CN108997331A - 一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺 - Google Patents

一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，所述工艺包括如下步骤：(1)将黄柏与水混合，并调节体系pH，得料液；(2)将甘露聚糖酶加入料液中进行反应，完毕后进行离心，取上层清液；(3)将上层清液盐析后分离，并干燥分离物，得小檗碱提取物。所述工艺通过采用甘露聚糖酶能够专一且高效地破坏黄柏细胞壁，有利于对黄柏中小檗碱的充分分离和提取，从而最大程度地保留小檗碱的含量与活性，且操作步骤简单，有利于规模化生产。

Description

一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺
技术领域
本发明属酶法提取领域，具体涉及一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺。
背景技术
小檗碱属于季铵型异喹啉类生物碱，是黄柏的主要有效成分之一，其含量的高低是判断黄柏生药及其产品质量的重要指标。小檗碱能溶解于冷水，略溶于冷乙醇，在热水或热乙醇中溶解度比较大。小檗碱对溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、淋球菌和弗式、志贺氏痢疾杆菌等均有抗菌作用，大量的文献报道小檗碱在治疗癌症、炎症、传染性疾病、心血管以及代谢性紊乱等方面有疗效。
目前小檗碱提取方法主要包括：稀硫酸法、石灰乳法和乙醇浸提法。稀硫酸法主要利用小檗碱的硫酸盐在酸性环境中溶解，然后加入盐酸再转化为盐酸盐析出；石灰乳法主要是通过增加细胞壁通透性使得游离生物碱溶解于水，再通过盐析和调节酸度等步骤提取分离小檗碱；乙醇浸提法根据小檗碱易溶于热乙醇而难溶解于冷乙醇的性质，以热乙醇为溶剂将其提出，然后再转化为盐酸盐析出。这三种方法虽然简便，但是极易对环境造成污染，且提取率低，限制了推广。
而若采用酶法提取，则可使得提取产率大为增加，酶是以蛋白质形式存在的一类特殊的生物催化剂，某些酶可以在常温、常压和温和的酸碱条件下，将植物细胞壁分解，较大幅度提高天然植物中有效成分的提取率，改善生产过程中的滤过速度和纯化效果，提高产品纯度和制剂的质量。利用酶反应所具有高度专一性的特点，选择相应的酶，可有效将细胞壁水解或降解，破坏细胞壁结构，使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中，从而达到提取目的，且有利于提高成分的提取率。
公开号为CN102807565A的专利提出一种提取黄连素的改进方法，步骤为先将黄柏进行粉碎、然后腾冲、再和酶反应、采用石灰乳浸提、然后沉淀结晶、干燥。所述改进方法利用纤维素酶降解细胞壁，使细胞壁受到不同程度的破坏，以增加细胞的通透率，提高细胞中活性成分的浸提率。但所述改进方法受限于纤维素酶与底物黄柏作用的酶解率，使黄柏细胞壁受到的破坏有限，且后续工艺繁琐，造成了小檗碱的损失。故需进一步研制自黄柏中提取小檗碱的工艺。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，所述工艺能够专一且高效地破坏黄柏细胞壁，分离黄柏中的小檗碱，最大程度地保留小檗碱的含量与活性，且操作步骤简单，有利于规模化生产。
本发明的技术方案为，提供一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，包括以下步骤：
(1)将黄柏与水混合，并调节体系pH，得料液；
(2)将甘露聚糖酶加入料液中进行反应，完毕后进行离心，取上层清液；
(3)将上层清液盐析后分离，并干燥分离物，得小檗碱提取物。
植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。甘露聚糖属于半纤维素，不同于其他成分，其在植物细胞壁中以穿插状态分布，通过多个位点与木质素以共价键形式键合，并以氢键形式包裹在纤维素周围。由于酶解具有专一性，故当加入甘露聚糖酶进行反应时，其能针对地分解黄柏细胞壁，快速释放细胞内部物质的同时亦不会对其造成负面影响，这可使得提取率大大提高。
优选地，步骤(1)中，所述黄柏经粉碎，粒度为40～150目。
优选地，步骤(1)中，所述水与黄柏重量比为3～10:1。
优选地，步骤(1)中，所述调节体系pH为以氢氧化钠或者碳酸钠调节体系pH至5～9。
优选地，步骤(2)中，所述甘露聚糖酶与黄柏重量比为0.05～4:100。
优选地，步骤(2)中，所述反应的温度为50～80℃，所述反应的时间为2～48h。
将甘露聚糖酶加入料液中进行反应后，体系除了含有提取成分外，还含种类繁杂的不溶物，这些成分的存在往往使体系呈混悬状态，并影响后续的滤过，为此要离心进行除杂。优选地，步骤(2)中，当离心转速为100～10000r/min，离心时间为10～120min，并控制离心温度为25～80℃时，可有效对体系进行分离。
小檗碱属季铵碱型，能溶解于水相体系，且随水体系温度升高，溶解度有增大趋势，但是其在盐类体系下溶解度骤降，故加入氯化钠减小小檗碱在上层清液中的溶解度，使之析出。优选地，步骤(3)中，当加入占上层清液重量0.5～3％的氯化钠，盐析温度为4～30℃，盐析时间为6～30h时，小檗碱的析出率最高。
优选地，步骤(3)中，所述分离方式采用过滤或离心操作，其中，过滤方法为将分离物经300～500目的滤网过滤；离心方法为将分离物在1000～10000r/min的条件下离心20～30min。
小檗碱在常压条件下熔点为85～86℃，所以应确保干燥温度低于熔点，以粉状固态形式干燥时滤出物比表面积大，干燥速率快，同时考虑到干燥效率，温度亦不可过低。优选地，步骤(3)中，所述干燥温度为60～80℃，干燥时间为8～20h时，对小檗碱提取物的干燥效果最佳。
本发明的有益效果为：本发明所述的基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，经发明人反复试验，从多种酶中筛选出甘露聚糖酶，其能够高效分解黄柏中的β-甘露糖苷键，使得反应体系黏度降低，有利于对黄柏中小檗碱的充分分离和提取，且酶解后的体系仅经离心和盐析即得小檗碱，精简的操作步骤不仅大大减少了小檗碱的损失率，而且有利于规模化生产。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，包括以下步骤：
(1)将黄柏粉碎至40～150目，并与其3倍重量的水混合，加入氢氧化钠调节pH为9，得料液；
(2)将甘露聚糖酶加入料液中，加入的甘露聚糖酶与黄柏的重量比为0.05:100，在50℃条件下反应48h，完毕后在100r/min转速下离心120min，控制离心温度于25～80℃区间内，离心结束后取上层清液；
(3)于上层清液中加入氯化钠进行盐析，加入的氯化钠与上层清液的重量比为0.5:100，在30℃条件下盐析6h后经500目滤网过滤，将滤出物在60℃条件下干燥20h，即得小檗碱提取物。
实施例2
本实施例提供一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，包括以下步骤：
(1)将黄柏粉碎至40～150目，并与其10倍重量的水混合，加入碳酸钠调节pH为5，得料液；
(2)将甘露聚糖酶加入料液中，加入的甘露聚糖酶与黄柏的重量比为4:100，在80℃条件下反应2h，完毕后在10000r/min转速下离心10min，控制离心温度于25～80℃区间内，离心结束后取上层清液；
(3)于上层清液中加入氯化钠进行盐析，加入的氯化钠与上层清液的重量比为3:100，在4℃条件下盐析30h后经300目滤网过滤，将滤出物在80℃条件下干燥8h，即得小檗碱提取物。
实施例3
本实施例提供一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，包括以下步骤：
(1)将黄柏粉碎至40～150目，并与其4.5倍重量的水混合，加入碳酸钠调节pH为7.5，得料液；
(2)将甘露聚糖酶加入料液中，加入的甘露聚糖酶与黄柏的重量比为1.5:100，在75℃条件下反应40h，完毕后在1000r/min转速下离心40min，控制离心温度于25～80℃区间内，离心结束后取上层清液；
(3)于上层清液中加入氯化钠进行盐析，加入的氯化钠与上层清液的重量比为1:100，在25℃条件下盐析10h后在1000r/min的条件下离心30min，将分离物在75℃条件下干燥12h，即得小檗碱提取物。
实施例4
本实施例提供一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，包括以下步骤：
(1)将黄柏粉碎至40～150目，并与其8.5倍重量的水混合，加入氢氧化钠调节pH为6.5，得料液；
(2)将甘露聚糖酶加入料液中，加入的甘露聚糖酶与黄柏的重量比为3:100，在55℃条件下反应10h，完毕后在7000r/min转速下离心20min，控制离心温度于25～80℃区间内，离心结束后取上层清液；
(3)于上层清液中加入氯化钠进行盐析，加入的氯化钠与上层清液的重量比为2.5:100，在10℃条件下盐析25h后在10000r/min的条件下离心20min，将分离物在65℃条件下干燥16h，即得小檗碱提取物。
实施例5
本实施例提供一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，包括以下步骤：
(1)将黄柏粉碎至40～150目，并与其6.5倍重量的水混合，加入氢氧化钠调节pH为7，得料液；
(2)将甘露聚糖酶加入料液中，加入的甘露聚糖酶与黄柏的重量比为2:100，在65℃条件下反应25h，完毕后在4000r/min转速下离心30min，控制离心温度于25～80℃区间内，离心结束后取上层清液；
(3)于上层清液中加入氯化钠进行盐析，加入的氯化钠与上层清液的重量比为2:100，在18℃条件下盐析15h后经400目滤网过滤，将滤出物在70℃条件下干燥14h，即得小檗碱提取物。
对比例1
本对比例提供一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，与实施例1的区别在于，将甘露聚糖酶改为纤维素酶，其他步骤均相同。
对比例2
本对比例提供一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，与实施例2的区别在于，将甘露聚糖酶改为β-葡聚糖酶，其他步骤均相同。
对比例3
本对比例提供一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，与实施例3的区别在于，将甘露聚糖酶改为木聚糖酶，其他步骤均相同。
对比例4
本对比例提供一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，与实施例4的区别在于，将甘露聚糖酶改为植酸酶，其他步骤均相同。
对比例5
本对比例提供一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，与实施例5的区别在于，将甘露聚糖酶改为角质酶，其他步骤均相同。
对实施例1～5和对比例1～5所述工艺进行评测，计算提取率和小檗碱含量，如表1所示。
工艺 提取率 提取物中小檗碱含量
实施例1 75.1％ 83.1％
实施例2 73.6％ 84.6％
实施例3 76.1％ 83.6％
实施例4 75.6％ 82.1％
实施例5 77.1％ 85.2％
对比例1 69.3％ 75.3％
对比例2 65.2％ 71.5％
对比例3 68.1％ 73.2％
对比例4 62.9％ 72.9％
对比例5 64.5％ 72.4％
注：其中A为提取物中小檗碱含量；B为黄柏中小檗碱含量；m为提取物重量；M为黄柏重量。
结果及结论：实施例工艺的提取率和提取物中小檗碱含量均高于对比例，表明相比于纤维素酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、植酸酶和角质酶，甘露聚糖酶对黄柏的酶解效率最佳，对黄柏中小檗碱分离和提取最为充分。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将黄柏与水混合，并调节体系pH，得料液；
(2)将甘露聚糖酶加入料液中进行反应，完毕后进行离心，取上层清液；
(3)将上层清液盐析后分离，并干燥分离物，得小檗碱提取物。
2.根据权利要求1所述的基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，其特征在于，步骤(1)中，所述黄柏经粉碎，粒度为40～150目。
3.根据权利要求1所述的基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，其特征在于，步骤(1)中，所述水与黄柏重量比为3～10:1。
4.根据权利要求1所述的基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，其特征在于，步骤(1)中，所述调节体系pH为以氢氧化钠或者碳酸钠调节体系pH至5～9。
5.根据权利要求1所述的基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，其特征在于，步骤(2)中，所述甘露聚糖酶与黄柏重量比为0.05～4:100。
6.根据权利要求1所述的基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，其特征在于，步骤(2)中，所述反应的温度为50～80℃，所述反应的时间为2～48h。
7.根据权利要求1所述的基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，其特征在于，步骤(2)中，所述离心转速为100～10000r/min，离心时间为10～120min，离心温度为25～80℃。
8.根据权利要求1所述的基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，其特征在于，步骤(3)中，所述盐析为加入占上层清液重量0.5～3％的氯化钠，盐析温度为4～30℃，盐析时间为6～30h。
9.根据权利要求1所述的基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，其特征在于，步骤(3)中，所述分离方式采用过滤或离心，过滤为经300～500目滤网过滤；离心为在1000～10000r/min条件下离心20～30min。
10.根据权利要求1所述的基于酶法自黄柏中提取小檗碱的工艺，其特征在于，步骤(3)中，所述干燥温度为60～80℃，干燥时间8～20h。
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