CN108883306A - 神经再生诱导材料 - Google Patents

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谷原正夫
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Mochida Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明提供一种用于神经损伤部的再生的非管状的神经再生诱导用材料，该材料包含：(A)将低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类用选自下述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂进行了共价键交联的交联体；以及(B)生物吸收性高分子。R1HN‑(CH2)n‑NHR2…(I)。[式中，R1和R2分别独立表示氢原子或者式‑COCH(NH2)‑(CH2)4‑NH2所表示的基团，n表示2～18的整数]。由此，提供一种能够诱导神经损伤部的再生的医疗用材料。

Description

神经再生诱导材料
技术领域
本发明涉及用于使神经的损伤部再生的神经再生诱导用材料。
背景技术
作为针对由外伤或肿瘤切除等引起的神经损伤的治疗方法，进行将已切断的神经彼此直接缝合的神经缝合、或者采集患者自身的健康神经并将其移植到损伤部的自体神经移植等。然而，在直接缝合神经的方法中，有时会施加张力而残留知觉异常或疼痛，自体神经移植则存在以下问题：牺牲了健康部位的神经，并且，神经采集部有时会出现疼痛或麻木等。
从1980年代初期开始，人们尝试着使用生物相容性材料连接末梢神经的断裂部位以使神经再生，对于直线状的神经缺损部，存在着几种用于神经再生的器具。例如，“ナーブリッジTM”是由聚乙醇酸和胶原构成的神经再生诱导管。然而，ナーブリッジ呈圆柱状，覆盖内腔的胶原的外侧的原材料硬，无法用于手指脚趾等的关节或关节附近部位等可动范围大的部分或者需要三维弯曲的部分的神经重建。另外，需要将已断裂的神经的末端拉入管内并通过缝合来固定，故手术繁杂，由于其内径也是固定的，所以通常必须要准备多个内径规格。另外，还无法用于神经分支部或神经丛部的缺损部，必须只将已断裂的神经的断端明确的神经以1：1进行接合。此外，作为以1：1接合神经的管，存在着由聚乳酸和ε-己内酰胺的共聚物构成的“NEUROLAC (注册商标)”等。
使用通过乙二胺进行共价键交联而制作的海藻酸海绵，显示出对直线状的神经缺损部的神经再生效果(专利文献1)。
有人公开了：将海藻酸盐凝胶加工成管状并用聚乙醇酸覆盖、再进行冷冻干燥而得到的材料使猫坐骨神经的大腿部的50mm的缺口再生(非专利文献1)。认为在猫坐骨神经缺口的再生中，海藻酸盐凝胶是管状器具还是非管状器具，在效果上并没有差别。非管状的器具是用两片海绵夹持神经的缺口而设置(非专利文献2)。公开了与此相关的技术(非专利文献3～6)。
有对大鼠脊髄的2mm的缺口使用海藻酸盐海绵的例子(非专利文献7)。
有人公开了：使用海藻酸海绵使猫面部神经背侧支的5mm的缺口再生。然而，神经的切断部位不是分支部(非专利文献8)。
有使用海藻酸盐凝胶海绵片使大鼠阴茎海绵体神经的2mm的缺口再生的文献(非专利文献9～14)。认为神经的切断部位是距骨盆神经节1mm的下游的海绵体神经，因此很难认为是分支的神经。关于阴茎海绵体神经的再生，有使用海藻酸盐凝胶海绵片作为施用来自人骨髄的CD133+细胞的基材的例子，但仅凭海藻酸盐凝胶海绵片无法获得显著的再生效果(非专利文献15)。另外，有在大鼠骨盆神经丛的约2mm的神经缺损部贴附海藻酸凝胶来尝试着使其再生的例子(非专利文献16、17)。在这些文献中，所使用的海藻酸盐片的细节尚不明确，另外，其效果还谈不上充分。
上述见解中的海藻酸盐海绵使用了未进行低内毒素处理的海藻酸钠，不是使用低内毒素海藻酸钠制作的海绵。
如上所述，迄今为止使用器具进行尝试的神经的再生基本上是针对直线状的神经缺损部，能够促进神经分支部或神经丛部的缺损部的再生的可实用化的材料尚属未知。
有人公开了含有由生物吸收性材料构成的无纺布和海藻酸钠的生物体组织加固材料套装(专利文献2)。然而，海藻酸钠未经交联即进行使用，另外也不是以神经再生为目的的材料。
有几篇评价多糖类等高分子材料与γ射线或电子射线的关系的文献。专利文献3公开了对由透明质酸单独形成的凝胶照射γ射线、电子射线、等离子体等而得到的凝胶。据说明，透明质酸单独的凝胶是指，除透明质酸以外未使用化学交联剂等，进行自身交联而获得的凝胶。专利文献4公开了在化学、热或者放射线等条件下由生物降解性聚合物构成的植入物。非专利文献18公开了：对组织工程学用海藻酸盐纳米纤维照射γ射线，通过γ射线照射量来控制崩解率的技术。另外，在有关使用了海藻酸的神经再生材料的文献中，记载着海藻酸凝胶的生物吸收性可以通过γ射线照射量来控制(非专利文献19)。然而，迄今为止，对材料照射γ射线或电子射线与神经再生的关系具体说来还尚未明确。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4531887号说明书；
专利文献2：日本特开2013-165884号公报；
专利文献3：日本特开2000-237294号公报；
专利文献4：美国专利申请公开2007/0203564号说明书；
非专利文献
非专利文献1：Neuroscience Letters, 259 (1999) 75-78；
非专利文献2：Journal of Neurotrauma, 第18卷, No.3 (2001), 第329-338页；
非专利文献3：J Biomed Mater Res, (2000) 49, 第528-533页；
非专利文献4：Exp Brain Res (2002) 146: 第356-368页；
非专利文献5：J Materials science: Materials in medicine, 16 (2005), 第503-509页；
非专利文献6：J Biomed Mater Res Pt A : 71A(4) (2004) 第661-668页；
非专利文献7：Journal of Biomedical Materials Research, 第54卷, 第373-384页(2001)；
非专利文献8：Scandinavian Journal of Plastic and Reconstructive Surgeryand Hand Surgery 2002; 36: 135-140；
非专利文献9：Urology 68: 1366-1371 (2006)；
非专利文献10：日本泌尿系统科学会杂志(2006)97卷2号 APP-089,
http://togodb.dbcls.jp/yokou_abstract/show/200601893130275；
非专利文献11：The Journal of Urology (2006) 第75卷. No.4增刊, 第421页,1307；
非专利文献12：日本泌尿系统科学会杂志(2007)98卷2号；
http://togodb.dbcls.jp/yokou_abstract/show/200701846760209 WS5-6；
非专利文献13：Urology View 第4卷, No.4, 第74-79页；
非专利文献14：泌尿系统外科(2009)22(2) 第133-138页；
非专利文献15：J Sex Med 2014; 11:第1148-1158页；
非专利文献16：日本泌尿系统科学会杂志(2005) 96卷2号 OP4-026；
http://togodb.dbcls.jp/yokou_abstract/show/200501884320564；
非专利文献17：The Journal of Urology (2005) 第173卷, No.4增刊, 第333页,1228；
非专利文献18：Tissue Engineering and Regenerative Medicine 第11卷增刊2, 第64-71页 (2014)；
非专利文献19：医学进展 (2005) 第215卷, No.10, 第867-873页。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题之一在于：提供一种能够诱导神经分支部和/或神经丛部的损伤部的再生的医疗用材料。
另外，本发明的另一课题在于：提供一种医疗用材料，该医疗用材料既可应用于直线状的神经损伤部，也可应用于神经分支部和/或神经丛部的损伤部，神经再生诱导效果高、安全，生物相容性优异。
另外，本发明的又一课题在于：提供一种非管状的神经再生诱导用材料，该材料具备可缝合的适度的强度，同时即使在不缝合的情况下也能够发挥神经再生效果，容易适用于各种场所或形状的损伤。
解决课题的方法
本发明是基于下述见解而提出的：包含将低内毒素海藻酸钠用下述通式(I)所表示的化合物和/或其盐进行共价键交联而制作的干凝胶状海藻酸交联体的神经再生诱导用材料诱导了大鼠坐骨神经的Y字形分支部的缺口的再生。迄今为止，还没有使用器具尝试进行坐骨神经分支部的缺口的再生诱导。本发明的神经再生诱导用材料在坐骨神经分支部的缺口中通过将1个神经断端部和多个神经断端部连接来诱导神经的再生，这是由以往的见解无法想到的出乎意料之处。
在本发明的另一方案中，使用包含将低内毒素海藻酸钠用下述通式(I)所表示的化合物和/或其盐进行共价键交联、并照射电子射线而获得的干凝胶状海藻酸交联体的神经再生诱导用材料，评价大鼠神经缺损部的再生诱导效果时发现：与没有照射电子射线的神经再生诱导用材料相比，照射了电子射线的神经再生诱导用材料的神经再生诱导效果提高。另外还发现：包含海藻酸交联体的神经再生诱导用材料的生物体内消失(残留)时间会影响到神经再生诱导效果；通过电子射线或γ射线的剂量等可以控制材料的生物体内消失；以及神经再生所期望的交联体的消失模式。另外，与不含生物吸收性高分子的材料相比，还包含生物吸收性高分子的神经再生诱导用材料的再生不充分的例子少，暗示了稳定地再生神经损伤部的可能性。这是意料之外的效果。另外还发现：包含生物吸收性高分子的神经再生诱导用材料根据需要也可以缝合，还能够抑制冷冻干燥时的材料的变形，操作性也优异，从而完成了本发明。
即，本发明的第1方案是提供以下的神经再生诱导用材料。
(1-1) 一种用于神经分支部和/或神经丛部的损伤部的再生的神经再生诱导用材料，包含将低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类用选自下述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂进行了共价键交联的交联体：
R1HN-(CH2)n-NHR2 (I)
式中，R1和R2分别独立表示氢原子或者式-COCH(NH2)-(CH2)4-NH2所表示的基团，n表示2～18的整数。
(1-2) (1-1)所述的神经再生诱导用材料，其中分子内具有羧基的生物吸收性多糖类为选自海藻酸、其酯及其盐的至少一种。
(1-3) (1-1)或(1-2)的任一项所述的神经再生诱导用材料，其中交联性试剂为上述通式(I)所表示的化合物的N-羟基琥珀酰亚胺盐。
(1-4) (1-3)所述的神经再生诱导用材料，其中上述通式(I)所表示的化合物的N-羟基琥珀酰亚胺盐为选自二氨基乙烷的二N-羟基琥珀酰亚胺盐、二氨基己烷的二N-羟基琥珀酰亚胺盐、N,N’-二赖氨酰-二氨基乙烷的四N-羟基琥珀酰亚胺盐和N-赖氨酰-二氨基己烷的三N-羟基琥珀酰亚胺盐的至少一种。
(1-5) (1-1)～(1-4)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料为干凝胶的形态。
(1-6) (1-1)～(1-5)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中分子内具有羧基的生物吸收性多糖类为100EU/g以下的内毒素含量。
(1-7) (1-1)～(1-6)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中神经分支部和/或神经丛部的损伤部存在于选自前列腺、腕、脑、脊髄、面部、颈、腰、骶骨、腰骶骨、阴部、心脏、腹腔和肠壁内部的至少一种中。
(1-7a) (1-1)～(1-6)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中神经分支部和/或神经丛部的损伤部存在于选自前列腺、膀胱、阴茎海绵体、腕、四肢、脑、脊髄、面部、颈、腰、骶骨、腰骶骨、阴部、心脏、腹腔、下小腹、骨盆、胸腔内部和肠壁内部的至少一种中。
(1-8) (1-1)～(1-7a)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料用于淋巴结清扫术所伴随的神经损伤部的再生。
(1-9) 在需要神经再生的对象中诱导神经分支部和/或神经丛部的损伤部的再生的方法，该方法包括以下步骤：将神经再生诱导用材料应用于神经分支部和/或神经丛部的损伤部，所述神经再生诱导用材料包含：将低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类用选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂进行了共价键交联的交联体。
(1-9a) 在需要神经再生的对象中诱导神经分支部和/或神经丛部的损伤部的再生的方法，该方法包括以下步骤：将(1-1)～(1-8)中任一项所述的神经再生诱导用材料应用于神经分支部和/或神经丛部的损伤部。
(1-10) 上述低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类，其用于在使用神经再生诱导用材料的神经分支部和/或神经丛部的损伤部的再生中使用，所述神经再生诱导用材料包含将低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类用选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的交联性试剂进行了共价键交联的交联体。
(1-10a) 上述低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类，其用于在使用(1-1)～(1-8)中任一项所述的神经再生诱导用材料的神经分支部和/或神经丛部的损伤部的再生中使用。
(1-11) 上述低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类和/或选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂在制造(1-1)～(1-8)中任一项所述的神经再生诱导用材料中的用途，其中上述神经再生诱导用材料被用于神经分支部和/或神经丛部的损伤部以使神经再生。
另外，本发明的第2方案是提供以下的神经再生诱导用材料。
(2-1) 一种神经再生诱导用材料，包含将低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类用选自下述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂进行共价键交联、并照射电子射线和/或γ射线而获得的交联体。
R1HN-(CH2)n-NHR2 (I)
式中，R1和R2分别独立表示氢原子或者式-COCH(NH2)-(CH2)4-NH2所表示的基团，n表示2～18的整数。
(2-2) (2-1)所述的神经再生诱导用材料，其中分子内具有羧基的生物吸收性多糖类为选自海藻酸、其酯及其盐的至少一种。
(2-3) (2-1)或(2-2)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中交联性试剂为上述通式(I)所表示的化合物的N-羟基琥珀酰亚胺盐。
(2-4) (2-3)所述的神经再生诱导用材料，其中上述通式(I)所表示的化合物的N-羟基琥珀酰亚胺盐为选自二氨基乙烷的二N-羟基琥珀酰亚胺盐、二氨基己烷的二N-羟基琥珀酰亚胺盐、N,N’-二赖氨酰-二氨基乙烷的四N-羟基琥珀酰亚胺盐和N-赖氨酰-二氨基己烷的三N-羟基琥珀酰亚胺盐的至少一种。
(2-5) (2-1)～(2-4)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料为干凝胶的形态。
(2-6) (2-1)～(2-5)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中分子内具有羧基的生物吸收性多糖类为100EU/g以下的内毒素含量。
(2-7) (2-1)～(2-6)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料以1kGy～100kGy的吸收剂量照射了电子射线和/或γ射线。
(2-8) (2-1)～(2-7)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料用7天～270天从应用部位消失。
(2-9) (2-1)～(2-8)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料还含有选自聚乙醇酸、聚乳酸以及它们的共聚物的至少一种。
(2-10) (2-1)～(2-9)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料用于末梢神经和/或中枢神经的损伤部的再生。
(2-11) (2-1)～(2-10)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料用于淋巴结清扫术所伴随的神经损伤部的再生。
(2-12) (2-1)～(2-11)中任一项所述的神经再生诱导用材料，与未照射电子射线和/或γ射线的材料相比，该材料从体内的应用部位消失为止的时间短。
(2-13) 在需要神经的损伤部再生的对象中诱导神经损伤部再生的方法，该方法包括以下步骤：将(2-1)～(2-12)中任一项所述的神经再生诱导用材料应用于神经损伤部。
(2-13a) 上述低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类，其用于在使用(2-1)～(2-12)中任一项所述的神经再生诱导用材料的神经损伤部的再生中使用。
(2-13b) 上述低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类和/或选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂在制造(2-1)～(2-12)中任一项所述的神经再生诱导用材料中的用途，其中上述神经再生诱导用材料被用于神经损伤部以使神经再生。
(2-14) 调节神经再生诱导用材料的体内残留时间的方法，该方法包括：对神经再生诱导用材料照射电子射线和/或γ射线的步骤，所述神经再生诱导用材料包含将低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类用选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂进行了共价键交联的交联体。
(2-15) 神经再生诱导用材料的制造方法，该方法至少包括以下步骤：对材料照射电子射线和/或γ射线，所述材料包含使用低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类和选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂进行了共价键交联的交联体。
另外，本发明的第3方案是提供以下的神经再生诱导用材料。
(3-1) 一种神经再生诱导用材料，包含将选自通过GPC-MALS测定的重均分子量为9万～70万的低内毒素的海藻酸、其酯及其盐的至少一种用选自下述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂进行了共价键交联的交联体。
R1HN-(CH2)n-NHR2 (I)
式中，R1和R2分别独立表示氢原子或者式-COCH(NH2)-(CH2)4-NH2所表示的基团，n表示2～18的整数。
(3-2) (3-1)所述的神经再生诱导用材料，其中选自低内毒素的海藻酸、其酯及其盐的至少一种的M/G比为0.5～3.0。
(3-3) 在需要神经损伤部再生的对象中诱导神经损伤部再生的方法，该方法包括以下步骤：将(3-1)或(3-2)所述的神经再生诱导用材料应用于神经损伤部。
(3-3b) 上述低内毒素的海藻酸、其酯或其盐，用于在使用(3-1)或(3-2)所述的神经再生诱导用材料的神经损伤部的再生中使用。
(3-3c) 上述低内毒素的海藻酸、其酯或其盐和/或选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂在制造(3-1)或(3-2)所述的神经再生诱导用材料中的用途，其中上述神经再生诱导用材料被用于神经损伤部以使神经再生。
另外，本发明的第4方案是提供以下的神经再生诱导用材料。
(4-1) 一种神经再生诱导用材料，包含将低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类用选自下述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂进行了共价键交联的交联体。
R1HN-(CH2)n-NHR2　　(I)
式中，R1和R2分别独立表示氢原子或者式-COCH(NH2)-(CH2)4-NH2所表示的基团，n表示2～18的整数。
(4-2) (4-1)所述的神经再生诱导用材料，其中分子内具有羧基的生物吸收性多糖类为选自海藻酸、其酯及其盐的至少一种。
(4-3) (4-1)或(4-2)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中交联性试剂为上述通式(I)所表示的化合物的N-羟基琥珀酰亚胺盐。
(4-4) (4-3)所述的神经再生诱导用材料，其中上述通式(I)所表示的化合物的N-羟基琥珀酰亚胺盐为选自二氨基乙烷的二N-羟基琥珀酰亚胺盐、二氨基己烷的二N-羟基琥珀酰亚胺盐、N,N’-二赖氨酰-二氨基乙烷的四N-羟基琥珀酰亚胺盐和N-赖氨酰-二氨基己烷的三N-羟基琥珀酰亚胺盐的至少一种。
(4-5) (4-1)～(4-4)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料为干凝胶的形态。
(4-6) (4-1)～(4-5)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中选自低内毒素的海藻酸、其酯及其盐的至少一种的通过GPC-MALS测定的重均分子量为9万～70万。
(4-7) (4-1)～(4-6)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中选自低内毒素的海藻酸、其酯及其盐的至少一种的M/G比为0.5～3.0。
(4-8) (4-1)～(4-7)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中分子内具有羧基的生物吸收性多糖类为100EU/g以下的内毒素含量。
(4-9) (4-1)～(4-8)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料还含有选自聚乙醇酸、聚乳酸、以及它们的共聚物的至少一种。
(4-10) (4-1)～(4-9)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料用7天～270天从应用部位消失。
(4-11) (4-1)～(4-10)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料被照射了电子射线和/或γ射线。
(4-12) (4-11)所述的神经再生诱导用材料，该材料以1kGy～100kGy的吸收剂量照射了电子射线和/或γ射线。
(4-13) (4-1)～(4-12)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料用于末梢神经和/或中枢神经的损伤部的再生。
(4-14) (4-1)～(4-10)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料用于神经分支部和/或神经丛的损伤部的再生。
(4-15) (4-14)所述的神经再生诱导用材料，其中神经分支部和/或神经丛部的损伤部存在于选自前列腺、腕、脑、脊髄、面部、颈、腰、骶骨、腰骶骨、阴部、心脏、腹腔和肠壁内部的至少一种中。
(4-15a) (4-14)所述的神经再生诱导用材料，其中神经分支部和/或神经丛部的损伤部存在于选自前列腺、膀胱、阴茎海绵体、腕、四肢、脑、脊髄、面部、颈、腰、骶骨、腰骶骨、阴部、心脏、腹腔、下小腹、骨盆、胸腔内部和肠壁内部的至少一种中。
(4-16) (4-13)所述的神经再生诱导用材料，该材料用于淋巴结清扫术所伴随的神经损伤部的再生。
(4-17) 在需要神经损伤部再生的对象中诱导神经损伤部再生的方法，该方法包括以下步骤：将(4-1)～(4-14)中任一项所述的神经再生诱导用材料应用于神经损伤部。
(4-17a) 上述低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类，其用于在使用(4-1)～(4-14)中任一项所述的神经再生诱导用材料的神经损伤部的再生中使用。
(4-17c) 上述低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类和/或选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂在制造(4-1)～(4-14)中任一项所述的神经再生诱导用材料中的用途，其中上述神经再生诱导用材料被用于神经损伤部以使神经再生。
另外，本发明的第5方案是提供以下的神经再生诱导用材料。
(5-1) 一种用于神经损伤部的再生的非管状的神经再生诱导用材料，该材料包含：(A)将低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类用选自下述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂进行了共价键交联的交联体；以及(B)生物吸收性高分子。
R1HN-(CH2)n-NHR2　　(I)
式中，R1和R2分别独立表示氢原子或者式-COCH(NH2)-(CH2)4-NH2所表示的基团，n表示2～18的整数。
(5-2) (5-1)所述的神经再生诱导用材料，其中分子内具有羧基的生物吸收性多糖类为选自海藻酸、其酯及其盐的至少一种。
(5-3) (5-1)或(5-2)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中交联性试剂为上述通式(I)所表示的化合物的N-羟基琥珀酰亚胺盐。
(5-4) (5-3)所述的神经再生诱导用材料，其中上述通式(I)所表示的化合物的N-羟基琥珀酰亚胺盐为选自二氨基乙烷的二N-羟基琥珀酰亚胺盐、二氨基己烷的二N-羟基琥珀酰亚胺盐、N,N’-二赖氨酰-二氨基乙烷的四N-羟基琥珀酰亚胺盐和N-赖氨酰-二氨基己烷的三N-羟基琥珀酰亚胺盐的至少一种。
(5-5) (5-1)～(5-4)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料为干凝胶的形态。
(5-6) (5-1)～(5-5)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中生物吸收性高分子为选自聚乙醇酸、聚乳酸和它们的共聚物、以及聚己内酯的至少一种。
(5-7) (5-1)～(5-6)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料以1kGy～100kGy的吸收剂量照射了电子射线和/或γ射线。
(5-8) (5-1)～(5-7)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中，在进行如下的撕裂试验时，最大试验力(荷重)为0.10(N)～10.0(N)：将上述材料剪成纵2cm×横2cm的尺寸(不管厚度如何)，在距其1个裁剪面5mm的位置用双夹把持以夹住该材料(把持部A)，将该材料的从把持部A所相对的裁剪面(B)到10mm的区域在生理盐水中浸渍15分钟，之后使带针的缝合线贯穿该材料的距该裁剪面(B)5mm的位置的中央部，将缝合线的两端固定在器具上，将该把持部A以10mm/分钟的速度沿材料的正方形面水平地拉伸。
(5-9) (5-2)～(5-8)中任一项所述的神经再生诱导剂用材料，其中上述材料中的选自海藻酸、其酯及其盐的至少一种的含量换算成海藻酸钠为0.2mg/cm2～12mg/cm2。
(5-10) (5-1)～(5-9)中任一项所述的神经再生诱导剂用材料，其中上述材料中的生物吸收性高分子的含量为0.05mg/cm2～30mg/cm2。
(5-11) (5-1)～(5-10)中任一项所述的神经再生诱导剂用材料，该材料用于末梢神经和/或中枢神经的损伤部的再生。
(5-12) (5-1)～(5-11)中任一项所述的神经再生诱导剂用材料，该材料用于神经分支部和/或神经丛部的损伤部的再生。
(5-13) (5-12)所述的神经再生诱导用材料，其中神经分支部和/或神经丛部的损伤部存在于选自前列腺、膀胱、阴茎海绵体、腕、四肢、脑、脊髄、面部、颈、腰、骶骨、腰骶骨、阴部、心脏、腹腔、下小腹、骨盆、胸腔内部和肠壁内部的至少一种中。
(5-14) (5-1)～(5-13)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料用于选自肿瘤切除、淋巴结清扫术和/或外伤所伴随的神经损伤部的再生、以及组织重建所伴随的神经损伤部的再生的至少一种的神经损伤部的再生。
(5-15) (5-2)～(5-14)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中上述选自低内毒素的海藻酸、其酯及其盐的至少一种的通过GPC-MALS法测定的重均分子量(绝对分子量)为8万以上。
(5-16) (5-2)～(5-15)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中上述选自低内毒素的海藻酸、其酯及其盐的至少一种的M/G比为0.4～3.0。
(5-17) 一种诱导神经损伤部再生的方法，该方法包括以下步骤：将(5-1)～(5-16)中任一项所述的神经再生诱导用材料应用于需要治疗的对象的神经损伤部。
(5-18) 用于在神经损伤部的再生中使用的上述低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类，所述神经损伤部的再生包括将(5-1)～(5-16)中任一项所述的神经再生诱导用材料应用于需要治疗的对象的神经损伤部。
(5-18a) 上述低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类和/或选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂在制造(5-1)～(5-16)中任一项所述的神经再生诱导用材料中的用途，其中将上述神经再生诱导用材料应用于神经损伤部以使神经再生。
(5-19) 调节神经再生诱导用材料的体内残留时间的方法，该方法至少包括以下步骤：
对包含(A)将低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类用选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂进行了共价键交联的交联体、以及(B)生物吸收性高分子的交联体照射电子射线和/或γ射线。
另外，本发明的第6方案是提供以下的神经再生诱导用材料的制造方法。
(6-1) 一种神经再生诱导用材料的制造方法，至少包括以下步骤：
步骤(1)：将包含低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类的溶液和选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂混合；
步骤(2)：将(1)中得到的混合物和生物吸收性高分子放入模具中静置一定时间，形成交联体；
步骤(3)：清洗(2)中得到的交联体，之后进行冷冻干燥；以及
步骤(4)：对(3)中得到的交联体照射电子射线和/或γ射线。
另外，本发明的第7方案是提供以下的神经再生诱导用材料。
(7-1) 一种非管状的神经再生诱导用材料，包含将低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类用选自下述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂进行了共价键交联的交联体，
R1HN-(CH2)n-NHR2　　(I)
式中，R1和R2分别独立表示氢原子或者式-COCH(NH2)-(CH2)4-NH2所表示的基团，n表示2～18的整数；
将上述材料剪成纵1cm×横1cm的尺寸(不管厚度如何)，将所得的4个该材料和25mL生理盐水放入50mL容量的离心管中，使用恒温振荡水槽进行振荡速率为往返120次/分钟、在50℃的温度下振荡的分解性试验时，从振荡开始起72小时后材料的残留率为10%～80%。
(7-2) (7-1)所述的神经再生诱导用材料，其中在上述分解性试验中，与开始起4小时后的残留率相比，开始起72小时后的残留率显示出降低。
(7-3) (7-1)或(7-2)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中在上述分解性试验中从开始起4小时后的残留率为55%以上。
(7-4) (7-1)～(7-3)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中分子内具有羧基的生物吸收性多糖类为选自海藻酸、其酯及其盐的至少一种。
(7-5) (7-1)～(7-4)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中交联性试剂为上述通式(I)所表示的化合物的N-羟基琥珀酰亚胺盐。
(7-6) (7-5)所述的神经再生诱导用材料，其中上述通式(I)所表示的化合物的N-羟基琥珀酰亚胺盐为选自二氨基乙烷的二N-羟基琥珀酰亚胺盐、二氨基己烷的二N-羟基琥珀酰亚胺盐、N,N’-二赖氨酰-二氨基乙烷的四N-羟基琥珀酰亚胺盐和N-赖氨酰-二氨基己烷的三N-羟基琥珀酰亚胺盐的至少一种。
(7-7) (7-1)～(7-6)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料为干凝胶的形态。
(7-8) (7-1)～(7-7)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料以1kGy～100kGy的吸收剂量照射了电子射线和/或γ射线。
(7-9) (7-1)～(7-8)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料还含有生物吸收性高分子。
(7-10) (7-9)所述的神经再生诱导用材料，其中生物吸收性高分子为选自聚乙醇酸、聚乳酸和它们的共聚物、以及聚己内酯的至少一种。
(7-11) (7-1)～(7-10)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中，在进行如下的撕裂试验时，最大试验力(荷重)为0.10(N)～10.0(N)：将上述材料剪成纵2cm×横2cm的尺寸(不管厚度如何)，在距其1个裁剪面5mm的位置用双夹把持以夹住该材料(把持部A)，将该材料的从把持部A所相对的裁剪面(B)到10mm的区域在生理盐水中浸渍15分钟，之后使带针的缝合线贯穿该材料的距该裁剪面(B)5mm的位置的中央部，将缝合线的两端固定在器具上，将该把持部A以10mm/分钟的速度沿材料的正方形面水平地拉伸。
(7-12) (7-4)～(7-11)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中上述材料中的选自海藻酸、其酯及其盐的至少一种的含量换算成海藻酸钠为0.2mg/cm2～12mg/cm2。
(7-13) (7-1)～(7-12)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中上述材料中的生物吸收性高分子的含量为0.05mg/cm2～30mg/cm2。
(7-14) (7-1)～(7-13)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料用于末梢神经和/或中枢神经的损伤部的再生。
(7-15) (7-1)～(7-14)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料用于神经分支部和/或神经丛部的损伤部的再生。
(7-16) (7-15)所述的神经再生诱导用材料，其中神经分支部和/或神经丛部的损伤部存在于选自前列腺、膀胱、阴茎海绵体、腕、四肢、脑、脊髄、面部、颈、腰、骶骨、腰骶骨、阴部、心脏、腹腔、下小腹、骨盆、胸腔内部和肠壁内部的至少一种中。
(7-17) (7-1)～(7-16)中任一项所述的神经再生诱导用材料，该材料用于选自肿瘤切除、淋巴结清扫术和/或外伤所伴随的神经损伤部的再生、以及组织重建所伴随的神经损伤部的再生的至少一种的神经损伤部的再生。
(7-18) (7-4)～(7-17)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中上述选自低内毒素的海藻酸、其酯及其盐的至少一种的通过GPC-MALS法测定的重均分子量(绝对分子量)为8万以上。
(7-19) (7-4)～(7-18)中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中上述选自低内毒素的海藻酸、其酯及其盐的至少一种的M/G比为0.4～3.0。
(7-20) 一种诱导神经损伤部再生的方法，该方法包括以下步骤：将(7-1)～(7-19)中任一项所述的神经再生诱导用材料应用于需要治疗的对象的神经损伤部。
(7-21) 上述低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类，其用于在神经损伤部的再生诱导方法中使用，所述神经损伤部的再生诱导方法包括将(7-1)～(7-19)中任一项所述的神经再生诱导用材料应用于需要治疗的对象的神经损伤部。
(7-21a) 上述低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类和/或选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂在制造(7-1)～(7-19)中任一项所述的神经再生诱导用材料中的用途，其中将上述神经再生诱导用材料应用于神经损伤部以使神经再生。
(7-22) 一种调节神经再生诱导用材料的体内残留时间的方法，该方法至少包括以下步骤：
对材料照射电子射线和/或γ射线，所述材料包含将低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类用选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂进行了共价键交联的交联体。
发明效果
本发明的神经再生诱导用材料能够促进目前除自体神经移植等以外再无有效的治疗方法的神经分支部和/或神经丛部的损伤部的再生，能够提供一种新的治疗方法。
另外，在本发明的方案之一中，神经再生诱导用材料的体内消失时间得到控制，神经再生诱导效果优异。
本发明的神经再生诱导用材料，无论神经的损伤部为直线状还是分支部和/或神经丛部、或者在无法看清缺损部的断端部的情况下均可使用，诱导神经再生，因此临床上的应用范围广。
在本发明的若干个方案中，神经再生诱导用材料为干凝胶状和/或片状，富有柔软性，因此能够包裹神经的断端部或接合部使其被神经再生诱导用材料覆盖。由于呈干凝胶状和/或片状，所以可以现场剪成适合于使用的患处的大小进行使用，因此事先无需准备多个符合神经内径的规格。另外，还可以在内窥镜下、腹腔镜下等将本发明的材料应用于神经的损伤部。
在本发明的若干个方案之一中，还包含生物吸收性高分子的神经再生诱导用材料具备适度的强度，在应用于患处时还可以用缝合线进行缝合使用。另一方面，本发明的材料即使不缝合也可使用，在不缝合的情况下，具有能够比较简易地实施手术的优点。
本发明的神经再生诱导用材料经过一定期间后会从体内消失，因此安全性和生物相容性优异。
在本发明的方案之一中，还包含生物吸收性高分子的神经再生诱导用材料具有适度的强度，即使在膝盖等可动部位该材料也不易破碎，可以稳定地再生神经损伤部。另外，还具有以下优点：在制造过程中形状不易发生变形，操作性优异，制造效率也高。
本发明的神经再生诱导用材料满足上述的任一种以上的效果。
附图说明
图1是对坐骨神经分支部的缺损部应用了A-3EDA・PGA50的术后8周的照片。
图2是对坐骨神经分支部的缺损部应用了A-2EDA・PGA100的术后8周的照片。
图3是对坐骨神经分支部的缺损部应用了A-2EDA・PGA100的术后8周的胫骨神经侧的再生轴突的染色照片。
图4是对坐骨神经分支部的缺损部应用了A-2EDA・PGA100的术后8周的腓骨神经侧的再生轴突的染色照片。
图5显示在坐骨神经分支部的缺损部应用海藻酸交联体以评价再生诱导效果的试验的示意图。圆筒形表示神经，长方形表示海藻酸交联体。在实施例中，以使用过两片海藻酸交联体夹住神经切断部的方式设置该交联体。
图6是对坐骨神经分支部的缺损部应用了海藻酸交联体A-2EDA (样品编号1)的术后8周的照片。箭头表示再生的神经轴突细、认为没有充分再生的部位。
图7是显示通过体外试验评价海藻酸交联体的分解性的结果的曲线图。
图8是显示通过体外试验评价海藻酸交联体的分解性的结果的曲线图。
图9是显示通过体外试验评价海藻酸交联体的分解性的结果的曲线图。
图10是显示皮肤成纤维细胞(NHDF)的细胞粘附性和细胞增殖性的评价结果的图。
图11是显示实施例10的海藻酸交联体的撕裂试验的试验方法的示意图。
图12是显示对6种海藻酸交联体进行撕裂试验时的最大试验力(N)的平均值的图。
具体实施方式
1. 分子内具有羧基的生物吸收性多糖类
在本发明的若干个方案之一中，可以使用一种或两种以上的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类来制作神经再生诱导用材料。分子内具有羧基的生物吸收性多糖类例如可以列举海藻酸、羧甲基淀粉、透明质酸、羧甲基纤维素等多糖类、其酯及其盐。生物吸收性多糖类优选在生物体内被分解、吸收。另外，多糖类优选为无细胞粘附性的生物吸收性多糖类。优选为选自海藻酸、其酯及其盐的至少一种。需要说明的是，在本说明书中，“神经再生诱导用材料”有时称作“本发明的材料”。
2. 海藻酸、其酯及其盐
本发明中使用的“海藻酸”、“海藻酸酯”、“海藻酸盐”可以来自天然，也可以是合成物，优选来自天然。在本说明书中，有时将“选自海藻酸、其酯及其盐的至少一种”记作“海藻酸类”。本发明中优选使用的海藻酸类是由巨藻、梨形囊巨藻、海带、泡叶藻、公牛藻、カジカ、爱森藻、昆布等褐藻类提取的生物吸收性多糖类，是由D-甘露糖醛酸(M)和L-古罗糖醛酸(G)这两种糖醛酸聚合成直链状的聚合物。更具体而言，是D-甘露糖醛酸的均聚物组分(MM组分)、L-古罗糖醛酸的均聚物组分(GG组分)以及D-甘露糖醛酸和L-古罗糖醛酸无规排列的组分(M/G组分)任意键合而成的嵌段共聚物。
海藻酸类的D-甘露糖醛酸与L-古罗糖醛酸的构成比(M/G比)主要根据海藻等作为来源的生物的种类而不同，另外，还受到该生物的生长场所或季节的影响，遍及M/G比为约0.2的高G型～M/G比为约5的高M型的大范围。已知海藻酸类的凝胶化能力、所生成的凝胶的性质受到M/G比的影响，通常G比率高时凝胶强度变高。除此以外，M/G比还会对凝胶的硬度、脆度、吸水性、柔软性等产生影响。本发明中使用的海藻酸类和/或其盐的M/G比通常为0.2～4.0，更优选0.4～3.0，进一步优选为0.5～3.0。在本说明书中，用“～”表示的数值范围是指分别包括“～”前后所记载的数值作为最小值和最大值的范围。
对本发明中使用的“海藻酸酯”、“海藻酸盐”没有特别限定，但由于其与交联剂反应，所以需要不具有不阻碍交联反应的官能团。作为海藻酸酯，可以优选列举海藻酸丙二醇酯。
作为海藻酸盐，例如可以列举海藻酸的一价盐、海藻酸的二价盐。
海藻酸的一价盐优选列举海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸铵等，更优选为海藻酸钠或海藻酸钾，尤其优选为海藻酸钠。
海藻酸的二价盐优选列举海藻酸钙、海藻酸镁、海藻酸钡、海藻酸锶等。
海藻酸类为高分子多糖类，难以准确地确定分子量，通常以重均分子量计为1000～1000万、优选1万～800万、更优选2万～300万的范围。在来自天然物的高分子物质的分子量测定中，已知值会因测定方法而产生不同。
例如，通过凝胶渗透层析(GPC)或凝胶过滤层析(也将这些方法一并称作尺寸排阻层析)测定的重均分子量优选10万以上、更优选为50万以上，还优选500万以下、更优选为300万以下。其优选范围是10万～500万，更优选为50万～350万。
另外，例如根据GPC-MALS法，可以测定绝对重均分子量。通过GPC-MALS法测定的重均分子量(绝对分子量)优选1万以上、更优选8万以上、进一步优选为9万以上，还优选100万以下、更优选80万以下、进一步优选70万以下、尤其优选为50万以下。其优选范围是1万～100万，更优选为8万～80万，进一步优选9万～70万，尤其优选为9万～50万。
通常，在通过上述方法算出高分子多糖类的分子量时，会产生10～20%的测定误差。例如，当为40万时值可以在32～48万左右的范围内发生变动，当为50万时值可以在40～60万左右的范围内发生变动，当为100万时值可以在80～120万左右的范围内发生变动。
海藻酸类的分子量的测定可以按照常规方法进行测定。
在分子量测定中采用凝胶渗透层析时代表性的条件如本说明书的实施例1所记载。柱例如可以使用GMPW-XL×2+G2500PW-XL (7.8mm I.D.×300mm)，洗脱液例如可以是200mM的硝酸钠水溶液，可以采用普鲁兰多糖作为分子量标准。
在分子量测定中采用GPC-MALS时代表性的条件如本说明书的实施例1所记载。作为检测器，例如可以使用RI检测器和光散射检测器(MALS)。
对本发明中使用的海藻酸类的粘度没有特别限定，以1w/w%的海藻酸类水溶液的形式测定粘度时，优选10mPa・s～1000mPa・s，更优选为50mPa・s～800mPa・s。
海藻酸类水溶液的粘度测定可以按照常规方法进行测定。例如，可以采用旋转粘度计法的同轴双圆筒形旋转粘度计、单一圆筒形旋转粘度计(Brookfield型粘度计)、圆锥-平板形旋转粘度计(锥板型粘度计)等进行测定。优选依照日本药典(第16版)的粘度测定法。在本发明中，更优选使用锥板型粘度计。这种情况下代表性的测定条件如本发明的实施例1所记载。
海藻酸类在由褐藻类提取之初分子量大、粘度高，在热干燥、纯化等过程中，分子量变小、粘度下降。通过制造步骤的温度等条件管理、作为原料的褐藻类的选择、制造步骤中的分子量的分级等方法，可以制备分子量不同的海藻酸类。而且，通过与具有不同的分子量或粘度的其他批次的海藻酸类混合，也可以形成具有目标分子量的海藻酸类。
本发明中使用的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类优选为低内毒素的生物吸收性多糖类。低内毒素是指内毒素水平低至实质上不会引起炎症或发热的程度。更优选地，期望是进行了低内毒素处理的生物吸收性多糖类。
低内毒素处理可以通过公知的方法或者基于此的方法来进行。例如，可以通过纯化透明质酸钠的菅等人的方法(例如参照日本特开平9-324001号公报等)、纯化β-1,3-葡聚糖的吉田等人的方法(例如参照日本特开平8-269102号公报等)、纯化海藻酸盐、结冷胶等生物高分子盐的William等人的方法(例如参照日本特表2002-530440号公报等)、纯化多糖的James等人的方法(例如参照国际公开第93/13136号小册子等)、Louis等人的方法(例如参照美国专利第5589591号说明书等)、纯化海藻酸盐的ハーマンフランク等人的方法(例如参照Appl Microbiol Biotechnol(1994)40：638-643等)等或者基于这些方法的方法来实施。本发明的低内毒素处理并不限于这些，可以通过清洗、滤器(内毒素去除滤器或带电的滤器等)过滤、超滤、使用了柱(内毒素吸附亲和柱、凝胶过滤柱、离子交换树脂柱等)的纯化、疏水性物质、树脂或活性炭等的吸附、有机溶剂处理(有机溶剂提取、通过添加有机溶剂进行析出、沉淀等)、表面活性剂处理(例如参照日本特开2005-036036号公报等)等公知的方法、或者适当组合这些方法进行实施。可以在这些处理步骤中组合离心等公知的方法。优选结合海藻酸的种类来适当选择。
内毒素水平可以通过公知的方法来确认，例如可以通过利用鲎试剂(LAL)的方法、使用エントスペシー(注册商标)ES-24S组(生化学工业株式会社)的方法等进行测定。
本发明中使用的生物吸收性多糖类的内毒素的处理方法没有特别限定，在使用鲎试剂(LAL)进行内毒素测定时，作为其结果，生物吸收性多糖类的内毒素含量优选为500内毒素单位(EU)/g以下，进一步优选100EU/g以下，尤其优选50EU/g以下，特别优选为30EU/g以下。进行了低内毒素处理的海藻酸钠例如可以通过Sea Matrix (注册商标) (持田制药株式会社)、PRONOVATM UP LVG (FMCBioPolymer)等市售品来获取。
3. 交联性试剂
本发明中优选使用的交联性试剂为选自下述通式(I)所表示的化合物中包含的胺类化合物及其盐的至少一种。在本说明书中，下述通式(I)所表示的化合物有时称作胺类化合物(I)。
R1HN-(CH2)n-NHR2 (I)
式中，R1和R2分别独立表示氢原子或者式-COCH(NH2)-(CH2)4-NH2所表示的基团，n表示2～18的整数。
作为具体例子，例如可以列举二氨基乙烷、二氨基丙烷、二氨基丁烷、二氨基戊烷、二氨基己烷、二氨基庚烷、二氨基辛烷、二氨基壬烷、二氨基癸烷、二氨基十二烷、二氨基十八烷等二氨基烷烃类和/或其盐、N-赖氨酰-二氨基乙烷、N,N’-二赖氨酰-二氨基乙烷、N-赖氨酰-二氨基己烷、N,N’-二赖氨酰-二氨基己烷等单或二赖氨酰二氨基烷烃类和/或其盐等，可以使用这些二胺及其盐的一种或两种以上。
其中，作为胺类化合物(I)和/或其盐，优选使用在上述通式(I)中n为2～8的化合物和/或其盐。当交联性试剂包含胺类化合物(I)的盐时，作为形成盐的成分，优选使用N-羟基琥珀酰亚胺。
作为包含胺类化合物(I)和/或其盐的交联性试剂，特别是二氨基乙烷的二N-羟基琥珀酰亚胺盐、二氨基己烷的二N-羟基琥珀酰亚胺盐、N,N’-二赖氨酰-二氨基乙烷的四N-羟基琥珀酰亚胺盐、N-赖氨酰-二氨基己烷的三N-羟基琥珀酰亚胺盐等，它们的安全性、生物相容性等更高，并且通过该交联性试剂进行共价键交联而得到的酸交联体的神经再生作用更好，因此优选使用。
4. 神经再生诱导用材料的制作
以下，作为分子内具有羧基的生物吸收性多糖类的例子，对包含使用了海藻酸类的海藻酸交联体的神经再生诱导用材料的制作进行说明，但关于其他的多糖类，也可以按照下述来制作。
本发明的干凝胶状海藻酸交联体例如可如下获得：将海藻酸类的水性溶液、上述交联性试剂和水溶性碳二亚胺等脱水缩合剂混合、溶解，流入模具中使其凝胶化，清洗凝胶，之后进行冷冻干燥。
交联反应的温度通常是在4℃～37℃的范围内进行，但从反应效率的角度考虑，优选在20℃～30℃的范围内进行。
神经再生诱导用材料在除了包含海藻酸交联体以外还包含其他成分时，对含有其他成分的步骤的顺序没有特别限定，例如含有其他成分的步骤可以在冷冻干燥前，也可以在冷冻干燥后。
在本发明的方案之一中，本发明的神经再生诱导用材料优选为干凝胶的形态。干凝胶是指凝胶干燥了的状态。凝胶在立体的网眼结构中包含水等溶剂，而干凝胶是指失去了溶剂而只形成网眼的凝胶。在本说明书中，干凝胶有时还称作“海绵”。
海藻酸类的溶液可以通过公知的方法或者基于此的方法来调制。溶剂只要是可适用于生物体的溶剂即可，没有特别限定，优选为水性溶剂，例如优选纯净水、蒸馏水、离子交换水、Milli-Q水、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、DMSO等。这些溶剂优选被灭菌，优选进行了低内毒素处理。
交联率可以通过使用的交联性试剂的摩尔比和交联反应时间来控制。降低交联率时，得到了柔软且含水率高的交联体，提高交联率时，交联体坚固且含水率降低。交联率可以根据交联体的用途而适当选择。
对所使用的交联性试剂的摩尔比没有特别限定，优选相对于海藻酸类所具有的羧基的总和为1摩尔%～50摩尔%的范围，更优选为5摩尔%～40摩尔%的范围。
关于交联反应时间，由于交联反应随时间而进行，所以在需要高交联率的情况下可以延长反应时间。反应时间通常在6小时～96小时的范围，在反应效率方面，优选为24小时～72小时的范围。
另外，在交联反应中，当海藻酸类的溶液浓度过低时，无法获得具有充分的机械强度的交联体，而当其浓度过高时，海藻酸类的溶解耗费时间，并且所得交联体的含水率低且变硬，不优选。因此，海藻酸类的溶液浓度优选为0.1%～5%的范围，进一步优选为0.5%～3%的范围。
通过交联反应得到的交联体，其自身也显示出实用的强度和稳定性，根据用途还可以和离子键交联、疏水键交联等其他的凝胶化方法并用。
在本发明的若干个方案中，当本发明的神经再生诱导用材料包含选自海藻酸、其酯及其盐的至少一种(海藻酸类)时，每1cm2的该材料中海藻酸类含量换算成海藻酸钠优选为0.2mg/cm2～12mg/cm2，更优选为0.5mg/cm2～7mg/cm2，进一步优选为1mg/cm2～6mg/cm2，尤其优选为1mg/cm2～5mg/cm2。在本说明书中，“海藻酸含量”一词表示将该材料中所含的海藻酸类的量换算成海藻酸钠的量而得到的值。
作为本发明的优选方案之一，本发明的神经再生诱导用材料除了包含分子内具有羧基的生物吸收性多糖类以外，例如还可以包含一种或两种以上的聚乙醇酸、聚乳酸、和它们的共聚物、以及聚己内酯等生物吸收性高分子。聚乙醇酸与聚乳酸的共聚物(在本说明书中还称作“PLGA”)例如作为羟乙酸乳酸聚酯等而已知。这些高分子被用作缝合线的材料等，具有生物吸收性，生物相容性优异。这些生物吸收性高分子的形态没有特别限定，可以优选使用无纺布、纺布、网、或者针刺品等，更优选以无纺布、网、或者针刺品的形态使用。例如，可以将片状的无纺布的生物吸收性高分子铺在托盘里，向该托盘内填充溶解有生物吸收性多糖类和交联剂等的溶液，使其凝胶化。本发明的神经再生诱导用材料中的、分子内具有羧基的生物吸收性多糖类和生物吸收性高分子的配置没有特别限定。可以层叠分子内具有羧基的生物吸收性多糖类的层与生物吸收性高分子的层，或者在生物吸收性高分子的两层之间夹入分子内具有羧基的生物吸收性多糖类的层，或者可以在1层中使两者混合存在。在本说明书的实施例5-(4)中，本发明的海藻酸交联体发挥神经再生诱导作用，而与是否含有PGA无关，因此可以使用PGA以外的材料代替PGA同样地进行使用。这些生物吸收性高分子可以提高交联体的强度，提高神经再生诱导用材料的操作性。在本说明书的实施例7中，使用PGA制作的交联体和使用同等程度含量的PLGA制作的交联体显示出同样的分解性，由此暗示：这些生物吸收性高分子在本发明中可以同样地使用。在本发明的一方案中，优选本发明的神经再生诱导用材料中使用的生物吸收性高分子为含有聚乙醇酸的高分子，还优选为聚乙醇酸和/或聚乙醇酸与聚乳酸的共聚物(PLGA)。
在本发明的优选方案之一中，本发明的神经再生诱导材料可以含有0.05mg/cm2～30mg/cm2的生物吸收性高分子，更优选为0.1mg/cm2～10mg/cm2，进一步优选为0.5mg/cm2～7mg/cm2，尤其优选为1mg/cm2～5mg/cm2。本发明的神经再生诱导材料通过含有这些生物吸收性高分子，具备也可缝合的强度，可以防止因冷冻干燥引起的材料的变形，制造效率也得到提高。另外，在本说明书的实施例中，与不含生物吸收性高分子的材料相比，这些含有生物吸收性高分子的神经再生诱导材料可见神经损伤再生不充分的例子少的趋势，由此暗示：通过含有生物吸收性高分子，交联体的强度提高，在膝盖等可动部位交联体也不易断裂，可以稳定地使轴突再生。
作为本发明的若干个方案之一，神经再生诱导用材料可以在不妨碍本发明的神经再生诱导用材料的效果的范围内含有其他的多糖类或高分子。其中，确认肝素具有肝素结合性生长因子的缓释等效果，因此本发明的神经再生诱导用材料还可以含有肝素。需要说明的是，在本发明的若干个方案中，神经再生诱导用材料不含肝素。
另外，作为本发明的若干个方案之一，神经再生诱导用材料可以含有对神经生长有用的因子。对神经生长有用的因子例如可以列举碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)等，但并不限于这些。然而，本发明的神经再生诱导用材料即使在不含对神经生长有用的因子的情况下，也能够发挥神经再生的诱导效果。在本发明的若干个方案中，神经再生诱导用材料不含这些因子。
含有通过交联反应得到的海藻酸交联体的材料通常可以利用清洗液除去未反应的试剂或脱水缩合剂，进行纯化。对清洗液没有特别限定，例如可以使用水、ECF (细胞外液(Extra Cellular Fluid))等。ECF可以通过将CaCl2(2.5mM)和NaCl(143mM)溶解于纯净水中来制作。ECF根据需要可以在通过灭菌用滤器后再使用。包含海藻酸交联体的材料经ECF清洗后，优选用水进行清洗，以除去残留的钙。本发明的神经再生诱导用材料可以以冷冻干燥前的凝胶状的状态进行使用。
海藻酸交联体的冷冻干燥可以利用本领域技术人员所已知的技术常识来实施。冷冻干燥的条件可以适当调节，可以设置一次干燥步骤、二次干燥步骤等。
在本发明的若干个方案之一中，对本发明的神经再生诱导用材料的形状没有特别限定，可以考虑使用其的神经损伤部的范围等适当选择。例如，当为干凝胶状的形态时，可以形成非管状(例如平板状、弯曲状、有凹凸的平板状等)和管状的形状，但优选为非管状，更优选为平板状。当神经再生诱导用材料为平板状时，可以根据神经损伤部的范围进一步剪切神经再生诱导用材料后再应用于损伤部，因此对平板的尺寸没有特别限定。例如，用纵×横×高度(厚度)表示平板状的形状时，对纵和横的长度没有特别限定，高度(厚度)优选为0.2mm～30mm，更优选为0.3mm～15mm，进一步优选为0.5mm～10mm，尤其优选为1mm～10mm。除了为上述高度(厚度)以外，进一步优选纵和横的长度分别为1mm～300mmx1mm～300mm，特别优选为3mm～200mmx3mm～200mm，进一步优选为5mm～150mmx5mm～150mm。需要说明的是，厚度可以不均匀，可以是一侧厚而另一侧薄的倾斜结构。
在本发明的若干个方案之一中，神经再生诱导用材料优选进行灭菌处理。灭菌可以列举γ射线灭菌、电子射线灭菌、环氧乙烷气体灭菌、乙醇灭菌等，但并不限于这些。在本发明的若干个方案中，由于交联体会被照射电子射线或γ射线，所以也可以获得灭菌效果。
5. 照射了电子射线和/或γ射线的神经再生诱导用材料
在本发明的若干个方案中，提供一种神经再生诱导用材料，该材料包含将低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类用上述的胺类化合物(I)和/或其盐进行共价键交联、且照射了电子射线和/或γ射线的交联体。在该方案中，照射电子射线和/或γ射线的对象可以只是将生物吸收性多糖类用上述交联剂进行了共价键合的交联体，在神经再生诱导用材料包含生物吸收性高分子或神经生长因子等其他成分的情况下，可以是包含其他成分的交联体。另外，照射了电子射线和/或γ射线之后的交联体也可以包含其他成分。
电子射线是放射线中的具有电荷的粒子射线之一，为了灭菌等目的而使用。电子射线可以使用电子加速器等进行照射。由于电子射线会穿透物质，因此也可进行复杂形状或闭塞部的灭菌处理，其特征在于不用担心处理后的残留物等。电子射线的剂量与电压、电流、照射时间(被照射物的搬运速度)等因素有关。与γ射线相比，电子射线的渗透力弱，因此能够控制所需的渗透力。与γ射线相比，电子射线的剂量率(每小时的剂量)高达5000～10000倍，能够进行短时间(数秒～分钟)内的处理。
γ射线是放射线中的电磁波之一，为了灭菌等目的而使用。γ射线可以使用放射线源的暴露装置等进行照射。γ射线的穿透性强，γ射线的剂量与热源强度、距热源的距离和照射时间等因素有关，处理时间耗费数小时，因此被照射物的劣化较大。
在本发明中，电子射线和γ射线均可使用，但从容易恒定地控制照射剂量、容易对被照射物照射均匀的剂量、以及γ射线的放射线源钴60的废弃物处理等方面考虑，更优选使用电子射线。
在本发明的若干个方案之一中，本发明的神经再生诱导用材料优选以1kGy～100kGy的吸收剂量照射电子射线和/或γ射线，更优选为3kGy～60kGy，进一步优选为5kGy～40kGy，尤其优选为5kGy～25kGy，进一步优选为10kGy～24kGy。
本发明的若干个方案的照射了电子射线和/或γ射线的神经再生诱导用材料，与未被照射的材料相比，直至从体内的应用部位消失的时间短，换言之，具有体内残留时间短的特征。“从应用部位消失”是指，将交联体放在应用部位，一定时间后观察应用部位时，通过肉眼观察无法看到交联体。此时的体内应用部位优选为神经损伤部位，例如可在大鼠等动物中进行皮下或肌肉内的埋植试验等，以确认从应用部位的消失。
这样的照射了电子射线和/或γ射线的神经再生诱导用材料，与未被照射的材料相比，具有神经再生诱导效果高的特征。
在本发明的若干个方案中，本发明的神经再生诱导用材料从应用部位消失优选为7天～270天，更优选为14天～180天，进一步优选为14天～150天，尤其优选为14天～120天。另外，在本发明的方案之一中，本发明的神经再生诱导用材料，按照本说明书的实施例6的记载，将该材料剪成纵0.7cm×横1.5cm(不管厚度如何)的尺寸，进行大鼠皮下埋植试验，从埋植起4周后通过埋植部位的组织染色进行评价时，希望看到残留材料的至少一部分。
在本发明的另一方案中，对于本发明的神经再生诱导用材料，按照本说明书的实施例7的记载，将该材料剪成纵1cm×横1cm的尺寸(不管厚度如何)，将所得的4个该材料和25mL的生理盐水放入50mL容量的离心管中，使用恒温振荡水槽进行振荡速率为往返120次/分钟、在50℃的温度下振荡的该材料的分解性试验时，从振荡开始起72小时后的材料残留率优选为10%～80%，更优选为20%～80%。这里的“残留率”是指，对实施了一定时间的分解性试验后的材料进行减压干燥(60℃)直至达到恒重后的材料质量相对于分解性试验开始前的材料质量的比例。另外，材料的裁剪面的纵和横垂直相交。此时材料的厚度直接采用作为试验对象的材料的厚度，但按照标准优选为约1mm～约10mm的厚度。
另外，在本发明的一个方案中，本发明的神经再生诱导用材料优选在上述分解性试验中从开始起72小时后的残留率与从开始起4小时后的残留率相比显示为下降。在本发明的实施例中，可知进行了乙醇灭菌的海藻酸交联体的神经再生诱导效果不充分，但与其组成相同的交联体在实施例7的分解性试验中从开始起72小时后的残留率仍超过100%。
另外，在本发明的一个方案中，本发明的神经再生诱导用材料优选在上述分解性试验中从开始起4小时后的残留率为55%以上，更优选为60%以上。在本说明书的实施例中可知：以高达40kGy、60kGy的剂量照射了电子射线的交联体，其神经再生效果不充分，认为其原因在于：如照射了高电子射线剂量的交联体在分解性试验刚刚开始后(4小时后)残留率下降所示，从将交联体设置在损伤部之初起交联体即消失，没有起到作为神经的立足点的作用。
在本发明的一个方案中，本发明的神经再生诱导用材料优选在上述分解性试验中从开始起4小时后的残留率为55%以上，之后残留率下降，从开始起72小时后残留率显示为10%～80%。
在本发明的一个方案中，本发明的神经再生诱导用材料在进行以下所述的撕裂试验(实施例10中记载的撕裂试验)时，最大试验力优选为0.10(N)～10.0(N)，更优选为0.10(N)～5.0(N)。
本发明中的撕裂试验如下实施。将作为对象的材料剪成纵2cm×横2cm的尺寸(不管厚度如何)。这里，纵与横的裁剪面垂直相交。由于是评价材料自身的撕裂强度的试验，所以此时材料的厚度直接采用作为试验对象的材料的厚度，但按照标准优选为约1mm～约10mm的厚度。在距该材料的1个裁剪面5mm的位置使用双夹把持以夹住该材料(把持部A)。将该材料的从把持部A所相对的裁剪面(B)到10mm的区域在生理盐水中浸渍15分钟。使带针的缝合线贯穿该材料的距裁剪面(B) 5mm的位置的中央部，将缝合线的两端固定在器具上。沿材料的正方形面以10mm/分钟的速度水平拉伸把持部A，直至该材料破裂，测定该拉伸荷重作为试验力(N)。以试验力的最大点作为最大试验力(N)。拉伸荷重的测定优选使用小型物性试验仪(EZ-graph，岛津制作所制造)来进行，在无法获取的情况下，可以使用与其类似的荷重测定机械。
对于把持部A所使用的双夹的大小，优选把持部的宽度为15mm～19mm。试验中使用的缝合线优选使用“バイクリル(注册商标)”、线粗为“4-0”，在无法获取的情况下，可以使用材质为羟乙酸乳酸聚酯910 (羟基乙酸/乳酸聚酯：90/10)、且线粗为4-0的缝合线。针优选使用圆针SH-1，在无法获取的情况下，可以使用与其类似的适合缝合线的针。
优选地，期望在计算材料的最大试验力时，剪断材料，以n=3～10测定试验力，求出其最大试验力的平均值，作为该材料的最大试验力。
本发明还提供一种调节神经再生诱导用材料的体内残留时间的方法，该方法至少包括以下步骤：对包含将低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类用上述的胺类化合物(I)和/或其盐进行了共价键交联的交联体的神经再生诱导用材料照射电子射线和/或γ射线。本发明还提供一种调节神经再生诱导用材料的体内残留时间的方法，该方法至少包括以下步骤：对包含(A)将低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类用选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂进行了共价键交联的交联体、以及(B)生物吸收性高分子的交联体照射电子射线和/或γ射线。为了缩短本发明的材料的体内残留时间，可提高电子射线和/或γ射线的照射剂量；反之，为了延长体内残留时间，可降低电子射线和/或γ射线的照射剂量，从而可以调节神经再生诱导用材料的体内残留时间。
本发明还提供一种神经再生诱导用材料的制造方法，该方法至少包括以下步骤：对材料照射电子射线和/或γ射线，所述材料包含使用低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类和胺类化合物(I)和/或其盐进行了共价键交联的交联体。“包含交联体的材料”除了包含由分子内具有羧基的生物吸收性多糖类制作的交联体以外，还可以任选地包含上述的生物吸收性高分子或者对神经生长有用的因子等其他成分。具体的优选方案如上所述。
本发明还提供一种神经再生诱导用材料的制造方法，该方法至少包括以下步骤：
步骤(1)：将包含低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类的溶液和选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂混合；
步骤(2)：将(1)中得到的混合物和生物吸收性高分子放入模具中静置一定时间，形成交联体；
步骤(3)：清洗(2)中得到的交联体，之后进行冷冻干燥；以及
步骤(4)：对(3)中得到的交联体照射电子射线和/或γ射线。
该制造方法的优选方案如本说明书所记载。
6. 使用方法
在本发明的若干个方案中，将神经再生诱导用材料应用于因外伤或肿瘤切除等产生的神经损伤部，诱导神经的再生和/或重建。本发明的神经再生诱导用材料通常在神经重建所需的数月后被吸收分解，最终并没有被代谢、排出，因此安全性优异。
在本发明中，“神经的损伤”包括失去了神经的连续性的状态(缺损)和虽然保持神经的连续性但神经功能受损的状态，还包括断裂等。在本说明书中，“缺损部”有时称作“缺口”、“切断部”等，还包含“断裂”。
神经损伤例如是因外伤、肿瘤切除、淋巴结清扫术、中枢神经或末梢神经系统的疾病等而发生的，但在本发明中，不在乎神经损伤的发生原因。例如，在神经缝合术或自体神经移植时，在神经与神经接合的部位，缝合线未到达的位置会形成产生间隙的状态，因此对于这样的部位也可应用神经再生诱导用材料。另外，例如也可在重建因各种原因发生了缺损、脱落、切除的组织时用于神经损伤部的再生。
在本发明中，“应用”是指将神经再生诱导用材料放置在神经损伤部。当神经损伤部为缺损部时，神经再生诱导用材料和神经的断端部不必接触，但优选以神经再生诱导用材料与已缺损的神经的断端部接触的方式放置本发明的材料，更优选以神经再生诱导用材料与神经的断端部重叠的方式放置本发明的材料。在无法看清神经断端部的情况等，也可不必使神经再生诱导用材料与神经的断端部接触。
神经再生诱导用材料的应用例如可以按照使神经再生诱导用材料相对于应该重建的神经的两端部从一个方向接触的方式来放置，例如还可以按照利用神经再生诱导用材料根据手术部位的状态在上下或左右夹住神经的两端部的方式进行操作，例如也可以按照用神经再生诱导用材料覆盖神经的两端部的整个周围的方式来放置。
当神经再生诱导用材料为非管状时，与管状材料相比，容易供给神经轴突伸长所需的营养及氧，另一方面，还可防止对组织修复起作用的纤维组织的侵入，因此对神经轴突伸长有利，优选为非管状，更优选为平板状。这种情况下，对组织修复起作用的纤维组织通过瘢痕化来破坏正常的组织修复。在本说明书的实施例8中发现了：与胶原海绵相比，本发明的海藻酸交联体显示出抑制成纤维细胞的粘附、增殖的效果，作为神经再生诱导用材料具备优选的性能。
在本发明中，“神经再生的诱导”是指促进神经细胞的增殖和/或神经轴突的伸长。当神经的损伤部为缺损部时，是指促进神经轴突的伸长以恢复神经的连续性。神经因损伤或破碎等而发生缺损时，从缺损部起末梢侧(切断端部的远位)的神经轴突因来自神经细胞体的连续性被中断而发生变性(在末梢神经中称作Waller变性)，丧失神经功能。距缺损部较远的发生了变性的神经轴突作为残留物被巨噬细胞等吞噬。之后，从中枢侧断端开始发芽的多个神经轴突伸长至末梢断端侧。优选从中枢侧起伸长的轴突与末梢侧的断端部连接。或者，神经再生的诱导还可以通过恢复至少一部分的已丧失的神经功能或知觉来显示。本发明中的神经再生的诱导未必是指完全恢复到损伤前的状态。本发明的神经再生诱导用材料优选达到上述的任一种以上的效果。
本发明的神经再生诱导用材料的使用方法如下：露出对象的应该重建的神经部位，根据应该重建的神经的长度或宽度，制作适当大小的神经再生诱导用材料，将其应用于应该重建的神经损伤部。“对象”为人或者人以外的生物，例如鸟和非人哺乳动物(例如牛、猴、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪、狗、兔、绵羊和马)。
管状材料需要根据应用部位的神经的粗细使管状材料的粗细相匹，但平板状材料则没有这个必要，可以根据损伤部的大小剪切材料进行应用。
当神经再生诱导用材料为干凝胶状时，可以直接以干燥状态进行使用，也可以在含有生理盐水或者纯净水等后以凝胶状的状态进行应用。即，本发明的神经再生诱导用材料可以是凝胶状的形态。
将神经再生诱导用材料应用于神经损伤部后，不需要进行神经再生诱导用材料与神经损伤部的缝合，但根据需要可以缝合神经再生诱导用材料和神经损伤部(例如神经断端部等)。
在本发明的若干个方案中，神经再生诱导用材料被用于神经分支部和/或神经丛部的损伤部。神经丛也称作神经集网，是指分支的神经形成了网眼状结构的部分。本发明的神经再生诱导用材料优选用于神经分支部和/或神经丛的损伤部，例如可用于前列腺、膀胱、阴茎海绵体、腕、四肢、脑、脊髄、面部、颈、腰、骶骨、腰骶骨、阴部、心脏、腹腔、下小腹、骨盆、胸腔内部、肠壁内部等。
在本发明的若干个方案中，神经再生诱导用材料的可应用部位没有特别限定，只要是神经损伤部即可。可用于末梢神经和/或中枢神经的损伤部的再生诱导，可用于直线状的神经、神经分支部和/或神经丛部的损伤部等。当为中枢神经时，例如可以列举脑或脊髄的损伤部。
在本发明的若干个方案中，本发明的神经再生诱导用材料可以和对神经的再生或者生长有用的因子、生理活性物质等体液因子、或者细胞并用使用。对并用的方法没有特别限定，例如可以使本发明的神经再生诱导用材料含有这些因子或细胞。作为体液因子，只要是对再生组织起到辅助性作用的因子即可，没有特别限定，例如可以列举bFGF、NGF、肝细胞生长因子、免疫抑制剂、抗炎药等。作为细胞，例如可以列举自体或者异体培养的间充质干细胞、骨髄间充质干细胞、神经干细胞、来自骨髄的单核细胞、来自脂肪的干细胞、生物体内多能性干细胞、ES细胞、神经前体细胞、iPS细胞、CD133+细胞等，但并不限于这些。在本发明的另一方案中，本发明的神经再生诱导用材料还优选不与这些细胞或因子并用的方案，更优选不与CD133+细胞并用。
对神经再生的评价方法没有特别限定，例如，关于神经轴突的伸长，如本说明书的实施例4和5所记载，在光学显微镜下观察对象部位的轴突伸长，或者，按照常规方法，用环氧树脂包埋神经，再使用甲苯胺蓝、抗III型β微管蛋白抗体或者抗S100抗体等试剂进行染色等，计数到达缺口的中间或者末梢侧断端部的有髄轴突的数目等，从而显示。利用环氧树脂等适当的方法进行包埋后，还可以使用透射电子显微镜(TEM)或者扫描电子显微镜(SEM)观察再生轴突的状态来进行评价。
例如，还可以通过电生理学测定(electrophysiological measurement)、组织病理学评价(histopathological evaluation)、步行模式(walking pattern)、用于研究轴突运输的追踪试验(tracer detective study for axoplasmic transport)、二点辨别检查(Two-point discrimination)等进行评价。
在电生理学测定中，例如可以使用CMAP(复合肌肉动作电位，compound muscleaction potentials)作为运动神经功能恢复的指标，使用SEP(体感诱发电位，somatosensory evoked potentials)等作为感觉神经功能恢复的指标(例如参照Journalof Materials Science: Materials in medicine 16 (2005) 第503-509页)。
本发明还提供一种在需要神经损伤部的再生的对象中诱导神经损伤部再生的方法，该方法包括以下步骤：将上述的神经再生诱导用材料应用于神经损伤部。本发明还提供一种在需要神经分支部和/或神经丛部的损伤部的再生的对象中诱导神经分支部和/或神经丛部的损伤部的再生的方法，该方法包括以下步骤：将上述的神经再生诱导用材料应用于神经分支部和/或神经丛部的损伤部。具体的方法如上所述。
本发明还提供低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类和/或选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂在制造上述神经再生诱导用材料中的用途，其中上述神经再生诱导用材料以应用于神经损伤部、优选神经分支部和/或神经丛部的损伤部的方式进行使用。具体的用途如上所述。
本发明还提供上述低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类，其用于在使用神经再生诱导用材料的神经损伤部、优选神经分支部和/或神经丛部的损伤部的再生中使用，其中所述神经再生诱导用材料包含将低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类用选自上述通式(I)所表示的化合物及其盐的交联性试剂进行了共价键交联的交联体。
接下来，给出实施例，进一步具体说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。
实施例
实施例1　海藻酸交联体的制作和性状的评价
分别使用海藻酸钠和作为交联剂的(i)氯化钙、(ii)氯化钙与氯化钠的混合物、(iii)乙二胺，制作干凝胶形态的海藻酸交联体，评价性状。
1-(1) 海藻酸钠
海藻酸钠使用6种内毒素含量均不足50EU/g的低内毒素的海藻酸钠(Sea Matrix (注册商标) 经销商持田制药株式会社)。
A-1、A-2和A-3的海藻酸钠的M/G比为0.4～1.8的范围，B-1、B-2和B-3的海藻酸钠的M/G比为0.1～0.4的范围。
各海藻酸钠的1w/w%水溶液的粘度和重均分子量见表1。
海藻酸钠的粘度测定按照日本药典(第16版)的粘度测定法，采用旋转粘度计法(锥板型旋转粘度计)进行测定。具体的测定条件如下。样品溶液的调制使用Milli-Q水来进行。测定仪器使用锥板型旋转粘度计(粘度粘弹性测定装置レオストレスRS600(ThermoHaake GmbH)传感器：35/1)。测定1w/w%的海藻酸钠溶液时转速设为1rpm。读取时间为测定2分钟，以开始后1分钟～2分钟的平均值作为测定的值。以3次测定的平均值作为测定值。测定温度设为20℃。
各海藻酸钠的重均分子量通过凝胶渗透层析(GPC)和GPC-MALS这两种测定方法进行测定。测定条件如下。
[前处理方法]
在样品中加入洗脱液进行溶解，之后用0.45μm的薄膜滤器进行过滤，以所得滤液作为测定溶液。
(1) 凝胶渗透层析(GPC)测定
[测定条件(相对分子量分布测定)]
柱：TSKgel GMPW-XL×2+G2500PW-XL (7.8mm I.D.×300mm×3根)；
洗脱液：200mM的硝酸钠水溶液；
流速：1.0mL/分钟；
浓度：0.05%；
检测器：RI检测器；
柱温：40℃；
注入量：200μL；
分子量标准：标准普鲁兰多糖、葡萄糖。
(2) GPC-MALS测定
[折射率增量(dn/dc)测定(测定条件)]
差示折射率计：Optilab T-rEX；
测定波长：658nm；
测定温度：40℃；
溶剂：200mM的硝酸钠水溶液；
样品浓度：0.5～2.5mg/mL(5浓度)
[测定条件(绝对分子量分布测定)]
柱：TSKgel GMPW-XL×2＋G2500PW-XL (7.8mm I.D.×300mm×3根)；
洗脱液：200mM的硝酸钠水溶液；
流速：1.0mL/分钟；
浓度：0.05%；
检测器：RI检测器、光散射检测器(MALS)；
柱温：40℃；
注入量：200μL。
[表1]
1-(2) 以氯化钙作为交联剂的海藻酸交联体的制作
只要没有特别说明，则以下操作在室温环境下(20～30℃)实施。将表1中的各低内毒素海藻酸钠冷冻干燥品用Milli-Q水溶解，制成1w/vol%的海藻酸钠水溶液。将无水氯化钙用Milli-Q水溶解，制成50mM的氯化钙水溶液。在装有1mL海藻酸钠水溶液的管(Falcon2054)中叠加1mL 50mM的氯化钙水溶液，静置一夜，之后将已凝胶化的材料用Milli-Q水清洗3次，进行冷冻干燥，得到干凝胶状的海藻酸交联体。
1-(3) 以氯化钙和氯化钠作为交联剂的海藻酸交联体的制作
将表1中的各低内毒素海藻酸钠冷冻干燥品用Milli-Q水溶解，制成1w/vol%的海藻酸钠水溶液。将无水氯化钙和氯化钠用Milli-Q水溶解，制作含有4mM钙离子和300mM钠离子的水溶液(钙-钠交联剂水溶液)。在装有1mL海藻酸钠水溶液的管(Falcon2054)中叠加1mL钙-钠交联剂水溶液，静置一夜，之后将已凝胶化的材料用Milli-Q水清洗3次，进行冷冻干燥，得到干凝胶状的海藻酸交联体。
另外，制作钙-钠交联剂水溶液的钙离子为10mM、20mM或50mM的交联剂水溶液，使用A-1或A-2的海藻酸钠，按照同样的顺序得到了海藻酸交联体。
1-(4) 使用乙二胺作为交联剂的海藻酸交联体的制作
将23g的N-羟基琥珀酰亚胺溶解于1000ml甲醇中。将6.7ml乙二胺溶解于100ml的甲醇中，再添加到N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中进行混合。在玻璃滤器上过滤收集所生成的晶体，将其干燥，得到了约27.0g的乙二胺二N-羟基琥珀酰亚胺盐(EDA・2HOSu)。
将表1中的各低内毒素海藻酸钠溶解于Milli-Q水中，在所得的1ml 1w/vol%的海藻酸钠水溶液中加入2.2mg EDA・2HOSu和16mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC・HCl)，进行溶解。
将混合物在Falcon2054管中、在室温下静置2天，使其凝胶化。将凝胶用ECF按照3次/天×约7天进行清洗，然后用Milli-Q水清洗3次，之后冷冻干燥，得到干凝胶状的海藻酸交联体。ECF(细胞外液(Extra Cellular Fluid))使用将CaCl2(2.5mM)和NaCl(143mM)溶解于纯净水中、并通过了灭菌滤器和内毒素去除滤器而得到的滤液。
1-(5) 海藻酸交联体的评价
对于上述1-(2)～1-(4)中得到的海藻酸交联体，从凝胶化、多孔性和PBS(磷酸缓冲盐水)中的残留性方面进行评价。
关于凝胶化，通过倒置法进行目视观察，所有溶液均发生了凝胶化的情形记作3分，约一半的溶液发生了凝胶化的情形记作2分，大部分的溶液没有发生凝胶化的情形记作1分。
关于多孔性，使用扫描型电子显微镜，在金包覆后在100倍(加速电压为15kV)下测定海藻酸交联体的剖面，具有100μm～500μm的均匀细孔时记作3分，具有不规则大小的细孔时记作2分，没有细孔时记作1分。
在PBS中的凝胶残留性试验中，将边长约5mm的各正方形凝胶放入5ml PBS中，观察37℃下、1周后的凝胶的状态，几乎全部残留时记作3分，约一半左右残留时记作2分，几乎全部溶解时记作1分。
其结果，以(i)氯化钙作为交联剂的交联体和以(ii)氯化钙和氯化钠的混合物作为交联剂的交联体在凝胶化评价中有一部分也是3分，但在多孔性评价和PBS中的凝胶残留性评价中基本上是2分或1分。
以(iii)乙二胺作为交联剂的海藻酸交联体的评价结果见表2。
在凝胶化评价中，A-2、A-3、B-2和B-3均发生了凝胶化，但A-1和B-1的凝胶化不充分。
在多孔性评价中可知：A-1、A-2和A-3均得到了孔的大小为300μm～500μm的多孔体。另一方面，B-1、B-2和B-3均未确认到细孔，呈碎片状。
在PBS中的凝胶残留性评价中，A-1在1周后残留约1/2，相对于此，A-2、A-3、B-1、B-2、B-3在1周后仍残留了几乎全部的透明含水凝胶。
由以上可知：从多孔性方面考虑，与B-1、B-2和B-3的海藻酸钠(M/G比为0.1～0.4)相比，优选使用A-1、A-2和A-3的海藻酸钠(M/G比为0.6～1.8)。
还可知：在A-1、A-2和A-3的海藻酸钠中，从凝胶化和PBS中的凝胶残留性方面考虑，优选使用A-2和A-3的海藻酸钠、即通过GPS-MALS测定的重均分子量为9万以上的海藻酸钠。
[表2]
实施例2　神经样细胞的存活率的评价
使1 mL的PC12细胞(50000细胞/mL)渗透到实施例1中制作的海藻酸交联体(约1.0 cm×1.0 cm)中。加入神经生长因子(NGF)(最终为100 ng/mL)培养7天(第3天追加0.5mL的培养基)，之后以150 μL/孔添加WST-8试剂(DOJINDO)，在37℃下静置3小时。在96孔板中分别注入每100 μL的上清，使用酶标仪(Tecan)测定450 nm的吸光度。
海藻酸交联体为以下4种：将A-2分别通过(i)氯化钙、(iii)乙二胺进行了交联的交联体(分别称作A-2Ca、A-2EDA)、将A-3分别通过(i)氯化钙、(iii)乙二胺进行了交联的交联体(分别称作A-3Ca、A-3EDA)。使用组织培养用板作为对照。
其结果，以对照中的神经样细胞的存活率为100%时，A-2EDA、A-3Ca和A-3EDA中的存活率均为98%以上。另一方面，只有A-2Ca显示出低存活率(63%)。
推测A-2Ca的神经样细胞存活率低的原因在于：洗脱的钙的毒性、以及溶解的海藻酸所引起的培养基中的粘度增大而导致供氧不足。
实施例3　照射了电子射线的海藻酸交联体的评价
3-(1) 对海藻酸交联体照射电子射线
使用低内毒素海藻酸钠的A-2和A-3，制作以氯化钙和氯化钠作为交联剂的海藻酸交联体(分别称作A-2CaNa、A-3CaNa)，按照实施例1-(4)制作以乙二胺作为交联剂的海藻酸交联体(分别称作A-2EDA、A-3EDA)。以氯化钙和氯化钠作为交联剂的海藻酸交联体如下制作：将分别填充有3.15ml的1%海藻酸钠水溶液的板浸在25ml的钙-钠交联剂水溶液(50mM的氯化钙无水合物、300mM的氯化钠)中使其凝胶化，清洗后进行冷冻干燥。
对各海藻酸交联体分别照射20kGy、40kGy、60kGy的电子射线。
电子射线照射装置使用RDI公司制造的Dynamitron型电子加速器，剂量测定装置使用CTA剂量计用岛津UV1800分光光度计。作为剂量计，使用CTA剂量计(富士胶卷公司制造的FTR-125)批号459。在加速电压为4.8MV、电流为20.0mA的条件下调节照射时间，照射电子射线，以达到目标照射剂量。
3-(2) 照射了电子射线的海藻酸交联体的崩解时间的评价
对于实施例3-(1)中制作的、照射了电子射线的海藻酸交联体和未照射电子射线的海藻酸交联体，测定其在生理盐水中的崩解时间。
具体而言，将各交联体剪成约7mm×约7mm，放入装有25ml生理盐水的50ml的离心管中，在37℃的恒温器内将离心管横着放倒，在此状态下以60rpm进行振荡，测定直至交联体完全崩解的时间。
结果见表3。
关于以氯化钙和氯化钠作为交联剂的海藻酸交联体(A-2CaNa、A-3CaNa)，没有发现电子射线剂量与溶解为止的时间有一定的关系。另一方面，关于以乙二胺作为交联剂的海藻酸交联体(A-2EDA、A-3EDA)，随着电子射线剂量的增高，直至溶解结束的时间变短。A-3EDA的电子射线照射量为0kGy和20kGy的交联体在20天后均未溶解，未照射的交联体20天后仍保持形状，相对于此，20kGy照射的交联体没有保持海绵的形状，呈无法用小镊子夹住的硬度。另外，与A-3EDA相比，发现A-2EDA整体上直至溶解结束的时间短的趋势。
[表3]
实施例4　使用了海藻酸交联体的大鼠坐骨神经损伤部的再生诱导
在大鼠坐骨神经(末梢神经)的切断部位设置乙二胺交联的海藻酸交联体，评价神经再生诱导的效果。
4-(1) 乙二胺交联海藻酸交联体的制作
按照实施例1-(4)，使用A-2和A-3的低内毒素海藻酸钠，制作通过乙二胺进行了共价键交联的干凝胶状海藻酸交联体(分别称作A-2EDA、A-3EDA)。此时交联体中的海藻酸含量为3.0mg/cm2。交联体的厚度为约2mm～约8mm。
4-(2) 直线状坐骨神经的切断和使用乙二胺交联的海藻酸交联体进行的再生诱导
对上述4-(1)中制作的A-2EDA和A-3EDA进行乙醇灭菌，用于下述实验。
将4周龄的雄性Wistar大鼠在麻醉下剥离未分支的直线状坐骨神经周围的膜，露出神经。向神经的里侧插入线，用线系住神经，将神经向上部提拉，在神经下部的空间放置1片海藻酸交联体。切断位于海藻酸交联体上的神经，制作7～8mm宽的缺口。之后，在神经的切断部位上再放置1片海藻酸交联体，从而设置成用两片海藻酸交联体夹住神经的切断部。两片海藻酸交联体剪成能够盖住中枢侧及末梢侧的两神经断端的大小进行使用。海藻酸交联体未进行缝合固定。缝合切开的肌肉，再缝合皮肤。
4-(3) 海藻酸交联体的回收和再生的神经轴突的评价
从上述4-(2)的手术起第8周时从手术部位回收海藻酸交联体和神经，从交联体中取出末梢侧的神经。取出的神经用2.5%戊二醛的PBS溶液固定1次，用2.0%四氧化锇的PBS溶液固定2次。脱水、置换后，包埋在环氧树脂中。以1μm的厚度薄切，用0.5%的甲苯胺蓝染色。在光学显微镜下进行观察，计数有髄轴突的数量。
其结果，在第8周的末梢侧神经中，对于A-2EDA确认到平均493根的有髄轴突，对于A-3EDA确认到平均524根的有髄轴突，确认了海藻酸交联体的神经再生诱导效果。然而，8周时回收的海藻酸交联体和神经的部分中，海藻酸交联体几乎没有被吸收，组织增大形成了块。
在作为比较例实施的、只进行神经的切断而未设置海藻酸交联体的组中，轴突根数平均为156根。另外，未切断神经的未处置的对照组的轴突根数平均为8918根。
4-(4) 坐骨神经分支部的切断和使用乙二胺交联的海藻酸交联体进行的再生诱导
将上述4-(1)中制作的A-2EDA用于下述实验。
将4周齢的雄性Wistar大鼠在麻醉下确认从坐骨神经到腓总神经和胫骨神经分支成Y字形的神经部位，剥离周围的膜，露出神经。用线系住坐骨神经，将神经向上提拉，在神经下方的空间放置1片海藻酸交联体。切断坐骨神经、腓总神经和胫骨神经，使包括神经分支部在内产生7～8mm的缺口。之后，在神经的切断部位上再放置1片海藻酸交联体，从而设置成用两片海藻酸交联体夹住神经的切断部。两片海藻酸交联体剪成能够盖住中枢侧及末梢侧的神经断端的大小进行使用。海藻酸交联体没有进行缝合固定。缝合切开的肌肉，再缝合皮肤。
4-(5) 海藻酸交联体的回收和再生的神经轴突的评价
从4-(4)的手术起第4周时从手术部位回收海藻酸交联体和神经，从交联体中取出末梢侧的神经。使用抗III型β微管蛋白抗体作为抗轴突的抗体，使用抗S100抗体(abcam公司制造)作为抗施旺细胞的抗体，进行染色。
其结果，在胫骨侧断端部和腓骨侧断端部均确认到了轴突的再生。在移植了交联体的部位，在凝胶表层部确认到了再生轴突。
实施例5　使用照射了电子射线的包含聚乙醇酸的海藻酸交联体进行大鼠坐骨神经损伤部的再生诱导
5-(1) 照射了电子射线的包含聚乙醇酸的乙二胺交联的海藻酸交联体的制作
按照实施例1-(4)，将EDA・2HOSu和EDC・HCl溶解于A-2的低内毒素海藻酸钠水溶液中。将所得溶液填充在铺有片状无纺布的聚乙醇酸(PGA)(100mg/cc、3.0mg/cm2 Non-woven PGABiofelt、Biomedical Structures (USA))的托盘中，进行冷冻干燥，从而制作了包含PGA的海藻酸交联体，作为A-2EDA・PGA100。此时交联体中的海藻酸含量为2.0mg/cm2。更详细而言，将海藻酸溶液填充在铺有PGA的托盘中，进行充分的凝胶化，之后进行凝胶的清洗，以除去未反应的交联剂和反应副产物。清洗液使用下述的ECF(细胞外液(Extra CellularFluid))：将CaCl2(2.5 mM、例如0.28 g/L)和NaCl(143 mM、例如8.36 g/L)溶解于纯净水中，并通过了0.22μm的滤器(Millipore公司制造、ミリパック20等)和内毒素去除滤器(Millipore公司制造、プレップスケールUFカートリッジPLGC CDUF 001 LG)而得到的滤液。适当交换清洗液，之后用蒸馏水清洗，除去过量的盐类后进行冷冻干燥。所得交联体的厚度为约2mm～约8mm。
同样，将使用A-3的低内毒素海藻酸钠制作的海藻酸交联体作为A-3EDA・PGA100。
对于所得的两种交联体，以20kGy的吸收剂量照射电子射线。
5-(2) 对直线状坐骨神经的再生诱导效果
按照4-(2)、4-(3)，将实施例5-(1)中得到的两种交联体(A-2EDA・PGA100和A-3EDA・PGA100)应用于直线状坐骨神经的缺口，从应用交联体起8周后评价对直线状坐骨神经的缺口的再生诱导效果。
其结果，在所有组中从缺口朝向末梢侧的断端部均看到了有髄神经的再生。再生的有髄神经的根数如下：对于A-2EDA・PGA100平均为12001根，对于A-3EDA・PGA100平均为7010根。在本说明书中，再生的有髄神经的根数是对所采集的组织标本中的判断为再生部位的神经束中的全部进行计数。健康大鼠的轴突根数大约是6700根左右，可知得到了充分数量的有髄神经的再生。
5-(3) 对坐骨神经分支部的缺损的再生诱导效果
按照实施例5-(1)，使用低内毒素海藻酸钠(A-2或A-3)和片状无纺布的聚乙醇酸(PGA)(50mg/cc、1.5mg/cm2)，制作两种包含PGA的海藻酸交联体，分别作为A-2EDA・PGA50、A-3EDA・PGA50。交联体中的海藻酸含量为2.0mg/cm2。所得交联体的厚度为约2mm～约8mm。对于得到的两种交联体，以20kGy的吸收剂量照射电子射线。对于包括实施例5-(1)中得到的两种交联体(A-2EDA・PGA100和A-3EDA・PGA100)在内共计4种含有PGA的海藻酸交联体，按照实施例4-(4)进行手术，从应用交联体起8周后评价对坐骨神经分支部的缺口的再生诱导效果。
8周后进行外观观察时，在所有组中均确认到了：神经组织从坐骨神经起与胫骨神经和腓骨神经连接。作为其例子，A-3EDA・PGA50和A-2EDA・PGA100的术后8周的照片分别见图1、图2。
另外，按照实施例4-(3)，将距末梢侧断端部远的神经的横断切片用甲苯胺蓝染色，结果见图3和图4。图3显示胫骨神经侧的再生轴突的照片，图4显示腓骨神经侧的再生轴突的照片。其结果，在胫骨神经侧和腓骨神经侧有髄轴突的直径长、数量多、髓磷脂厚，确认到了充分的再生。即，本发明的神经再生诱导用材料在用于神经分支部的缺损部时，显示了诱导分支的双方的神经的再生。
5-(4) 对坐骨神经的直线状或者分支部的缺损的再生诱导效果(2)
对于以下各样品，按照实施例4，从应用交联体起8周后评价对大鼠坐骨神经分支部的缺口的再生诱导效果。
按照实施例1-(4)，使用A-2的低内毒素海藻酸钠，制作进行了乙二胺交联的海藻酸交联体(海藻酸含量为2.0mg/cm2)，照射20kGy的电子射线，作为样品编号1。
分别以实施例5-(3)中使用的A-2EDA・PDA50和A-2EDA・PDA100作为样品编号2、3，显示了实施例5-(3)中得到的结果。
按照实施例5-(1)，使用A-3的低内毒素海藻酸钠和PGA100制作了交联体(A-3EDA・PGA100)。将海藻酸含量为2.0mg/cm2的交联体作为样品编号4，将海藻酸含量为4.0mg/cm2的交联体作为样品编号5，对这些交联体以15kGy照射电子射线。
不含PGA的海藻酸交联体，在冷冻干燥时交联体的形状发生变形，难以得到一定形状的交联体，而含有PGA的海藻酸交联体维持了填充在板上的形状，能够进行冷冻干燥，可以提高制造效率。
需要说明的是，以只进行了神经分支部的切断的组作为样品编号6，以未进行神经分支部的切断的未处置组作为样品编号7，进行评价。
对于各组，从缺口起计数末端的胫骨侧和腓骨侧的再生轴突根数，算出其平均值(n=6～8)。在神经分支部的缺损部使用海藻酸交联体的试验的示意图见图5。另外，只进行了神经分支部的切断的组的平均再生根数如下：胫骨侧为200根、腓骨侧为138根，以此为参考，各组中胫骨和腓骨的再生根数均为400根以下的轴突视为再生不充分，求出各组中判断为再生不充分的再生部位的比例。结果见表4。
[表4]
其结果，在样品编号1～5中，胫骨侧和腓骨侧均显示出充分的神经轴突的再生，与样品编号6的只进行了分支部切断的组相比，再生轴突的根数多。可知：即使与未进行神经分支部的切断的未处置组(样品编号7)相比，在施术后8周的时间点也可获得充分的再生效果。
另外，不含PGA的交联体(样品编号1)的再生轴突的根数与含有PGA的交联体(样品编号2和3)的根数相比没有发现显著差别。由此显示：交联体中是否存在PGA对神经再生效果没有显著的影响。另一方面，在各组中比较再生轴突根数为400根以下的再生不充分的轴突比例时，不含PGA的交联体(样品编号1)为33%，相对于此，样品编号2～5的含有PGA的交联体为0%～19%。即，在含有PGA的海藻酸交联体中，与不含PGA的海藻酸交联体相比，看到了再生不充分的例子少的趋势。再生不充分的例子中，还有在接近大鼠膝盖的部分再生神经变细的例子。认为这是由于：膝盖的活动对交联体施加压力而使其破碎(断裂)，丧失了交联体的连续性，导致再生不充分。与不含PGA的交联体相比，含有PGA的海藻酸交联体的强度高，即使在膝盖等可动部凝胶也不易破碎(断裂)，暗示了能够稳定地使轴突再生的可能性。使用不含PGA的交联体(样品编号1)时再生不充分的一个例子见图6。
另外，对于按照实施例1-(4)使用A-2的低内毒素海藻酸钠制作的、照射了40kGy或60kGy的电子射线且不含PGA的海藻酸交联体(A-2EDA、海藻酸含量为2mg/cm2)，按照实施例5-(2)评价了术后8周时对直线状神经缺口的再生效果。其结果，再生轴突的平均根数分别少至平均267根、平均275根。术后8周时在患处未见交联体的残留。考察再生轴突根数如此少的原因时，由此前的试验可知：(i)在实施例5-(2)中，照射了20kGy的电子射线的含有PGA的交联体对直线状的神经缺口显示出了充分的神经再生效果；(ii)对分支部的缺口也有效果，但交联体中是否存在PGA对神经再生效果没有显著影响(表4)，考虑到这些，暗示了将电子射线剂量升高到40kGy或60kGy对神经再生效果产生影响的可能性。
实施例6　海藻酸交联体的皮下埋植试验
6-(1) 大鼠长期皮下埋植试验(1)
在此前的试验中，暗示了海藻酸交联体的体内消失速度(残留率)与神经再生效果的关联，因此对于各种交联体，进行大鼠皮下埋植试验，研究体内消失速度。
对于按照实施例1-(4)和实施例5-(1)使用A-2或A-3的低内毒素海藻酸钠制作的海藻酸交联体(一部分还包括含有PGA的交联体)，改变电子射线剂量进行照射，制作了样品。样品的种类如表5所示。样品编号43和44分别只以PGA(50mg/cc、1.5mg/cm2)、PLGA(50mg/cc、1.5mg/cm2)作为样品。将纵0.7cm×横1.5cm(不管厚度如何)的尺寸的各样品埋植在大鼠背面部的皮下，4周后进行组织学评价。组织学评价是通过如下制作的标本进行评价。即，按照常规方法制作石蜡包埋块，进行苏木精-伊红染色和番红O染色。以5个等级的评分评价样品的残留性。即，对于各样品，无样品残留为0、极少残留为1、少量残留为2、中等残留为3、明显残留为4，各组以n=3或6进行评价，以其平均值作为该样品的残留评分。
结果见表5。其结果，使用A-2的低内毒素海藻酸钠制作的海藻酸交联体的A-2EDA，在相同海藻酸含量的交联体中，随着电子射线剂量的升高，残留评分可见下降的趋势。另外，增加海藻酸含量时，残留评分可见上升的趋势。关于使用A-3的低内毒素海藻酸钠制作的海藻酸交联体的A-3EDA，也可见相同的趋势。比较A-2EDA和A-3EDA时，当海藻酸含量和电子射线剂量相同时，与A-2EDA相比，A-3EDA可见残留评分升高的趋势。
[表5]
实施例6-(2) 大鼠长期皮下埋植试验(2)
按照实施例1-(4)和实施例5-(1)，制作表6所示的样品，和6-(1)一样埋植在大鼠背面部的皮下，8周后和12周后对样品的残留性进行组织学评价。组织学评价是通过如下制作的标本进行评价。即，取出埋植的皮下组织，用10%中性缓冲福尔马林溶液固定后，切取组织，制作石蜡包埋块，进行苏木精-伊红染色和番红O染色。样品的残留性以5个等级的评分进行评价。即，对于各样品，无样品残留为0、极少残留为1、少量残留为2、中等残留为3、明显残留为4，各组以n=3进行评价，以其平均值作为该样品的残留评分。
[表6]
其结果，各样品在8周、12周时残留评分均逐渐降低。由样品编号51与52的残留率的比较可知：PGA的添加对残留率没有产生大的影响。另外，由样品编号52与53的比较可知：通过增加海藻酸含量，样品的残留率上升。样品编号52、53作为表4的样品编号4、5，样品编号54是在实施例5-(3)中确认到了神经再生效果的交联体。像这样使用神经再生诱导用材料在大鼠背面部进行皮下埋植试验时，通过从埋植起8周后～12周后的患处的组织学评价，确认到了样品的残留，同时认为这对于神经再生效果而言是所希望的要素之一。
实施例7　海藻酸交联体的水中分解性试验
通过体外试验评价海藻酸交联体的分解性。
将剪成了纵1cm×横1cm的尺寸(不管厚度如何)的4个样品放入50mL容量的离心管(玻璃制)中，加入25mL的生理盐水，之后使用恒温振荡水槽进行振荡，随时间观察样品的变化。以样品的纵横裁剪面垂直相交的方式进行裁剪。各样品的厚度为约2mm～约8mm。测定时间点为开始起4小时时、1天(24小时)、2天(48小时)、3天(72小时)、4天(96小时)、5天(120小时)和6天(144小时)。试验开始前称量样品。在各测定时，将测定后的液体用孔径为10μm的膜滤器(メルク制造、オムニポア)进行减压过滤，获得过滤收集的残余物的图像，之后进行减压干燥(60℃)至恒重。称量残留的样品，算出相对于试验开始前的样品量的比例，作为残留率(%)。
恒温振荡水槽(トーマス科学器械制造、T-N22S型；调温装置：ヤマト科学制造、CTA401S)的振荡速率设为往返120次/分钟。溶剂温度设为50℃，作为恒温振荡水槽的设定温度。
对在实施例5-(3)(4)中确认到了大鼠神经再生效果的样品编号61～64和未照射电子射线的交联体进行评价。评价的交联体见表7。样品编号66与实施例4-(2)中在大鼠试验中进行了乙醇灭菌后使用的交联体的组成相同。样品68是以按照实施例5-(1)使用PLGA(50mg/cc、1.5mg/cm2)代替PGA而同样制作的交联体作为样品。
[表7]
结果见图7。其结果，样品编号61～64的交联体可见残留率随时间而降低的趋势，试验开始起3天后(72小时后)的残留率显示出约20%～约70%的范围。另一方面，作为不含PGA、且未照射电子射线的交联体的样品65和66的残留率上升。作为含有PGA或PLGA、且未照射电子射线的交联体的样品67和68，可见残留率随时间而降低，但试验开始起3天后(72小时后)的残留率显示为80%以上。
以上结果暗示：在该试验中，试验开始起3天后(72小时后)的交联体残留率处于约20%～约80%的范围的交联体对神经再生而言是优选的。
对于变更电子射线和γ射线的剂量进行照射的交联体，同样地进行评价。评价的交联体如表8所示。样品编号71是在实施例5-(4)中确认到了大鼠神经再生效果的交联体。
[表8]
结果见图8。其结果，作为照射了电子射线的交联体的样品编号71和72，同样可见残留率随时间而降低的趋势，但在两者中比较刚刚开始后的4小时后的残留率时，与电子射线剂量为15kGy的样品71相比，电子射线剂量为30kGy的样品72的残留率低。作为照射了γ射线的交联体的样品编号73～75也和照射了电子射线的交联体一样，可见残留率随时间而降低的趋势。另外，在样品编号73～75中，γ射线剂量为50kGy的样品75在刚刚开始后的4小时后的残留率下降至约50%左右。由该结果暗示：通过提高电子射线和γ射线的照射剂量，刚刚开始后的残留率下降。在神经缺口设置交联体以促进神经的再生时，若交联体在设置后的早期消失，则认为其无法成为神经的再生初期的立足点。如实施例5-(4)所记载，以40kGy或60kGy的电子射线剂量进行了照射的交联体，其直线状神经缺口的再生效果不高，认为这可能是交联体从设置之初即消失，没有发挥作为神经的立足点的作用。
在按照实施例5-(1)使用PLGA(50mg/cc、1.5mg/cm2)代替PGA同样地制作的交联体和含有PGA的交联体中同样地比较分解性。评价的交联体如表9所示。样品编号84是在实施例5-(3)中确认到了神经再生效果的交联体，而样品编号85是在实施例5-(4)中确认到了神经再生效果的交联体。
[表9]
结果见图9。其结果，含有PLGA的样品和含有PGA的样品一样，残留率随时间而降低。在含有PLGA的样品编号81和82、含有PGA的样品编号83、84、85中均可见以下趋势：电子射线剂量越高的样品，开始起4小时后的残留率越低，之后同样显示出残留率的降低。如上所述，暗示了PLGA作为交联体的材料可以代替PGA同样地进行使用。
实施例8 交联体对正常人皮肤成纤维细胞的效果
对于按照实施例1-(4)制作的用乙二胺进行了交联的海藻酸交联体和市售的胶原海绵，评价正常人皮肤成纤维细胞(NHDF：Normal Human Dermal Fibroblasts)的细胞粘附性和细胞增殖性，并进行比较。认为NHDF等成纤维细胞会向用于神经再生的空间移动、增殖，妨碍神经再生。
样品为(1) A-2EDA、(2) A-3EDA、(3)牛胶原海绵(SpongeCol (注册商标),Advanced BioMatrix公司制造)、(4) 2D对照(组织培养皿)这4组。各样品的大小如下：(1)和(2)为纵约5mm×横约5mm×厚度约2mm～约7mm，(3)为直径4mm的圆形×厚度约1mm。在各样品中接种104个细胞，在培养基中培养1天、4天后，将各样品转移到新的孔中，以分离未粘附于样品的细胞，之后使用WST-8试剂，根据450nm的吸光度评价粘附于各样品的细胞数。培养基为10%的FCS/EMEM。
NHDF的粘附和增殖的结果见图10。其结果，在培养1天后，在A-2EDA和A-3EDA的交联体中，NHDF发生了与胶原海绵相同程度的粘附，但之后细胞数减少。另一方面，在胶原海绵中显示出细胞数的增加。如上所述显示了：与胶原海绵相比，海藻酸交联体会抑制妨碍神经再生的成纤维细胞的粘附、增殖。
实施例9 对大鼠海绵体神经丛去除模型的神经再生效果
9-(1) 大鼠海绵体神经丛去除模型的制作
将大鼠在基于吸入2%异氟醚的麻醉下固定成仰卧位。切开下腹部的正中，在显微镜下展开骨盆内部，露出骨盆神经丛和海绵体神经。治疗组和未治疗组均确保海绵体神经，之后以横切分支成网眼状的神经丛的方式切除约2mm的海绵体神经。左右进行同样的处置。治疗组是将按照实施例5-(1)制作的含有PGA的海藻酸交联体(A-3EDA・PGA100)以充分覆盖神经切除断端的方式放置，进行缝合固定。未治疗组仅切除神经。正常对照组没有进行海绵体神经的切除。之后，缝合下腹部的肌肉层和皮肤。手术前以20000单位/kg的用量肌肉内注射苄青霉素钾。另外，将镇痛剂丁丙诺啡以0.01mg/kg的用量按照1天2次、3天为1mL/kg的容量进行皮下给药。各组以n=3进行。
9-(2) 交尾行为的确认
从9-(1)的处置起4周后和7周后，使各组的3只与确认到发情的雌性同居在金属网制的铺有床网的笼内。第二天，根据雌性的阴道塞(copulatory plug)的有无，确认是否存在交尾行为。需要说明的是，无法确认阴道塞的大鼠继续观察至第7天再进行判定。
其结果，在各组的3只中可见交尾行为(雌性存在阴道塞)的大鼠的比例见表10。其结果，未进行海绵体神经切除的正常对照100%可见交尾行为，但在切除了海绵体神经的未治疗组中，4周后和7周后均完全没有看到交尾行为。另一方面，在切除海绵体神经后放置了上述海藻酸交联体的治疗组中，在4周后和7周后均以2/3的比例可见交尾行为。由此显示：含有海藻酸的交联体使海绵体神经中的网眼状结构的神经丛本身被切除了的损伤部在手术起4周后这样的早期再生，使功能恢复至能够进行正常的交尾行为。
[表10]
实施例10　海藻酸交联体的撕裂试验
对于表11的6种海藻酸交联体，假设通过手术缝合交联体的情形，进行撕裂试验，比较各样品的强度。
样品编号101和104是不含PGA的海藻酸交联体，其他样品是含有PGA的海藻酸交联体，分别按照实施例1-(4)、实施例5-(1)的记载来制作。样品编号101～103没有照射电子射线，样品编号104～106以15kGy照射了电子射线。
试验方法如下。试验方法的示意图见图11。裁剪各样品使达到纵2cm×横2cm的尺寸(不管厚度如何)。这里纵与横的裁剪面垂直相交。此时各样品的厚度为约2mm～约8mm。在距其1个裁剪面5mm的位置用双夹(把持部的宽度为约15mm)把持以夹住该材料(把持部A)。将该样品的从把持部A所相对的裁剪面(B)到10mm的整个部分在生理盐水中浸渍15分钟。使带针的缝合线(バイクリル(注册商标)、4-0、圆针SH-1)贯穿该样品的距裁剪面(B)5mm的位置的中央部，将缝合线的两端固定在器具上。沿着样品的正方形面以10mm/分钟的速度水平拉伸上述把持部A。在缝合线附近继续拉伸直至各样品破裂，测定拉伸荷重作为试验力。拉伸荷重的测定使用小型物性试验仪(EZ-graph、岛津制作所制造)来进行。各样品均以n=5进行测定，求出试验力的最大点(最大试验力)的平均值。
[表11]
结果见图12。其结果，在未照射电子射线的各交联体(样品编号101～103)和照射了电子射线的各交联体(样品编号104～106)中，与不含PGA的交联体相比，含有PGA的交联体的最大试验力(N)高。另外，与未照射电子射线的交联体(样品编号101～103)相比，照射了电子射线的交联体(样品编号104～106)整体上最大试验力略有下降。
另外，对于这些交联体，进行假设了手术中的缝合手法、交联体在设置部位的固定的缝合试验时，不含PGA的交联体(样品编号101和104)用缝合线牢固地系住时，交联体破碎，无法进行缝合，但含有PGA的样品编号102、103、105、106充分具有可以缝合的强度。撕裂强度的结果，海藻酸含量为2mg/cm2和4mg/cm2时由含量引起的差异变大，撕裂试验和缝合试验的结果，认为很大程度上全是由有、无PGA的差别引起的。由此认为：为了形成可缝合的交联体，在上述试验中优选试验力超过0.10(N)的交联体。

Claims (15)

1. 一种用于神经损伤部的再生的非管状的神经再生诱导用材料，该神经再生诱导用材料包含：(A)将低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类用选自下述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂进行了共价键交联的交联体；以及(B)生物吸收性高分子；
R1HN-(CH2)n-NHR2 (I)
式中，R1和R2分别独立表示氢原子或者式-COCH(NH2)-(CH2)4-NH2所表示的基团，n表示2～18的整数。
2.权利要求1所述的神经再生诱导用材料，其中分子内具有羧基的生物吸收性多糖类为选自海藻酸、其酯及其盐的至少一种。
3.权利要求1或2中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中交联性试剂为所述通式(I)所表示的化合物的N-羟基琥珀酰亚胺盐。
4.权利要求3所述的神经再生诱导用材料，其中所述通式(I)所表示的化合物的N-羟基琥珀酰亚胺盐为选自二氨基乙烷的二N-羟基琥珀酰亚胺盐、二氨基己烷的二N-羟基琥珀酰亚胺盐、N,N’-二赖氨酰-二氨基乙烷的四N-羟基琥珀酰亚胺盐和N-赖氨酰-二氨基己烷的三N-羟基琥珀酰亚胺盐的至少一种。
5.权利要求1～4中任一项所述的神经再生诱导用材料，该神经再生诱导用材料为干凝胶的形态。
6.权利要求1～5中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中生物吸收性高分子为选自聚乙醇酸、聚乳酸和它们的共聚物、以及聚己内酯的至少一种。
7.权利要求1～6中任一项所述的神经再生诱导用材料，该神经再生诱导用材料以1kGy～100kGy的吸收剂量照射了电子射线和/或γ射线。
8.权利要求1～7中任一项所述的神经再生诱导用材料，其中，在进行如下的撕裂试验时，最大试验力(荷重)为0.10(N)～10.0(N)：将所述材料剪成纵2cm×横2cm的尺寸(不管厚度如何)，在距其1个裁剪面5mm的位置用双夹把持以夹住该材料(把持部A)，将该材料的从把持部A所相对的裁剪面(B)到10mm的区域在生理盐水中浸渍15分钟，之后使带针的缝合线贯穿该材料的距该裁剪面(B)5mm的位置的中央部，将缝合线的两端固定在器具上，将该把持部A以10mm/分钟的速度沿材料的正方形面水平地拉伸。
9.权利要求2～8中任一项所述的神经再生诱导剂用材料，其中所述材料中的选自海藻酸、其酯及其盐的至少一种的含量换算成海藻酸钠为0.2mg/cm2～12mg/cm2。
10.权利要求1～9中任一项所述的神经再生诱导剂用材料，其中所述材料中的生物吸收性高分子的含量为0.05mg/cm2～30mg/cm2。
11.权利要求1～10中任一项所述的神经再生诱导剂用材料，该神经再生诱导剂用材料用于末梢神经和/或中枢神经的损伤部的再生。
12.权利要求1～11中任一项所述的神经再生诱导剂用材料，该神经再生诱导剂用材料用于神经分支部和/或神经丛部的损伤部的再生。
13.权利要求12所述的神经再生诱导用材料，其中神经分支部和/或神经丛部的损伤部存在于选自前列腺、膀胱、阴茎海绵体、腕、四肢、脑、脊髄、面部、颈、腰、骶骨、腰骶骨、阴部、心脏、腹腔、下小腹、骨盆、胸腔内部和肠壁内部的至少一种中。
14.权利要求1～13中任一项所述的神经再生诱导用材料，该神经再生诱导用材料用于选自肿瘤切除、淋巴结清扫术和/或外伤所伴随的神经损伤部的再生、以及组织重建所伴随的神经损伤部的再生的至少一种神经损伤部的再生。
15.一种神经再生诱导用材料的制造方法，至少包括以下步骤：
步骤(1)：将包含低内毒素的分子内具有羧基的生物吸收性多糖类的溶液和选自所述通式(I)所表示的化合物及其盐的至少一种交联性试剂混合；
步骤(2)：将(1)中得到的混合物和生物吸收性高分子放入模具中静置一定时间，形成交联体；
步骤(3)：清洗(2)中得到的交联体，之后进行冷冻干燥；以及
步骤(4)：对(3)中得到的交联体照射电子射线和/或γ射线。
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