CN108998558A

CN108998558A - 一种水稻粒宽调控基因gw8的荧光分子标记及其引物

Info

Publication number: CN108998558A
Application number: CN201811010603.4A
Authority: CN
Inventors: 邓国富; 高利军; 卿冬进; 戴高兴; 黄娟; 高菊; 梁海福; 伍豪; 周维永; 周萌; 陈韦韦
Original assignee: Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2018-12-14
Anticipated expiration: 2038-08-31
Also published as: CN108998558B

Abstract

本发明提供了一种水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记及其引物，其引物包括Allele‑AT引物、Allele‑GC引物和Common‑R1引物，所述Allele‑AT引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述Allele‑GC引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述Common‑R1引物的序列如SEQ ID NO：3所示。采用本发明的技术方案，实现了快速检测水稻品种中是否含有2个碱基缺失的GW8等位基因；方法简单，解决了目前使用的方法效率低，使用有毒物质的缺点；可以应用于分子标记辅助选择GW8等位基因，改良水稻粒形农艺性状。

Description

一种水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记及其引物

技术领域

本发明属于生物分子学技术领域，尤其涉及一种水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记及其引物。

背景技术

水稻作为重要的粮食作物之一，养育世界上约50％的人口。由于水稻产量与品质有着负相关的影响，所以同时提高水稻产量和品质依然是水稻育种家面临的一个挑战性问题。谷粒大小是影响产量和品质的一个重要因素，是水稻育种的主要目标之一。在高温地区，谷粒宽灌浆难，造成米质下降。而粒宽负调控基因GW8的功能缺失使谷粒变细，米质提高。因此，开发GW8基因的荧光分子标记用于分子标记辅助选择育种对水稻米质改良用重要的研究意义。

然而，现有技术一般是利用分子标记引物进行PCR扩增，经过琼脂糖电泳和核酸染料染色后检测PCR产物。这种方法需要琼脂糖电泳分析，耗时间；而且还要使用有毒的核酸染料。

发明内容

针对以上技术问题，本发明公开了一种水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记及其引物，实现了快速检测水稻品种中是否含有2个碱基缺失的GW8等位基因；方法简单，解决了目前使用的方法效率低，使用有毒物质的缺点。

对此，本发明采用的技术方案为：

一种水稻粒宽调控基因GW8荧光分子标记的引物，包括Allele-AT引物、Allele-GC引物和Common-R1引物，所述Allele-AT引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述Allele-GC引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述Common-R1引物的序列如SEQ ID NO：3所示。具体而言，引物的序列如下：

Allele-AT：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACTAATTTGTGCTGATATATCAAACATCAT；

Allele-GC：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTAATTTGTGCTGATATATCAAACATCGC；

Common-R1：TGAGAATCTTGCCCCTGAATTTTG。

将上述引物用于PCR扩增，含有2个碱基缺失的GW8等位基因的水稻DNA模板经扩增后，荧光扫描获得FAM荧光信号，而没有2个碱基缺失的GW8等位基因水稻DNA模板经扩增后，荧光扫描获得HEX荧光信号。该检测方法简单可靠，能快速检测水稻品种中是否含有水稻粒宽调控GW8等位基因。因为不需要电泳检测，直接用荧光扫描仪获取扩增数据，所以解决目前现有技术使用的方法因存在效率低，使用有毒物质的缺点。

本发明公开了一种水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记，其采用如权利要求1所述的水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记的引物获得。

进一步优选的，所述的水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记的方法为：采用Allele-AT引物、Allele-GC引物和Common-R1引物对水稻植株中的GW8基因进行扩增，在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行检测，如果扫描获得FAM荧光信号，则含2碱基缺失的GW8等位基因。如果扫描获得HEX荧光信号，则为不含2碱基缺失的GW8等位基因。

采用此技术方案，3条引物同时加入到PCR反应体系进行扩增，籽粒较窄水稻品种等位基因GW8序列可以根据SNP差异与正向引物Allele-AT匹配而扩增获得FAM荧光信号值；而籽粒较宽GW8等位基因序列与正向引物Allele-GC匹配而扩增获得HEX荧光信号值。

进一步优选的，所述的水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记采用以下步骤实施：

步骤S1，提取水稻植株的基因组DNA；

步骤S2，将Allele-AT引物、Allele-GC引物和Common-R1引物同时加入到PCR反应体系中进行扩增获得PCR产物；其中PCR的反应程序为：95℃，5min；然后10个循环95℃、20sec，65℃、1min，每循环-0.8℃；然后32个循环95℃，20sec，57℃，1min；

步骤S3，将PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值结合标记信息，进行基因分型，获得基因型结果；

步骤S4，对荧光强度信号值进行分析，如果扫描获得FAM荧光信号，则为含2碱基缺失的GW8等位基因；如果扫描获得HEX荧光信号，则为不含2碱基缺失的GW8等位基因。

进一步优选的，步骤S2中，PCR反应体系为10μL的体系：5μL 2×PARMS master mix(包含2条通用荧光引物)，0.15μL 10mM Allele-AT引物，0.15μL 10mM Allele-GC引物，0.4μL 10mM Common-R1引物，1μL模板DNA，3.3μL ddH2O。

进一步优选的，5μL 2×PARMS master mix中包含2条通用荧光引物。

本发明公开了一种如上所述的水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记的应用，其应用在水稻粒宽调控GW8等位基因的检测和/或水稻粒宽调控的辅助选择育种中。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明基于Penta-primer amplification refractory mutation system(PARMS)技术，通过研究得到的GW8序列与其等位基因序的2个碱基的差异，开发了能跟踪水稻谷粒宽的共显性荧光分子标记PM-GW8，由3条引物构成，分别为Allele-AT引物、Allele-GC引物和Common-R1引物，通过PCR扩增，不需要DNA电泳检测，而直接用荧光扫描仪获取扩增数据，方法简单可靠，检验快速；将数据经过分析，获得水稻GW8的基因型数据，用于分子标记辅助选择GW8等位基因，改良水稻粒形农艺性状。

附图说明

图1是本发明的粒宽调控等位基因GW8的扩增示意图；其中，#1，Allele 1FAM荧光通用引物；#2，Allele 2HEX荧光通用引物；#3，Allele-AT(标记引物)；#4，Allele-GC(标记引物)；#5，Common-R1(标记引物)。

图2是本发明检测的41个籼稻亲本品种GW8分子标记的基因分型结果图。

具体实施方式

下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。

一种水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记，其采用以下步骤：

(1)取水稻叶片，通过CTAB提取法(十六烷基三甲基溴化铵法)获得水稻的基因组DNA；

(2)PCR扩增：将3条引物Allele-AT、Allele-GC和Common-R1同时加入到PCR反应体系中，并对所述的水稻植株中的GW8基因进行扩增得到PCR产物。

引物的序列如下：

Allele-AT：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACTAATTTGTGCTGATATATCAAACATCAT；

Allele-GC：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTAATTTGTGCTGATATATCAAACATCGC；

Common-R1：TGAGAATCTTGCCCCTGAATTTTG。

其中，PCR反应程序为：95℃，5min；然后10个循环95℃，20sec，65℃(-0.8℃每循环)，1min；然后32个循环95℃，20sec，57℃，1min；

PCR反应体系为10ul：5μL 2×PARMS master mix(包含2条通用荧光引物)，0.15μL10mM Allele-AT标记引物，0.15μL 10mM Allele-GC标记引物，0.4μL 10mM Common-R1通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μL ddH2O。

PCR扩增引物设计如图1所示，含有2个碱基缺失的GW8等位基因的水稻DNA模板经扩增后，荧光扫描获得FAM荧光信号，而没有2个碱基缺失的GW8等位基因水稻DNA模板经扩增后，荧光扫描获得HEX荧光信号。

(3)将PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果。

(4)根据荧光信号值进行分析，如果扫描获得FAM荧光信号，则为含2碱基缺失的GW8等位基因；如果扫描获得HEX荧光信号，则为不含2碱基缺失的GW8等位基因。

按照本发明的水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记的方法对上述41种籼稻亲本品种的是否包含2碱基缺失的GW8基因进行检测，结果如图2所示，美B品种检测到FAM荧光信号的(右下方灰色点)，其包含2碱基缺失GW8基因；其它40个籼稻品种检测到HEX荧光信号的(左上方黑色点)，为没有2碱基缺失GW8基因。

并对41个籼稻品种进行粒宽测量，41份籼稻亲本材料的粒宽测量数据如表1所示，结果显示：其中美B中的GW8基因在分子标记检测结果中显示包含2碱基缺失，其粒宽比其它的40个籼稻品种窄，经t检验，到达显著性差异。

结合粒宽测量数据分析结果，检测到FAM荧光信号的GW8基因型的美B品种的粒宽较窄，验证包含2碱基缺失的GW8基因的籽粒较窄。

因此，可以用该荧光分子标记跟踪GW8基因进行水稻粒宽农艺性状改良。

表1 41份籼稻亲本材料的粒宽测量数据

编号

品种名称

粒宽(mm)

GW8基因

编号

品种名称

粒宽(mm)

GW8基因

1

美B

2.23±

--AT

21

华2048B

3.50±0.14^*

GCAT

2

博IIIB

2.78±0.11^*

GCAT

22

恒丰B

2.66±0.14^*

GCAT

3

宇19B

2.88±0.12^*

GCAT

23

112B

2.86±0.14^*

GCAT

4

深95B

2.92±0.14^*

GCAT

24

天丰B

2.73±0.12^*

GCAT

5

II-32B

3.18±0.09^*

GCAT

25

多系一号

2.68±0.14^*

GCAT

6

汕B

3.31±0.09^*

GCAT

26

R774

2.86±0.07^*

GCAT

7

IRBB7

2.88±0.13^*

GCAT

27

桂99

2.65±0.05^*

GCAT

8

50067

3.18±0.10^*

GCAT

28

R273

2.70±0.07^*

GCAT

9

雅恢2155

3.00±0.08^*

GCAT

29

R795

3.18±0.08^*

GCAT

10

R5867

2.79±0.18^*

GCAT

30

R7571

2.89±0.10^*

GCAT

11

R087

2.64±0.08^*

GCAT

31

辐恢838

3.48±0.14^*

GCAT

12

丙4114

2.76±0.15^*

GCAT

32

R527

3.02±0.11^*

GCAT

13

R9516

2.59±0.10^*

GCAT

33

R789

2.56±0.05^*

GCAT

14

福伊B

2.90±0.11^*

GCAT

34

华占

2.57±0.08^*

GCAT

15

中九B

2.88±0.07^*

GCAT

35

138R

2.52±0.88^*

GCAT

16

金23B

2.55±0.08^*

GCAT

36

测253

2.79±0.12^*

GCAT

17

博B

2.55±0.11^*

GCAT

37

桂红1号

2.52±0.11^*

GCAT

18

龙丰B

2.64±0.06^*

GCAT

38

B324

3.09±0.09^*

GCAT

19

岳4B

2.60±0.09^*

GCAT

39

谷梅4号

3.44±0.07^*

GCAT

20

岗46B

3.42±0.09^*

GCAT

40

金围矮

3.32±0.14^*

GCAT

41

GW2

3.12±0.16^*

GCAT

注：“--AT”代表GW8等位基因FAM荧光信号，“GCAT”代表GW8等位基因HEX荧光信号，^*代表与美B相比的t检验值达到显著性差异，p<0.05。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院

<120> 一种水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记及其引物

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtcgga gtcaacggat tactaatttg tgctgatata tcaaacatca t 51

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tactaatttg tgctgatata tcaaacatcg c 51

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgagaatctt gcccctgaat tttg 24

Claims

1.一种水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记的引物，其特征在于：包括Allele-AT引物、Allele-GC引物和Common-R1引物，所述Allele-AT引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述Allele-GC引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述Common-R1引物的序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记，其特征在于：其采用如权利要求1所述的水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记的引物获得。

3.根据权利要求2所述的水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记，其特征在于：采用Allele-AT引物、Allele-GC引物和Common-R1引物对水稻植株中的GW8基因进行扩增，在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行检测，如果扫描获得FAM荧光信号，则含2碱基缺失的GW8等位基因；如果扫描获得HEX荧光信号，则为不含2碱基缺失的GW8等位基因。

4.根据权利要求3所述的水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记，其特征在于：其采用以下步骤实施：

步骤S1，提取水稻植株的基因组DNA；

步骤S2，将Allele-AT引物、Allele-GC引物和Common-R1引物同时加入到PCR反应体系中进行扩增获得PCR产物；其中PCR的反应程序为： 95℃，5min；然后10个循环95℃、20sec，65 ℃、1 min，每循环-0.8 ℃；然后32个循环95℃，20 sec，57 ℃，1 min；

5.根据权利要求4所述的水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记，其特征在于：步骤S2中，PCR反应体系为10 μL的体系：5 μL 2×PARMS master mix（包含2条通用荧光引物），0.15 μL 10 mM Allele-AT引物，0.15 μL 10 mM Allele-GC引物，0.4 μL 10 mM Common-R1引物，1 μL模板DNA，3.3 μL ddH2O。

6.根据权利要求5所述的水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记，其特征在于：5 μL 2×PARMS master mix中包含2条通用荧光引物。

7.一种如权利要求2~6任意一项所述的水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记的应用，其应用在水稻粒宽调控GW8等位基因的检测和/或水稻粒宽调控的辅助选择育种中。