CN110551118A - 一种黄柏中小檗碱的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄柏中小檗碱的提取方法，涉及中药提取技术领域。该方法包括利用复合益生菌对黄柏进行微生物发酵，接着对发酵产物进行水提，得提取物；其中复合益生菌包括植物乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、丁酸梭菌、汉逊酵母和凝结芽孢杆菌中的至少两种。其利用复合益生菌对黄柏进行微生物发酵预处理，复合益生菌在发酵过程中产生的多种酶可以将黄柏中的粘液质进行分解，解决黄柏传统水提过程中过滤难的问题，同时还能分解黄柏的细胞壁，使小檗碱更易释放出来，此外，在发酵时产生的酸使发酵产物处于酸环境，增加小檗碱在水中的溶解度，可以提高发酵产物提取率，提取效果更佳。

Description

一种黄柏中小檗碱的提取方法

技术领域

本发明涉及中药提取技术领域，具体而言，涉及一种黄柏中小檗碱的提取方法。

背景技术

黄柏为芸香科植物黄皮树的干燥树皮，是常用的中药之一，其主要成分为小檗碱，研究表明不同等级、不同产区与采收期的黄柏，其小檗碱含量都不一样，吴姗姗《不同等级黄柏饮片中小檗碱与黄柏碱含量研究》文献中报道一级饮片小檗碱含量范围为6.4803-8.7309％，二级饮片小檗碱含量范围为3.7038-5.2703％。

小檗碱是一种季铵生物碱，其游离碱为黄色针状结晶，微溶于水，能溶于热水和热乙醇中。小檗碱及其盐类有很好的抗菌作用，体外对多种革兰氏阳性及阴性菌均有抑菌作用，对溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、脑膜炎球菌、志贺痢疾杆菌、伤寒杆菌、白喉杆菌等有较强的抑制作用，低浓度时抑菌，高浓度时杀菌，大量文献报道小檗碱在肿瘤、糖尿病、心血管等方面的疾病有很高的临床应用价值。

目前提取小檗碱的主要方法有：酸水法、石灰乳法和乙醇法。酸水法主要是利用小檗碱在酸性溶液中硫酸盐溶解度大于盐酸盐，所以用少量的硫酸浸提，然后在提取液中加入盐酸转化为盐酸盐而析出，该方法虽然取法工艺简单、成本低，但存在溶剂易腐蚀设备、不安全、不环保等问题；石灰乳法主要是利用游离状态下的小檗碱在水中溶解度大，在提取液中投入石灰乳进行碱化，待其有效成分成游离状态时，再通过盐析和调节酸度提取分离小檗碱，虽然该方法中石灰乳能沉淀黏液质，提取效率优于酸水法，但大量的石灰乳可能引起成分损失，也浪费盐酸，增加了生产成本，污染也大；乙醇法主要是利用小檗碱易溶于热乙醇，难溶于冷乙醇的性质，运用热乙醇将其提出，然后再将其转化为盐酸盐析出，该方法溶剂限制性低、清洁易得并可反复使用、节能环保，但存在回收操作复杂、易燃不安全等缺点。

而采用传统的水煎煮法，具有操作简单，提取溶剂廉价易得且安全无毒，提取过程不污染环境等优点，但黄柏树皮中除含有生物碱外，还富含粘液质，粘液质是与树胶结构相似的多糖类物质，干燥的粘液质为白色粉末，有强烈的吸湿性，在水中能迅速膨胀，溶解形成粘稠的胶浆，使黄柏水提取液黏稠度较大而极难过滤。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄柏中小檗碱的提取方法，其通过微生物发酵对黄柏进行前处理，能够有效解决黄柏中小檗碱传统水提过程中由于粘液质溶胀形成胶浆使水提液稠度高而难过滤的问题，提高小檗碱的提取率。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供一种黄柏中小檗碱的提取方法，利用复合益生菌对黄柏进行微生物发酵，接着对发酵产物进行水提，得提取物；

其中，所述复合益生菌包括植物乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、丁酸梭菌、汉逊酵母和凝结芽孢杆菌中的至少两种。

在可选的实施方式中，进行所述微生物发酵包括将所述复合益生菌制成发酵菌液，然后将所述黄柏和所述发酵菌液置于培养基中进行发酵；

优选地，所述发酵菌液中所述复合益生菌占所述发酵菌液的质量百分数为50％-75％。

在可选的实施方式中，所述复合益生菌中任意一种益生菌占所述发酵菌液的质量百分数为10-40％，优选为20％-30％。

在可选的实施方式中，在进行所述微生物发酵时，将所述黄柏80-100重量份和所述发酵菌液1-3重量份置于所述培养基160-500重量份中进行发酵。

在可选的实施方式中，所述培养基的组分按重量份数计包括氮源10-100份、磷酸氢二钾0.5-0.7份、碳源0.5-0.7份、水150-300份；

优选地，所述氮源为豆粕粉、尿素和玉米浆中的一种或多种；

优选地，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、牛肉膏和蛋白胨中的一种或多种。

在可选的实施方式中，所述微生物发酵为厌氧发酵；

优选地，通过向发酵容器中充入氮气进行厌氧发酵至pH值为3.5-4.5；

优选地，发酵温度为30-50℃；

优选地，发酵时间为24-240小时。

在可选的实施方式中，所述发酵菌液是将所述复合益生菌加水于30-50℃下培养20-30小时获得的。

在可选的实施方式中，对所述发酵产物进行水提包括：先加入所述发酵产物9-11倍量的水进行煎煮提取1-2小时，趁热过滤收集第一滤液；再加入所述发酵产物7-9倍量的水进行煎煮提取0.5-1.5小时，趁热过滤收集第二滤液，合并所述第一滤液和所述第二滤液，接着对合并后的所述第一滤液和所述第二滤液进行浓缩。

在可选的实施方式中，所述黄柏为黄柏粉，优选地所述黄柏粉的粒径为10-80目。

在可选的实施方式中，所述小檗碱的转移率大于81％。

本发明具有以下有益效果：本申请提供的黄柏中小檗碱的提取方法利用复合益生菌对黄柏进行微生物发酵预处理，复合益生菌在发酵过程中会产生多种酶，可以将黄柏中的粘液质进行分解，解决黄柏传统水提过程中过滤难的问题，而本发明复合益生菌还会产生的纤维素酶，对黄柏的细胞壁能起到分解作用，增加细胞的通透性，使黄柏中的小檗碱更易释放出来，同时本发明复合益生菌为产酸菌，经发酵后，发酵产物处于酸环境，增加小檗碱在水中的溶解度，本申请中的复合益生菌具有协同作用，可以提高发酵产物提取率，提取效果更佳。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本申请提供了一种黄柏中小檗碱的提取方法，其包括：

S1、黄柏的准备。

将黄柏进行清理、分拣、去除杂质及发霉、生虫的，然后将黄柏粉碎至10-80目，即得黄柏粉。

S2、发酵菌液的准备。

发酵菌液是将能产酸产纤维素的复合益生菌加水振荡培养后获得的，具体来说，将复合益生菌加水后于温度为30-50℃的条件下培养20-30小时。本实施例中，复合益生菌包括但不限于植物乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、丁酸梭菌、汉逊酵母和凝结芽孢杆菌中的至少两种。经发明人研究发现，将多种益生菌复配使用，效果明显优于单一的益生菌，这是基于本申请所选择的这些益生菌复合后具有多种菌群种类，能够产生多种酶，可以将黄柏中的粘液质进行分解，解决黄柏传统水提过程中过滤难的问题。具体来说，本申请所选择的益生菌可以产生纤维素酶，从而有效分解黄柏的细胞壁，增加细胞的通透性，使得黄柏中的小檗碱更容易释放。此外，本申请所选的益生菌还可以产酸，经发酵过后，发酵产物处于酸性环境下，不同的益生菌产酸能力不同，产生的代谢物也不尽相同。本申请中通过多种益生菌复配，使得产酸能力增强，发酵产物的pH值降低，进而能够增加小檗碱在水中的溶解度，进而提高小檗碱的提取率。

具体到本实施例中，发酵菌液中复合益生菌占发酵菌液的质量百分数为50％-75％。本申请中复合益生菌的用量大，能够有效起到产酸和产纤维素的效果。优选地，复合益生菌中任意一种益生菌占发酵菌液的质量百分数为10-40％，优选为20％-30％。本申请中通过控制每一种益生菌的用量以及复合益生菌的用量，能够保证益生菌的产酸和产纤维素的量。经发明人研究发现，益生菌的用量过少或过多时，会造成复配益生菌的复配效果和协同效果减弱。

S3、培养基的准备。

培养基是为物料发酵提供必须的营养元素，本实施例中的培养基的成分按重量份数计包括但不限于氮源10-100份、磷酸氢二钾0.5-0.7份、碳源0.5-0.7份和水150-300份；优选地，氮源为豆粕粉、尿素和玉米浆中的一种或多种；优选地，碳源为葡萄糖、蔗糖、牛肉膏和蛋白胨中的一种或多种。

S4、将黄柏、发酵菌液和培养基成分混合发酵。

按照黄柏80-100重量份、发酵菌液1-3重量份和培养基160-500份进行配料并进行微生物发酵得到发酵产物。本申请中的微生物发酵为厌氧发酵，具体地，通过向发酵容器中充入氮气进行厌氧发酵至pH值为3.5-4.5；优选地，发酵温度为30-50℃；优选地，发酵时间为24-240小时。

本申请中通过pH值来控制发酵的结束时间，在该pH下发酵产物处于酸性条件下，增加了小檗碱在水中的溶解度，提高小檗碱的提取率。

S5、小檗碱的提取。

将步骤S4获得的发酵产物进行水提。具体来说，先加入发酵产物9-11倍量的水煎煮提取1-2小时，趁热过滤，并收集第一滤液；再加入发酵产物7-9倍量的水，再次煎煮提取0.5-1.5小时，趁热过滤，并收集第二滤液，合并第一滤液和第二滤液，接着对合并后的第一滤液和第二滤液进行浓缩至200-300ml。

在提取了小檗碱后，采用高效液相色谱法测定提取液中小檗碱的含量，计算提取过程中小檗碱的转移率。小檗碱含量以发酵产物中实际所含黄柏量来计算，以盐酸小檗碱计。经检测，采用本申请提供的黄柏中小檗碱的提取方法，小檗碱的转移率大于81％，显著高于现有技术中的普通水提方法获得的小檗碱的转移率。

现有技术中存在利用酶解的方法将黄柏的植物组织进行分解，从而加快有效成分的释放和提取，具体来说，现有技术中主要是利用纤维素酶直接加入后，酶解一段时间，然后再进行常规的提取方式，但是申请人发现，采用这样的方式固然能提高小檗碱的收率，但是效果并不明显，这是基于黄柏富含粘液质，而纤维素酶只能促进黄柏细胞壁的分解，而不能减少黄柏的粘液质，进而导致粘液质溶胀形成胶浆使水提液稠度高而难过滤的问题仍然存在。这也是酶解法主要用于其他含有小檗碱的中药，例如黄连、三颗针的提取中，而在黄柏水提小檗碱中是较少使用的原因。

本申请中通过增加益生菌，利用发酵的过程，产生了多种酶，包括但不限于纤维素酶、甘露聚糖酶，降低了粘液质的粘性，从而有利于后续的过滤和分离。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种黄柏中小檗碱的提取方法，包括如下步骤：

(1)黄柏的准备：将黄柏清理、分拣，去除杂质及发霉、生虫的，之后粉碎至60目，备用；

(2)发酵菌液的准备：将提纯后的植物乳酸杆菌和丁酸梭菌自斜面接入三角瓶中，37℃震荡培养20小时。菌液混合比例为：植物乳酸杆菌30％、丁酸梭菌20％；

(3)培养基的准备：培养基的成分包括豆粕粉、磷酸氢二甲、葡萄糖和水。

(4)微生物发酵：将黄柏100份、益生菌液3份、豆粕粉30份、磷酸氢二甲0.6份、葡萄糖0.6份和水180份用三维混合机充分混匀，装入容器内，充入氮气密封进行厌氧发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为144小时；

(5)小檗碱的提取及转移率：将(4)中发酵产物先用10倍量的水煎煮提取1.5小时，趁热过滤，收集第一滤液，再用8倍量的水煎煮提取1小时，趁热过滤，收集第二滤液，合并第一滤液和第二滤液并浓缩至300mL，之后用高效液相色谱法测定提取液中小檗碱的含量，计算提取过程中小檗碱的转移率。小檗碱含量以发酵产物中实际所含黄柏量来计算，以盐酸小檗碱计。

实施例2

一种黄柏中小檗碱的提取方法，包括如下步骤：

(1)黄柏的准备：将黄柏清理、分拣，去除杂质及发霉、生虫的，之后粉碎至24目，备用；

(2)发酵菌液的准备：将提纯后的丁酸梭菌和凝结芽孢杆菌自斜面接入三角瓶中，30℃震荡培养30小时。菌液混合比例为：丁酸梭菌25％、凝结芽孢杆菌30％；

(3)培养基的准备：培养基的成分包括豆粕粉、磷酸氢二甲、葡萄糖和水。

(4)微生物发酵：将黄柏80份、益生菌液2份、豆粕粉80份、磷酸氢二甲0.5份、葡萄糖0.5份和水250份用三维混合机充分混匀，装入容器内，充入氮气密封进行厌氧发酵，发酵温度为35℃，发酵时间为96小时；

(5)小檗碱的提取及转移率：将(4)中发酵产物先用10倍量的水煎煮提取1.5小时，趁热过滤，收集第一滤液，再用8倍量的水煎煮提取1小时，趁热过滤，收集第二滤液，合并第一滤液和第二滤液并浓缩至300mL，之后用高效液相色谱法测定提取液中小檗碱的含量，计算提取过程中小檗碱的转移率。小檗碱含量以发酵产物中实际所含黄柏量来计算，以盐酸小檗碱计。

实施例3

一种黄柏中小檗碱的提取方法，包括如下步骤：

(1)黄柏的准备：将黄柏清理、分拣，去除杂质及发霉、生虫的，之后粉碎至80目，备用；

(2)发酵菌液的准备：将提纯后的植物乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌和汉逊酵母自斜面接入三角瓶中，40℃震荡培养22小时。菌液混合比例为：植物乳酸杆菌20％、保加利亚乳酸杆菌25％、汉逊酵母25％；

(3)培养基的准备：培养基的成分包括豆粕粉、磷酸氢二甲、葡萄糖和水。

(4)微生物发酵：将黄柏90份、益生菌液2份、豆粕粉100份、磷酸氢二甲0.7份、葡萄糖0.7份和水230份用三维混合机充分混匀，装入容器内，充入氮气密封进行厌氧发酵，发酵温度为45℃，发酵时间为48小时；

(5)小檗碱的提取及转移率：将(4)中发酵产物先用11倍量的水煎煮提取2小时，趁热过滤，收集第一滤液，再用9倍量的水煎煮提取1.5小时，趁热过滤，收集第二滤液，合并第一滤液和第二滤液并浓缩至300mL，之后用高效液相色谱法测定提取液中小檗碱的含量，计算提取过程中小檗碱的转移率。小檗碱含量以发酵产物中实际所含黄柏量来计算，以盐酸小檗碱计。

实施例4

一种黄柏中小檗碱的提取方法，包括如下步骤：

(1)黄柏的准备：将黄柏清理、分拣，去除杂质及发霉、生虫的，之后粉碎至50目，备用；

(2)发酵菌液的准备：将提纯后的丁酸梭菌、汉逊酵母和凝结芽孢杆菌自斜面接入三角瓶中，37℃震荡培养24小时。菌液混合比例为：丁酸梭菌20％、汉逊酵母25％、凝结芽孢杆菌30％；

(3)培养基的准备：培养基的成分包括豆粕粉、磷酸氢二甲、葡萄糖和水。

(4)微生物发酵：将黄柏80份、益生菌液2份、豆粕粉50份、磷酸氢二甲0.5份、葡萄糖0.6份和水150份用三维混合机充分混匀，装入容器内，充入氮气密封进行厌氧发酵，发酵温度为35℃，发酵时间为192小时；

(5)小檗碱的提取及转移率：将(4)中发酵产物先用10倍量的水煎煮提取1.5小时，趁热过滤，收集第一滤液，再用8倍量的水提取1小时，趁热过滤，收集第二滤液，合并第一滤液和第二滤液并浓缩至300mL，之后用高效液相色谱法测定提取液中小檗碱的含量，计算提取过程中小檗碱的转移率。小檗碱含量以发酵产物中实际所含黄柏量来计算，以盐酸小檗碱计。

实施例5

一种黄柏中小檗碱的提取方法，包括如下步骤：

(1)黄柏的准备：将黄柏清理、分拣，去除杂质及发霉、生虫的，之后粉碎至10目，备用；

(2)发酵菌液的准备：将提纯后的保加利亚乳酸杆菌和汉逊酵母自斜面接入三角瓶中，50℃震荡培养20小时。菌液混合比例为：保加利亚乳酸杆菌30％、汉逊酵母25％；

(3)培养基的准备：培养基的成分包括豆粕粉、磷酸氢二甲、葡萄糖和水。

(4)微生物发酵：将黄柏100份、益生菌液3份、豆粕粉60份、磷酸氢二甲0.6份、葡萄糖0.7份和水200份用三维混合机充分混匀，装入容器内，充入氮气密封进行厌氧发酵，发酵温度为40℃，发酵时间为120小时；

(5)小檗碱的提取及转移率：将(4)中发酵产物先用9倍量的水煎煮提取1小时，趁热过滤，收集第一滤液，再用7倍量的水煎煮提取0.5小时，趁热过滤，收集第二滤液，合并第一滤液和第二滤液并浓缩至300mL，之后用高效液相色谱法测定提取液中小檗碱的含量，计算提取过程中小檗碱的转移率。小檗碱含量以发酵产物中实际所含黄柏量来计算，以盐酸小檗碱计。

实施例6-7

本实施例与实施例5基本相同，区别在于，菌液中益生菌的用量不同：

实施例6中，菌液混合比例为：保加利亚乳酸杆菌15％、汉逊酵母40％；

实施例7中，菌液混合比例为：保加利亚乳酸杆菌5％、汉逊酵母50％。

对比例1

本对比例提供一种传统水提法自黄柏中提取小檗碱的工艺，与实施例1的区别在于，未将黄柏进行微生物前处理，后续水提方法及小檗碱转移率计算方法均相同。

对比例2

本对比例提供一种单一微生物前处理法自黄柏中提取小檗碱的工艺，与实施例1的区别在于，将混合菌液换成单一的植物乳酸杆菌液，以黄柏100份、植物乳酸杆菌液3份、豆粕粉30份、磷酸氢二甲0.6份、葡萄糖0.6份、水180份，混匀37℃发酵144小时，后续水提方法及小檗碱转移率计算方法均相同。

对比例3

本对比例提供一种酸水法自黄柏中提取小檗碱的工艺，与实施例1的区别在于，未将黄柏进行微生物前处理，提取时用0.5％硫酸溶液浸泡24小时，次日，把浸泡液倒出，后续小檗碱转移率计算方法相同。

对比例4

本对比例提供一种石灰乳法自黄柏中提取小檗碱的工艺，与实施例1的区别在于，未将黄柏进行微生物前处理，提取时将黄柏置于饱和石灰水中浸泡12小时，之后用水渗漉，收集渗漉液，加入渗漉液7％(质量浓度)的固体食盐，搅拌后放置过夜，过滤，沉淀，加30倍热水溶解，趁热过滤，后续小檗碱转移率计算方法相同。

对比例5

本对比例提供一种乙醇法自黄柏中提取小檗碱的工艺，与实施例1的区别在于，未将黄柏进行微生物前处理，提取时首次用9倍60％乙醇先浸泡1小时，提取1.5小时，趁热过滤，后再用9倍60％乙醇提取2次，趁热过滤，每次1小时，合并所有滤液，后续小檗碱转移率计算方法相同。

对比例6

本对比例提供一种酶解黄柏前处理法自黄柏中提取小檗碱的工艺，与实施例1的区别在于，未将黄柏与发酵菌液混合发酵，直接向黄柏中加入缓冲液和纤维素酶，酶解1小时后过滤，然后再进行后续的水提。

对实施例1～7和对比例1～6所述工艺进行评测，对比提取溶剂，观察提取液性状，计算小檗碱转移率，结果如表1：

表1.各示例的小檗碱转移率的结果统计

结果分析：

实施例5与实施例6-7相比，实施例5的提取小檗碱转移率优于实施例6-7，这说明菌液中某一益生菌的用量比过多或过少时，会影响复合益生菌的协同作用，从而影响小檗碱的转移率。与对比例1相比，实施例1～7的提取溶剂与其相同，但提取液较之澄清，易过滤，说明黄柏经微生物前处理后，其中粘液质可被分解，更利于黄柏水提液的过滤，而实施例1～7的小檗碱转移率均高于对比例1，说明发酵后发酵产物的酸环境更利于小檗碱的溶出，这在生产中可极大提高经济效益；与对比例2相比，实施例1～5的小檗碱转移率均更高，说明复合菌液具有协同作用，可以提高发酵产物提取率；与对比例3～5相比，实施例1～5的提取液性状与之相同，都澄清易过滤，且小檗碱转移率也相差不大，但是相比提取溶剂，实施例1～5的溶剂廉价易得且安全环保，而对比例3的溶剂易腐蚀设备，不安全、不环保，对比例4的溶剂用量大且污染环境，对比例5的溶剂虽然清洁易得，可反复使用，但回收操作复杂，且易燃不安全。而对比例6虽然相较于对比例1而言，小檗碱转移率提高，但是提取液的性状仍然呈浑浊，不易过滤的状态，这表明，单一的纤维素酶是分解粘液质的效果并不理想。综合所述，以微生物前处理黄柏后再用传统法水提小檗碱，具有安全高效，节资环保的优点，适合企业规模化生产，且运用复合菌液可以提高小檗碱转移率。

综上所述，本申请提供的黄柏中小檗碱的提取方法利用复合益生菌培养获得的发酵菌液对黄柏进行预处理，发酵菌液在发酵过程中会产生多种酶，可以将黄柏中的粘液质进行分解，解决黄柏传统水提过程中过滤难的问题，而本发明复合益生菌还会产生的纤维素酶，对黄柏的细胞壁能起到分解作用，增加细胞的通透性，使黄柏中的小檗碱更易释放出来，同时本发明复合益生菌为产酸菌，经发酵后，发酵产物处于酸环境，增加小檗碱在水中的溶解度，本申请中的复合益生菌具有协同作用，可以提高发酵产物提取率，提取效果更佳。

本发明利用发酵菌液对黄柏进行前处理，再水提小檗碱，其工艺与现在常用的酸水法、石灰乳法、乙醇法等工艺相比，所用溶剂简单易得，工艺成本低，操作简单易行，提取耗能低，安全性高，不产生任何污染废液废气，而且发酵是在较温和的条件下进行生物转化，能最大限度地保护小檗碱免遭损失；同时采用微生物发酵生产酶的方法绿色环保，比传统的酶解法节约成本。

通常中药的有效成分经提取后，废渣即被直接倒掉，对环境造成极大的污染，也浪费中药资源，而经微生物转化技术对中药进行发酵，可充分释放有效成分，提高其有效成分的含量，在临床上可减少中药使用量，节约中药资源，还能将中药中的纤维素、木质素等大分子物质降解，将中药转化为菌体蛋白和多糖等，充分利用药渣，很好的解决废渣的问题，为生态环境改善做出重大贡献。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种黄柏中小檗碱的提取方法，其特征在于，其包括利用复合益生菌对黄柏进行微生物发酵，接着对发酵产物进行水提，得提取物；

其中，所述复合益生菌包括植物乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、丁酸梭菌、汉逊酵母和凝结芽孢杆菌中的至少两种。

2.根据权利要求1所述的黄柏中小檗碱的提取方法，其特征在于，进行所述微生物发酵包括将所述复合益生菌制成发酵菌液，然后将所述黄柏和所述发酵菌液置于培养基中进行发酵；

优选地，所述发酵菌液中所述复合益生菌占所述发酵菌液的质量百分数为50％-75％。

3.根据权利要求2所述的黄柏中小檗碱的提取方法，其特征在于，所述复合益生菌中任意一种益生菌占所述发酵菌液的质量百分数为10-40％，优选为20％-30％。

4.根据权利要求2所述的黄柏中小檗碱的提取方法，其特征在于，在进行所述微生物发酵时，将所述黄柏80-100重量份和所述发酵菌液1-3重量份置于所述培养基160-500重量份中进行发酵。

5.根据权利要求4所述的黄柏中小檗碱的提取方法，其特征在于，所述培养基的组分按重量份数计包括氮源10-100份、磷酸氢二钾0.5-0.7份、碳源0.5-0.7份和水150-300份；

优选地，所述氮源为豆粕粉、尿素和玉米浆中的一种或多种；

优选地，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、牛肉膏和蛋白胨中的一种或多种。

6.根据权利要求2所述的黄柏中小檗碱的提取方法，其特征在于，所述发酵菌液是将所述复合益生菌加水于30-50℃下培养20-30小时获得的。

7.根据权利要求1所述的黄柏中小檗碱的提取方法，其特征在于，所述微生物发酵为厌氧发酵；

优选地，通过向发酵容器中充入氮气进行厌氧发酵至pH值为3.5-4.5；

优选地，发酵温度为30-50℃；

优选地，发酵时间为24-240小时。

8.根据权利要求1所述的黄柏中小檗碱的提取方法，其特征在于，对所述发酵产物进行水提包括：先加入所述发酵产物9-11倍量的水进行煎煮提取1-2小时，趁热过滤收集第一滤液；再加入所述发酵产物7-9倍量的水进行煎煮提取0.5-1.5小时，趁热过滤收集第二滤液，合并所述第一滤液和所述第二滤液，接着对合并后的所述第一滤液和所述第二滤液进行浓缩。

9.根据权利要求1所述的黄柏中小檗碱的提取方法，其特征在于，所述黄柏为黄柏粉，优选地所述黄柏粉的粒径为10-80目。

10.根据权利要求1所述的黄柏中小檗碱的提取方法，其特征在于，所述小檗碱的转移率大于81％。