分成2组，10只/组，分别经颈部皮下注射或肌肉注射1601批疫苗，0.3ml/只，另取5只同日龄SPF鸡不免疫作为对照，连续观察14日，记录试验鸡和对照鸡的精神状态，剖检注射部位并观察是否出现局部炎症、疫苗吸收是否完全等情况。结果表明颈部皮下注射和肌肉注射两种途径对注射部位及全身没有引起明显不良反应，在整个观察期内试验鸡采食饮水均正常，免后15日解剖，注射部位吸收良好，证明该疫苗经两种注射途径对SPF鸡是安全的。详见表3。
表3 SPF鸡单剂量接种的安全试验
疫苗批次 接种途径 接种剂量 观察时间 不良反应情况 剖检情况
1601 颈部皮下 0.3ml/只 14日 10/10健活，无不良反应 10/10吸收良好，无炎症反应
1601 肌肉注射 0.3ml/只 14日 10/10健活，无不良反应 10/10吸收良好，无炎症反应
对照组 - 不免疫 14日 5/5健活，无不良反应 5/5无异常
对SPF鸡各种接种途径的单剂量重复接种的安全试验
取20只21日龄SPF鸡，随机分成2组，10只/组，分别经颈部皮下注射或肌肉注射1601批疫苗，0.3ml/只，于免疫后14日，以同样的接种方式同种接种剂量进行免疫，另取5只同日龄SPF鸡不免疫作为对照，连续观察14日，记录试验鸡和对照鸡的精神状态，剖检注射部位并观察是否出现局部炎症、疫苗吸收是否完全等情况。结果表明颈部皮下注射和肌肉注射两种途径对注射部位及全身没有引起明显不良反应，在整个观察期内试验鸡采食饮水均正常，二免后15日解剖，注射部位吸收良好，证明该疫苗经两种注射途径单剂量重复接种对SPF鸡是安全的。详见表4。
表4 SPF鸡单剂量重复接种的安全试验
对SPF鸡各种接种途径一次性超剂量接种的安全试验
取20只21日龄SPF鸡，随机分成2组，10只/组，分别经颈部皮下注射或肌肉注射1603批疫苗，1.0ml/只，另取5只同日龄SPF鸡不免疫作为对照，连续观察14日，记录试验鸡和对照鸡的精神状态，剖检注射部位并观察是否出现局部炎症、疫苗吸收是否完全等情况。结果表明颈部皮下注射和肌肉注射两种途径对注射部位及全身没有引起明显不良反应，在整个观察期内试验鸡采食饮水均正常，免后15日解剖，注射部位吸收良好，证明该疫苗经两种注射途径超剂量对SPF鸡是安全的。详见表5。
表5 SPF鸡各种接种途径一次性超剂量接种的安全试验
疫苗批次 接种途径 接种剂量 观察时间 不良反应情况 剖检情况
1603 颈部皮下 1ml/只 14日 10/10健活，无不良反应 10/10吸收良好，无炎症反应
1603 肌肉注射 1ml/只 14日 10/10健活，无不良反应 10/10吸收良好，无炎症反应
对照组 - 不免疫 14日 5/5健活，无不良反应 5/5无异常
实验6：疫苗的持续期试验
用实验室试制的3批疫苗进行21日龄SPF鸡的抗体消长规律和免疫持续期的研究。试验结果显示，免疫后21日、4个月内H9抗体≥8.0log2，攻毒后100％(10/10)病毒分离阴性；免疫后5个月，抗体降至7.3log2以下，攻毒后100％(10/10)病毒分离阴性。而对照鸡攻毒后病毒分离率均为5/5病毒分离阳性，保护率为0％。从结果来看，疫苗免疫后5个月内仍能够达到理想的保护效果。为预防H9亚型禽流感病毒的发生，我们将免疫剂量及免疫期定为：3周龄，0.3ml/只，免疫期为5个月。结果详见表6。
表6 21日龄SPF鸡持续期情况
实验7：疫苗与同类产品的有效性比较
将实验室制备的禽流感病毒二价灭活疫苗(H9N2亚型，QC株+WT株)与三个国内生产的H9疫苗进行免疫效力对比试验。结果发现，现有的三个厂家的H9疫苗都只针对两个抗原群中的一个抗原群，使用别一抗原群毒株进行攻击时，保护率比较差，一般只能达到40％-60％的水平。因此，有必要进行双价疫苗的研制。结果详见表7。
表7与同类产品的比较试验
实验8：疫苗单联苗的对比试验
用实验室制备的禽流感病毒QC株和WT株疫苗与禽流感病毒二价灭活疫苗(H9N2亚型，QC株+WT株)免疫21日龄SPF鸡，免疫后3W，禽流感病毒二价灭活疫苗(H9N2亚型，QC株+WT株)的血清抗体使用两个抗原检测均在9.5log2以上，而禽流感病毒QC株疫苗的抗体为8.8log2，禽流感病毒WT株疫苗的抗体为8.5log2。因此说明，QC株和WT株制备联苗相互均无拮抗作用，相互之间存在协同作用。结果详见表8。
表8单联苗的对比试验结果
实验9：对流行毒株的攻毒保护试验
用实验室制备禽流感病毒二价灭活疫苗(H9N2亚型，QC株+WT株)免疫21日龄SPF鸡，免疫后3W，使用A抗原群流行毒株A/Chicken/Guangdong/GD/2018、A/Chicken/Xichuan/XC/2017和B抗原群流行毒株A/Chicken/Shandong/SD/2017、A/Chicken/Hebei/HB/2017进行攻毒，从而评价疫苗的保护效果。
结果详见表9。
表9疫苗对流行毒株的攻毒保护试验
表9结果显示：疫苗对A、B两抗原群的4株流行毒株的保护率均为100％(抑制排毒)。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种H9亚型禽流感病毒，其特征在于：该H9亚型禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒QC株，保藏编号为CCTCC NO：V201804；或该H9亚型禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒WT株，保藏编号为CCTCC NO：V201805。
2.权利要求1所述的H9亚型禽流感病毒在制备防控禽流感的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的药物为疫苗。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的疫苗为减毒疫苗或灭活疫苗。
5.一种疫苗，其特征在于：所述的疫苗的抗原包括保藏编号为CCTCC NO：V201804的H9亚型禽流感病毒QC株或保藏编号为CCTCC NO：V201805的H9亚型禽流感病毒WT株中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于：所述的疫苗为减毒疫苗或灭活疫苗。
7.一种禽流感病毒H9亚型二价灭活疫苗，其特征在于：所述的疫苗是用保藏编号为CCTCC NO：V201804的H9亚型禽流感病毒QC株和保藏编号为CCTCC NO：V201805的H9亚型禽流感病毒WT株作为抗原灭活后制备得到。
8.一种禽流感病毒H9亚型二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将权利要求7所述的H9亚型禽流感病毒QC株和H9亚型禽流感病毒WT株分别扩大培养，收获扩大培养后的病毒液；
测定EID50，并将病毒液适应性稀释和/或浓缩至每0.1ml病毒液中病毒含量≥107.0EID50；
分别灭活病毒液；
将H9亚型禽流感病毒QC株和H9亚型禽流感病毒WT株灭活病毒液按照体积比1:1进行混合，加入2～4倍体积的吐温-80，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解，得到水相；
将白油和司本-80按照体积比(92～94)：(6～8)混合，充分混匀，得到油相；
将水相与油相按1:(1.0～2.5)的体积比混合，乳化，制备得到疫苗。
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