BR112020019949B1

BR112020019949B1 - Enxertos permeados por polímero e métodos de produção e uso dos mesmos

Info

Publication number: BR112020019949B1
Application number: BR112020019949-4A
Authority: BR
Inventors: Nicholas Pashos; William HEIM
Original assignee: Bioaesthetics Corporation
Priority date: 2018-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2023-10-31
Also published as: WO2019195227A1; AU2019248637A1; CA3095736A1; EP3773769A4; EP3773769A1; BR112020019949A2; US20210023267A1

Abstract

esta invenção refere-se a enxertos permeados por polímero e métodos de produção e uso dos mesmos.

Description

[001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisório US N° 62/651.485, depositado em 2 de abril de 2018, e 62/775.963, depositado em 06 de dezembro de 2018, cujos conteúdos são cada um incorporado por referência em sua totalidade.

[002] Todas as patentes, pedidos de patentes e publicações mencionados neste documento estão incorporadas em sua totalidade por meio deste por referência. As divulgações dessas publicações, em sua totalidade, são incorporadas por referência a este pedido, a fim de descrever com mais detalhes o estado da técnica conforme compreendido por aqueles versados na técnica da invenção descrita e reivindicada aqui até o momento.

[003] Essa divulgação de patente contém material que está indivíduo à proteção de direitos autorais. O proprietário dos direitos autorais não tem nenhuma objeção à reprodução facsímile por qualquer pessoa do documento de patente ou a divulgação de patentes como aparece na Patente US e Escritório de Marca Registrada de arquivo ou registros de patentes, mas por outro lado se reserva todos e quaisquer direitos autorais.

CAMPO DA INVENÇÃO

[004] Esta invenção refere-se a enxertos permeados por polímero e métodos de produção e uso dos mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[005] Plastinação é uma técnica que utiliza polímeros para permitir a preservação de corpos, partes do corpo, espécimes anatômicos e espécimes cirúrgicos em um estado físico próximo ao da condição de vida. Existem limitações e desvantagens da plastinação que a impede de ser usada em um ambiente clínico. Além disso, os plastinados que são obtidos após o procedimento de plastinação são geralmente usados em um ambiente não clínico, como para a preservação de tecidos para fins de ensino ou exame histológico. Aspectos da invenção abordam essas necessidades não atendidas, fornecendo enxertos impregnados de resina para uso in vivo e métodos de fabricação e uso dos mesmos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] A presente invenção fornece um enxerto permeado com polímero para uso in vivo em um indivíduo.

[007] Nas modalidades, o enxerto permeado com polímero compreende um tecido substancialmente livre de células e que é permeado com um polímero que é substancialmente uniformemente distribuído no tecido. Nas modalidades, o tecido descelularizado está substancialmente livre de água ou está livre de água.

[008] Nas modalidades, o enxerto compreende menos do que cerca de 50% de polímero. Em modalidades, o enxerto compreende mais de 0% de polímero, mais de cerca de 0,1% de polímero, mais de cerca de 1% de polímero, mais de cerca de 5% de polímero, mais de cerca de 10% de polímero, mais de cerca de 20% de polímero, mais de cerca de 30% de polímero, mais de cerca de 40% de polímero, mais de cerca de 50% de polímero.

[009] Nas modalidades, o tecido compreende um tecido dérmico e/ou um tecido epidérmico.

[010] Nas modalidades, o tecido compreende um órgão (por exemplo, um pulmão ou um fígado), um músculo, um ligamento, um osso, um mamilo, aréola, um mamilo ligado a uma aréola, um lábio, pele, um tendão, uma aorta, um vaso sanguíneo.

[011] Nas modalidades, o tecido descelularizado retém substancialmente pelo menos uma molécula de matriz. Por exemplo, a molécula da matriz é um componente da matriz extracelular, exemplos não limitativos dos quais compreendem laminina, elastina, fibronectina, colágeno (como um colágeno Tipo I, um colágeno Tipo III, um colágeno Tipo IV, um colágeno Tipo VI, ou uma combinação dos mesmos), ou uma combinação dos mesmos.

[012] Nas modalidades, o tecido descelularizado é substancialmente livre de pele, gordura e/ou tecido fibroso.

[013] Nas modalidades, o enxerto permeado por polímero compreende um polímero natural (como alginato ou colágeno) e/ou polímero sintético (como cianoacrilato).

[014] Nas modalidades, o polímero compreende um polímero colorido, como um polímero que compreende melanina, um corante ou uma combinação dos mesmos.

[015] Nas modalidades, o polímero compreende pelo menos uma célula viável, um polímero que compreende pelo menos um antibiótico, um polímero biodegradável (por exemplo, quitosana, colágeno, alginato, cianoacrilato, dermabond), um polímero não biodegradável (por exemplo, silício, UHMWPE), um polímero capaz de reticulação polimérica ou uma combinação dos mesmos.

[016] Nas modalidades, as células foram introduzidas em enxerto permeado por polímero sob condições que conduzem a repovoar o tecido com as células ou sua progênie. Por exemplo, as células viáveis compreendem células exógenas, células autólogas, células alogênicas. Exemplos não limitativos de tipos de células utilizados incluem células estromais, fibroblastos, células endoteliais, células progenitoras, células-tronco, células específicas de órgãos, células específicas de tecidos, queratinócitos, melanócitos, uma célula nervosa ou uma combinação dos mesmos.

[017] A presente invenção fornece ainda um método para fazer um enxerto permeado com polímero para uso in vivo.

[018] Nas modalidades, o método compreende a obtenção de um tecido descelularizado; opcionalmente, fixar o tecido descelularizado submergindo o tecido descelularizado em um fixador por um período de tempo suficiente para fixar o tecido; substituir substancialmente toda a água dentro do tecido por um solvente, submergindo o tecido descelularizado no solvente por um período de tempo e a uma temperatura suficiente para substituir toda ou substancialmente toda a água dentro do tecido; opcionalmente, remover toda ou substancialmente toda a gordura dentro do tecido submergindo o tecido descelularizado em um solvente por um período de tempo e a uma temperatura suficiente para remover substancialmente todos os lipídios; permear o tecido com um polímero submergindo o tecido no polímero e submetendo o tecido submerso a vácuo por um período de tempo suficiente para permear o tecido com o polímero; opcionalmente, reticulação polimérica do polímero permeado no tecido; em que o tecido permeado com polímero compreende o polímero distribuído de maneira substancialmente uniforme no referido tecido; fornecendo assim um enxerto permeado com polímero para uso in vivo.

[019] Nas modalidades, o reticulador químico pode ser misturado com o polímero ou precursor do mesmo antes de permear o tecido descelularizado e/ou matriz.

[020] As modalidades podem compreender ainda a descelularização de um tecido de células da epiderme e/ou células da derme, embora retendo substancialmente pelo menos uma molécula de matriz, como uma molécula da matriz extracelular.

[021] Por exemplo, a molécula da matriz é um componente da matriz extracelular, exemplos não limitativos dos quais compreendem laminina, elastina, fibronectina, colágeno (como um colágeno Tipo I, um colágeno Tipo III, um colágeno Tipo IV, um colágeno Tipo VI, ou uma combinação dos mesmos), ou uma combinação dos mesmos.

[022] As modalidades podem ainda compreender o repovoamento do tecido com células viáveis em condições que conduzam ao repovoamento do tecido com as células ou sua progênie. O repovoamento ocorre aproximadamente ao mesmo tempo que a etapa de permeação e/ou o repovoamento ocorre após a etapa de permeação. As células viáveis podem compreender células exógenas, células autólogas, células alogênicas. Exemplos não limitativos de tipos de células utilizados incluem células estromais, fibroblastos, células endoteliais, células progenitoras, células-tronco, células específicas de órgãos, células específicas de tecidos, queratinócitos, melanócitos, uma célula nervosa ou uma combinação dos mesmos.

[023] Nas modalidades, o fixador compreende glutaraldeído, genipina.

[024] Nas modalidades, o solvente compreende acetona, xileno, álcool.

[025] Nas modalidades, o tecido descelularizado é incubado em acetona a cerca de -15°C a 25°C por um período de tempo.

[026] Nas modalidades, a reticulação polimérica compreende reticulação polimérica UV, reticulação polimérica química.

[027] Ainda, a invenção é direcionada ao método de enxerto em um indivíduo de um enxerto impregnado com polímero.

[028] Nas modalidades, o método compreende a obtenção do enxerto permeado com polímero, conforme descrito neste documento, e implantação do enxerto permeado com polímero em um sítio no indivíduo; enxertando assim a um indivíduo o enxerto permeado com polímero.

[029] Nas modalidades, o enxerto permeado por polímero foi repovoado com células viáveis. As células viáveis podem compreender células exógenas, células autólogas, células alogênicas. Exemplos não limitativos de tipos de células utilizados incluem células estromais, fibroblastos, células endoteliais, células progenitoras, células-tronco, células específicas de órgãos, células específicas de tecidos, queratinócitos, melanócitos, uma célula nervosa ou uma combinação dos mesmos.

[030] Outros objetos e vantagens desta invenção tornar-se-ão facilmente evidentes a partir da descrição que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[031] A FIG. 1 mostra um esquema de um método para fazer um enxerto permeado com polímero. (NAC: complexo aréola do mamilo).

[032] A FIG. 2 mostra um esquema de fibras de proteína e estrutura de polímero.

[033] A FIG. 3 mostra exemplos de aplicações de um enxerto permeado com polímero.

[034] A FIG. 4 são micrografias eletrônicas de crio-triagem de pele intacta e acelular de macaco rhesus mostrando feixes de colágeno e fibras na epiderme e derme.

[035] A FIG. 5 é um esquema do processo de plastinação da invenção. (Superior) Um ABG embebido em acetona é incubado em um banho de polímero (roxo) e indivíduo à impregnação por força de vácuo, fazendo com que o polímero substitua a acetona que escapou. ABG é lavado e colocado em condições de banho (dependente de polímero) para induzir a polimerização. (Inferior) Visão ampliada do enxerto de ECM sendo impregnado por força de vácuo com monômeros antes da reticulação polimérica de monômeros para polímeros dentro do espaço intersticial.

[036] A FIG. 6 é um esquema que mostra a pele humana intacta que é descelularizada e cortada no tamanho certo. Os polímeros são biotinilados e impregnados a vácuo em enxertos de pele acelular usando diferentes combinações de polímero, concentração e tempo de impregnação. Os polímeros impregnados são então medidos quanto à ocupação e distribuição do polímero. Enxertos bem-sucedidos são então medidos quanto à resistência mecânica e bioatividade.

[037] A FIG. 7 mostra a reconstrução NAC.

[038] A FIG. 8 é um esquema para o processo de descelularização e enxerto do NAC para uso humano. Etapas: 1) Remoção de um NAC de cadáver para geração de enxerto ou remoção do NAC do paciente como parte da mastectomia. 2) Decelularização do NAC do doador. 3) Onlay de enxerto de NAC acelular enxertado no paciente 4) Repovoamento natural da estrutura de andaime NAC acelular com células do paciente, resultando na regeneração de NAC.

[039] A FIG. 9 mostra a histologia de dcl-NHP NAC representativo. (Extrema esquerda) Micrografia H&E de um dcl-NHP NAC selecionado aleatoriamente. As regiões em caixas amarelas são mostradas em maior ampliação nas micrografias 1-3.

[040] A FIG. 10 mostra peso e neovascularização (murino). Para todos os resultados, foi realizada ANOVA de uma via com teste postthoc de Tukey. * = p <0,05; ** = p<0,01; *** = p<0,001.

[041] FIG. 11 mostra a histologia de dcl-NHP NAC representativo (modelo murino). (abaixo) Micrografia H&E de um dcl-NHP NAC selecionado aleatoriamente. A região na caixa verde é mostrada em maior ampliação nas micrografias 1-3.

[042] A FIG. 12 mostra os pesos corporais de NHP. A) Pesos corporais do NHP. B) Gráfico dos pesos médios dos períodos de estudo.

[043] A FIG. 13 mostra eritrócitos. A) Gráfico de contagens de células eritrocitárias. B) Gráfico de contagens de células eritrocitárias médias dos períodos de estudo.

[044] A FIG. 14 mostra a contagem de plaquetas. A) Gráfico das contagens de plaquetas antes, durante e depois do experimento de enxerto. B) Gráfico das contagens médias de plaquetas dos períodos de estudo.

[045] A FIG. 15 mostra as propriedades dos eritrócitos. A) propriedades eritrocitárias B) Gráfico dos valores médios de propriedade eritrocitária dos períodos oHgb(hemoglobina), Hct(hematócrito), Mcv(volume corpuscular médio), Mch(hemoglobina corpuscular média), Mchc(hemoglobina corpuscular média por célula) e Rdw(largura de distribuição de glóbulos vermelhos).

[046] A FIG. 16 mostra o perfil de leucócitos do sangue periférico NHP. A) Gráfico de leucócitos de antes, durante e após a experiência de enxerto B) Gráfico de contagens de leucócitos médias de períodos de estudo. WBC(glóbulos brancos), Neu(neutrófilos), Lym(linfócitos), Mon(monócitos), Eos(eosinófilos) e Bas(basófilos).

[047] A FIG. 17 mostra eletrólitos. A) Gráfico de eletrólitos de antes, durante e após o experimento de enxerto. B) Gráfico dos níveis médios de eletrólitos dos períodos de estudo. Para todos os resultados, foi realizada ANOVA de uma via com teste postthoc de Tukey. * = p <0,05; ** = p<0,01; *** = p<0,001.

[048] A FIG. 18 mostra a histologia de dcl-NHP NAC representativo (abaixo) A) NHP NAC descelularizado B) Nativo vs Decell, C) orientação de enxerto, D) Semana 1 vs semana 6 H&E. E) ampliação do centro da semana 6 da parte D (quadrado verde).

[049] A FIG. 19 é uma ilustração que mostra um processo para gerar poliABG carregado com droga. A pele humana derivada do doador é descelularizada usando o processo de patente pendente e cortada no tamanho certo. Os enxertos são saturados em um solvente orgânico, submersos em uma mistura de polímero e banho de droga e indivíduos a pressão de vácuo. A alta pressão de vapor do solvente orgânico provoca escape do enxerto, criando uma mudança na pressão dentro do interstício. Após o retorno à pressão normal, o polímero circundante e a mistura da droga são impregnados à força no enxerto. A droga carregada com poliABG é lavada e colocada em condições que permitem a polimerização do polímero em um hidrogel que retém fisicamente a droga.

[050] A FIG. 20 é uma tabela que mostra modalidades de droga + poliABG descritas neste documento em comparação com produtos clínicos atuais.

[051] A FIG. 21 mostra dados para poliABGs dérmicos. Pele humana acelular desidratada e saturada com acetona (1 x 1 x 0,4 cm) foi incubada na presença de soluções de gelatina ou fibroína de seda sob condições idênticas, com apenas variação de pressão. “Impregnação”: aplicação de vácuo. “Difusão”: pressão atmosférica. “Controle”: pele humana acelular desidratada e acetona saturada na presença de solução carreadora (PBS). (Superior) Manchas H&E de pele humana acelular impregnada de gelatina. A gelatina aparece como uma mancha rosa claro dentro do interstício. (Inferior) Manchas azuis Alcian de pele humana acelular impregnada de fibroína de seda. A fibroína de seda aparece como uma mancha azul escura dentro do interstício. As imagens mostradas são do centro do enxerto a uma profundidade de ~ 2 mm da superfície do enxerto. A formação de hidrogel foi induzida pela exposição de poliABG a banho de PBS resfriado para gelatina e metanol para fibroína de seda.

[052] A FIG. 22 mostra micrografias eletrônicas de crio-triagem de pele intacta e acelular de macaco rhesus mostrando feixes de colágeno e fibras na epiderme e derme.

[053] A FIG. 23 mostra (superior) um ABG embebido em acetona é incubado em um banho de polímero (roxo) e indivíduo a impregnação por força de vácuo, permitindo que o polímero substitua a acetona que escapa. O ABG é lavado e colocado em condições de banho (dependente de polímero) para induzir a polimerização. (Inferior) Visão ampliada do enxerto de ECM sendo impregnado com força de vácuo com monômeros antes da reticulação polimérica dos monômeros aos polímeros dentro do intersticial.

[054] A FIG. 24 mostra que a pele humana intacta é descelularizada e cortada no tamanho certo. Os polímeros são biotinilados e impregnados a vácuo em enxertos de pele acelular usando diferentes combinações de polímero, concentração e tempo de impregnação. Os polímeros impregnados são então medidos quanto à ocupação e distribuição do polímero. Enxertos bem-sucedidos são então medidos quanto à resistência mecânica e bioatividade.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Abreviações e Definições

[055] As descrições detalhadas de uma ou mais modalidades preferidas são fornecidas neste documento. É para ser compreendido, contudo, que a presente invenção pode ser modalizada de várias formas.

[056] Portanto, detalhes específicos aqui descritos não são para ser interpretados como limitativos, mas sim como uma base para as reivindicações e como uma base representativa para ensinar um perito na arte para empregar a presente divulgação em qualquer forma adequada.

[057] As formas singulares "uma", "um" e "a/o" incluem referências no plural, a menos que o contexto claramente dite de outra forma. O uso da palavra "um" ou "uma" quando usado em conjunto com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou no relatório descritivo pode significar "um", mas também é consistente com o significado de "um ou mais, ”pelo menos um” e “um ou mais de um”. Sempre que qualquer uma das frases "por exemplo", "tal como", "incluindo" e semelhantes sejam usadas neste documento, a frase "e sem limitação" é entendida como seguida, a menos que explicitamente declarado de outra forma. Da mesma forma, "um exemplo", "exemplar" e semelhantes são entendidos como não limitativos.

[058] O termo "substancialmente" permite desvios do descrito que não impactam negativamente a finalidade pretendida. Os termos descritivos são entendidos como modificados pelo termo "substancialmente", mesmo se a palavra "substancialmente"não for explicitamente recitada.

[059] Os termos "compreendendo" e "incluindo" e "tendo" e "envolvendo" (e de forma semelhante "compreende", "inclui", "tem" e "envolve") e semelhantes são usados indistintamente e têm o mesmo significado. Especificamente, cada um dos termos é definido de acordo com a definição comum da lei de patentes dos Estados Unidos de "compreendendo" e, portanto, é interpretado como um termo aberto que significa "pelo menos o seguinte" e também é interpretado para não excluir recursos adicionais, limitações, aspectos, etc. Assim, por exemplo, "um processo envolvendo as etapas a, b e c" significa que o processo inclui pelo menos as etapas a, b e c. Onde quer que os termos "um" ou "uma" sejam usados, "um ou mais"é entendido, a menos que tal interpretação seja absurda no contexto.

[060] Tal como utilizado neste documento, o termo "cerca de"é utilizado para significar aproximadamente, mais ou menos, em torno de ou na faixa de. Quando o termo "cerca de"é usado em conjunto com um intervalo numérico, ele modifica esse intervalo estendendo os limites acima e abaixo dos valores numéricos estabelecidos. Em geral, o termo "cerca de"é usado neste documento para modificar um valor numérico acima e abaixo do valor declarado por uma variação de 20 por cento para cima ou para baixo (maior ou menor).

[061] A plastinação é uma técnica que utiliza polímeros para permitir a preservação de corpos, partes do corpo, tecidos corporais, peças anatômicas e peças cirúrgicas em um estado físico próximo ao da condição de vida. Durante o processo de plastinação, um polímero curável é puxado ou puxado para a estrutura do tecido usando uma câmara de vácuo. Este procedimento utiliza polímeros que são fortemente impregnados nos tecidos para torná-los estáveis e livres de deterioração.

Enxerto permeado de polímero descelularizado

[062] Os aspectos da invenção são direcionados a composições que compreendem enxertos permeados de polímero descelularizado, tais como aqueles que podem ser implantados em um indivíduo. Um "enxerto" pode se referir a uma estrutura ou composição que é implantada ou fixada em um indivíduo para substituir uma característica anatômica ou para corrigir um defeito anatômico.

[063] Nas modalidades, os enxertos descritos neste documento podem ser usados para usos in vivo, como a substituição de mamilos ou aréolas, ou ambos, que foram removidos cirurgicamente ou foram perdidos devido a trauma. Os enxertos permeados de polímero descritos neste documento podem ser feitos de qualquer tecido, estrutura ou apêndice do corpo de um indivíduo que pode ser descelularizado e/ou retém substancialmente pelo menos uma molécula de matriz após a descelularização, como um órgão (por exemplo, um pulmão ou fígado), um músculo, um ligamento, um osso, um mamilo, aréola, um mamilo ligado a uma aréola, um lábio, pele, um tendão, uma aorta, um vaso sanguíneo. Nas modalidades, o enxerto compreende um tecido dérmico e/ou um tecido epidérmico, como um tecido dérmico descelularizado e/ou tecido epidérmico.

[064] O enxerto pode compreender quaisquer tecidos que retêm substancialmente pelo menos uma molécula de matriz após o processo de descelularização. Por exemplo, a molécula da matriz pode compreender uma molécula ou componente da matriz extracelular. “Matriz extracelular” pode se referir à complexa rede de macromoléculas que preenchem o espaço extracelular em um tecido, como em um mamilo, aréola ou pele. A matriz extracelular é composta de glicosaminoglicanos (GAGs), muitas vezes covalentemente ligados à proteína que forma os proteoglicanos, e proteínas fibrosas, incluindo colágeno, elastina, fibronectina e laminina. Como a pele está sujeita a alongamentos e flexões frequentes, ela tem um conteúdo relativamente alto de elastina e fibras elásticas. O colágeno, por exemplo, pode compreender um colágeno Tipo I, um colágeno Tipo III, um colágeno Tipo IV, um colágeno Tipo VI ou uma combinação dos mesmos. “Proteína fibrosa da matriz extracelular” e "molécula de adesão celular" pode se referir a uma proteína fibrosa da matriz extracelular, tal como fibronectina, laminina, elastina ou um colágeno, incluindo aqueles descritos neste documento.

[065] O enxerto pode compreender um tecido que é livre de células ou substancialmente livre de células. "Substancialmente livre de células"pode descrever um tecido ou enxerto que teve pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais das células presentes no tecido ou estrutura removida. A redução percentual no número de células pode ser determinada, por exemplo, contando por inspeção visual o número de células visíveis nas amostras pré e pós- descelularização, juntamente com a coloração DAPI para visualizar os núcleos. Em algumas modalidades, o próprio enxerto pode estar livre de tecido ou substancialmente livre de tecido. Por exemplo, "substancialmente livre de tecido" pode descrever um enxerto que teve pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais do tecido ou estrutura removida. Em algumas modalidades, o próprio enxerto pode estar livre de células ou substancialmente livre de células (por exemplo, onde o enxerto consiste essencialmente na matriz extracelular com ou sem a presença do polímero). Por exemplo, "um enxerto substancialmente livre de células"pode descrever um enxerto em que pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais das células estão ausentes da estrutura do enxerto (por exemplo, onde o enxerto consiste essencialmente na matriz extracelular com ou sem a presença de polímero). Em algumas modalidades, o enxerto pode compreender essencialmente a matriz extracelular após um tecido ter sido descelularizado. Em algumas modalidades, o enxerto pode compreender essencialmente a matriz extracelular após um tecido ter sido descelularizado, além da presença de polímero.

[066] O enxerto pode compreender um tecido isento de água (ou seja, um enxerto anidro) ou substancialmente isento de água. "Substancialmente livre de água"pode descrever um tecido que teve pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais da água presente no tecido ou estrutura removida.

[067] O enxerto também pode compreender um tecido isento de pele, gordura, lipídios e/ou tecido fibroso. Por exemplo, "substancialmente livre de pele, gordura, lipídios ou tecido fibroso" pode descrever um tecido que teve pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais da pele, gordura, lipídios ou tecido fibroso presente no tecido ou estrutura removida.

[068] A plastinização utiliza polímeros que penetram nos tecidos e/ou são fortemente impregnados nos tecidos para torná-los estáveis e isentos de deterioração. O versado na técnica reconhecerá que as modalidades preferidas utilizarão um polímero com as seguintes propriedades para obter os melhores resultados: fácil e não tóxico de manusear; uma baixa viscosidade no estado não curado; uma base e uma mistura de catalisador/ativador de resina que tem um longo tempo de trabalho ou está em uma fase líquida por um longo tempo permitindo a impregnação ou permeação nos tecidos; cura que não seja inibida pela presença de tecido; propriedades mecânicas apropriadas após a cura, tais como firmeza apropriada para estimular um estado natural e/ou capacidade de ser repovoado por células; acessibilidade.

[069] Nas modalidades, o enxerto pode compreender cerca de 50% de polímero ou menos. Por exemplo, o enxerto pode compreender cerca de 0,1% de polímero a cerca de 50% de polímero. Por exemplo, o enxerto pode compreender cerca de 0,1% de polímero e cerca de 99,9% de matriz extracelular, ou o enxerto pode compreender cerca de 1% de polímero e cerca de 99% de matriz extracelular ou cerca de 50% de polímero e cerca de 50% de matriz extracelular. Nas modalidades particulares, o enxerto pode compreender cerca de 10% a cerca de 30% de polímero. Nas modalidades, o enxerto compreende cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25% ou cerca de 30% de polímero. Nas modalidades, o polímero é substancialmente uniformemente distribuído no enxerto.

[070] Nas modalidades, o polímero pode ser fornecido em uma solução que compreende cerca de 50% de polímero ou menos. Por exemplo, a solução pode compreender cerca de 0,1% de polímero a cerca de 50% de polímero. Se o tecido descelularizado for submerso em um banho de polímero a 1%, então a quantidade de polímero dentro do "enxerto"recém-formado seria inferior a 1%.

[071] Nas modalidades, o polímero pode ser um polímero natural ou um polímero sintético. Os polímeros naturais ocorrem na natureza e podem ser extraídos, como polissacarídeos ou proteínas. Exemplos não limitativos de polissacarídeos compreendem sulfato de condroitina, heparina, heparano, ácido algínico (isto é, alginato), ácido hialurônico, dermatano, sulfato de dermatano, pectina, carboximetilcelulose, quitosana, melanina (e seus derivados, como eumelanina, feomelanina, e neuromelanina), ágar, agarose, gel, goma e semelhantes, bem como suas formas de sal (como sal de sódio e sal de potássio). Exemplos não limitativos de proteínas compreendem colágeno, gelatina alcalina, gelatina ácida, gelatina de recombinação de genes e assim por diante.

[072] Polímeros sintéticos são moléculas artificiais formadas pela polimerização de uma variedade de monômeros, tais como macromoléculas compreendendo ácido poliacrílico, ácido poliaspártico, ácido politartárico, ácido poliglutâmico, ácido polifumárico e assim por diante, bem como suas formas de sal (como sal de sódio e sal de potássio). Exemplos não limitativos de polímeros sintéticos compreendem cianoacrilato.

[073] Nas modalidades, o polímero pode ser um hidrogel. "Hidrogel" pode se referir a uma ampla classe de materiais poliméricos com uma estrutura de rede reticulada tridimensional contendo uma grande quantidade de água, com o estado entre um líquido e um sólido sem fluidez.

[074] O polímero pode ser um polímero colorido e/ou pode ser colorido, como por meio de um corante. Nas modalidades, o polímero compreende melanina, um corante ou uma combinação dos mesmos. Esses corantes de polímeros são conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, pode ser feita referência às seguintes publicações: Pat. US N° 5.032.670, Pat. US N° 4.999.418, Pat.US N° 5.106.942, Patente US N° 5.030, 708, Patente US N° 5.102.980, Patente US N° 5.043, 376, Patente US N° 5.104.913, Patente US N° No. 5.281.659, Patente US N° 5.194.463, Patente US N° 4.804.719, Publicação Internacional N° WO- 92/07913

[075] Nas modalidades, o polímero pode ser um polímero biodegradável, que pode se referir a um material polimérico que se degrada em condições aeróbias e/ou anaeróbias na presença de bactérias, fungos, algas ou outros micro-organismos. Exemplos não limitativos de polímeros biodegradáveis compreendem quitosana, colágeno, alginato, cianoacrilato, dermabond. Em outras modalidades, o polímero pode ser um polímero não biodegradável, por exemplo, borracha, silício ou UHMWPE.

[076] Em ainda outras modalidades, o polímero pode ser uma mistura de polímero. As concentrações dos vários componentes dentro da mistura de polímero dependerão de uma série de fatores, incluindo as propriedades físicas e mecânicas desejadas da mistura final, os critérios de desempenho dos artigos a serem fabricados a partir de uma mistura particular, o equipamento de processamento usado para fabricar e converter a mistura no artigo de manufatura desejado e os componentes particulares dentro da mistura.

[077] Nas modalidades, o enxerto pode ser semeado com células viáveis de modo a repovoar o enxerto permeado com polímero com as células viáveis. O termo "célula viável"pode referir-se a uma célula que está viva e capaz de crescimento, proliferação, migração e/ou diferenciação. Os tecidos descelularizados e/ou enxerto podem atuar como suportes estruturais pelos quais as células viáveis podem migrar e repovoar prontamente. Em algumas modalidades, as células do tecido nativo (por exemplo, o indivíduo hospedeiro) também podem migrar para as estruturas estruturais criadas através do processo de descelularização e prontamente repovoar o enxerto permeado com polímero.

[078] Por exemplo, os tecidos descelularizados e/ou o enxerto permeado com polímero podem ser semeados e incubados com células exógenas em condições que conduzam ao repovoamento do tecido descelularizado e/ou enxerto com as células exógenas ou células derivadas das células exógenas. Em algumas modalidades, as células exógenas podem ser autólogas, homólogas (por exemplo, alogênicas) ou heterólogas. Por exemplo, "autólogo"refere-se a material biológico (por exemplo, células exógenas) que será introduzido no mesmo indivíduo de quem o material foi coletado ou derivado. Por exemplo, "homólogo"pode se referir a material biológico (por exemplo, células exógenas) coletado ou derivado de um doador compatível que será introduzido em um indivíduo diferente do qual o material foi coletado ou derivado. Por exemplo, "heterólogo"pode se referir a material biológico (por exemplo, células exógenas) coletado ou derivado de um doador compatível de uma espécie diferente que será introduzido em um indivíduo. Exemplos não limitativos de células exógenas que podem ser semeadas (e, portanto, úteis para repovoar o tecido descelularizado e/ou enxerto permeado por polímero) incluem queratinócitos, melanócitos, células nervosas, células estromais, fibroblastos, células endoteliais, células progenitoras, células-tronco, células específicas de órgão, células específicas de tecido ou uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, os queratinócitos migram prontamente e repovoam a derme descelularizada e/ou a epiderme descelularizada. Em algumas modalidades, os melanócitos migram prontamente e repovoam o tecido descelularizado e/ou enxerto permeado com polímero. Em algumas modalidades, as células nervosas migram prontamente e repovoam o tecido descelularizado e/ou enxerto permeado com polímero. Em outras modalidades, as células nervosas podem ser neuroesferas ou células neuronais. Por exemplo, "exógeno"refere-se a células que foram introduzidas (por exemplo, semeadas) para recelularizar ou repovoar um tecido descelularizado de modo que as células que não se originaram no tecido descelularizado. Sem limitar- se pela teoria, se um mamilo de um indivíduo é descelularizado e repovoado com queratinócitos, melanócitos e/ou células nervosas originadas de um punção de pele retirado do mesmo indivíduo, os queratinócitos, melanócitos e/ou células nervosas ainda são exógenos para o mamilo descelularizado porque não se originaram do mamilo.

[079] As condições propícias para repovoar o enxerto dependem das células utilizadas e podem incluir temperatura, a presença ou ausência de fatores de crescimento, a presença ou ausência de fatores de diferenciação ou fatores de migração, o polímero usado para permear o tecido, ou conteúdo do ar. Em modalidades, o enxerto permeado com polímero é introduzido ou implantado em um indivíduo e as próprias células do indivíduo migram para o enxerto. Em outras modalidades, as células viáveis são introduzidas no tecido ou enxerto antes de implantar o enxerto no indivíduo.

[080] Um versado na técnica pode semear células exógenas no tecido descelularizado e/ou enxerto, colocando as estruturas em meio de cultura contendo células dissociadas ou dissociadas e expandidas e permitindo que as células migrem para o tecido descelularizado ou enxerto e repovoar as estruturas. Em algumas modalidades, as células podem ser injetadas em um ou mais lugares no tecido descelularizado ou enxerto, como no interior, a fim de acelerar o repovoamento das estruturas.

[081] As células viáveis podem ser cultivadas antes da ressemeadura do tecido ou enxerto. O meio de cultura usado para crescer e expandir as células de interesse pode ser isento de soro e não requer o uso de células alimentadoras. Os meios adequados específicos para queratinócitos são conhecidos na técnica e incluem (mas não estão limitados a): Meio de crescimento de queratinócitos 2 (PromoCell GmbH, Heidelberg, Alemanha); Meio basal de queratinócitos Stemline™ (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, Mo.); definido, suplemento de meio livre de BPE (K 3136) (Sigma-Aldrich Corp.) e ATCC's Dermal Cell Basal Medium (PCS-200-030) suplementado com Keratinocyte Growth Kit (PCS-200-040). Os meios adequados específicos para melanócitos são conhecidos na técnica e incluem (mas não estão limitados a) meio de crescimento compreendendo insulina, ácido ascórbico, glutamina, epinefrina e cloreto de cálcio. Ver, por exemplo, ATCC Melanocyte Growth Kit (ATCC-PCS-200-041). Os meios adequados específicos para células nervosas são conhecidos na técnica e incluem (mas não estão limitados a) meio de crescimento compreendendo DMEM, FBS a 10%, suplementado com NGF e L- glutamina. O polímero pode ser misturado com pelo menos um antibiótico. "Antibiótico"pode se referir a uma substância que controla o crescimento de bactérias, fungos ou micro-organismos semelhantes, em que a substância pode ser uma substância natural produzida por bactérias ou fungos, ou uma substância sintetizada química/bioquimicamente (que pode ser um análogo de uma substância natural), ou uma forma quimicamente modificada de uma substância natural. Um versado na técnica reconhecerá que o polímero pode ser misturado com uma grande variedade de antibióticos, como penicilinas, cefalosporinas, macrolídeos, fluoroquinolonas, sulfonamidas, tetraciclinas, aminoglicosídeos e semelhantes.

[082] As modalidades podem compreender ABGs impregnados com polímeros biodegradáveis, tais como aqueles descritos neste documento, que podem fornecer propriedades mecânicas aprimoradas. A impregnação de polímero de um ABG pode, por si só, aumentar as propriedades mecânicas do enxerto, permitindo que seja mais durável do que um enxerto não impregnado e, assim, evitar a falha do enxerto devido a forças mecânicas.

[083] Nas outras modalidades, o ABG e/ou o ABG impregnado com polímero podem compreender ainda produtos terapêuticos e/ou drogas, tais como para a liberação prolongada ou controlada de tais terapêuticos e/ou drogas. Tais agentes podem ser usados para prevenir e/ou tratar a progressão e/ou sintomas da doença (tais como aquelas doenças e sintomas descritos neste documento) e também podem ser usados para prevenir, tratar e ou aliviar os efeitos colaterais indesejados da implantação do enxerto. Exemplos não limitativos de efeitos colaterais indesejados de implantação ou enxerto de ABG, por exemplo, incluem dor, infecção, inflamação ou cicatriz. Esses efeitos colaterais indesejados podem ser evitados, tratados ou aliviados por meio de liberação prolongada, controlada e local de drogas e/ou agentes terapêuticos do polímero ou ABG. Por exemplo, a adição de pelo menos um antibiótico, pelo menos um anti-inflamatório e/ou pelo menos um analgésico e/ou anestésico pode prevenir a infecção, reduzir a inflamação local e diminuir a dor no local cirúrgico e/ou de implantação, assim, por exemplo, proporcionando alívio sintomático.

[084] ABG e/ou polímeros podem ser misturados com agentes terapêuticos e/ou profiláticos permitindo a liberação prolongada do agente terapêutico e/ou profilático. Exemplos não limitantes de tais agentes compreendem antibióticos, analgésicos, anti-inflamatórios ou qualquer combinação dos mesmos.

[085] "Antibiótico"pode se referir a um agente que controla o crescimento de bactérias, fungos ou micro-organismos semelhantes, em que a substância pode ser uma substância natural produzida por bactérias ou fungos, ou uma substância sintetizada química/bioquimicamente (que pode ser um análogo de um substância natural), ou uma forma quimicamente modificada de uma substância natural. Um versado na técnica reconhecerá que a estrutura de andaime pode ser revestido com uma grande variedade de antibióticos, como penicilinas, cefalosporinas, macrolídeos, fluoroquinolonas, sulfonamidas, tetraciclinas, aminoglicosídeos e semelhantes.

[086] "Analgésico"pode se referir a um agente que pode fornecer alívio da dor. Um analgésico é qualquer membro de um grupo de drogas usados para obter analgesia, ou seja, o alívio da dor. Por exemplo, o analgésico pode ser um derivado de pirazolona, como (ampirona, dipirona, antipirina, aminopirina e propifenazona), aspirina, paracetamol, um anti-inflamatório não esteroidal (como ibuprofeno, diclofenaco sódico ou naproxeno sódico), um opióide (como fosfato de codeína, cloridrato de tramadol, sulfato de morfina, oxicodona) ou qualquer combinação dos mesmos. Um anestésico se refere a qualquer membro de um grupo de drogas usadas para induzir a anestesia - em outras palavras, para resultar em uma perda temporária da sensação ou percepção da dor. Exemplos não limitativos de anestésicos compreendem benzocaína, cloroprocaína, cocaína, ciclometicina, dimetocaína, larocaína, piperocaína, propoxicaína, procaína, novocaína, proparacaína, tetracaína, ametocaína, articaína, bupivacaína, cinquocaína, dibucaína, etidocaína, lidocaína, lidocaína, prilocaína, ropivacaína, trimecaína.

[087] Um "anti-inflamatório"refere-se a uma substância que trata ou reduz a gravidade da inflamação e/ou inchaço. Exemplos não limitativos de anti-inflamatórios compreendem anti-inflamatórios esteroides (como corticosteróides) e anti-inflamatórios não esteroides (como aspirina, celecoxib, diclofenac, diflunisal, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, cetorolaco, nabumetona, naproxinato, piroxicam, salsalato, sulindac, tolmetina).

[088] Enxertos de liberação prolongada têm um objetivo comum de melhorar o tratamento e/ou alívio sintomático em relação ao alcançado por suas contrapartes não controladas. O uso de uma preparação de liberação prolongada idealmente projetada em tratamento médico pode ser caracterizado por um mínimo de substância medicamentosa sendo empregada para curar, controlar e/ou fornecer alívio da condição em um período mínimo de tempo. Por exemplo, os enxertos de liberação prolongada podem liberar uma quantidade de uma droga ao longo de 1 dia, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou mais. As vantagens das formulações de liberação prolongada incluem atividade prolongada da droga, frequência de dosagem reduzida e maior adesão do paciente. Além disso, as formulações de libertação prolongada podem ser utilizadas para afetar o tempo de início da ação ou outras características, tais como os níveis sanguíneos da droga, e podem, assim, influenciar a ocorrência de lado (por exemplo, efeitos adversos).

[089] A maioria das formulações de libertação prolongada são concebidas para libertar inicialmente uma quantidade da droga (ingrediente ativo) que prontamente produz o efeito terapêutico desejado, e gradual e continuamente libertar outras quantidades da droga para manter este nível de efeito terapêutico ou profiláctico durante um período prolongado de tempo. De modo a manter este nível constante de droga no corpo, a droga deve ser liberada a uma taxa que irá substituir a quantidade de droga a ser metabolizada e excretada do corpo. A libertação prolongada de um ingrediente ativo pode ser estimulada por várias condições, incluindo, mas não se limitando ao pH, temperatura, enzimas, água, ou outras condições fisiológicas ou compostos.

[090] O polímero pode ser capaz da reticulação polimérica. Uma reticulação polimérica, ou ligação cruzada, refere-se a uma ligação, como bods covalentes ou ligações iônicas, que liga uma cadeia de polímero a outra. A reticulação polimérica pode promover uma diferença nas propriedades físicas dos polímeros. Por exemplo, um polímero líquido ou resina pode ser transformado em um semissólido (ou seja, gel) ou sólido pela reticulação polimérica das cadeias juntas. A modificação resultante das propriedades mecânicas depende fortemente da densidade da reticulação polimérica. Baixas densidades de reticulação polimérica diminuem as viscosidades de polímero fundidos. As densidades de reticulação polimérica intermediária transformam polímeros gomosos em materiais que têm propriedades elastoméricas altas e potencialmente altas resistências. Densidades de reticulação polimérica muito altas podem fazer com que os materiais se tornem muito rígidos ou vítreos, como os materiais de fenol-formaldeído. O versado na técnica reconhecerá que a extensão da reticulação polimérica e as especificidades da reticulação polimérica irão variar com base nos polímeros utilizados, nos métodos de reticulação polimérica utilizados e no resultado desejado.

[091] Os enxertos anidros plastinizados descritos neste documento podem ser armazenados mais facilmente e por períodos mais longos de tempo do que os enxertos não plastinizados. As condições de armazenamento podem ser dependentes das propriedades do próprio enxerto, como o polímero e/ou o tecido utilizado. Como exemplos, os enxertos plastinizados podem ser armazenados hidratados, desidratados ou parcialmente hidratados. Por exemplo, um enxerto hidratado pode ser armazenado em glicerol, solução salina, água ou solução de preservação de órgãos (como perfadex). Os enxertos podem ser armazenados a qualquer temperatura entre cerca de -80°C e cerca de 4°C. Os enxertos podem ser liofilizados.

Métodos de descelularização

[092] Os aspectos da invenção são direcionados a enxertos permeados de polímero que compreendem um tecido livre ou substancialmente livre de células (isto é, descelularizado). “Decelularização” de um tecido ou estrutura biológica pode referir-se à remoção da maioria ou de todas as células do tecido ou estrutura. Ver, por exemplo, o pedido de patente US 15/523.306, que é incorporado por referência neste documento em sua totalidade.

[093] Um tecido ou estrutura biológica "descelularizada" (como a derme ou epiderme neste documento), por exemplo, pode referir-se à remoção da maioria ou todas as células do tecido ou estrutura enquanto a matriz extracelular (ECM) é substancialmente preservada em além de moléculas de adesão celular. A matriz extracelular é uma rede complexa de macromoléculas que preenchem o espaço extracelular em um tecido (como a derme e/ou epiderme que pode compreender um mamilo e/ou aréola). A matriz extracelular tem três componentes principais: (1) proteoglicanos viscosos (por exemplo, glicosaminoglicanos (GAGs) covalentemente ligados a proteínas), como hialuronano, sulfato de heparano, sulfato de queratano, sulfato de condroitina e sulfato de dermatano; (2) fibras de colágeno insolúveis (proteínas que fornecem força) e elastina (proteínas que fornecem resiliência); e (3) proteínas ECM fibrosas solúveis (incluindo fibronectina e laminina) que ligam proteoglicanos e fibras de colágeno a receptores na superfície celular. Uma "proteína fibrosa da matriz extracelular" e uma "molécula da matriz" podem se referir a uma proteína fibrosa da matriz extracelular, como fibronectina, laminina, elastina ou colágeno. Em algumas modalidades o colágeno pode compreender um colágeno Tipo I, um colágeno Tipo III, um colágeno Tipo IV, um colágeno Tipo VI ou uma combinação dos mesmos.

[094] Por exemplo, um tecido pode ser removido de um paciente (por exemplo, próprio ou não-próprio), de um cadáver ou de um primata não humano. Esses tecidos/estruturas removidos podem ser referidos como um "tecido doador" e podem ser descelularizados enquanto retêm suas estruturas brutas naturais, microarquitetura e moléculas de matriz, incluindo colágeno, fibronectina, elastina e glicosaminoglicanos.

[095] Aspectos da invenção são ainda direcionados à preparação e/ou utilização de enxertos permeados com polímero que compreendem um tecido que foi substancialmente descelularizado. "Descelularizar substancialmente todas" as células de um tecido ou estrutura descrita significa que pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais das células presentes no tecido ou estrutura foram removidos. A redução percentual no número de células pode ser determinada, por exemplo, contando por inspeção visual o número de células visíveis nas amostras pré e pós-descelularização, juntamente com a coloração DAPI para visualizar os núcleos.

[096] Outros relataram a descelularização de órgãos, como exemplificado pela Patente US N° 8.470.520, cuja totalidade é incorporada por referência neste documento. Os órgãos cuja descelularização é relatada nesta patente incluem o pulmão, mas não a pele. Os protocolos para descelularizar o pulmão e os órgãos compreendeu as seguintes etapas. Primeiro se entrará em contato com o pulmão com uma solução diluída de um detergente ou tensoativo capaz de permear as membranas celulares eucarióticas e solubilizar as proteínas da membrana e será incubada a 4°C. O detergente ou tensoativo foi trocado a cada dia. Após 4 dias, as amostras foram lavadas com água por várias horas e, em seguida, contatadas e incubadas com uma solução a 2% de um sal biliar, desoxicolato de sódio ("SDC"), por 4 dias a 4°C, com a solução de sal biliar mudou a cada dia. As amostras foram então submetidas a uma segunda lavagem com água, incubadas com DNase I por 2 horas, novamente a 4°C, lavadas novamente com água e em seguida armazenadas. As soluções foram introduzidas no pulmão por perfusão.

[097] Descobriu-se que um protocolo que foi usado anteriormente com sucesso para descelularizar órgãos como o pulmão não funcionou para a epiderme do mamilo descelularizada em estudos usando mamilos de macaco Rhesus. Especificamente, o protocolo que descelularizou o pulmão com sucesso conseguiu descelularizar aproximadamente 95% das células da derme, mas apenas 5% das células epidérmicas.

[098] AlloDerm® e Glyaderm®, duas matrizes dérmicas acelulares disponíveis comercialmente, são usadas como extensores de tecido ou substituto dérmico para feridas e queimaduras. Nenhum deles contém epiderme acelular. Acredita-se que esses materiais são feitos separando-se a epiderme da derme antes da descelularização da derme. Sem querer se limitar à teoria, acredita-se que isso se deva em parte ao fato de a epiderme ser mais densa que a derme e muito mais difícil de descelularizar.

[099] Para resolver este problema, foram realizados estudos para encontrar protocolos que teriam sucesso na descelularização da epiderme mamilar. Após a consideração da experimentação, conseguiu-se desenvolver modificações que descelularizaram com sucesso a epiderme do mamilo, junto com a derme que a acompanha. Dados esses resultados com a descelularização da epiderme mamilar e da derme, se espera que os protocolos funcionem igualmente bem na descelularização da epiderme e derme da pele. Em algumas modalidades, a epiderme do tecido do doador é descelularizada junto com a derme.

[100] Para descelularizar mamilos, incluindo a epiderme, foi modificado o protocolo de várias maneiras. Primeiro, as temperaturas das incubações e lavagens aumentaram - em vez de conduzi-las a 4°C, elas foram conduzidas à temperatura ambiente. Em segundo lugar, em vez de mudar as soluções a cada dia durante as incubações de vários dias, as amostras foram deixadas na mesma solução durante a incubação. Sem desejar ser limitado pela teoria, pensava-se que isso aumentaria a digestão das células, não removendo quaisquer proteases endógenas presentes nas células. Terceiro, os tempos de incubação foram duplicados. Quarto, a concentração do sal biliar foi duplicada, com a concentração do sal biliar elevada a partir de 2% a 4%. Quarto, para o pulmão, o órgão foi perfundido. Como os mamilos não possuem vasos que possibilitem a pronta perfusão, as amostras foram inicialmente agitadas em um agitador orbital regulado para uma velocidade de rotação de 85-125 rpm, que julgou-se sujeitar o mamilo a soluções de forma a simular a perfusão. Verificamos, no entanto, que o mamilo não descelularizou na agitação de baixa velocidade, mas sim quando a velocidade do agitador foi aumentada para 325 rpm. Embora nenhuma dessas mudanças por si mesmas ou quaisquer duas ou três juntas tenham sido suficientes para descelularizar as amostras de mamilo, a combinação de todos os quatro teve sucesso.

[101] Como o protocolo de descelularização original funcionou no pulmão, que tem vias aéreas permitindo essencialmente que todo o tecido do órgão fosse contatado com os detergentes e outros reagentes, mas não funcionou quando usado no mamilo, o mamilo parece ser particularmente resistente à descelularização da epiderme. Acredita-se que o protocolo desenvolvido para descelularizar o mamilo pode, portanto, ser usado para descelularizar outras partes do corpo para as quais uma matriz acelular pode ser útil.

[102] Com base nos estudos realizados no mamilo, uma amostra a descelularizada é contatada com um primeiro detergente ou solução tensoativo por 48 horas a cerca de 144 horas, mais preferencialmente cerca de 72 a cerca de 120 horas, ainda mais preferencialmente cerca de 80 a cerca de 110 horas, ainda mais preferencialmente por cerca de 96 horas, em que "cerca de" significa ±2 horas, detergente ou tensoativo que pode permear membranas celulares eucarióticas e solubilizar proteínas de membrana. Detergentes adequados incluem 4-(1,1,3,3- tetrametilbutil)fenil-polietilenoglicol (Triton™ X-100), octilfenoxipolietóxi- etanol (IGEPAL® CA-630), CHAPS (3-[(3- colamidopropil)dimetilamônio]-1-propanossulfonato), dodecilsulfato de sódio e polietilenoglicol, sendo os três primeiros os mais preferidos. A amostra é então lavada com água, de preferência por várias horas, e depois posta em contato com um sal biliar solúvel apropriado como um segundo detergente por um período de tempo semelhante aos descritos acima para uso com o primeiro detergente, acima. Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, Mo.), por exemplo, vende pelo menos os seguintes sais de sódio de ácidos biliares: colato de sódio, desoxicolato de sódio, glicocolato de sódio, taurocolato de sódio e taurodeoxicolato de sódio. Embora todos esses sais tenham sódio como cátion, outros cátions podem ser usados para formar um sal de um ácido biliar para uso nos métodos da invenção, desde que o sal biliar resultante seja solúvel e descelularize a epiderme. Qualquer sal biliar particular pode ser facilmente testado para ver se é adequado para seu uso na descelularização da epiderme, usando-o no lugar de SDC no protocolo de descelularização estabelecido nos Exemplos e submetendo a amostra resultante a exame histológico ou imunológico, ou ambos, para determinar se substancialmente todas as células epidérmicas do mamilo foi removido. Se tiver, o sal biliar é adequado para uso no protocolo.

[103] A amostra é então lavada novamente com água por algumas horas, de preferência cerca de duas, e então lavada com uma solução salina por algumas horas, de preferência cerca de duas, onde "cerca de" significa mais ou menos 15 minutos. As amostras são então incubadas durante a noite com 5x estreptomicina-penicilina-anfotericina B (vendida por uma série de fornecedores a 100x, incluindo Sigma Aldrich, Lonza Walkerville, Inc. (Walkerville, Md.), American Type Culture Collection ("ATCC", Manassas, Va.) e EMD Millipore (Billerica, Mass.)), lavados com água, tratados com desoxirribonuclease I ("DNase I") por várias horas, de preferência cerca de duas horas, e então armazenados em uma solução salina tamponada com fosfato contendo 5x estreptomicina-penicilina-anfotericina B a 4°C até o uso. Usando um agitador orbital como um exemplo, as rotações por minuto, ou rpm, são ajustadas entre cerca de 250 e cerca de 400, mais preferencialmente cerca de 275 a cerca de 375, ainda mais preferencialmente cerca de 300 a cerca de 350 e mais preferencialmente cerca de 325, com "cerca de" neste caso, significando 5 rpm em cada lado do número indicado. Os agitadores orbitais são preferidos por seu movimento contínuo suave e mistura uniforme. Uma série de outros agitadores são conhecidos na técnica, incluindo agitadores oscilantes, giratórios, recíprocos, aéreos, plataforma vibratória e agitadores rotativos. Além disso, outros dispositivos, como rotadores, que permitem a mistura uniforme do conteúdo dos recipientes ao longo do tempo são conhecidos. Em geral, qualquer agitador, rotador ou dispositivo semelhante que forneça agitação mecânica de uma amostra pode ser usado, desde que forneça mistura uniforme sem ser tão violento que a ação de mistura perturbe a integridade física da amostra, como um mamilo ou NAC, sendo descelularizado. Dependendo do tipo de agitador ou rotador, a velocidade de agitação dos recipientes que contêm a amostra pode ser indicada em unidades diferentes de rpms. Prevê-se que o versado na técnica será prontamente capaz de determinar a configuração de velocidade apropriada para o agitador ou rotador particular usado por referência à configuração de rpm para um agitador orbital, conforme estabelecido acima.

[104] O uso de tecidos descelularizados fornece uma estrutura melhor para a ressemeadura e formação de um enxerto para uso in vivo . Como os versados na técnica irão entender, um tecido pode ser descelularizado e então repovoado ou recelularizado. Não se espera que um tecido ou estrutura recelularizada tenha a combinação de tipos de células que podem estar presentes na estrutura antes de sofrer descelularização. Por exemplo, o tecido descelularizado ou enxerto pode ser repovoado usando células exógenas. “Exógeno” em relação às células introduzidas para recelularizar um tecido descelularizado significa células que não se originaram no tecido descelularizado. A título de exemplo, se um mamilo de um paciente é descelularizado e repovoado com queratinócitos originários de um punção de pele retirado do mesmo paciente, como utilizado neste documento, os queratinócitos ainda são exógenos ao mamilo descelularizado porque não se originaram do mamilo.

Métodos de plastinação

[105] Os aspectos da invenção são direcionados a métodos de plastinização de tecidos de modo a fornecer um enxerto plastinizado (isto é, permeado por polímero) para uso in vivo . As etapas do processo de plastinação podem incluir fixação, desidratação, impregnação forçada no vácuo e endurecimento. Ver, por exemplo, Prasad, Ganesh, et al. "Preservation of tissue by plastination: A Review."Int. J. Adv. Health Sci 1.11 (2015): 27-31; e Patente US 4.278.701, cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade neste documento. Fixação

[106] A Fixação de um tecido descelularizado pode se referir a um processo utilizado para matar todos os micro-organismos de modo a evitar a decomposição dos tecidos. Em modalidades, a fixação de tecido pode não ser necessária. O processo de fixação geralmente compreende submergir, imergir ou perfundir o tecido com um fixador por um período de tempo suficiente para fixar o tecido. O versado na técnica reconhecerá que o período de tempo suficiente para fixar o tecido pode depender da taxa de penetração do fixador, do tipo de tecido a ser fixado, do tamanho do tecido a ser fixado, da concentração do fixador e aditivos a ser usado, o tipo de fixador usado, temperatura, tonicidade e semelhantes. Exemplos não limitativos de fixadores que podem ser usados nos métodos descritos neste documento compreendem aldeídos (como formaldeído ou glutaraldeído), genipina ou combinações de dois ou mais fixadores. Geralmente, o processo de fixação pode levar cerca de 3 a 4 horas, mas pode ser mais curto ou mais longo, conforme necessário. Desidratação

[107] "Desidratação"refere-se a um processo pelo qual toda ou substancialmente toda a água é removida do tecido descelularizado para fornecer um tecido que está livre ou substancialmente livre de água. "Substancialmente livre de água"pode descrever um tecido que teve pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de água presente no tecido ou estrutura removida.

[108] Nas modalidades neste documento, toda ou substancialmente toda a água dentro do tecido descelularizado é removida e/ou substituída por um solvente orgânico por submersão, imersão ou perfusão do tecido com o solvente por um período de tempo e a uma temperatura suficiente para remover e/ou substituir toda ou substancialmente toda a água dentro do tecido.

[109] Nas modalidades, todos ou substancialmente todos os lipídios e/ou gordura dentro do tecido podem ser removidos e/ou substituídos por um solvente orgânico por submersão, imersão ou perfusão do tecido com o solvente por um período de tempo e em uma temperatura suficiente para remover e/ou substituir toda ou substancialmente toda a gordura e lipídio no tecido.

[110] Exemplos não limitativos de solventes orgânicos compreendem acetona, xileno, diclorometano (isto é, DCM ou cloreto de metileno) e/ou álcoois, como etanol ou metanol. O solvente orgânico retirará toda ou substancialmente toda a água do tecido e a substituirá dentro do tecido.

[111] O versado na técnica reconhecerá que o período de tempo e temperatura suficientes para substituir e/ou remover a água do tecido pode depender da taxa de penetração do solvente, do tipo de tecido, do tamanho do tecido, da concentração do solvente e quaisquer aditivos a serem usados, o tipo de solvente usado, tonicidade e semelhantes. Por exemplo, o tecido descelularizado pode ser incubado em acetona a cerca de -15°C a 25°C por um período de tempo tão curto quanto cerca de 5 minutos a tão longo quanto cerca de 10 dias.

[112] Nas modalidades, a água em um tecido pode ser removida e/ou substituída por imersão sequencial do tecido em mudanças repetidas de solventes orgânicos até que toda ou substancialmente toda a água dentro do tecido seja removida ou substituída. O mesmo solvente orgânico pode ser usado em cada banho, ou diferentes solventes podem ser usados nos banhos, como começando com o solvente mais barato, como etanol aquoso, e progredindo gradualmente para etanol anidro e/ou acetona que pode então ser seguido por outros solventes orgânicos para se adequar às condições de processamento, isto é, solventes que são compatíveis com o precursor do polímero e com o polímero sólido a ser obtido a partir dele por polimerização, ou que são pelo menos compatíveis com o precursor e volatilizam antes ou durante a cura. Permeação Forçada

[113] A substituição do solvente por polímero é uma etapa central na plastinação e geralmente compreende submergir ou imergir o tecido descelularizado em um banho de polímero líquido por um período de tempo sob condições de vácuo. Conforme o solvente deixa o tecido, tal como vaporizando, o polímero líquido é atraído para o tecido de modo que o polímero possa permear e/ou impregnar o tecido. O polímero pode ser distribuído de maneira substancialmente uniforme no tecido.

[114] Nas modalidades, o polímero pode compreender aqueles descritos neste documento, exemplos não limitativos dos quais compreendem resinas acrílicas, resinas epóxi, resinas de poliéster, poliuretanos e resinas de silicone variando amplamente em suas propriedades químicas e suas características de processamento, particularmente nas condições sob o qual eles são formados por polimerização de monômeros ou intermediários.

[115] O tecido contendo solvente pode ser permeado e/ou impregnado com um polímero de seu precursor por submersão, imersão ou perfusão do tecido com uma composição fluida compreendendo o polímero ou precursor do mesmo, e quaisquer outros aditivos, tais como catalisadores ou endurecedores, agentes químicos de reticulação polimérica (tais como glutaraldeído, carbodi-imida (1-etil-3-(3-dimetil aminopropil)-carbodiimida), compostos de epóxi, seis diisocianato de metileno, glicerina, alginato, genipin, ácido nordiidroguaiarético, proantocianidina, ácido tânico e galato de epigalocatequina), aceleradores, plastificantes e ingredientes convencionais semelhantes. A impregnação do tecido imerso pode ser auxiliada por evaporação ou de outra forma liberando o solvente orgânico do tecido, tal como por vácuo, uma vez que o solvente pode ser mais volátil do que qualquer componente da solução de polímero. Por exemplo, expor o tecido imerso no polímero a um vácuo pode causar impregnação ou permeação em um tempo muito curto se o solvente for volátil no vácuo e a composição precursora não for excessivamente viscosa. As composições até cerca de 5000 cps têm sido usadas sem dificuldade, e composições ainda mais viscosas podem ser empregadas para impregnação por pedido alternado de pressão negativa e positiva. Uma viscosidade muito mais baixa é necessária para uma impregnação bem- sucedida por perfusão.

[116] Por exemplo, o tecido, imerso e/ou submerso em um solvente volátil pode ser removido do solvente e colocado na solução de polímero. O solvente pode ter uma alta pressão de vapor e um baixo ponto de ebulição (por exemplo, acetona: + 56°C, cloreto de metileno: + 40°C), enquanto a solução de polímero tem uma baixa pressão de vapor e um alto ponto de ebulição. Assim, no pedido de vácuo, o solvente é continuamente extraído da amostra como bolhas gasosas. Conforme o solvente sai do tecido, um vazio é produzido no tecido e a resina sintética é aspirada para a amostra.

[117] O versado na técnica reconhecerá que a taxa de extração de solvente do tecido pode variar e pode depender das propriedades do tecido a ser impregnado e/ou do solvente a ser extraído. A taxa de extração do solvente pode ser visualizada quando as bolhas sobem suavemente à superfície e estouram. Quando não aparecer mais bolhas, o processo estará concluído.

[118] Para monitorar as mudanças no vácuo, inicialmente um medidor de vácuo ou uma coluna de Hg é usado e, posteriormente, um manômetro é usado. A impregnação ou permeação é considerada completa quando a pressão absoluta se estabilizou em cerca de 2-10 mm Hg por alguns dias. Além disso, na visualização das bolhas, as pequenas bolhas medindo cerca de 1-1,5 cm são agora grandes 4-5 cm, que é o vapor de água. Nas modalidades, o tecido pode ser deixado no banho de impregnação à pressão atmosférica por um período de tempo, como 24 horas, para permitir o equilíbrio da pressão do polímero na amostra e no banho de impregnação. Após esta etapa, o tecido pode ser removido. Reticulação polimérica

[119] Após a imersão em uma solução de polímero, o tecido pode ser removido do polímero e o excesso de polímero pode ser drenado ou removido por limpeza e semelhantes antes que as condições de polimerização (ou seja, condições de reticulação polimérica ou condições de cura) sejam estabelecidas. As reticulações poliméricas podem ser formadas por reações químicas que são iniciadas por gás, luz, calor, pressão, mudança no pH, radiação, agentes de reticulação polimérica e semelhantes. As reticulações poliméricas são úteis para prevenir a degeneração da integridade estrutural da estrutura de andaime que permanece após a descelularização, aumentando a resistência mecânica e reduzindo a calcificação da matriz. Por exemplo, a mistura de um monômero não polimerizado ou parcialmente polimerizado com agentes de reticulação polimérica pode resultar em uma reação química que forma reticulações poliméricas (isto é, polimeriza). O versado na técnica reconhecerá que a extensão da reticulação polimérica e as especificidades da reticulação polimérica irão variar com base no polímero e precursores utilizados, os métodos de reticulação polimérica utilizados, os agentes de reticulação polimérica utilizados e o resultado desejado.

[120] Um agente de reticulação polimérica de biomaterial ideal demonstra pouca ou nenhuma citotoxicidade e é de baixo custo. Existem muitos agentes de reticulação polimérica para a fixação de estruturas de andaimes derivados de ECM, que podem ser classificados como (i) agentes de reticulação polimérica químicos e (ii) agentes de reticulação polimérica naturais. Os agentes químicos de reticulação polimérica compreendem glutaraldeído (GA), carbodiimida (1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)- carbodiimida (EDC)), compostos epoxi, seis diisocianato de metileno, glicerina e alginato, por exemplo; e os agentes de reticulação polimérica naturais incluem genipina (GP), ácido nordihidroguaiarético (NDGA), ácido tânico e procianidinas (PC), por exemplo. Ver Ma, Bing, et al. "Crosslinking strategies for preparation of extracellular matrix- derived cardiovascular scaffolds."Regenerative biomaterials 1.1 (2014): 81-89, que é incorporado por referência neste documento em sua totalidade.

[121] Exemplos não limitativos de um agente de reticulação polimérica incluem glutaraldeído, carbodiimida (1-etil-3-(3-dimetil aminopropil)-carbodiimida), compostos de epóxi, seis diisocianato de metileno, glicerina, alginato, colágeno, genipina, ácido nordi- hidroguaiarético, proantocianidina, ácido tânico e galato de epigalocatequina.

[122] Nas modalidades, a superfície e as propriedades mecânicas do produto acabado (isto é, o enxerto permeado com polímero) é para duplicar ou imitar aquelas do tecido fresco. Por exemplo, composições precursoras de borracha de silicone de baixa viscosidade são polímeros exemplares para a produção de objetos resilientes que duplicam a configuração da superfície de tecido fresco e a resiliência da borracha de silicone curada simula a suavidade do tecido fresco em algum grau reduzido.

[123] A reticulação polimérica pode depender do polímero utilizado. Por exemplo, a cura a gás pode ser usada para plastinação usando resina de silicone. Nesta técnica, a reticulação polimérica decisiva do agente de cura é aplicado em uma forma gasosa ao tecido. O tecido impregnado de silicone é mantido em uma câmara fechada e exposto a um endurecedor gasoso que, por evaporação da solução estoque, está continuamente circulando na atmosfera da câmara. Uma pequena bomba de membrana auxilia na evaporação e circulação do gás, levando a uma cura mais rápida.

[124] Como outro exemplo, a cura de um tecido impregnado com epóxi ou tecido impregnado com emulsão de polimerização pode usar as aminas de tecido presentes no próprio tecido para a cura. Essas aminas são aceleradores eficazes e, junto com os anidridos, são suficientes para a cura total dos tecidos.

[125] Como ainda outro exemplo, a polimerização pode ser induzida pela exposição a uma fonte de radiação, como a exposição a feixe de elétrons, radiação gama ou luz UV. Por exemplo, o processamento de feixe de elétrons pode ser usado para reticular o tipo C de polietileno reticulado. Outros tipos de polietileno reticulado são feitos pela adição de peróxido durante a extrusão (tipo A) ou pela adição de um agente de reticulação polimérica (por exemplo, vinilsilano) e um catalisador durante a extrusão e, em seguida, executando uma cura pós-extrusão.

[126] As condições de polimerização são escolhidas para se adequar ao polímero específico e/ou composição precursora empregada dentro dos limites estabelecidos pela necessidade de evitar a decomposição do tecido e podem incluir temperaturas elevadas, irradiação com luz ultravioleta, a presença de iniciadores ou catalisadores, e outros fatores conhecidos em si. Se o oxigênio atmosférico inibe indevidamente a cura da resina de poliéster, o objeto impregnado pode ser imerso em glicerol anidro ou mantido em uma atmosfera de nitrogênio durante a cura. Como exemplo, a polimerização da borracha de silicone não é inibida pelo oxigênio na atmosfera, mas pode ser retardada conforme necessário mantendo uma temperatura baixa (abaixo de 32 °F) durante a impregnação. Seu índice de refração (n=1,405) melhora a aparência natural da superfície do tecido impregnado e a resiliência da borracha de silicone curada simula a maciez do tecido fresco em algum grau reduzido.

[127] Nas modalidades, por exemplo, quando as resinas de poliéster ou epóxi são empregadas como o polímero, a temperatura da composição de fluido de polímero pode ser monitorada para evitar a polimerização e um aumento acentuado na viscosidade antes que o precursor de resina em excesso seja removido.

Métodos de tratamento

[128] Os aspectos da invenção são direcionados a métodos de uso de um enxerto permeado com polímero (por exemplo, um enxerto biológico acelular (ABG) descrito neste documento) para tratar um indivíduo em necessidade do mesmo. Os ABGs de acordo com a invenção podem ser alternativas para implantes de malha sintética para uso, por exemplo, em prolapso de órgão pélvico (POP) e reparo de parede abdominal, reparo de hérnia. Os ABGs de acordo com a invenção também podem servir como alternativas para uso de fundas, por exemplo, na reconstrução de mama. Além disso, os ABGs de acordo com a invenção podem ser alternativas para suportes suplementares e/ou coberturas para tecido (por exemplo, substituição de enxertos sintéticos ou biologicamente derivados) para uso com gengivas, tendões, mama, queimaduras e semelhantes. Por exemplo, o indivíduo pode necessitar de reparo ou substituição de mamilo, reconstrução de mama, reparo ou substituição de hérnia, reparo ou substituição de vasos sanguíneos, reparo ou substituição de músculo, reparo ou substituição de órgãos inteiros, reparo ou substituição de tendão, reparo de lábio leporino ou substituição ou reparo ou substituição do palato. Em algumas modalidades, um ABG pode ser usado para tratar prolapso de órgão pélvico (POP) em um indivíduo, por exemplo, para uso em um indivíduo submetido a uma cirurgia POP.

[129] Nas modalidades, o método pode compreender a obtenção de um enxerto plastinizado, como um enxerto permeado por polímero, como descrito neste documento, e a fixação do enxerto a um sítio preparado no paciente. Em algumas modalidades, o método compreende ainda dar tempo para que as células do paciente se integrem na parte do corpo.

[130] O termo "tratar" pode se referir a parcialmente ou completamente aliviar, melhorar, aprimorar, aliviar, retardar o início, inibir a progressão, reduzir a gravidade e/ou reduzir a incidência de um ou mais sintomas, características ou manifestações clínicas de uma doença, distúrbio e/ou condição específica. O tratamento pode ser administrado a um indivíduo que não exibe sinais de uma doença, distúrbio e/ou condição (por exemplo, antes de uma doença, distúrbio e/ou condição identificável) e/ou a um indivíduo que exibe apenas os primeiros sinais de uma doença, distúrbio e/ou condição com a finalidade de diminuir o risco de desenvolver patologia associada à doença, distúrbio e/ou condição.

[131] O termo "indivíduo"ou "paciente" pode se referir a qualquer organismo ao qual aspectos da invenção podem ser administrados, por exemplo, para fins experimentais, diagnósticos, profiláticos e/ou terapêuticos. Os indivíduos típicos aos quais as composições da presente divulgação podem ser administradas serão mamíferos, particularmente primatas, especialmente humanos. Para pedidos veterinários, uma ampla variedade de indivíduos será adequada, por exemplo, como gado, ovelhas, cabras, vacas, porcos e semelhantes; aves domésticas, como galinhas, patos, gansos, perus e semelhantes; e animais domesticados, particularmente animais de estimação, como cães e gatos. Para pedidos de diagnóstico ou pesquisa, uma grande variedade de mamíferos será de indivíduos adequados, incluindo roedores (por exemplo, camundongos, ratos, hamsters), coelhos, primatas e suínos, como porcos consanguíneos e semelhantes. O termo “indivíduo vivo” refere-se a um indivíduo mencionado acima ou outro organismo que está vivo. O termo “indivíduo vivo” refere-se a todo o indivíduo ou organismo e não apenas uma parte extirpada (por exemplo, um fígado ou outro órgão) do indivíduo vivo.

[132] Conforme usado neste documento, "alterado em comparação com um controle" amostra ou indivíduo é entendido como tendo um nível de um analito ou indicador diagnóstico ou terapêutico (por exemplo, marcador) a ser detectado em um nível que é estatisticamente diferente de uma amostra de uma amostra de controle de estado normal, não tratada ou anormal. O indicador diagnóstico ou terapêutico pode ser a avaliação do crescimento do tecido enxertado ou a observação da falta de rejeição do enxerto. A determinação da significância estatística está ao alcance dos versados na técnica, por exemplo, o número de desvios padrão da média que constituem um resultado positivo ou negativo.

[133] Nas modalidades, o enxerto permeado com polímero pode ser implantado em um sítio preparado ou dentro de um indivíduo em necessidade; desse modo enxertando em um indivíduo o enxerto permeado com polímero.

[134] Nas modalidades, o enxerto foi repovoado com células viáveis, conforme descrito neste documento.

[135] Em outras modalidades, o tecido descelularizado não foi repovoado ou foi apenas parcialmente repovoado por células (como queratinócitos, melanócitos, células nervosas ou uma combinação dos mesmos que foram semeados ou que migraram do tecido nativo) antes de enxertar em um indivíduo em necessidade.

[136] As células do leito preparado (como queratinócitos, células- tronco da pele, melanócitos, células nervosas e fibroblastos) podem migrar para o enxerto permeado com polímero e repovoá-lo. Em algumas modalidades, a migração de células para o enxerto é facilitada por (a) colocar o enxerto no indivíduo no leito preparado e (b) revestir o enxerto e a junção onde o enxerto se junta à pele do indivíduo com uma substância biocompatível. Por exemplo, a substância biocompatível (ou revestimento oclusivo) pode ser um selante de tecido, um adesivo de tecido, cola de tecido ou uma cola cirúrgica. Por exemplo, "biocompatível"refere-se a um material que não é tóxico, não é prejudicial ou inibidor para células, tecidos ou órgãos de mamíferos com os quais entra em contato. Além disso, quando o material está em uso com relação a um enxerto, não induz uma resposta imunológica ou inflamatória suficiente para ser deletéria à saúde do indivíduo ou ao enxerto do enxerto. Outros revestimentos oclusivos biocompatíveis que fornecem uma barreira de selante do ar, como colas de fibrina, podem ser usados. Um selante de fibrina, TISSEEL®, está disponível comercialmente, assim como os selantes BIOGLUE® e DuraSeal®. Um exemplo não limitativo de um selante de tecido inclui 2-octil cianoacrilato de alta viscosidade (por exemplo, vendido comercialmente sob os nomes DERMABOND® (unidade Ethicon da Johnson & Johnson) e Sure+Close®II).

[137] Uma vez que o enxerto permeado com polímero é enxertado no indivíduo, ele pode ser coberto com um revestimento oclusivo biocompatível, conforme descrito neste documento. O versado na técnica pode obter prontamente queratinócitos, melanócitos, células nervosas ou uma combinação dos mesmos, a partir de um ou mais punções de pele (do mesmo indivíduo ou de um doador compatível) de acordo com métodos e ensinamentos conhecidos na técnica. Os queratinócitos, melanócitos, células nervosas ou uma combinação dos mesmos podem ser colocados em um meio de cultura adequado para manutenção e estabilidade, a partir do qual as células podem então penetrar no enxerto. Em algumas modalidades, essas células também podem ser injetadas no enxerto em um ou mais locais. Os enxertos da invenção podem ser mantidos em um meio de cultura de células adequado para manutenção e expansão de queratinócitos (humanos ou não humanos); meio de cultura de células adequado para manutenção e expansão de melanócitos (humanos ou não humanos); meio de cultura de células adequado para manutenção e expansão de células nervosas (humanas ou não humanas). O meio de cultura usado para crescer e expandir as células de interesse pode ser isento de soro e não requer o uso de células alimentadoras.

Kits

[138] As composições e enxertos, conforme descrito neste documento, também podem ser fornecidos em um kit. Em uma modalidade, o kit inclui (a) um recipiente que contém uma composição ou um enxerto conforme descrito neste documento e, opcionalmente, (b) material informativo. Em outra modalidade, o kit compreende frascos que compreendem (a) um fixador, um solvente orgânico, um polímero, um ligante químico ou qualquer combinação dos mesmos e (b) material informativo. O material informativo pode ser descritivo, instrutivo, de marketing ou outro material que se relacione com os métodos descritos neste documento e/ou o uso da composição, o enxerto para benefício terapêutico ou soluções. Em uma modalidade, o kit também inclui um selante biocompatível para o tratamento de um indivíduo em necessidade.

[139] O material informativo dos kits não se limita em sua forma. Em uma modalidade, o material informativo pode incluir informações sobre a produção da composição ou do enxerto, componentes da composição ou do enxerto, data de expiração, lote ou informações do sítio de produção e assim por diante. Em uma modalidade, o material informativo se refere a métodos de administração ou fixação da composição ou do enxerto, por exemplo, em uma forma adequada ou modo de administração, para tratar um indivíduo. As informações podem ser fornecidas em uma variedade de formatos, incluindo texto impresso, material legível por computador, gravação de vídeo ou gravação de áudio ou informações que fornecem um link ou endereço para material substantivo. Além de uma composição ou enxerto como descrito neste documento, a composição no kit pode incluir outros ingredientes, como um tampão, um estabilizador ou um conservante. A composição ou enxerto pode ser fornecido em uma forma estéril e pré- embalado.

[140] O kit pode incluir um ou mais recipientes para a composição ou enxertos descritos neste documento. Em algumas modalidades, o kit contém recipientes separados, divisórias ou compartimentos para a composição ou enxerto e material informativo. Por exemplo, a composição pode estar contida em uma placa de cultura e o material informativo pode estar contido em uma luva ou pacote de plástico. Em outras modalidades, os elementos separados do kit estão contidos dentro de um recipiente único, não dividido. Por exemplo, a composição ou enxerto está contido em um recipiente ou placa de cultura que contém o material informativo na forma de um marcador. Os recipientes dos kits podem ser herméticos, impermeável à água (por exemplo, impermeável a mudanças na umidade ou evaporação) e/ou à prova de luz.

EXEMPLOS

[141] Os exemplos abaixo são fornecidos para facilitar uma compreensão mais completa da invenção. Os exemplos seguintes ilustram os modos exemplificativos de fazer e praticar a invenção. No entanto, o escopo da invenção não se limita às modalidades específicas descritas nestes Exemplos, que são apenas para fins de ilustração unicamente, uma vez que os métodos alternativos podem ser utilizados para obter resultados semelhantes.

EXEMPLO 1 Protocolo de plastinação e métodos para manipulação de tecidos

[142] Etapa 1: Obter um tecido descelularizado. Por exemplo, o tecido pode ser descelularizado usando o protocolo conforme descrito no pedido de patente US 15/523.306, a totalidade do qual é incorporado por referência neste documento. Geralmente, a pele, a gordura e os tecidos fibrosos são removidos antes do processo de descelularização.

[143] Etapa 2: Opcionalmente, fixe o tecido. Por exemplo, o tecido pode ser fixado em um aldeído, como formaldeído ou glutaraldeído.

[144] Etapa 3: Mergulhe o tecido em um solvente para garantir que a água dentro dos tecidos seja reposta. O tecido pode ser submerso no solvente em uma série de banhos para garantir que a água contida nos tecidos seja reposta. O conteúdo de água nos banhos pode ser medido antes que o tecido seja submerso e em pontos de tempo enquanto o tecido está submerso para determinar quando esta etapa está concluída. Quando toda ou substancialmente toda a água é removida do banho, o processo está completo.

[145] Os solventes podem compreender compostos orgânicos, como acetona ou álcoois (como o etanol), ou solventes que se tornam gasosos sob vácuo. Por exemplo, o tecido pode ser submerso em um banho de acetona frio (por exemplo, aproximadamente -15°C-25°C) por um período de tempo. O versado na técnica reconhecerá que o tempo e a temperatura dos banhos de solvente irão variar dependendo do polímero a ser usado, se as células serão ou não usadas para repovoar o tecido.

[146] Opcionalmente, os banhos de solvente podem ser usados para dissolver a gordura corporal solúvel dentro do tecido. Por exemplo, a acetona pode ser aquecida à temperatura ambiente para dissolver a gordura corporal solúvel.

[147] Etapa 4: Impregnação forçada a vácuo.A amostra é submersa em um banho de polímero ou resina e sujeita a vácuo. O processo de impregnação forçada a vácuo é concluído quando nenhuma bolha é observada.

[148] O versado na técnica reconhecerá que uma variedade de polímeros e/ou resinas podem ser usados. Por exemplo, silicone de grau médico pode ser usado.

[149] Diferentes tipos de polímeros podem ser utilizados, o que encoraja diferentes tipos de crescimento celular. Por exemplo, alginato pode ser usado como o polímero para estimular o crescimento de neurite.

[150] Nas modalidades, os polímeros podem ser misturados com outros componentes, como células ou antibióticos. Por exemplo, o polímero misturado com células pode ser usado para semear novas células para aplicação de manipulação de tecidos em biomateriais. No momento, esse é um desafio não resolvido para a manipulação de tecidos. Como outro exemplo, os polímeros podem ser misturados com agentes terapêuticos e/ou profiláticos, tais como analgésicos, anti- inflamatórios, antibióticos, antifúngicos ou antimicrobianos, permitindo a liberação prolongada do agente terapêutico e/ou profilático.

[151] Nas modalidades, o polímero pode ser um polímero biodegradável (como quitosana, colágeno, alginato, polímeros de cianoacrilato, como dermabond e semelhantes) ou polímeros não biodegradáveis (como silício ou polietileno de ultra-alto peso molecular). O silício, por exemplo, pode ser usado para enxertos de tecidos moles e UHMWPE pode ser usado para enxertos ósseos.

Etapa 5: Reticulação polimérica

[152] O versado na técnica reconhecerá que uma variedade de reticuladores e/ou métodos de reticulação polimérica podem ser usados. Por exemplo, reticulação polimérica UV, química ou gasosa pode ser usada, tal como após o protocolo de plastinação estar completo, ou reticulação polimérica lenta pode ser usada, tal como durante o protocolo de plastinação. Por exemplo, o reticulante pode ser misturado com o polímero (por exemplo, alginato, carbonato de cálcio e GDL).

Modalidades alternativas:

[153] Se o tecido for muito denso após o processo de plastinação, como muito denso para a semeadura de células ou muito denso para as próprias células do paciente migrarem através do enxerto, as modalidades podem compreender a utilização de maior concentração de água misturada com o banho de polímero, menos densidade de reticulação polimérica e/ou criar buracos ou canais (como mecanicamente, gravado a laser, quimicamente, luz e semelhantes). Objetivos e usos:

[154] I) Mecânica: Atualmente um dos maiores problemas com matrizes descelularizadas na área médica é a redução das propriedades mecânicas. Aplicando a plastinação aos tecidos moles descelularizados, as propriedades mecânicas seriam bastante modificadas (isto é, aprimoradas). Por exemplo, os próprios polímeros podem se auto-reticular com a matriz extracelular, ou reticulação polimérica da matriz extracelular com os polímeros ou reticulação polimérica dos polímeros para si mesmo permitiria a modificação das propriedades mecânicas. Por exemplo, mais reticulação polimérica pode resultar em propriedades mecânicas mais altas, como módulo de elasticidade. Os polímeros que atuam como lubrificantes de drenagem também podem ser usados na cartilagem descelularizada ou em materiais semelhantes, como juntas ou discos. Lubrificantes drenantes se referem ao fluido que é espremido mecanicamente da cartilagem ou implantes semelhantes para manter uma camada de fluido na cartilagem ou na superfície do implante, de modo a reduzir o atrito e lubrificar as juntas.

[155] II) Semeadura de células: Um obstáculo dentro da manipulação de tecidos é a entrega de células por todo o material ou estrutura de andaime. Atualmente, alguns injetam as células em pontos específicos, criam o material com as células antes da reticulação polimérica para um encapsulamento físico dentro do material (material limitado) e empurram as células através de dispositivos de fluido, semeiam na superfície e permitem a auto-migração. As modalidades descritas nestes documentos utilizarão a plastinação para a semeadura de células, o que permitirá que as células sejam semeadas profundamente e potencialmente de maneira uniforme nos tecidos. Tais modalidades serão úteis para materiais que não podem ser criados pré- misturados com células, para encapsulamento físico ou ao usar estruturas decelularizadas de órgãos inteiros, como pulmão, coração, fígado, pâncreas.

[156] Em estruturas derivadas biologicamente de órgãos inteiros, por exemplo, um método comum de semeadura celular é lavar as células através das redes de vasos descelularizados ou vias aéreas, e contando com a auto-migração das células para entrar nas paredes e partes mais profundas de toda a estrutura de andaime do órgão. Conforme descrito neste documento, ao infundir e submergir todo o órgão com polímeros que têm células misturadas nos mesmos, uma distribuição substancialmente uniforme e semeadura celular completa da estrutura do andaime derivado biologicamente ocorrerá, mesmo dentro das paredes do vaso e mais profundamente de toda estrutura de andaime do órgão. A pressão e a duração do vácuo, o processo de temperatura e os solventes dependerão da célula.

[157] III) Migração/diferenciação celular: Diferentes tipos de polímeros podem ser utilizados para encorajar diferentes tipos de crescimento celular. Por exemplo, o alginato pode estimular as neuroesferas a se diferenciarem em subconjuntos proporcionalmente diferentes de células do que a agarose, o ágar ou a goma de gel. As modalidades neste documento capitalizam essas propriedades inatas de diferentes polímeros para encorajar células diferentes ou subconjunto das mesmas a crescer e/ou se diferenciar sem o uso de drogas ou fatores de crescimento exógenos.

EXEMPLO 2

[158] Prolapso de órgão pélvico (POP) é uma condição comum em mulheres causada pela perda de suporte do tecido do assoalho pélvico, fazendo com que os órgãos herniem no lúmen vaginal ou ânus. Os sintomas de POP, como incontinência, infecções frequentes do trato urinário, dificuldade para evacuar, sangramento, pressão e dor, podem ter impactos negativos significativos na saúde da mulher, na vida diária e na qualidade de vida, afetando especialmente a imagem corporal, as relações familiares e a saúde sexual1-3. POP afeta 33% a 50% de todas as mulheres4-6, afetando potencialmente mais de 1 bilhão de mulheres em todo o mundo7. Entre 3% e 11% de todas as mulheres têm POP sintomático grave4, 6, 28. Nos Estados Unidos, mais de 300.000 cirurgias de POP são realizadas anualmente para POP sintomático8. As opções cirúrgicas para o tratamento de POP incluem implantes de malha sintética e enxertos biológicos acelulares (ABGs). Os implantes de malha sintética apresentam riscos de segurança significativos, incluindo infecção crônica, danos aos nervos e tecidos, laceração genital e outros8-13. Os produtos ABG atuais têm menos complicações, geralmente menos graves do que a malha sintética, mas têm taxas de recorrência mais altas e podem ter complicações incluindo infecção, falha mecânica do enxerto e falha de integração do hospedeiro14-22. Apesar das complicações dos produtos atualmente disponíveis comercialmente para POP, os cirurgiões ainda apoiam seu uso porque a malha sintética e os produtos ABG têm taxas de cura mais altas do que os métodos cirúrgicos tradicionais de tecido nativo, que falham em 2 anos para 40% das mulheres23-25. Dados os efeitos negativos do POP não tratado e os riscos envolvidos no tratamento cirúrgico do POP, o POP representa uma área de significativa necessidade médica não atendida que está desesperada por uma solução segura e eficaz.

[159] Um novo tipo de ABG para cirurgias POP está sendo desenvolvido. Através de métodos de manipulação de tecidos, o enxerto de acordo com a invenção terá propriedades mecânicas aprimoradas e servirá como um dispositivo de distribuição de drogas para distribuição de vários agentes terapêuticos, tais como analgésicos, antibióticos, anti- infecciosos, combinações desses. Esse enxerto atenderá às necessidades médicas não atendidas do POP, pois deve ser um produto mais seguro e eficaz do que os implantes de malha sintética e ABGs atualmente no mercado. POP tem opções de tratamento não cirúrgico e cirúrgico. As opções não cirúrgicas (exercícios de Kegel, pessários de plástico, etc.) têm eficácia limitada para pacientes com POP grave. As opções cirúrgicas incluem o uso de tecido nativo, implantes de malha sintética e ABGs para reparo do suporte do assoalho pélvico. Mais de 40% de cirurgias POP vaginais com tecido nativo falharão em dois anos24, 25. Implantes de malha sintética foram criados em resposta às altas taxas de falha encontradas em reparos de tecidos nativos13, 30. Geralmente são feitos de polipropileno não absorvível8. Os ABGs foram desenvolvidos como uma alternativa às malhas de polipropileno30. Os ABGs são derivados naturalmente da matriz dérmica porcina ou bovina que se tornou acelular e não imunogênica por meio do processo de descelularização. Os ABGs são ideais porque retêm o microambiente nativo da matriz extracelular (ECM), que promove o repovoamento da célula hospedeira do enxerto e, assim, a integração completa do enxerto com o tecido do hospedeiro. Por exemplo, algumas cirurgias POP transvaginais usam tecidos nativos do paciente. Os reparos de tecido nativo têm taxas desanimadoras de falha - 40% dos reparos de tecido nativo falham em 2 anos - e muitos cirurgiões preferem “reparos reforçados ou aumentados” usando as duas opções abaixo24, 25, 47-49. Assim, os ABGs estão sendo explorados como alternativas mais seguras à malha30. Os médicos estão usando atualmente o enxerto de assoalho pélvico anterior Surgisis® BioDesignTMda Cook Medical e a matriz de assoalho de MatriStem TMda Acell, Inc.14. Os ABGs não apenas reparam o POP, mas também oferecem uma estrutura para a regeneração do tecido do paciente. Até o momento, todo ABG apresentou taxas de recorrência mais altas do que as malhas sintéticas, mas com menos complicações14.

[160] Por exemplo, os implantes de malha podem ser feitos de uma variedade de materiais, mais comumente polipropileno não absorvível8. Sérias preocupações sobre a segurança das malhas vaginais sintéticas foram levantadas. As malhas sintéticas e os ABGs atualmente disponíveis têm desvantagens. A malha sintética é o maior delito em massa desde o amianto, com base no número de processos (as mulheres entraram com mais de 104.000 processos no tribunal federal dos EUA31). Vários processos importantes foram movidos sobre o uso de malhas sintéticas em cirurgias POP, com mulheres sofrendo efeitos colaterais graves, incluindo morte, infecção crônica (por exemplo, sepse), sangramento, danos em nervos e tecidos, órgãos perfurados, cicatrizes vaginais, laceração genital, dor durante o sexo, dor abdominal crônica e sofrimento psicológico que acompanha esses efeitos colaterais físicos9, 13. Um inquérito do Senado australiano, em consulta com o Conselho Médico da Austrália, determinou que o uso de malha vaginal para POP causou “agonia e dor históricas” que tiveram um “impacto devastador” na saúde, carreira e relacionamentos das mulheres9,10,32. Em um caso importante nos Estados Unidos em março de 2018, a subsidiária Ethicon da Johnson & Johnson perdeu uma ação judicial de US $ 35 milhões por esconder falhas, lesões e taxas de complicações dos pacientes. O processo alegou que o produto de malha da Ethicon, Prolift, “causou ferimentos graves e irreversíveis, condições e danos a um número significativo de mulheres”33. Algumas empresas optaram por resolver fora do tribunal em vez de ir a julgamento público. A Endo International, Inc. teve um acordo de US $ 830 milhões em 2014 e um acordo adicional de US $ 400 milhões no mesmo ano34.

[161] A Food and Drug Administration (FDA) emitiu uma Notificação de Saúde Pública em 2008 sobre os riscos do uso de malha vaginal sintética para POP12. Em 2011, o FDA determinou que eventos adversos graves associados à malha cirúrgica em POP não são raros e divulgou uma atualização sobre a segurança e eficácia da malha. O FDA finalmente decidiu que a segurança da malha cirúrgica para POP não está bem estabelecida. Em 2016, o FDA emitiu um pedido final reclassificando as malhas como dispositivos da Classe III, exigindo dados de ensaios clínicos mais extensos11. Em 2017, a Australian Therapeutic Goods Administration cancelou a aprovação de diversos tipos de malhas cirúrgicas em cirurgias POP, banindo efetivamente os produtos35. O Instituto Nacional de Saúde e Excelência Clínica do Reino Unido emitiu uma declaração de orientação que atua como uma proibição de fato da malha vaginal em cirurgias POP36. As malhas cirúrgicas são proibidas em todas as operações pélvicas na Nova Zelândia, não apenas no POP vaginal36.

[162] No POP, a vagina e os tecidos moles de suporte estão comprometidos tanto estrutural quanto funcionalmente, com esses tecidos apresentando músculo liso desorganizado e atrofiado e conteúdo alterado de colágeno e elastina30, 55-59. Conforme descrito neste documento, os médicos estão recorrendo aos ABGs como opções mais seguras para o reparo de POP em vez do uso de malhas sintéticas.

[163] ABGs são tecidos, como pele ou tendão, que são recuperados de um doador (humano ou animal) e processados para remover células e imunógenos. As proteínas da ECM (por exemplo, colágeno, elastina), que em grande parte constituem a arquitetura da maioria dos tecidos, são retidas durante a descelularização. Este processo gera essencialmente um enxerto tridimensional livre de células e DNA que é passível de repovoamento e remodelação da célula hospedeira durante o curso da cicatrização.

[164] O material cirúrgico não autólogo que pode ser usado com o enxerto da invenção (1) fornece suporte estrutural, (2) promove o processo natural de cicatrização de feridas do corpo, (3) permite o crescimento interno e (4) integra-se totalmente com o tecido do hospedeiro no tempo. Os ABGs são superiores aos enxertos sintéticos na medida em que preservam, ao invés de recriar, o microambiente da matriz nativa, retendo a composição única e complexa da matriz do tecido20, 60. A preservação dessas propriedades complexas promove o repovoamento eficiente e o restabelecimento funcional das células e do suprimento sanguíneo dentro dos ABGs, levando ao seu maior sucesso em relação aos enxertos sintéticos. Por mais de 30 anos, os ABGs têm sido usados em cirurgias para reconstrução da mama, reparo de hérnia abdominal, cicatrização de feridas por queimadura, reparo de uretra, reparo de tendão e úlcera diabética/reparo de ferida crônica61, 62. ABGs disponíveis comercialmente, como AlloDerm, DermACELL e FlexHD são considerados clinicamente necessários para reconstruções da mama, reparos cirúrgicos abdominais e queimaduras, juntamente com outras indicações.

[165] Apesar das vantagens dos ABGs, há espaço significativo para melhorias nos ABGs para todas as indicações. Meta-análises em grandes estudos clínicos para uso de ABG em reconstruções da mama e reparos de hérnia mostram que os ABGs têm taxas de complicações relativamente altas, estimadas em 10-23%37-41. Complicações específicas em pacientes com gasometria arterial são mais comumente atribuídas a infecção (celulite), formação de seroma e necrose15, 16. Análises mais detalhadas em falhas de ABG mostram vascularização reduzida, integridade mecânica pobre, falha de integração (resultando em cicatrizes) e rejeição imunológica17-22.

[166] Para melhorar os resultados clínicos para procedimentos POP e desenvolver novas capacidades de ABGs para pedidos mais amplos na medicina regenerativa, os ABGs de acordo com a invenção serão impregnados com polímeros biodegradáveis que podem fornecer propriedades mecânicas aprimoradas e liberação local e prolongada de drogas. Sem limitar-se pela teoria, a impregnação de polímero de um ABG por si só aumentará as propriedades mecânicas do enxerto, permitindo que seja mais durável do que um enxerto não impregnado e, assim, evitar a falha do enxerto devido a forças mecânicas. A infecção, geralmente resultado de bactérias oportunistas, poderia ser compensada através da liberação prolongada de antibiótico local do polímero, enquanto a adição de agentes anti-inflamatórios e analgésicos pode reduzir a inflamação local e diminuir a dor no sítio da cirurgia. Essas propriedades aditivas aumentarão a aceitação do enxerto e a integração do hospedeiro, diminuindo a probabilidade de complicações e facilitando a recuperação do paciente.

[167] A inovação conforme descrito neste documento é a adaptação de técnicas de plastinação de tecido63-66para fortalecer mecanicamente ABGs e para a distribuição prolongada e localizada de drogas a partir desses enxertos. Enxertos embutidos de polímero foram descritos anteriormente; no entanto, geralmente são uma combinação de polímeros sintéticos ou naturais e matrizes de colágeno fabricadas67; não ABGs de ocorrência natural. O método dos inventores forçará os polímeros impregnados no ambiente tridimensional denso e nativo de um ABG, permitindo propriedades mecânicas aprimoradas do enxerto, enquanto retém a complexidade morfológica da ECM endógena. A manutenção da densidade natural da fibra de colágeno e do alinhamento dentro dos enxertos impregnados com polímero fornecerá ainda suporte para recelularização robusta e cicatrização de feridas 67, 68 .

Justificativa.

[168] Existem três aspectos principais para a impregnação de polímero de ABGs, conforme descrito neste documento: (1) descelularização de tecido intacto, (2) impregnação à base de plastinação de polímeros naturais e (3) liberação de droga de polímeros. Em uma primeira instância, os aspectos (1) e (2) conforme descritos serão integrados. Em um segundo caso, os inventores irão então incorporar (3) a liberação da droga.

[169] (1) Descelularização: As técnicas de descelularização para a regeneração de todo o órgão do pulmão foram otimizadas em modelos de ratos e primatas não humanos (NHP)69, 70e agora têm sido empregadas com sucesso na pele humana. Com a modificação do processo de descelularização, a viabilidade de descelularizar matrizes dérmicas já foi demonstrada71. O processo de descelularização atende a critérios previamente definidos para a geração de tecido acelular não imunogênico pós-descelularização71, 72. Este método de descelularização está coberto pelo pedido de patente US N° 2018/0015204 A126, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

[170] O processo de descelularização foi caracterizado na derme NHP para a retenção de componentes de ECM colágeno, glicosaminoglicanos (GAGs) e elastina71. Resumidamente, os colágenos (tipos I e III) são os principais componentes da ECM da pele, os GAGs são polissacarídeos hidrofílicos que fornecem retenção de impacto à ECM e as fibras de elastina são um componente essencial para a elasticidade da pele. Os inventores confirmaram a preservação do conteúdo de colágeno e GAG em níveis semelhantes à derme intacta e detectaram uma diminuição nos níveis de elastina71. Uma diminuição da elastina é altamente comum em tecido descelularizado73,74; no entanto, os níveis diminuídos de elastina medidos são suficientes para a manutenção das propriedades mecânicas do tipo nativo73, 74. Os níveis de componentes de ECM retidos da matriz dérmica NHP descelularizada são semelhantes aos dados de outro tecido epitelial, como pulmão de macaco rhesus e rato, e pele de porco73-76. Além disso, a derme descelularizada apoiou a proliferação celular (> 65%), a migração celular e não induziu significativamente a apoptose (<1,5%)71. Além disso, os inventores avaliaram a estrutura da fibra de ECM da derme NHP descelularizada com criomicroscopia eletrônica de triagem e descobriram que a integridade dos feixes de colágeno e as fibras foeram mantidas nas camadas dérmica e epidérmica, semelhantes à derme intacta (Figura 4). A derme descelularizada é desprovida de níveis imunogênicos de material genômico e mantém sua estrutura geral em micro e macroescala. Esses dados demonstram que o processo de descelularização é adequadamente otimizado para a pele, criando uma matriz acelular que retém os elementos estruturais.

[171] (2) Plastinação:Gunther von Hagens popularizou a plastinação na década de 1970 e o processo tem sido usado para preservar amostras de tecido cirúrgico ou de autópsia para ensino, histologia, evidências judiciais e preservação de todo o organismo64. O processo é bem compreendido63-66, sendo o método mais caracterizado de impregnação de polímero para tecido humano a Técnica S1065, 66. Em resumo, essa técnica desidrata órgãos inteiros fixos ou fatias de órgãos por meio de incubações controladas em solventes orgânicos, incluindo etanol e acetona. Após o pedido de vácuo, a acetona dentro de um tecido passa por uma transição de fase de líquido para gás, criando uma pressão negativa dentro do tecido que leva soluções de banho, como polímeros, diretamente para o enxerto. Esta técnica tem sido amplamente utilizada com uma variedade de polímeros de vários tamanhos e cargas moleculares, incluindo silicones, poliésteres e resinas77-81. Até o momento, a plastinação não tem sido usada com o propósito de impregnar ABGs com polímeros para uso in vivo ou em qualquer pedido terapêutico.

[172] Mudanças na técnica de plastinação S10 padrão serão feitas a fim de impregnar ABGs com polímeros para uso in vivo , bem como para pedidos terapêuticos. Os inventores usarão o processo de descelularização descrito acima para gerar um ABG nativo, não reticulado. Após a desidratação do ABG por sucessivas incubações em etanol, o enxerto será saturado com acetona. Semelhante ao processo de plastinação original, os inventores usarão a impregnação por força controlada a vácuo27do enxerto para substituir a acetona no enxerto por biomateriais e polímeros e proteínas biologicamente derivados biocompatíveis (Figura 5).

[173] Liberação de drogas: Os polímeros, incluindo polímeros biodegradáveis, têm sido usados há muito tempo em sistemas de distribuição de drogas como carreadores82. Os inventores utilizarão polímeros naturais que são passíveis de encapsulamento de droga para distribuição localizada de droga em locais de colocação do enxerto. Os inventores irão alavancar conhecimentos e métodos de distribuição cutânea e liberação prolongada de drogas que são bem conhecidos na técnica para desenvolver um método para fornecer liberação prolongada de droga dentro do tecido em regeneração. Essa abordagem evita os efeitos sistêmicos dos métodos atuais e fornece uma dose terapêutica mais elevada no sítio de ação relevante da droga. Artigos foram publicados relacionados a polímeros biodegradáveis usados para encapsular e liberar fatores de crescimento de uma maneira controlada e prolongada83(incorporado por referência em sua totalidade). Este estudo usou um novo construto de alginato como um arcabouço de tecido multifuncional para o reparo do sistema nervoso central que entregou um fator neurotrófico derivado do cérebro (Neurotrofina-3)83. No programa ABG impregnado com polímero descrito neste documento, os inventores usarão materiais e métodos semelhantes para encapsular fisicamente antibióticos, analgésicos e/ou agentes anti-inflamatórios nos polímeros selecionados para tratar de problemas com infecção, dor e resposta hiperinflamatória do hospedeiro.

Estudo.

[174] Os inventores estão desenvolvendo um método para impregnar um ABG com polímeros biodegradáveis que têm propriedades mecânicas robustas e bem caracterizadas e são passíveis de encapsulamento de drogas para local e distribuição controlada de compostos em sítios de enxerto. Um enxerto impregnado com polímero terá propriedades mecânicas aprimoradas, permitindo que seja mais durável do que um enxerto não impregnado e diminuirá a probabilidade de complicações associadas à falha mecânica. A liberação controlada de antibióticos a partir desses polímeros nos sítios de enxerto pode ter o potencial de conter complicações com infecção e a liberação de agentes anti-inflamatórios pode suprimir imediatamente a inflamação, permitindo uma maior probabilidade de aceitação/integração do enxerto com o hospedeiro. A criação de um ABG impregnado com polímero bioativo requer descelularização completa do tecido intacto derivado biologicamente, encapsulação física de antibióticos e agentes anti- inflamatórios em um polímero biodegradável e impregnação da pele descelularizada com o polímero carregado com droga. Os inventores irão concentrar esforços no desenvolvimento e otimização de um novo método de impregnação de polímero com base em técnicas de plastinação de tecido. Os inventores irão então analisar as propriedades dos ABGs impregnados com polímero (Figura 6). Para tanto, os objetivos são:

[175] Objetivo 1. Determinar quais parâmetros otimizam a impregnação de polímero de ABGs. Os inventores desenvolverão métodos para a impregnação de enxertos de pele acelular com três polímeros biodegradáveis: alginato, elastina e fibroína de seda. Os três polímeros serão testados em três concentrações cada e três tempos de incubação de impregnação a vácuo também serão avaliados. Para cada combinação de parâmetros, os inventores irão gerar enxertos de teste em triplicado. Esses enxertos serão analisados histologicamente quanto à penetração e distribuição do polímero. Os inventores irão determinar subsequentemente as condições específicas que produzem uma ocupação de polímero no enxerto que é >5% do espaço vazio/intersticial do enxerto e têm uma distribuição de polímero de modo que a ocupação de polímero normalizada seja de ±40% da média (para descrição, ver Abordagem Experimental). Os enxertos que atendem a esses critérios de sucesso avançarão para os Objetivos 2 e 3 descritos neste documento.

[176] Os inventores irão desenvolver métodos para a impregnação de enxertos de pele acelular com cada um dos três polímeros biodegradáveis: alginato, elastina e fibroína de seda. Esses polímeros bem caracterizados foram escolhidos por sua biocompatibilidade, propriedades de mecânica ajustável, forma monomérica pequena e relativamente simples, facilidade de reticulação para gerar formas poliméricas, natureza derivada biologicamente e uso comprovado em pedidos biomédicos. Ao impregnar ABGs com esses polímeros, os inventores podem manipular e melhorar as propriedades mecânicas dos ABGs. Em princípio, o polímero impregnado pode ocupar uma percentagem do espaço vazio/intersticial dentro da ECM e pode reticular a si mesmo e/ou a ECM. Como esses polímeros se reticulam prontamente por meio de mecanismos químicos (pH, Ca2+) ou físicos (temperatura, sonicação), a reticulação polimérica pode ocorrer de forma rápida e eficiente, independentemente do tamanho do enxerto. A reticulação polimérica não baseada em enzimas contorna as limitações com a difusão da enzima e atividade prolongada dentro da densidade do enxerto. As razões adicionais para a seleção desses três polímeros são as seguintes:

[177] (a) Alginato: o alginato (algin, ácido algínico) é um polímero natural isolado de uma alga marrom e é um polímero aprovado pela FDA geralmente considerado seguro (GRAS). O alginato tem sido amplamente utilizado na medicina regenerativa e na distribuição de drogas, por ser histocompatível para uso humano e apresentar citotoxicidade mínima ou desprezível87-90. Conforme descrito nesta seção, o alginato tem sido usado como um arcabouço de tecido para a liberação de drogas83. O alginato pode ser induzido a formar hidrogéis altamente reticulados com cátions multivalentes (por exemplo, Ca2+)83.

[178] (b) Elastina: Os inventores caracterizaram anteriormente uma redução de 69% no conteúdo de elastina na derme acelular NHP da derme nativa (n=3, p <0,01)71. Esses achados foram semelhantes aos dados do pulmão do macaco rhesus, pulmão de rato e derme suína: a diminuição da elastina durante o processo de descelularização é uma característica amplamente observada e caracterizada dos métodos de descelularização à base de detergente73-76. Estudos recentes observando a adição de elastina insolúvel em combinação com colágeno em um arcabouço de tecido cardiovascular biomimético descobriram que a elastina alterou marcadamente as propriedades mecânicas e biológicas do arcabouço, reduzindo os módulos de tração e compressão específicos sem afetar negativamente o tamanho dos poros ou a porosidade91. A tropoelastina, a forma monomérica da elastina, pode ser induzida a reticular com ela mesma ou com o colágeno. A elastina mais comumente usada é a a-elastina, que pode ser reticulada por calor, sonicação repetitiva91ou mudança de pH92.

[179] (c) Fibroína de seda: A seda é composta principalmente por duas proteínas, fibroína e sericina. A sericina pode desencadear uma resposta imunológica, mas não é fibroína 93. Seda foi recentemente explorada como um veículo de distribuição de drogas, estabilizador de drogas e estrutura biológica para manipulação de tecidos93e é um biomaterial aprovado pela FDA. Seda é de interesse para manipuladores biomédicos devido às suas propriedades de biocompatibilidade favoráveis e atributos mecânicos únicos, incluindo uma hierarquia de estrutura em nano e microescala bem definida, biocompatibilidade, subprodutos não inflamatório e compatibilidade do método de esterilização93-95. O FDA aprovou uma variedade de produtos de seda para uso in vivo , incluindo suturas e suporte (por exemplo, Seri® Surgical Scaffold). A seda pode ser induzida a se reticular com ela mesma ou com o colágeno por calor ou sonicação repetitiva93.

[180] Abordagem Experimental: A impregnação de polímero será realizada conforme descrito neste documento27. A Figura 6 mostra o fluxo de trabalho. Os inventores irão primeiro descelularizar pele de cadáver de doador humano (2-3 mm de espessura) para servir como o modelo ABG. Todo o tecido é obtido por meio de bancos de tecidos de doadores falecidos credenciados pela AATB. Após a descelularização e antes da impregnação do polímero, os ABGs serão cortados em quadrados de 1 cm x 1 cm. Além disso, todos os polímeros serão biotinilados por meio de reticulação à base de carbodiimida padrão para permitir a detecção de polímero dentro de ABGs. Não se espera que a biotinilação dos polímeros propostos interfira com sua capacidade de formar polímeros ou tenha um efeito significativo em suas propriedades físicas. A biotina é uma pequena molécula de 244 Da amplamente utilizada na conjugação de proteínas e já foi utilizada com alginato96e fibroína97e demonstrou não alterar as propriedades do polímero.

[181] Durante a impregnação, o ABG será gradualmente desidratado por meio de incubações graduais com etanol antes da saturação completa com o solvente orgânico, acetona. O ABG saturado com acetona será colocado com uma solução de banho de polímero solubilizado em água e sujeito à baixo vácuo por diferentes períodos de tempo a 4°C. Uma vez que a polimerização aumenta sob temperaturas mais quentes, serão realizadas impregnações a 4°C para garantir a entrada do polímero no ABG como um monômero antes da polimerização. Para cada polímero, serão testadas três concentrações: baixa (1% peso/volume), normal (10% peso/volume) e alta (20% peso/volume). A quantidade de tempo necessária para a etapa de impregnação a vácuo pode variar amplamente, dependendo da espessura e complexidade do tecido a ser impregnado. Períodos de tempo maiores que um dia podem ser necessários a 4°C, portanto, os inventores estarão testando períodos de incubação de 1, 3 e 10 dias.

[182] O objetivo desta etapa é penetrar o polímero em e através do ABG. Os inventores usarão uma abordagem de Design de Experimentos fatorial completo para otimizar a concentração de polímero, o tempo de incubação de impregnação e a temperatura de incubação. Para cada condição de impregnação, os inventores irão gerar enxertos impregnados em triplicado para avaliação da eficácia da impregnação. Um total de 27 combinações de parâmetros possíveis (três polímeros; três concentrações; três vezes) exigirá, portanto, a geração de 81 enxertos.

[183] As amostras serão submetidas a análises histológicas e imuno-histoquímicas (IHC) para medir a ocupação e distribuição do polímero dentro do ABG. Ocupação de polímero é definida como a área de sinal do polímero (conforme medido por coloração com NeutrAvidin- HRP de polímeros biotinilados) dividida pela área ABG total. Como a pele é estratificada, a densidade da ECM não é uniforme em toda a sua espessura (da epiderme à hipoderme). Sem limitar-se pela teoria, a variabilidade na distribuição do polímero ao longo da espessura do ABG. A fim de medir a distribuição do polímero, a área ABG será discretizada em regiões de 500 µm X 500 µm, a ocupação normalizada do polímero será calculada para cada região e, em seguida, a distribuição da ocupação normalizada do polímero em todo o enxerto será analisada quanto ao desvio da média. A ocupação normalizada do polímero é a ocupação do polímero (ou seja, % da área do polímero) dividida pela ocupação do espaço intersticial (ou seja, % da área vazia) antes da impregnação do polímero. O espaço intersticial antes da impregnação será medido diretamente a partir das seções manchadas de H&E (subtraindo a área da ECM da área total de ABG). Os inventores estão normalizando a ocupação do polímero após a impregnação para a ocupação do espaço intersticial antes da impregnação porque a quantidade de polímero que entra em uma região do ABG está diretamente relacionada à quantidade de espaço vazio que existia antes da impregnação.

[184] Serão determinadas as condições que produzem uma ocupação de polímero no enxerto que é >5% da área do enxerto e têm uma distribuição de polímero de modo que a ocupação de polímero normalizada é de ±40% da média. Sem limitar-se pela teoria, um aumento de 5% do material dentro do enxerto será suficiente para alterar as propriedades mecânicas. Sem ser limitado pela teoria, a ocupação normalizada do polímero estará dentro de 40% da média com base em uma análise de Monte Carlo para um enxerto discretizado em que a ocupação ECM e a ocupação do polímero para cada região que foram atribuídas aleatoriamente dentro dos intervalos de 20-50% e 140%, respectivamente. Apenas enxertos que atendam a esses parâmetros serão usados.

[185] Objetivo 2. Caracterizar as propriedades mecânicas dos ABGs impregnados com polímero. Os inventores irão testar todos os enxertos de pele acelular impregnados com polímero que atendam aos critérios descritos neste documento. Os inventores irão correlacionar as propriedades mecânicas ao método de impregnação. Os testes incluem teste de tração, teste de estouro de bola e teste de retirada de sutura. Os inventores irão determinar quais polímeros e condições otimizam as propriedades do enxerto. Por exemplo, um enxerto permeado por polímero deve ter um módulo de Young e resistência à tração >10 MPa, que é maior do que o existente não impregnado com polímero ABGs84- 86 .

[186] A impregnação de polímero de um ABG aumentará as propriedades mecânicas do enxerto, permitindo que seja mais durável do que um enxerto não impregnado. Sem ser limitado pela teoria, um ABG impregnado com polímero deve ter um módulo de Young e resistência à tração de >10 MPa, com base em valores da literatura de pele humana extirpada e in vivo , bem como valores não impregnados com polímero existentes para ABGs84-86, 98, 99. Os examinadores examinarão os enxertos que atendem aos requisitos de impregnação de polímero descritos neste documento, e somente os enxertos com características favoráveis serão usados nos estudos descritos a seguir. Se vários pontos de tempo para um determinado par de polímero/concentração avançar, apenas o enxerto de teste com a maior ocupação de polímero avançará. Portanto, um máximo de nove combinações de parâmetros (em triplicado, para n = 27 enxertos) avançarão para o teste descrito nesta seção. Os inventores irão correlacionar propriedades mecânicas com metodologia de impregnação. Os dados coletados também informarão os esforços para desenvolver enxertos ajustáveis e personalizados com diferentes propriedades mecânicas. As propriedades mecânicas serão medidas por tração uniaxial, estouro de bola e teste de retirada de sutura. O teste de tração uniaxial mede propriedades como o módulo de Young (tensão longitudinal: razão de deformação para medir a capacidade de suportar a tensão ou compressão longitudinal), resistência à tração final, resistência ao escoamento, alongamento e coeficiente de Poisson. O teste de estouro de bola é usado para medir a resistência de um material à deformação e falha. O teste de retirada de sutura é comumente usado para medir a resistência de um material, como enxertos cirúrgicos e malhas, à falha nos pontos de ligação da sutura.

[187] Abordagem Experimental: Teste de tração uniaxial, estouro de bola e extração de sutura serão realizados pela Exponent, Inc. (Philadelphia, PA). Para testes mecânicos, os enxertos impregnados com polímero terão 6,4 cm x 1 cm, conforme necessário para o encaixe do instrumento. Embora maior do que os enxertos usados no Objetivo 1, uma vez que a espessura do enxerto será consistente, os inventores esperam que a difusão forçada do polímero através dos enxertos seja consistente, apesar das diferenças de área de superfície. ABGs comercialmente disponíveis serão incluídos como controles para comparação.

[188] (a) Teste não axial: Esses testes serão realizados de acordo com ASTM D638100. As amostras serão cortadas em formato de osso de cachorro e a amostra será testada com um extensômetro de vídeo para identificar a cepa. Os módulos elásticos, o alongamento na ruptura e a resistência à tração final serão determinados.

[189] (b) Teste de estouro de bola: Esses testes serão realizados de acordo com ASTM D6797-15101e Freytes et al 102. As amostras serão cortadas em 2 x 2 cm e rompidas em um teste de pressão de estouro da bola da sonda com uma sonda de 5,56 mm de diâmetro e um orifício de folga de 9,75 mm de diâmetro a uma taxa de 25,4 mm/min.

[190] (c) Teste de extração de sutura: Oteste de extração de sutura será realizado de acordo com ASTM F543103. Uma sutura será passada através do enxerto uma vez, e as pontas soltas serão enroladas e amarradas em torno de um acessório de extração de sutura. O enxerto de pele será estacionário, preso à base do quadro de reação de forma que a direção da carga aplicada da sutura seja paralela ao enxerto. Uma carga de tração será aplicada às amostras a 5 mm/min até que ocorra a falha. A força de tração axial do corpo de prova será determinada.

[191] Se os testes acima provarem ser ineficazes para determinar as propriedades mecânicas dos ABGs devido às condições de teste limitadas (ou seja, temperatura, pré-condicionamento, taxa de cepa) ou adequação dos testes para o material (ou seja, elástico, viscoelástico, assimetria), os inventores usarão a análise mecânica dinâmica (DMA). O DMA é usado para medir a viscoelasticidade do polímero determinando o módulo complexo (relação tensão: cepa sob condições vibratórias), módulo de Young e resistência à tração final. O DMA é uma alternativa aos testes de tração uniaxial e estouro da bola. Se necessário, uma varredura de frequência será conduzida em um espécime por amostra a uma temperatura fixa de 20°C e frequências variadas entre -0,1 Hz e 10 Hz, para determinar o Young, armazenamento dinâmico e módulos de perda, resistência à tração e tan (d) como em função da frequência.

[192] Os inventores irão determinar quais polímeros e condições otimizam as propriedades do enxerto. O enxerto permeado com polímero deve ter um módulo de Young e resistência à tração de >10 MPa, que é maior do que os ABGs83-85não impregnados com polímero existentes.

[193] Objetivo 3. Caracterizar a bioatividade in vitro dos ABGs impregnados com polímero. Os inventores irão medir a bioatividade dos enxertos de pele acelular impregnados com polímero que atenderam aos critérios indicados acima, semeando enxertos in vitro com fibroblastos uterinos primários humanos e, em seguida, determinando a percentagem de viabilidade celular, proliferação e apoptose de acordo com métodos conhecidos na técnica. Os inventores também avaliarão a capacidade das células de migrar para o enxerto. Os inventores irão determinar quais polímeros e condições otimizam as propriedades do enxerto, por exemplo, um enxerto permeado por polímero que suporta >80% de células viáveis e >50% de células proliferativas.

[194] Um ABG impregnado com polímero, como o enxerto de acordo com a invenção, que é bioativo e suporta a migração celular, é essencial para um eventual uso clínico. Os inventores examinarão os enxertos que atendem aos requisitos e apenas os enxertos com características favoráveis serão usados nos estudos descritos abaixo. Um máximo de nove combinações de parâmetros (em triplicado, para n=27 enxertos) avançarão para o teste. Estas etapas de teste usam células humanas em combinação com o enxerto da invenção.

[195] Os inventores irão medir a bioatividade dos enxertos impregnados com polímero semeando enxertos in vitro com fibroblastos uterinos primários humanos e, em seguida, avaliando a proliferação celular, apoptose e migração. Ensaios semelhantes foram realizados anteriormente após a semeadura de células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea (BMSCs) NHP na derme NHP descelularizada71. Esses dados mostraram menos de 1% das células sendo apoptóticas e aproximadamente 65% da população de células permanecendo proliferativa durante a totalidade do estudo, sem alterações observadas entre os dias71. A coloração de viabilidade celular será conduzida. O trabalho de microscopia será então executado. A coloração Ki-67, EdU e TUNEL e a captura de imagem serão subsequentemente realizadas. Para todos os ensaios de bioatividade, a significância estatística será determinada com ANOVA bicaudal com a = 0,05. Os resultados numéricos serão dados como média ± erro padrão da média.

[196] Abordagem Experimental: Os enxertos acelulares serão pré-condicionados com meio de crescimento celular em uma incubadora de cultura de células em condições padrão de cultura de células de mamíferos (37°C/5% de dióxido de carbono) por 30 minutos antes da semeadura. Cada enxerto terá 1 cm X 1 cm e será semeado com 1 x106 fibroblastos uterinos primários; cada enxerto será executado em triplicado. Esta densidade deve fornecer infiltração suficiente do enxerto de modo a permitir a presença de células suficientes dentro do enxerto, bem como boa resolução de célula única sem um sinal de fundo alto devido ao excesso de células. Os enxertos semeados serão cultivados por uma e duas semanas antes da análise.

[197] Para todas as manchas, cada enxerto semeado será cortado em pedaços de 5 mm X 5 mm para evitar a penetração insuficiente de anticorpo e corante no tecido. A viabilidade celular, proliferação e apoptose serão medidas por microscopia de fluorescência e quantificadas usando o software ImageJ. As medições serão feitas em 5 campos de visão aleatórios por amostra para cada ensaio de bioatividade e fundo subtraído. Sinais fora de foco de células que não estão no plano focal serão excluídos. Os enxertos semeados serão avaliados da seguinte forma:

[198] (a) Viabilidade celular: a viabilidade será medida dentro do enxerto por coloração com calceína-AM e homodímero-1 de etídio (Thermo; ensaio LIVE/DEAD). Calcein-AM cora células vivas verdes com atividade esterase ativa, enquanto homodímero-1 de etídio cora os núcleos das células com perda de integridade da membrana.

[199] (b) Proliferação: A proliferação celular será medida por meio de coloração Ki-67 e incorporação de EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina). A IHC será realizada em seções de enxertos semeados com anti-Ki67 (Sinalização celular, camundongo) e coloração secundária conjugada com Alexa Fluor 488. O ensaio Click-iT EdU (Invitrogen) irá marcar células mitoticamente ativas através da incorporação de EdU com marcação fluorescente.

[200] (c) Apoptose: A apoptose será avaliada pelo ensaio de rotulagem end-nick de dUTP mediado por TdT (TUNEL) (In Situ Kit de detecção de morte celular - Fluoresceína, Roche), conforme descrito anteriormente71, 73. As amostras tratadas com solução marcada sem enzima serão incluídas como controles negativos, enquanto as amostras tratadas com DNase I antes da coloração TUNEL servirão como controles positivos. Todas as amostras serão coradas com DAPI após a coloração TUNEL.

[201] (d) Migração celular: Usando as imagens de lâmina capturadas no trabalho de histologia descrito acima, será avaliada a capacidade das células de migrar para os ABGs impregnados com polímero em comparação com os ABGs não tratados com polímero. Será contado o número relativo de células, conforme indicado pelos núcleos corados, dentro de cada enxerto.

[202] O estudo de migração celular quantificará o número de células por campo em função da distância da borda do enxerto a fim de gerar um valor de "migração". No entanto, os fibroblastos semeados em um único lado do enxerto irão provavelmente migrar para o enxerto nesse único lado. A maioria das células migratórias será da área onde o enxerto faz contato direto com a placa de cultura de células, e a distância migrada será distorcida dependendo da posição original das células migratórias. Por esse motivo, o número de células migradas será apenas contabilizado. Os inventores serão capazes de fazer avaliações mais quantitativas da distância de migração em estudos posteriores, quando o enxerto for implantado em um modelo in vivo.

[203] Assim, os inventores irão determinar quais polímeros e condições otimizam as propriedades do enxerto, por exemplo, o enxerto permeado com polímero suportará>80% de células viáveis e > 50% de células proliferativas. Os inventores selecionarão ainda as condições de parâmetros ideais para avançar para estudos posteriores.

[204] Os inventores estão desenvolvendo ABGs impregnados com polímero para melhorar a função mecânica dos ABGs e distribuir drogas localmente de uma maneira controlada para melhorar a cura e os resultados do paciente. O exemplo neste documento descreve esforços para produzir um enxerto de pele acelular impregnado com polímero. Em um estudo subsequente, os inventores irão misturar drogas selecionadas com o polímero biodegradável antes da impregnação do polímero enxertado. Ao escolher materiais biodegradáveis sintonizáveis que se destinam a se decompor no corpo ao longo do tempo, os inventores permitirão a distribuição sustentada a droga na área em torno do enxerto. Os inventores irão então caracterizar a eficácia de encapsulação e a cinética de liberação da droga, bem como a genotoxicidade do enxerto. Essas atividades promoverão os estudos de ABG impregnados com polímeros. Referências para este exemplo. 1. 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EXEMPLO 3

[205] Aloenxertos de complexo mamilo-aréola acelular para uso na reconstrução da mama

[206] Existem mais de 3 milhões de sobreviventes de câncer de mama vivendo nos Estados Unidos, com um número significativo que se submeteram a mastectomias seguidas de reconstruções do complexo mamilo-aréola (NAC). Atualmente, as estratégias de reconstrução do NAC dependem de técnicas não vivas ou não permanentes: tatuagem, próteses ou estruturas cirúrgicas semelhantes a mamilos. É descrita neste documento uma abordagem de manipulação de tecido que pode permitir um enxerto onlay de NAC humano durante os procedimentos de reconstrução da mama.Aoaplicar a descelularização, a remoção de componentes celulares do tecido, para um NAC doador inteiro intacto, a estrutura da matriz extracelular (ECM) do NAC é preservada; assim, a criação de uma estrutura de andaime derivado biologicamente para as células repovoar e regenerar o NAC.

[207] Tecido NAC de primata não humano (NHP) foi usado como modelo para tecidos humanos. Um método de descelularização à base de detergente foi usado para derivar estruturas de andaime NAC inteiros do tecido NHP NAC. A caracterização in vitro inclui: viabilidade celular, proliferação/apoptose, análise histológica, análise comparativa do perfil proteômico e análise do material. A análise in vivo de biocompatibilidade, vasculogênese e viabilidade foi avaliada usando dois modelos, murinos e modelos animais de NHP.

[208] No modelo de implante subcutâneo C57BL/6 murino de biocompatibilidade e neovascularização, enxertos NAC derivados de rhesus descelularizados foram comparados apenas à cirurgia, pele de camundongo nativa e derme acelular derivada de suíno comercialmente disponível, durante 3 semanas. Para avaliar a neovascularização e infiltrado de células imunes, sangue periférico, pesos e os implantes foram coletados; citometria de fluxo e imuno-histoquímica. A viabilidade foi conduzida por um modelo de enxerto onlay de macacos rhesus NHP não letal, CBC/chem12, e o peso foi analisado ao longo do estudo de 6 semanas, e a imunoquímica foi realizada em cada um dos 20 enxertos NAC. A significância estatística foi determinada por testes t bicaudais ou ANOVA de duas vias com um teste de Tukeypost-hoc. Tamanho da amostra in vitro: n> 3; in vivo: murino n> 5/grupo; Enxertos NHP n=6/ponto de tempo

[209] Com referência à FIG. 7 à FIG. 18, os dados apresentados neste documento demonstram que as estruturas de andaimes são desprovidas de células, retêm a integridade da ECM e um alto grau de bioatividade. O conteúdo de colágeno e glicosaminoglicanos não foi significativamente alterado pelo processo de descelularização; enquanto o conteúdo de elastina diminuiu. A proliferação e apoptose de BMSCs semeadas foram encontradas em ~ 65% e <1. 5%, respectivamente.

[210] In vivo: A análise dos dados de citometria de fluxo, testando o sangue para células imunes circulantes, indicou que não havia uma diferença significativa entre o enxerto descelularizado e o controle de derme descelularizado disponível comercialmente. A análise dos dados de peso de camundongos mostra que aqueles com NACs descelularizados tiveram um ganho de peso percentual significativamente maior do que aqueles com derme descelularizada comercialmente disponível. A imuno-histoquímica de CD31+ indicou que a neovascularização dentro dos enxertos de NAC estava presente nos pontos de tempo de 14 e 21 dias, significativa em comparação com o controle (P < 0,05). Nenhuma resposta imune local ou sistêmica foi indicada em comparação ao controle. O estudo de viabilidade no modelo NHP não mostrou resposta imune local ou sistêmica, e a reepitelização começou em 7 dias e a formação de vasos sanguíneos em 21 dias.

[211] Estes estudos dos enxertos de complexo mamilo-aréola derivado de rhesus decelularizados mostram dados significativos de que tanto o método de descelularização identificado como o enxerto de complexo mamilo-aréola total derivado biologicamente permitem neovascularização e resposta imunológica mínima. Juntamente com a imagem de microscopia eletrônica da estrutura de andaime NAC descelularizado, o enriquecimento de ECM estrutural e proteínas do citoesqueleto demonstrado por proteômica e coloração de IHC sugerem que a microarquitetura está suficientemente intacta e a paisagem de proteína tem propriedades favoráveis para epitelização e vascularização bem-sucedidas após a implantação. A partir desses estudos in vivo, observou-se que o processo de descelularização e os implantes descelularizados foram capazes de permitir a reepitelização e a formação de vasos sanguíneos, além de manter um perfil de biocompatibilidade seguro em relação aos controles. Sem desejar ser limitado pela teoria, esses dados indicam que todo um complexo mamilo-aréola derivado biologicamente é uma solução viável e potencialmente útil no pedido da regeneração/reconstrução do complexo mamilo-aréola após uma mastectomia devido ao câncer de mama.

Exemplo 4

[212] Enxertos acelulares derivados biologicamente (ABGs) são tecidos recuperados de doadores e então descelularizados para remover células e imunógenos. Por mais de 30 anos, os ABGs têm sido usados em cirurgias para correção de hérnia abdominal, cicatrização de feridas por queimadura, úlcera diabética/reparação de feridas crônicas e outras indicações. ABGs têm taxas de complicações relativamente altas que são atribuídas principalmente a infecção, formação de seroma, falha mecânica e necrose. Essas complicações representam uma necessidade médica significativa não atendida para os 7,5 milhões de americanos tratados com ABGs anualmente.

[213] As modalidades descritas neste documento abordam esta necessidade médica não atendida e incluem ABGs com sistemas de distribuição de drogas à base de hidrogel sintonizáveis para liberação sustentada local de agentes terapêuticos do próprio ABG. A impregnação de ABGs com polímeros para pedidos terapêuticos não foi realizada antes. Incorporar a entrega de drogas à base de hidrogel em ABGs permite a administração única e de baixa dose de droga em locais- alvo, diminuindo assim a toxicidade da droga e sua degradação metabólica.

[214] Usando uma técnica de impregnação de polímero descrita neste documento, redes de hidrogel carregadas com droga dentro do interstício de ABGs dérmicos humanos que prontamente formam redes de hidrogel permitirão a liberação sustentada e local de agentes terapêuticos a partir de ABG. Os experimentos de validação podem incluir o uso de vancomicina - um antibiótico comumente usado para o tratamento da infecção por Staphylococcus aureus - para demonstrar a liberação sustentada de ABGs impregnados com gelatina ou redes de hidrogel de polímero de fibroína de seda. Por exemplo, estudos de validação podem usar ABGs dérmicos impregnados com polímeros naturais biodegradáveis misturados com vancomicina. As modalidades neste documento utilizam o deslocamento acionado por força de um solvente volátil de um material poroso, forçando polímeros e drogas na solução de banho circundante para os vazios densos e limitados por difusão do enxerto. Os estudos de validação (1) caracterizarão a impregnação de ABG com misturas de vancomicina-polímero, (2) definirão o perfil de liberação da droga e determinarão a eficácia da droga após a liberação de ABGs impregnados e (3) caracterizarão a bioatividade celular dos ABGs impregnados.

[215] Estes estudos irão validar a abordagem impregnada com polímero e validar o uso de modalidades neste documento como uma base para futuras pesquisas ABG impregnadas com polímero de drogas. Sem desejar ser limitado pela teoria, dotar os ABGs com propriedades terapêuticas aditivas transformará a manipulação de tecidos e as abordagens regenerativas dentro da clínica.

Exemplo 5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

[216] Enxertos acelulares derivados biologicamente (ABGs) são tecidos recuperados de doadores e descelularizados para remover células, DNA e imunógenos. As proteínas da matriz extracelular (ECM), que em grande parte constituem a arquitetura da maioria dos tecidos, são retidas durante esse processo, resultando em um enxerto de proteína tridimensional livre de células e DNA. Por mais de 30 anos, ABGs têm sido usados em cirurgias para reparo de hérnia abdominal, reconstrução de mama, cicatrização de feridas por queimadura, úlcera diabética/reparo de feridas crônicas e outras indicações1, 2. Apesar das vantagens, os ABGs têm taxas de complicações relativamente altas3-7, que são atribuídas principalmente a infecção, formação de seroma, falha mecânica e necrose8-14. Essas complicações são uma necessidade clínica significativa não atendida para os 7,5 milhões de americanos tratados com ABGs anualmente15.

[217] Para abordar essas questões, as modalidades neste documento compreendem ABGs com sistemas de entrega de drogas à base de hidrogel sintonizáveis (DDS) (ou seja, polímeros) para liberação sustentada local de agentes terapêuticos (por exemplo, antibióticos, analgésicos e anti-inflamatórios). Incorporar a distribuição de drogas à base de hidrogel por meio de polímeros em ABGs permite a administração de drogas em baixa dose e local específico, evitando assim o risco de toxicidade associado à administração sistêmica. A impregnação de ABGs com polímeros para pedidos terapêuticos não foi realizada antes.

[218] Sem desejar ser limitado pela teoria, ABGs impregnados com polímero (poliABGs) carregados com drogas (droga+poliABGs) abordarão diretamente complicações conhecidas de ABGs tradicionais e resultarão em melhores resultados clínicos. Isso é baseado nas capacidades regenerativas naturais estabelecidas dos ABGs16-18para reconstrução de tecidos e avanços terapêuticos recentes em plataformas de hidrogel para a distribuição controlada de drogas19. Usando uma técnica de impregnação de polímero descrita neste documento, uma droga dérmica humana+ olyABG será feita com polímeros biocompatíveis e carregáveis de droga que prontamente formam redes de hidrogel para permitir a liberação local sustentada de agentes terapêuticos do enxerto.

[219] As modalidades podem compreender redes de hidrogel carregadas com droga dentro do interstício de ABGs dérmicos. As técnicas de impregnação de polímero descritas neste documento podem utilizar o deslocamento acionado por força de um solvente volátil de um material poroso, forçando polímeros e drogas na solução de banho circundante para os vazios densos e limitados por difusão do ABG. Gelatina e fibroína de seda, polímeros biodegradáveis seguros e naturais com propriedades de liberação de drogas conhecidas, serão usados para as redes de hidrogel. Como estudos de validação, a vancomicina será usada como droga modelo. A vancomicina é um antibiótico comumente usado para o tratamento de infecções bacterianas Gram-positivas pós-operatórias, como Staphylococcus aureus (S. aureus)20, 21. Sem desejar ser limitado pela teoria, a liberação sustentada de vancomicina de ABGs impregnados com diferentes polímeros biodegradáveis será mostrada.

[220] Os objetivos dos estudos de validação compreendem:

[221] Objetivo 1. Caracterizar a impregnação de ABG com misturas de polímero de vancomicina.

[222] ABGs serão impregnados à força com misturas de vancomicina-polímero, testando polímeros de gelatina e fibroína de seda em duas concentrações. Este polímero de vancomicina ABGs impregnados (vanc+poliABGs) serão caracterizados quanto à ocupação do polímero, que mede a eficiência da impregnação do polímero e é importante para as características de distribuição da droga. Ensaios de tração serão realizados para caracterizar as propriedades mecânicas dos vanc+poliABGs, uma vez que propriedades mecânicas alteradas podem afetar o desempenho do ABG. Tais estudos determinarão as condições de impregnação que produzem uma ocupação de polímero > 5% do volume vanc+poliABG e uma distribuição de polímero de forma que a ocupação normalizada de polímero seja ± 40% da média. Além disso, tais estudos caracterizarão o módulo de Young, a resistência à tração e o coeficiente de Poisson de vanc+poliABGs.

[223] Objetivo 2. Definir o perfil de liberação da droga e determinar a eficácia da droga após a liberação de ABGs impregnados.

[224] A cinética (parâmetro de liberação rápida, meia-vida) de liberação de vancomicina de vanc+poliABGs será medida por meio de detecção baseada em HPLC. Para medir a eficácia da vancomicina após a liberação de vanc+poliABGs, o teste de sensibilidade à difusão em disco de Kirby-Bauer contra S.aureus sensível à vancomicina será usado. Tais estudos permitirão observar a liberação da droga, igual ou superior à concentração inibitória mínima para S.aureus (1 µg/mL), após 20 dias. Além disso, esses estudos irão medir o efeito na cinética de liberação de drogas de diferentes tipos de hidrogel (gelatina, seda) e concentrações.

[225] Objetivo 3. Caracterizar a bioatividade celular de ABGs impregnados.

[226] A bioatividade de vanc+poliABGs será determinada semeando-os com fibroblastos dérmicos humanos primários e medindo a viabilidade celular, proliferação e apoptose. Tais estudos permitirão a validação da biocompatibilidade de ABGs impregnados, mostrando populações de células que são >80% viáveis, >50% proliferativas e <1% apoptóticas.

[227] Juntos, esses estudos irão validar a abordagem impregnada com polímero. Em última análise, o objetivo é melhorar os resultados clínicos reduzindo complicações que surgem de infecções relacionadas à cirurgia ABG. Dotando ABGs com propriedades terapêuticas irá transformar os campos da cirurgia reconstrutiva e cicatrização de feridas.

SIGNIFICADO

[228] Enxertos sintéticos e derivados biologicamente são usados em uma ampla variedade de procedimentos cirúrgicos. Os enxertos de origem biológica são materiais (pele, tendões, enxertos ósseos, etc.) retirados de doadores. Esses enxertos derivados biologicamente podem ser autoenxertos, aloenxertos ou xenoenxertos e podem ser celulares (CBGs) ou acelulares (ABGs). Os CBGs retêm as células nativas do doador e o DNA e geralmente são esterilizados para minimizar o risco de infecção. CBGs são muito semelhantes em estrutura e função aos tecidos do hospedeiro que estão substituindo, mas os CBGs sofrem de graves limitações, uma consequência da contenção de células, como a necessidade de correspondência doador/receptor e extensa imunossupressão para prevenir a rejeição, bem como suprimento de sangue adequado imediato para prevenir infecção e necrose.

[229] Enxertos acelulares derivados biologicamente (ABGs) foram criados para tratar de rejeição de CBG, infecção e problemas de necrose7, 22, 23. Os métodos de descelularização removem as células doadoras e o DNA dos CBGs, deixando apenas a matriz extracelular nativa rica em proteínas (ECM). ABGs atendem a critérios bem estabelecidos para concentração de DNA24, 25e tamanho de fragmento que se mostrou não imunogênico e, portanto, elimina o risco de rejeição imunológica, necessidade de correspondência doador/receptor e tratamento com imunossupressão anti-rejeição do medicamento. Uma vez que os ABGs são desprovidos de células, eles não requerem um suprimento de sangue imediato para prevenir a necrose.

[230] ABGs são rotineiramente usados para reparo de hérnia, reconstrução de mama e gerenciamento de feridas (queimaduras, úlceras diabéticas)1, 2, 13-15. Estima-se que 350.000 reparos de hérnia ventral são realizados anualmente nos Estados Unidos com enxertos sintéticos ou ABGs26, 27. Como os ABGs estão associados a taxas mais baixas de infecção e, devido às taxas de cicatrização mais rápidas, são menos propensos a exigir a remoção do que os enxertos sintéticos, os ABGs são mais comumente usados na correção de hérnias27-32. Além disso, os enxertos sintéticos têm sido bastante litigados, principalmente para uso na correção de hérnias do assoalho pélvico e ventral 33-39. A reconstrução da mama é responsável pelo uso clínico significativo de ABGs; aproximadamente 75.000 mulheres têm reconstruções da mama utilizando ABGs anualmente40-42. ABGs também são amplamente utilizados no tratamento e reparo de feridas. Feridas crônicas, que incluem úlceras vasculares (úlceras venosas e arteriais), úlceras diabéticas e úlceras de pressão, afetam cerca de 4,5 milhões de pessoas nos EUA43. ABGs aumentam significativamente a probabilidade de cicatrização bem-sucedida de feridas em úlceras de pé diabético44e queimaduras graves45, 46acima do padrão de tratamento. Os tempos médios de cicatrização de úlceras de pé diabético graves são reduzidos pela metade com ABGs (40 dias) em comparação com o tratamento convencional (77 dias)47, 48.

[231] Apesar de suas inúmeras vantagens e uso difundido, meta- análises em grandes estudos clínicos para ABGs em reparo de hérnia e reconstrução de mama mostram ABGs têm taxas de complicação relativamente altas de 10-23%3-7, que são atribuídas principalmente à infecção (celulite), formação de seroma, falha mecânica e necrose8-14. Análises mais detalhadas em falhas de ABG mostram vascularização reduzida, integridade mecânica pobre, falha de integração (resultando em cicatrizes) e rejeição imunológica18, 49-53. Além disso, a infecção é a complicação pós-operatória mais comum com ABGs54. Os sítios cirúrgicos são altamente suscetíveis à colonização por bactérias patogênicas, como Staphylococcus aureus (S.aureus); portanto, o uso de administração local e sistêmica de antibióticos é frequentemente prescrito para os pacientes no pós-operatório. No entanto, esses antibióticos não são totalmente eficazes devido às limitações dos métodos de administração (por exemplo, metabolismo da droga, distribuição ineficiente no sítio relevante, etc.). As reparações de hérnia abdominal mostraram taxas de infecção de 25% que são quase tão altas quanto a taxa de recorrência de hérnia de 27%55. Estudos clínicos usando ABGs para reconstrução de mama mostraram uma taxa de infecção reduzida em comparação com reparos de hérnia, mas uma taxa que ainda é prevalente em 6,9%41. Essas complicações resultam em falha do enxerto e requerem cirurgia repetida, aumentando o risco de complicações adicionais para o paciente e aumentando o custo. Soluções aprimoradas são necessárias para combater essa necessidade médica significativa não atendida.

[232] O enxerto ideal é biocompatível e resistente à infecção, trombose, necrose e falha mecânica. As modalidades deste documento compreendem um ABG dérmico impregnado com polímeros biodegradáveis, biocompatíveis e carregados com droga (droga+poliABG) que prontamente formam redes de hidrogel para permitir a liberação sustentada e local de agentes terapêuticos da droga+poliABG. Sem desejar limitar-se pela teoria, antibióticos que distribuem droga + poliABGs, analgésicos e/ou agentes anti- inflamatórios abordarão problemas com infecção, dor e respostas hiperinflamatórias do hospedeiro, respectivamente, aumentando assim a aceitação do enxerto e a integração do hospedeiro, diminuindo a probabilidade de complicações e melhorando o gerenciamento da dor do paciente, a cura e o tempo de recuperação do paciente. Além disso, os polímeros impregnados podem aumentar as propriedades mecânicas de droga + poliABGs, nomeadamente elasticidade e resistência à tração.

[233] As modalidades descritas neste documento abordarão a necessidade médica significativa não atendida de complicações ABG para melhorar os resultados clínicos para os 7,5 milhões de americanos tratados com ABGs a cada ano15.

[234] Rigor da pesquisa anterior: ABGs podem ser impregnados com polímeros carregados de droga para aplicações terapêuticas, um conceito novo que ainda não foi realizado. ABGs são aprovados pela FDA e têm sido usados em cirurgias reconstrutivas por mais de 30 anos26-32, 41-47, 56. Os estudos de validação usarão polímeros de gelatina e fibroína de seda. Gelatina e fibroína de seda têm sido amplamente utilizadas em aplicações biomédicas, particularmente para distribuição de drogas à base de hidrogel57-65. Ambos os polímeros são geralmente considerados seguros (GRAS) pelo FDA, não imunogênicos, biocompatíveis e promovem a adesão e proliferação celular66; eles possuem formas monoméricas relativamente pequenas e simples, são derivados biologicamente e se reticulam rapidamente por meio de mecanismos químicos (pH, álcool) e físicos (temperatura, sonicação). A fibroína de seda também é bem conhecida por sua resiliência mecânica61, 67, 68.

INOVAÇÃO:

[235] As modalidades neste documento compreendem uma técnica de impregnação que se baseia no deslocamento acionado pela força de solventes voláteis, forçando polímeros e drogas da solução de banho circundante para os vazios densos e limitados por difusão dos ABGs para criar droga + poliABGs (FIG. 19). Os princípios dessa técnica não destrutiva são semelhantes aos usados em processos industriais de fortalecimento de materiais porosos e têm sido usados na preservação de tecidos e cadáveres inteiros para fins didáticos69-72. Esta abordagem é nova, já que a impregnação de ABGs com polímeros para aplicações terapêuticas não foi realizada antes.

[236] Enxertos embutidos de polímero foram descritos anteriormente73; no entanto, essas são frequentemente redes de hidrogel e suportes impressos em 3D compostos de misturas de polímero único, em oposição a ABGs de ocorrência natural73. Sem desejar limitar-se pela teoria, ABGs não foram usados anteriormente para sistemas de administração de drogas à base de hidrogel devido à natureza limitada de difusão da ECM. A abordagem inovadora supera esse problema e direciona os polímeros para o ECM denso e nativo do ABG, permitindo que os polímeros permeiem o interstício do tecido (consulte os dados neste documento). Ao contrário dos enxertos incorporados em polímero que tentam recriar ECM, a abordagem poliABG utiliza ECM real, aproveitando sua complexidade morfológica natural e propriedades receptivas às células. A FIG. 20 demonstra os pontos fortes de droga + poliABG versus opções atuais.

ESTRUTURA:

[237] As etapas principais envolvidas na criação de drogas + poliABGs compreendem 1) descelularização do tecido doador, 2) impregnação por força de polímeros naturais formadores de hidrogel e 3) liberação de drogas à base de hidrogel da droga + poliABGs.

[238] 1) Descelularização: As abordagens de descelularização são otimizadas para tecido específico e preservam em grande parte a composição, estrutura e complexidade mecânica de ECM. As técnicas de descelularização para a regeneração de órgãos inteiros do pulmão em modelos de ratos e primatas não humanos (NHP) foram previamente otimizadas74,75, e empregaram com sucesso essas abordagens na pele humana para criar ABGs dérmicos humanos24. O processo de descelularização atende a critérios amplamente aceitos para a geração de tecido acelular não imunogênico pós-descelularização24, 25. Por exemplo, o método de descelularização pode compreender aquele descrito em US 2018/0015204, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade. O processo de descelularização na derme do NHP para a retenção de componentes de ECM colágeno, glicosaminoglicanos (GAGs), laminina, fibronectina e elastina foi caracterizado24. A preservação dessas moléculas em níveis semelhantes aos da derme intacta também foi confirmada. Os níveis de componentes de ECM retidos da derme NHP descelularizada são semelhantes aos dados de outro tecido epitelial, como pulmão de macaco rhesus e rato, e pele de porco77-80. Além disso, a derme NHP descelularizada suporta proliferação celular (> 65%), migração celular e não induz apoptose (<1,5%) de forma significativa24. Por último, os experimentos in vivo em NHPs com os ABGs dérmicos humanos descelularizados foram concluídos. Esses ABGs suportam a re- epitelização e neovascularização, mostrando cobertura epitelial quase completa em 6 semanas após o enxerto (91,4 ± 8,6% de cobertura, n = 6 ABGs). A formação neovascular, medida por PECAM1 + lúmens de vasos, ocorreu dentro desses ABGs logo em 1 semana após o enxerto, com formação de vasos mais maduros, bem como maior presença de vasos, ocorrendo ao longo do tempo. Esses dados demonstram que o processo de descelularização é apropriadamente otimizado para a pele, criando um ABG dérmico que suporta a regeneração.

[239] 2) Impregnação de polímero:O conceito de impregnação de polímero neste documento pode compreender aqueles de processos industriais para fortificar materiais porosos, como madeira, e plastinação para preservar tecidos e organismos inteiros69-72. Ambas as aplicações envolvem a substituição de água de amostras por solventes orgânicos com altas pressões de vapor. Após a aplicação de vácuo, o solvente dentro da amostra se torna volátil e sofre uma transição de fase de líquido para gás. Esta transição de solvente e evacuação resultante da amostra cria uma pressão negativa dentro da amostra que força soluções de banho, como polímeros e drogas, para o material. Essa técnica tem sido usada em aplicações industriais com uma variedade de substâncias de vários tamanhos e cargas moleculares81-85.

[240] A abordagem e a aplicação neste documento difere dos usos anteriores de impregnação de polímero em várias áreas principais. Em primeiro lugar, o pedido é para a geração de um sistema de distribuição de drogas à base de hidrogel para fins terapêuticos. Isso difere enormemente dos usos anteriores de impregnação de polímero, que eram usados exclusivamente para fortificação e preservação de materiais. Em segundo lugar, as modalidades neste documento estão impregnando biomateriais com polímeros naturais biocompatíveis. Isso difere muito dos usos anteriores de impregnação de polímero, em que polímeros como adesivos, resinas e ligas são usados. Por último, o material da amostra é um ABG, não um tecido cadavérico fixo ou material feito pelo homem. Como os materiais da amostra são diferentes, as condições para a impregnação do polímero também variam. As condições de impregnação de polímero foram amplamente otimizadas para serem adequadas para ABGs dérmicos. As condições de impregnação estabelecidas para tecido fixo e intacto não resultam na impregnação de tecido acelular.

[241] 3) Distribuição de drogas à base de hidrogel: Os polímeros biodegradáveis naturais têm sido usados há muito tempo em sistemas de distribuição de drogas (DDS) como carreadores86. Eles podem formar redes de hidrogel que permitem a liberação controlada de drogas hidrofóbicas e hidrofílicas em doses constantes durante longos períodos86. Suas propriedades biodegradáveis permitem o desaparecimento gradual, eliminando a remoção do próprio portador do medicamento. O hidrogel natural DDS é totalmente ajustável, permitindo o controle do tamanho dos poros da rede. Isto é importante uma vez que os poros do hidrogel irão aprisionar a droga e, dependendo da natureza da droga, o tamanho dos poros pode ser ajustado para aprisionar fisicamente pequenos versus grandes agentes terapêuticos. Gelatina e fibroína de seda, por exemplo, podem ser utilizadas em estudos de validação, uma vez que são polímeros naturais bem estabelecidos que são passíveis de carregamento e liberação de drogas57-65. Conhecimento e métodos de distribuição de drogas e distribuição de drogas à base de hidrogel serão utilizados para permitir a liberação prolongada de drogas de um ABG ao longo do tempo. Polímeros biodegradáveis usados para encapsular e liberar fatores de crescimento de maneira controlada e prolongada já foram mostrados87. Este estudo usou um novo construto de alginato como um arcabouço de tecido multifuncional para o reparo do sistema nervoso central que entregou um fator neurotrófico derivado do cérebro (Neurotrofina-3)87. No programa de drogas + poliABG, serão usados métodos semelhantes para aprisionar fisicamente a vancomicina em hidrogéis de gelatina e fibroína de seda.

[242] A distribuição localizada da droga é mais adequada para infecções do sítio cirúrgico, pois fornece uma dose terapêutica mais elevada no local relevante de ação da droga, evita o metabolismo da droga e reduz os efeitos fora do alvo. Um ABG DDS à base de hidrogel fornecerá liberação local prolongada, permitindo a administração de baixa dose, direcionada e não sistêmica para infecções de sítio cirúrgico.

DADOS PRELIMINARES:

[243] Demonstrou-se que vários polímeros naturais funcionaram como DDS57-61, 86-94. Os estudos de validação se concentraram na gelatina e na fibroína de seda, uma vez que ambas foram amplamente estudadas para uso na distribuição de drogas57-65. Através da abordagem de impregnação de polímero descrita neste documento, redes de hidrogel dentro de ABGs foram geradas. Estudos identificaram condições de impregnação que levam à impregnação de polímero bem- sucedida dentro de ABGs dérmicos, permitindo uma impregnação leve a quase completa dos espaços intersticiais. Esses estudos foram realizados em grande parte com polímeros naturais e, em menor grau, polímeros sintéticos.Dados preliminares de polímeros naturais e sintéticos demonstram consistentemente que a impregnação de polímero por meio do deslocamento acionado por força de uma solução volátil do ABG supera amplamente a difusão sozinha. A difusão baseada na gravidade de soluções poliméricas penetrará centenas de mícrons no enxerto, ocupando exclusivamente o perímetro do enxerto, enquanto a impregnação acionada por força levará à ocupação do polímero por todo o enxerto, com profundidades de penetração na casa dos vários milímetros (FIG. 21). Esses dados apontam para as propriedades limitadas por difusão natural do ABG dérmico e como a abordagem de impregnação de polímero supera essa limitação. Esses estudos de validação demonstram a capacidade de gerar hidrogéis de gelatina e fibroína de seda dentro de ABGs.

ABORDAGEM:

[244] Polímeros de gelatina e fibroína de seda serão usados para aprisionar fisicamente a vancomicina dentro de um ABG dérmico. A vancomicina foi escolhida como droga modelo por ser altamente eficaz contra bactérias Gram-positivas patogênicas comuns em infecções cirúrgicas, como S. aureus, Clostridium difficile e Staphylococcus epidermidis20, 21. A vancomicina continua sendo uma droga de escolha para o tratamento de infecções graves por S. aureus resistentes à meticilina20. Embora existam cepas de S. aureus com resistência completa à vancomicina (concentração inibitória mínima = 16 µg/mL), elas são relativamente raras (total de 14 casos nos EUA)20.

[245] Objetivo 1. Caracterizar a impregnação ABG com misturas de vancomicina-polímero.

[246] Este objetivo aborda a capacidade de impregnar ABGs com gelatina e misturas de polímero de fibroína de seda/vancomicina. Diferentes concentrações de polímero serão testadas, pois essa propriedade controla bastante o tamanho do poro do hidrogele19; o tamanho do poro do hidrogel controla a difusividade dos agentes fisicamente aprisionados, especificamente a concentração de liberação e o comprimento de difusão. Assim, espera-se que a cinética de liberação de vancomicina difira com a concentração de polímero, mostrando maior liberação de explosão e menor comprimento de liberação com menor concentração versus maior concentração de polímero. Como os polímeros que possuem propriedades mecânicas mensuráveis estão sendo usados, particularmente no caso da fibrina de seda, as propriedades de tração serão medidas para determinar como esses polímeros afetam as propriedades mecânicas de ABG.

Abordagem de Validação:

[247] Geração de vanc + poliABGs. Uma ilustração desta abordagem é mostrada na FIG. 19 Resumidamente, a pele humana derivada de um doador é descelularizada usando o processo de patente pendente e cortada em retângulos de 1 x 3 cm com 0,4 cm de espessura e, em seguida, desidratada. Serão preparadas soluções de polímero separadas de gelatina e fibroína de seda com 7,5 mg/mL de vancomicina (a concentração é 10 vezes maior do que a concentração inibitória mínima para S. aureus e dentro da faixa não tóxica para os níveis séricos de sangue95). Duas concentrações de cada polímero serão testadas: 5% e 20% p/v para gelatina e 1% e 5% p/v para fibroína de seda. O ABG desidratado será saturado em um solvente orgânico e incubado com misturas de polímero e droga e então impregnado à força usando o processo descrito neste documento. O vanc + poliABG será lavado e fixado em condições de polimerização para gelatina e fibroína de seda (gelatina: 4°C, metanol; fibroína de seda: 37°C, etanol). Essas condições não afetam adversamente a solubilidade ou a atividade da vancomicina96. Os controles incluirão ABG sozinho e poliABG sem vancomicina. Um total de 27 amostras (2 polímeros, 2 concentrações, 2 controles/condição, controle sozinho ABG, n = 3) será analisado. As amostras serão analisadas por histologia com hematoxilina e eosina (H&E) [gelatina] e azul de alcian [fibroína de seda].

[248] Medição da ocupação e distribuição do polímero dentro de vanc + poliABG. A ocupação do polímero será quantificada - área de sinal do polímero (medida por manchas histológicas)/área total de ABG. Esta medida mostra a eficiência da impregnação do polímero e é importante para as características de distribuição da droga. A análise de imagem com ferramentas de análise de segmentação e limiar de canal (ImageJ) será usada. A distribuição da ocupação normalizada do polímero será analisada -% da área do polímero/% da área vazia antes da impregnação - em todos os ABGs para desvio da média. A normalização é usada porque, sem desejar limitar-se pela teoria, a quantidade de polímero que entra em uma região do ABG está diretamente relacionada à quantidade de espaço vazio que existia antes da impregnação. As análises estatísticas entre as condições de impregnação do polímero e as interações das condições serão realizadas com uma ANOVA de duas vias (a = 0,05).

[249] Medição das propriedades mecânicas de vanc+poliABGs. Será realizado o teste de tração uniaxial em um analisador de microdeformações (TSA Instruments) de acordo com ASTM D63897. Estresse: perfis de deformação para ABGs serão gerados e o módulo de Young, resistência à tração e coeficiente de Poisson serão caracterizados. Um total de n = 15 repetições/condição de ABG será analisado. Os controles incluirão ABG sozinho e poliABG sem vancomicina. Um total de 135 amostras (2 polímeros, 2 concentrações, 2 controles/condição, controle sozinho ABG, n = 15) será analisado. As diferenças nas medidas das propriedades mecânicas serão analisadas com ANOVA de um fator (a = 0,05). Resultados:

[250] Sem desejar limitar-se pela teoria, ocupação de polímero > 5% de área de vanc+poliABG e distribuição de polímero de modo que a ocupação normalizada de polímero seja ± 40% da média. Como a pele é estratificada, a densidade da ECM não é uniforme em sua espessura. Assim, a variabilidade da distribuição do hidrogel ao longo da espessura dos vanc+poliABGs pode ocorrer. Os valores previstos são baseados em simulações de Monte Carlo. A impregnação de polímero deve afetar as propriedades mecânicas gerais do ABG; a extensão dessa influência é desconhecida. Nesses valores mínimos de ocupação e distribuição de polímero, vanc+poliABGs contendo fibroína de seda - mas não aqueles contendo gelatina - devem ter propriedades mecânicas alteradas significativamente, mostrando especificamente aumentos no módulo de Young, resistência à tração e coeficiente de Poisson. O vanc+poliABG ideal terá um módulo de Young e resistência à tração maior do que os tradicionais ABGs87, 98-102dérmicos comercialmente disponíveis.

[251] Objetivo 2. Definir o perfil de liberação da droga e determinar a eficácia da droga após a liberação de ABGs impregnados.

[252] Este objetivo valida se vanc+poliABGs irão liberar vancomicina de uma maneira que afeta a sobrevivência de S. aureus. Este objetivo validará a liberação e a atividade da droga de vanc+poliABGs. Medir a cinética de liberação do medicamento é essencial para determinar se o potencial terapêutico pode ser esperado, com base na concentração, duração e perfil de liberação do medicamento (ou seja, contínua versus pulsátil). Esses perfis mostrarão se as propriedades de liberação do medicamento diferem com o tipo e a concentração do polímero. A eficácia do medicamento após a liberação será medida contra S. aureus sensível à vancomicina para demonstrar o efeito terapêutico potencial. O S. aureus foi escolhido por ser comum em infecções cirúrgicas. A vancomicina é um tratamento eficaz para S. aureus. Uma vez que a liberação da droga por si só não implica a atividade da droga, particularmente ao longo do tempo, este ensaio fornece uma saída funcional para a atividade da droga e uma abordagem quantitativa para medir Suscetibilidade de S. aureus. O Objetivo 2 validará vanc+poliABGs gerados nas condições identificadas no Objetivo 1 que atendam aos limites de ocupação e distribuição de polímero identificados.

[253] Abordagem de validação: A cinética de liberação de droga (parâmetro de liberação rápida, meia-vida) de vanc+poliABG (gerado através da mesma abordagem no Objetivo 1) será medida usando uma célula de difusão vertical de 6 amostras (Teledyne Hanson Research) e detecção com base em HPLC103. A célula de difusão vertical é comumente usada para estudos de absorção percutânea de sistemas de liberação de drogas dérmicos e transdérmicos104. As amostras de ABG serão colocadas contra uma membrana porosa em um banho de soro fisiológico. A droga liberada passará através da membrana para o meio receptor ao longo do tempo. As amostras serão coletadas em 0, 1, 3, 10, 100 (4 d), 300 (13 d) e 500 horas (21 d) para cada ABG. As amostras de liberação do medicamento coletadas serão analisadas via HPLC103 (Agilent 1220). HPLC é o método mais sensível e comum para identificação de vancomicina e determinação de pureza105-107. Os controles incluirão ABG sozinho, poliABG sem vancomicina e ABG saturado com vancomicina (sem polímero). Um total de 210 amostras (2 polímeros, 2 concentrações, 2 controles/condição, ABG + vanc (sem polímero), ABG sozinho, 7 pontos de tempo, n = 3) serão executados para o trabalho de cinética da droga. Estatísticas descritivas serão compiladas para cada vanc+poliABG. Para medir a eficácia da vancomicina, o teste de sensibilidade à difusão em disco de Kirby-Bauer será usado de acordo com a técnica padrão com S. aureus (ATCC 29213)108. A eficácia da droga é medida como zona de inibição (ZOI) - área na qual o organismo de desafio não cresce. Neste ensaio, as amostras de meio receptor da célula de difusão vertical serão manchadas em wafers e colocadas em placas de cultura de S. aureus confluentes por 18 horas. Amostras do meio receptor coletadas em 0, 1, 3, 10, 100 (4 d), 300 (13 d) e 500 horas (21 d) para cada ABG serão testadas. Os controles incluem ABG sozinho e poliABG sem vancomicina. Um total de 252 amostras (2 polímeros, 2 concentrações, 2 controles/condição, 7 pontos de tempo, n = 3) será executado. Além disso, um wafer carregado de vancomicina de 75 µg/mL será um controle positivo. O ZOI será fotografado e medido usando ImageJ para cada ponto de tempo. Se ocorrer resistência a antibióticos, os dados podem ser não gaussianos. Os estudos usarão uma ANOVA unilateral não paramétrica de Kruskal-Wallis por classificações (a = 0,05) para analisar esses dados, uma vez que esse teste não faz suposições sobre a normalidade dos dados.

[254] Resultados: Sem desejar limitar-se pela teoria, a vancomicina liberada do vanc+poliABGs será detectada após 20 dias, em concentrações eficazes em ou excedendo os níveis letais para S. aureus. Nesse caso, nenhum crescimento de S. aureus é esperado. O ZOI diminuirá com o tempo, à medida que menos vancomicina é liberada de vanc+poliABGs. O ensaio deve ter um limite de quantificação de ZOI inferior de 50 µg/mL de vancomicina109. Dadas as diferenças nas taxas de degradação do hidrogel de polímero, a gelatina deve liberar vancomicina mais rápido do que a fibroína de seda.

[255] Objetivo 3. Caracterizar a bioatividade celular de ABGs impregnados.

[256] Este objetivo valida que um vanc+poliABG é bioativo, dá suporte a viabilidade e proliferação celular e não irá induzir apoptose. Todas as concentrações de polímero do Objetivo 1 serão testadas no Objetivo 3. A bioatividade de vanc + poliABGs será determinada medindo as atividades celulares em fibroblastos dérmicos primários humanos adultos normais (HDFa) cultivados na presença de vanc + poliABGs. As células HFDa são células aderentes originalmente isoladas da derme adulta, semelhantes às ABGs e requerem interação célula-substrato para a sobrevivência. Viabilidade celular, proliferação e apoptose são métricas robustas comumente usadas para avaliar os efeitos citotóxicos e, portanto, são apropriadas para cumprir este objetivo. Esses experimentos fornecerão evidências mensuráveis da presença ou ausência de citotoxicidade devido à liberação de vancomicina (concentração e duração) e/ou a presença dos próprios poliABGs.

[257] Abordagem de Validação: Carregar vanc+poliABGs (círculos de 1 cm de diâmetro) em placas de 48 poços. Os controles incluirão ABG sozinho, poliABG sem vancomicina e ABG saturado com vancomicina (sem polímero). Um total de 100 amostras (2 polímeros, 2 concentrações, 2 controles/condição, ABG + vanc (sem polímero), apenas ABG, 2 pontos de tempo, n = 5) serão analisados. As células HDFa (ATCC, PCS-201-012) serão semeadas em ABGs (5 x 104 células/ABG) e cultivadas por 1 e 2 semanas. A viabilidade celular será medida via coloração com calceína-AM e homodímero-1 de etídio (ensaio LIVE/DEAD, Thermo). A proliferação celular será medida por meio de imunomarcação Ki-67 (anti-Ki67, Sinalização Celular) e incorporação de EdU (ensaio Click-iT EdU, Invitrogen). A apoptose será medida com o ensaio TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Roche) com controles positivos e negativos apropriados do kit24, 77. Todas as amostras para cada ensaio serão fotografadas em um microscópio fluorescente de campo amplo, pois cada saída é fluorescente. As medições serão feitas em 5 campos de visão aleatórios/ABG para cada ensaio e fundo subtraído. O software ImageJ será usado para quantificação de imagens. A análise estatística será ANOVA One-way (a = 0,05) com o teste postthoc de Tukey.

[258] Resultados: Ensaios semelhantes foram realizados com células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea de macaco Rhesus24e esperam resultados semelhantes neste objetivo: > 80% de viabilidade celular, > 50% de células proliferativas e < 1% de células apoptóticas. Desenvolvimento de PoliABG.

[259] Um novo medicamento + poliABG pode abordar as limitações de enxertos clinicamente disponíveis: infecções, cicatrizes, integridade mecânica deficiente e integração deficiente do hospedeiro. Os estudos subsequentes podem envolver outras infecções clinicamente relevantes, incluindo S. aureus resistente à meticilina (MRSA). REFERÊNCIAS CITADAS NESTE EXEMPLO 1. Jeffcoate WJ, Vileikyte L, Boyko EJ, Armstrong DG, Boulton AJM. Current Challenges and Opportunities in the Prevention and Management of Diabetic Foot Ulcers. Diabetes Care. 2018;41(4):645-52. 2. Scarritt ME, Pashos NC, Bunnell BA. A review of cellularization strategies for tissue engineering of whole organs. Front Bioeng Biotechnol. 2015; 3: 43. 3. Kim JY, Davila AA, Persing S, Connor CM, Jovanovic B, Khan SA, Fine N, Rawlani V. A meta-analysisof human acellular dermis and submuscular tissue expander breast reconstruction. Plast ReconstrSurg. 2012;129(1):28-41. 4. Ho G, Nguyen TJ, Shahabi A, Hwang BH, Chan LS, Wong AK. 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EXEMPLO 6

[260] Este Exemplo desenvolve um método de impregnação de polímero, com base na plastinação de tecido, para gerar um enxerto biológico acelular de próxima geração. Até o momento, a plastinação não tem sido usada com o propósito de impregnar enxertos biológicos acelulares com polímeros para uso in vivo em qualquer aplicação terapêutica.

[261] Para melhorar os resultados clínicos para procedimentos POP que usam enxertos biológicos acelulares ou malhas sintéticas, os inventores irão impregnar um enxerto biológico acelular com polímeros biodegradáveis que podem aumentar as propriedades mecânicas do enxerto e fornecer administração de droga local e prolongada. Este método irá incorporar o polímero ao ambiente tridimensional natural do tecido acelular, que retém a matriz extracelular, incluindo fibras de colágeno alinhadas naturalmente, que comprovadamente suportam a recelularização e cicatrização de feridas. A criação de um enxerto biológico acelular impregnado com polímero bioativo requer descelularização completa do tecido do doador, encapsulação física de antibióticos e agentes anti-inflamatórios em um polímero biodegradável e impregnação da pele descelularizada com o polímero carregado com a droga. Anteriormente, o grupo descelularizou com sucesso uma variedade de tecidos (pulmão, tumores, tecido adiposo, complexos areolopapilar), incluindo a pele. Neste exemplo, os inventores irão desenvolver um novo método de impregnação de polímero e caracterizar as propriedades mecânicas e a bioatividade celular desses enxertos. Além disso, os inventores irão encapsular compostos com estes polímeros biodegradáveis, antes da impregnação do enxerto. Isso permitirá que o enxerto libere a droga de maneira prolongada nos locais de enxerto/cirurgia.

[262] Impactos mais amplos: POP é uma área de necessidade médica significativa não atendida, dados os efeitos negativos do POP não tratado e os riscos envolvidos nos tratamentos cirúrgicos POP. Em todo o mundo, as mulheres têm um risco vitalício de 33-50% de desenvolver POP. Os usuários finais do produto são mulheres americanas com POP sintomático que buscam uma solução cirúrgica, por exemplo, cerca de 300.000 dessas cirurgias são realizadas a cada ano nos Estados Unidos. As opções cirúrgicas atuais para o tratamento de POP incluem malha sintética e implantes de enxerto biológico acelular. Malhas sintéticas apresentam riscos de segurança significativos e vários países proibiram seu uso. Os médicos indicaram que um enxerto biológico com maior segurança e eficácia do que as opções atuais seria completamente transformador e ganharia uso generalizado. Estima-se que o mercado anual total endereçável para enxertos impregnados com polímero para uso em cirurgias POP é $750 milhões.

[263] Prolapso de órgão pélvico (POP) é uma condição comum em mulheres causada pela perda de suporte do tecido do assoalho pélvico, fazendo com que os órgãos herniem no lúmen vaginal ou ânus. Os sintomas de POP, como incontinência, infecções frequentes do trato urinário, dificuldade para evacuar, sangramento, pressão e dor, podem ter impactos negativos significativos na saúde da mulher, na vida diária e na qualidade de vida, afetando especialmente a imagem corporal, as relações familiares e a saúde sexual1-3. POP afeta 33% a 50% de todas as mulheres4-6, afetando potencialmente mais de 1 bilhão de mulheres em todo o mundo7. Nos Estados Unidos, mais de 300.000 cirurgias de POP são realizadas anualmente para POP8 sintomático. As opções cirúrgicas para o tratamento de POP incluem implantes de malha sintética e enxertos biológicos acelulares (ABGs). As malhas sintéticas apresentam riscos de segurança significativos, incluindo infecção crônica, danos aos nervos e tecidos, laceração genital e outros8-13. ABGs atuais têm menos complicações, geralmente menos graves do que as malhas sintéticas, mas têm taxas de recorrência mais altas e podem ter complicações, incluindo infecção, falha mecânica do enxerto e falha de integração do hospedeiro14-22. Apesar das complicações dos produtos atuais disponíveis comercialmente para POP, os cirurgiões ainda apoiam seu uso porque as malhas sintéticas e ABGs têm taxas de cura mais altas do que os métodos cirúrgicos de tecidos nativos tradicionais, que falham em 2 anos para 40% das mulheres23- 25. Dados os efeitos negativos do POP não tratado e os riscos envolvidos no tratamento cirúrgico do POP, o POP representa uma área de significativa necessidade médica não atendida que está desesperada por uma solução segura e eficaz. os clientes-alvo incluem uroginecologistas e outros médicos que tomam decisões.

[264] Os inventores estão desenvolvendo um novo tipo de ABG para cirurgias POP. Esse enxerto terá propriedades mecânicas aprimoradas e servirá como veículo para a administração de medicamentos, como analgésicos, antibióticos e anti-infecciosos. Esse enxerto atenderá às necessidades médicas não atendidas do POP, pois deve ser um produto mais seguro e eficaz do que as malhas sintéticas e ABGs atualmente no mercado. Um método de descelularização 26 está sendo combinado com uma nova abordagem de impregnação de polímero bioativo com base na plastinação de tecido 27 para criar um ABG aprimorado com polímero. Até o momento, a plastinação não tem sido usada com o propósito de impregnar ABGs com polímeros para uso in vivo em qualquer aplicação terapêutica.

[265] As abordagens de manipulação de tecidos permitem o desenvolvimento de substitutos biológicos que podem substituir ou restaurar os tecidos naturais. Especificamente, serão usados polímeros naturais biodegradáveis projetados para liberar compostos antibióticos, analgésicos ou anti-inflamatórios, para prevenir falha mecânica ou imunológica de um ABG. Os polímeros irão melhorar as propriedades mecânicas do ABG, nomeadamente elasticidade e resistência à tração, permitindo-lhe ser mais durável do que um ABG não impregnado e, assim, evitar a falha do enxerto devido a forças mecânicas perturbadoras. Esses mesmos polímeros podem encapsular drogas para liberação local dentro do sítio cirúrgico do enxerto. A liberação de compostos antibióticos pode compensar a infecção de bactérias oportunistas, melhorando a cura e o tempo de recuperação do paciente. A liberação de compostos analgésicos e anti-inflamatórios pode diminuir a dor e a hiperinflamação local, melhorando o controle da dor do paciente e aumentando a probabilidade de aceitação do enxerto e integração do hospedeiro.

[266] Neste documento, os inventores discutem o desenvolvimento do método de impregnação de polímero inspirado por plastinação. Em seguida, serão analisadas as propriedades físicas, mecânicas e bioativas dos ABGs impregnados com polímeros.

[267] POP afeta 33% a 50% de todas as mulheres4-6, afetando potencialmente mais de 1 bilhão de mulheres em todo o mundo7. POP vaginal tem um impacto negativo significativo na saúde da mulher, vida diária e qualidade de vida, especialmente impactando a imagem corporal, relações familiares e saúde sexual1-3. Entre 3% e 11% de todas as mulheres têm POP sintomático grave4, 6, 28. Isso é aproximadamente 3,5 - 12,8 milhões de mulheres apenas nos EUA29. POP tem opções de tratamento não cirúrgico e cirúrgico para reparo do assoalho pélvico. As opções não cirúrgicas (exercícios de Kegel, pessários de plástico, etc.) têm eficácia limitada para pacientes com POP grave. As opções cirúrgicas incluem o uso de tecido nativo, malhas sintéticas e ABGs. Mais de 40% das cirurgias vaginais POP usando tecido nativo irão falhar dentro de dois anos24, 25. Malhas sintéticas foram criadas em resposta às altas taxas de falha encontradas em reparos de tecidos nativos13, 30. Geralmente são feitas de polipropileno não absorvível8. Os ABGs foram desenvolvidos como uma alternativa às malhas de polipropileno30. Os ABGs são derivados naturalmente da matriz dérmica porcina ou bovina que se tornou acelular e não imunogênica por meio do processo de descelularização. Os ABGs são ideais porque retêm o microambiente nativo da matriz extracelular (ECM), que promove o repovoamento da célula hospedeira do enxerto e, assim, a integração completa do enxerto com o tecido do hospedeiro.

[268] As malhas sintéticas e ABGs atualmente disponíveis têm desvantagens. A malha sintética é o maior delito em massa desde o amianto, com base no número de processos (as mulheres entraram com mais de 104.000 processos no tribunal federal dos EUA31). Vários processos importantes foram movidos sobre o uso de malhas sintéticas em cirurgias POP, com mulheres sofrendo efeitos colaterais graves, incluindo morte, infecção crônica (por exemplo, sepse), sangramento, danos em nervos e tecidos, órgãos perfurados, cicatrizes vaginais, laceração genital, dor durante o sexo, dor abdominal crônica e sofrimento psicológico que acompanha esses efeitos colaterais físicos 9, 13. Um inquérito do senado australiano, em consulta com o Conselho Médico da Austrália, determinou que o uso de malha vaginal para POP causou “agonia e dor históricas” que tiveram um “impacto devastador” na saúde, carreira e relacionamentos das mulheres 9, 10, 32. Em um caso importante nos Estados Unidos em março de 2018, a subsidiária Ethicon da Johnson & Johnson perdeu uma ação judicial de US $ 35 milhões por esconder falhas, lesões e taxas de complicações dos pacientes. O processo alegou que o produto de malha da Ethicon, Prolift, “causou ferimentos graves e irreversíveis, condições e danos a um número significativo de mulheres” 33. Algumas empresas optaram por um acordo fora do tribunal em vez de ir a julgamento público. A Endo International, Inc. teve um acordo de US $ 830 milhões em 2014 e um acordo adicional de US $ 400 milhões no mesmo ano 34. A Food and Drug Administration (FDA) emitiu uma Notificação de Saúde Pública em 2008 sobre os riscos do uso de malha vaginal sintética para POP12. Em 2011, o FDA determinou que eventos adversos graves associados à malha sintética em POP não são raros e divulgou uma atualização sobre a segurança e eficácia da tela. O FDA finalmente decidiu que a segurança da malha sintética para POP não é bem estabelecida. Em 2016, o FDA emitiu um pedido final reclassificando as malhas como dispositivos da Classe III, exigindo dados de ensaios clínicos mais extensos11. Em 2017, a Australian Therapeutic Goods Administration cancelou a aprovação de diversos tipos de malhas sintéticas em cirurgias POP, banindo efetivamente os produtos 35. O Instituto Nacional de Saúde e Excelência Clínica do Reino Unido emitiu uma declaração de orientação que atua como uma proibição de fato da malha vaginal em cirurgias POP 36. As malhas sintéticas são proibidas em todas as operações pélvicas na Nova Zelândia, não apenas na POP vaginal 36.

[269] ABGs têm menos complicações do que malhas sintéticas para POP 14; no entanto, eles têm seus próprios problemas. Cada ABG usado para POP até o momento mostrou taxas de recorrência mais altas do que as malhas sintéticas14. ABGs usados em outras indicações têm taxas de complicações de até 23%37-41. As complicações são variadas e incluem infecção, integridade mecânica deficiente e falha na integração15-22. Dado o risco de 33-50% ao longo da vida de desenvolver POP para mulheres, a incidência de 12% ao longo da vida de cirurgia POP para mulheres8, 28, 42-44, os efeitos negativos do POP não tratado e os riscos conhecidos envolvidos no tratamento cirúrgico POP, o POP representa uma área de significativa necessidade médica não atendida.

[270] Os inventores estão desenvolvendo um novo tipo de ABG para uso em cirurgias POP para mulheres com POP grave. Por meio de práticas de manipulação de tecidos, o ABG impregnado com polímero terá propriedades mecânicas aprimoradas e servirá como veículo para a distribuição de drogas como analgésicos, antibióticos e anti- infecciosos, para ajudar a diminuir complicações potenciais e melhorar a segurança e eficácia da cirurgia POP.

[271] Os inventores discutem neste documento o desenvolvimento de um novo ABG impregnado com polímero para uso em cirurgias graves de POP, que será significativamente mais seguro e eficaz do que as opções de tratamento existentes:

[272] Tecidos nativos: Algumas cirurgias POP transvaginais usam tecidos nativos do paciente. Os reparos de tecido nativo têm taxas desanimadoras de falha - 40% dos reparos de tecido nativo falham em 2 anos - e muitos cirurgiões preferem “reparos reforçados ou aumentados” usando as duas opções abaixo24, 25, 47-49.

[273] Implantes de malha sintética: As malhas sintéticas podem ser feitas de uma variedade de materiais, mais comumente polipropileno não absorvível8. Sérias preocupações sobre a segurança das telas vaginais sintéticas foram levantadas (ver discussão neste documento).

[274] ABGs: ABGs estão sendo explorados como alternativas mais seguras para malha30. Os médicos estão usando atualmente o enxerto de assoalho pélvico anterior Surgisis® BioDesignTM da Cook Medical e matriz do assoalho pélvico MatriStemTM da Acell, Inc.14. Os ABGs não apenas reparam o POP, mas também oferecem uma estrutura para a regeneração do tecido do paciente. Até o momento, todo ABG apresentou taxas de recorrência mais altas do que as malhas sintéticas, mas com menos complicações14.

[275] No POP, a vagina e os tecidos moles de suporte estão comprometidos tanto estrutural quanto funcionalmente, com esses tecidos apresentando músculo liso desorganizado e atrofiado e conteúdo alterado de colágeno e elastina30,55-59. Os médicos estão recorrendo aos ABGs como opções mais seguras para o reparo de POP em vez do uso de malhas sintéticas. ABGs são tecidos, como pele ou tendão, que são recuperados de um doador (humano ou animal) e processados para remover células e imunógenos. As proteínas da ECM (por exemplo, colágeno, elastina), que em grande parte constituem a arquitetura da maioria dos tecidos, são retidas durante a descelularização. Este processo gera essencialmente um enxerto tridimensional livre de células e DNA que é passível de repovoamento e remodelação da célula hospedeira durante o curso da cicatrização.

[276] O material cirúrgico não autólogo alvo é aquele que (1) fornece suporte estrutural, (2) promove o processo natural de cicatrização de feridas do corpo, (3) permite o crescimento interno e (4) integra-se totalmente com o tecido do hospedeiro no tempo - todas as características dos ABGs. Os ABGs são superiores aos enxertos sintéticos na medida em que preservam, ao invés de recriar, o microambiente da matriz nativa, retendo a composição única e complexa da matriz do tecido20, 60. A preservação dessas propriedades complexas promove o repovoamento eficiente e o restabelecimento funcional das células e do suprimento sanguíneo dentro dos ABGs, levando ao seu maior sucesso em relação aos enxertos sintéticos. Por mais de 30 anos, os ABGs têm sido usados em cirurgias para reconstrução da mama, reparo de hérnia abdominal, cicatrização de feridas por queimadura, reparo de uretra, reparo de tendão e úlcera diabética/reparo de ferida crônica61, 62. ABGs comercialmente disponíveis, como DermACELL e FlexHD são considerados clinicamente necessários para reconstruções da mama, reparos cirúrgicos abdominais e queimaduras, juntamente com outras indicações.

[277] Apesar das vantagens dos ABGs, há espaço significativo para melhorias nos ABGs para todas as indicações. Meta-análises em grandes estudos clínicos para uso de ABG em reconstruções da mama e reparos de hérnia mostram que os ABGs têm taxas de complicações relativamente altas, estimadas em 10-23%37-41. Complicações específicas em pacientes com gasometria arterial são mais comumente atribuídas a infecção (celulite), formação de seroma e necrose15, 16. Análises mais detalhadas em falhas de ABG mostram vascularização reduzida, integridade mecânica pobre, falha de integração (resultando em cicatrizes) e rejeição imunológica17-22.

[278] Para melhorar os resultados clínicos para procedimentos POP e desenvolver novos recursos de ABGs para aplicações mais amplas na medicina regenerativa, os inventores irão impregnar ABGs com polímeros biodegradáveis que podem fornecer propriedades mecânicas aprimoradas e liberação local e prolongada de drogas. Sem limitar-se pela teoria, a impregnação de polímero de um ABG por si só aumentará as propriedades mecânicas do enxerto, permitindo que seja mais durável do que um enxerto não impregnado e, assim, evitar a falha do enxerto devido a forças mecânicas. A infecção, geralmente resultado de bactérias oportunistas, poderia ser compensada através da liberação sustentada de antibiótico local do polímero, enquanto a adição de agentes anti-inflamatórios e analgésicos pode reduzir a inflamação local e diminuir a dor no sítio da cirurgia. Essas propriedades aditivas aumentarão a aceitação do enxerto e a integração do hospedeiro, diminuindo a probabilidade de complicações e facilitando a recuperação do paciente.

[279] Os inventores descrevem neste documento, neste exemplo, a adaptação de técnicas de plastinação de tecido63-66 para fortalecer ABGs e distribuição prolongada e localizada de drogas de ABGs. Enxertos embutidos de polímero foram descritos; no entanto, geralmente são uma combinação de polímeros sintéticos ou naturais e matrizes de colágeno fabricadas67; não ABGs de ocorrência natural. O método forçará os polímeros impregnados no ambiente tridimensional denso e nativo de um ABG, permitindo propriedades mecânicas aprimoradas do enxerto, enquanto retém a complexidade morfológica da ECM endógena. A manutenção da densidade natural da fibra de colágeno e do alinhamento dentro dos enxertos impregnados com polímero fornecerá ainda suporte para recelularização robusta e cicatrização de feridas 67, 68.

[280] Existem três aspectos principais para a impregnação de polímero de ABGs descritos neste documento: (1) descelularização de tecido intacto, (2) impregnação à base de plastinação de polímeros naturais e (3) liberação de droga de polímeros. Aqui, os inventores irão integrar os conceitos (1) e (2). Posteriormente, os inventores irão então incorporar (3) a liberação da droga.

[281] Descelularização: Os inventores otimizaram anteriormente as técnicas de descelularização para a regeneração de todo o órgão do pulmão em modelos de rato e primata não-humano (NHP) 69, 70 e empregaram com sucesso essas abordagens na pele humana. Com a modificação deste processo de descelularização, os inventores demonstraram a viabilidade de descelularizar matrizes dérmicas71. Mostrou-se que processo de descelularização atende a critérios previamente definidos para a geração de tecido acelular não imunogênico pós-descelularização71, 72. Por exemplo, consultar US 2018/0015204 A1 ("Surgical Grafts for Replacing the Nipple and Areola or Damaged Epidermis") 26, que é incorporada por referência neste documento em sua totalidade.

[282] Caracterizou-se o processo de descelularização na derme NHP para a retenção dos componentes da ECM colágeno, glicosaminoglicanos (GAGs) e elastina71. Resumidamente, os colágenos (tipos I e III) são os principais componentes da ECM da pele, os GAGs são polissacarídeos hidrofílicos que fornecem retenção de impacto à ECM e as fibras de elastina são um componente essencial para a elasticidade da pele. Foi confirmada a preservação do conteúdo de colágeno e GAG em níveis semelhantes à derme intacta e foi detectada uma diminuição nos níveis de elastina71. Uma diminuição da elastina é altamente comum em tecido descelularizado73,74; no entanto, os níveis diminuídos de elastina que foram medidos são suficientes para a manutenção das propriedades mecânicas de tipo nativo73, 74. Os níveis de componentes de ECM retidos da matriz dérmica NHP descelularizada são semelhantes aos dados de outro tecido epitelial, como pulmão de macaco rhesus e rato, e pele de porco73-76. Além disso, a derme descelularizada apoiou a proliferação celular (>65%), a migração celular e não induziu significativamente a apoptose (<1,5%)71. Além disso, foi avaliada a estrutura da fibra de ECM da derme NHP descelularizada com criomicroscopia eletrônica de varredura e descobriu-se que a integridade dos feixes de colágeno e as fibras foram mantidas nas camadas dérmica e epidérmica, semelhantes à derme intacta (FIG. 22). A derme descelularizada é desprovida de níveis imunogênicos de material genômico e mantém sua estrutura geral em micro e macroescala. Esses dados demonstram que o processo de descelularização é adequadamente otimizado para a pele, criando uma matriz acelular que retém os elementos estruturais.

[283] Plastinação: Gunther von Hagens popularizou a plastinação na década de 1970 e o processo desde então tem sido usado para preservar amostras de tecido cirúrgico ou de autópsia para ensino, histologia, evidências judiciais e preservação de todo o organismo64. O processo é bem definido63-66 com o método mais conhecido e bem caracterizado de impregnação de polímero para tecido humano sendo a Técnica S10 65,66. Em resumo, essa técnica desidrata órgãos inteiros fixos ou fatias de órgãos por meio de incubações controladas em solventes orgânicos, incluindo etanol e acetona. Após o pedido de vácuo, a acetona dentro de um tecido passa por uma transição de fase de líquido para gás, criando uma pressão negativa dentro do tecido que leva soluções de banho, como polímeros, diretamente para o enxerto. Esta técnica tem sido amplamente utilizada com uma variedade de polímeros de vários tamanhos e cargas moleculares, incluindo silicones, poliésteres e resinas77-81. Até o momento, a plastinação não tem sido usada com o propósito de impregnar ABGs com polímeros para uso in vivo em qualquer aplicação terapêutica.

[284] As melhorias serão feitas na Técnica de Plastinação S10 padrão. Primeiro, será usado o processo de descelularização descrito acima para gerar um ABG nativo e não reticulado. Após a desidratação do ABG por meio de incubações sucessivas em etanol, o enxerto ficará saturado com acetona. Semelhante ao processo de plastinação original, será usada a impregnação por força controlada por vácuo27 do enxerto para substituir a acetona no enxerto por biomateriais e polímeros e proteínas biologicamente derivados biocompatíveis (FIG. 23).

[285] Liberação de drogas: Os polímeros, incluindo polímeros biodegradáveis, têm sido usados há muito tempo em sistemas de distribuição de drogas como carreadores82. Planejou-se utilizar polímeros naturais bem estabelecidos que são passíveis de encapsulamento de drogas para distribuição localizada de drogas em locais de colocação do enxerto. Vai se alavancar o conhecimento e os métodos de aplicação dérmica e liberação prolongada de medicamentos para desenvolver um método que forneça liberação prolongada de medicamentos dentro do tecido em regeneração. Essa abordagem evita os efeitos sistêmicos dos métodos atuais e fornece uma dose terapêutica mais elevada no sítio de ação relevante da droga. Foi publicado sobre polímeros biodegradáveis usados para encapsular e liberar fatores de crescimento de uma maneira controlada e prolongada83, que é incorporado por referência em sua totalidade. Este estudo usou um construto de alginato, por exemplo, como um arcabouço de tecido multifuncional para o reparo do sistema nervoso central que entregou um fator neurotrófico derivado do cérebro (Neurotrofina-3) 83. No programa ABG impregnado com polímero, serão usados materiais e métodos semelhantes para encapsular fisicamente antibióticos, analgésicos e/ou agentes anti-inflamatórios nos polímeros que foram selecionados, para resolver problemas com infecção, dor e resposta hiperinflamatória do hospedeiro.

[286] Os riscos, juntamente com alguns esforços de mitigação, estão resumidos na Tabela abaixo.

[287] Visão geral: POP é uma área de grande necessidade médica não atendida, dado o risco de 33-50% ao longo da vida de desenvolver POP para mulheres e a incidência de 12% ao longo da vida de cirurgia POP para mulheres 8, 28, 42-44. Nenhuma das opções atuais de tratamento cirúrgico para POP grave é aceitável: as substituições de tecido nativo frequentemente falham em 2 anos 24, 25, as malhas sintéticas não são seguras 11, 12, 35, 36 e os ABGs atuais têm altas taxas de complicações 37-41. As falhas do produto ABG incluem integridade mecânica deficiente, rejeição imunológica e infecção15-22. Os inventores estão desenvolvendo um novo tipo de produto ABG que resolverá esses problemas, usando os processos patenteados de descelularização26 e impregnação de polímero à base de plastinação27. Até o momento, a plastinação não tem sido usada com o propósito de impregnar ABGs com polímeros para uso in vivo em qualquer aplicação terapêutica.

[288] Especificamente, está sendo desenvolvido um método para impregnar um ABG com polímeros biodegradáveis que têm propriedades mecânicas robustas e bem caracterizadas e são passíveis de encapsulamento de drogas para distribuição local e controlada de compostos em sítios de enxerto. Um enxerto impregnado com polímero terá propriedades mecânicas aprimoradas, permitindo que seja mais durável do que um enxerto não impregnado e diminuirá a probabilidade de complicações associadas à falha mecânica. A liberação controlada de antibióticos a partir desses polímeros nos sítios de enxerto pode ter o potencial de conter complicações com infecção e a liberação de agentes anti-inflamatórios pode suprimir imediatamente a inflamação, permitindo uma maior probabilidade de aceitação/integração do enxerto com o hospedeiro. A criação de um ABG impregnado com polímero bioativo requer descelularização completa do tecido intacto derivado biologicamente, encapsulação física de antibióticos e agentes anti- inflamatórios em um polímero biodegradável e impregnação da pele descelularizada com o polímero carregado com droga.

[289] (1) Determinação de quais parâmetros otimizam a impregnação de polímero de ABGs. Serão desenvolvidos métodos para a impregnação de enxertos de pele acelular com três polímeros biodegradáveis: alginato, elastina e fibroína de seda. Se pretende testar os três polímeros em três concentrações cada e também avaliar três tempos de incubação de impregnação a vácuo. Para cada combinação de parâmetros, serão gerados enxertos de teste em triplicado. Esses enxertos serão analisados histologicamente quanto à penetração e distribuição do polímero. Serão determinadas as condições que produzem uma ocupação de polímero no enxerto que é >5% da área do enxerto e tem uma distribuição de polímero de modo que a ocupação de polímero normalizada é de ± 40% da média (para descrição, consultar Abordagem Experimental). Os enxertos que atendem a esses critérios de sucesso avançarão para os Objetivos 2 e 3 descritos abaixo.

[290] Justificativa: Aqui, serão desenvolvidos métodos para a impregnação de enxertos de pele acelular com cada um dos três polímeros biodegradáveis: alginato, elastina e fibroína de seda. Esses polímeros bem caracterizados foram escolhidos por sua biocompatibilidade, propriedades mecânicas ajustáveis, forma monomérica pequena e relativamente simples, facilidade de reticulação para gerar formas poliméricas, natureza derivada biologicamente e uso comprovado em aplicações biomédicas. Ao impregnar ABGs com esses polímeros, se pode manipular e melhorar as propriedades mecânicas dos ABGs. Em princípio, o polímero impregnado pode ocupar uma porcentagem do espaço vazio/intersticial dentro do ECM e pode ligar-se a si mesmo e/ou ao ECM. Como esses polímeros se reticulam prontamente por meio de mecanismos químicos (pH, Ca2+) ou físicos (temperatura, sonicação), a reticulação polimérica pode ocorrer de forma rápida e eficiente, independentemente do tamanho do enxerto. A reticulação polimérica não baseada em enzimas contorna as limitações com a difusão da enzima e atividade sustentada dentro da densidade do enxerto. As razões adicionais para a seleção desses três polímeros são as seguintes:

[291] (a) Alginato: O alginato (algina, ácido algínico) é um polímero natural isolado de uma alga marrom e é um polímero aprovado pela FDA geralmente considerado como seguro (GRAS)87. O alginato tem sido amplamente utilizado na medicina regenerativa e na distribuição de drogas, por ser histocompatível para uso humano e apresentar citotoxicidade mínima ou desprezível88-91. Conforme mencionado na seção neste documento, a equipe já usou alginato como um arcabouço de tecido para a liberação de drogas83. O alginato pode ser induzido a formar hidrogéis altamente reticulados com cátions multivalentes (por exemplo, Ca2+) 83.

[292] (b) Elastina: Como discutido acima na seção de descelularização, caracterizou-se anteriormente uma redução de 69% no teor de elastina na derme acelular NHP da derme nativa (n = 3, p < 0,01)71. Esses achados foram semelhantes aos dados do pulmão do macaco rhesus, pulmão de rato e derme suína: a diminuição da elastina durante o processo de descelularização é uma característica amplamente observada e caracterizada dos métodos de descelularização à base de detergente73-76. Estudos recentes observando a adição de elastina insolúvel em combinação com colágeno em um arcabouço de tecido cardiovascular biomimético descobriram que a elastina alterou marcadamente as propriedades mecânicas e biológicas do arcabouço, melhorando a durabilidade sem afetar negativamente o tamanho dos poros ou a porosidade92. A tropoelastina, a forma monomérica da elastina, pode ser induzida a reticular com ela mesma ou com o colágeno. A elastina mais comumente usada é a a-elastina, que pode ser reticulada por calor, sonicação repetitiva92 ou mudança de pH93.

[293] (c) Fibroína da Seda: A seda é composta principalmente por duas proteínas, fibroína e sericina. A sericina pode desencadear uma resposta imunológica, mas não é fibroína94. Seda foi recentemente explorada como um veículo de distribuição de drogas, estabilizador de drogas e estrutura biológica para manipulação de tecidos94 e é um biomaterial aprovado pela FDA. A seda é de interesse para engenheiros biomédicos devido às suas propriedades de biocompatibilidade favoráveis e atributos mecânicos exclusivos, incluindo uma hierarquia de estrutura bem definida em nano e microescala, biocompatibilidade, subprodutos não inflamatórios e compatibilidade de método de esterilização94-96. A FDA aprovou uma variedade de produtos de seda para uso in vivo, incluindo suturas e suportes (por exemplo, Seri® Surgical Scaffold). A seda pode ser induzida a se reticular com ela mesma ou com o colágeno por calor ou sonicação repetitiva94.

[294] Abordagem Experimental: A impregnação de polímero será realizada conforme descrito neste documento. A FIG. 24 mostra o fluxo de trabalho para este método. Primeiro irá se descelularizar a pele de cadáver de doador humano (2-3 mm de espessura) para servir como o modelo ABG. Este estudo não constitui pesquisa com seres humanos. Todo o tecido é obtido por meio de bancos de tecidos de doadores falecidos credenciados pela AATB. Os bancos de tecidos não estão associados aos inventores, as amostras não são coletadas especificamente para este estudo e todas as amostras são desidentificadas antes de serem transferidas para os inventores.

[295] Após a descelularização e antes da impregnação do polímero, os ABGs serão cortados em quadrados de 1 cm x 1 cm. Além disso, todos os polímeros serão biotinilados por meio de reticulação à base de carbodi-imida padrão para permitir a detecção de polímero dentro de ABGs. Não se espera que a biotinilação dos polímeros interfira com sua capacidade de formar polímeros ou tenha um efeito significativo em suas propriedades físicas. A biotina é uma pequena molécula de 244 Da amplamente utilizada na conjugação de proteínas e já foi utilizada com alginato97 e fibroína98 e demonstrou não alterar as propriedades do polímero.

[296] Durante a impregnação, o ABG será gradualmente desidratado por meio de incubações graduais com etanol antes da saturação completa com o solvente orgânico, acetona. O ABG saturado com acetona será colocado com uma solução de banho de polímero solubilizado em água e indivíduo a baixo vácuo por diferentes períodos de tempo a 4°C. Uma vez que a polimerização aumenta sob temperaturas mais quentes, serão realizadas impregnações a 4°C para garantir a entrada do polímero no ABG como um monômero antes da polimerização. Para cada polímero, serão testadas três concentrações: baixa (1% peso/volume), normal (10% peso/volume) e alta (20% peso/volume). A quantidade de tempo necessária para a etapa de impregnação a vácuo pode variar amplamente, dependendo da espessura e complexidade do tecido a ser impregnado. Períodos de tempo maiores que um dia podem ser necessários a 4°C, portanto, serão testados períodos de incubação de 1, 3 e 10 dias.

[297] O objetivo desta etapa é penetrar o polímero em e através do ABG. Será usada uma abordagem de Design de Experimentos fatorial completo para otimizar a concentração de polímero, o tempo de incubação de impregnação e a temperatura de incubação.

[298] Para cada condição de impregnação, serão gerados enxertos impregnados em triplicata para avaliação da eficácia da impregnação. Um total de 27 combinações de parâmetros possíveis (três polímeros; três concentrações; três vezes) exigirão, portanto, a geração de 81 enxertos. Serão enviadas amostras para análise histológica e imuno-histoquímica (IHC) para medir a ocupação e distribuição do polímero dentro do ABG. A ocupação do polímero é definida como a área de sinal do polímero (conforme medido por coloração com NeutrAvidin-HRP de polímeros biotinilados) dividida pela área ABG total. Como a pele é estratificada, a densidade da ECM não é uniforme em toda a sua espessura (da epiderme à hipoderme). Assim, sem limitar-se pela teoria, pode resultar em variabilidade na distribuição do polímero ao longo da espessura do ABG. A fim de medir a distribuição do polímero, a área ABG será discretizada em regiões de 500 µm X 500 µm, a ocupação normalizada do polímero será calculada para cada região e, em seguida, a distribuição da ocupação normalizada do polímero em todo o enxerto será analisada quanto ao desvio da média. A ocupação normalizada do polímero é a ocupação do polímero (ou seja, % da área do polímero) dividida pela ocupação do espaço intersticial (ou seja, % da área vazia) antes da impregnação do polímero. O espaço intersticial antes da impregnação será medido diretamente a partir das seções manchadas de H&E (subtraindo a área da ECM da área total de ABG). Está se normalizando a ocupação do polímero após a impregnação para a ocupação do espaço intersticial antes da impregnação, pois se pressupôs que a quantidade de polímero que entra em uma região do ABG está diretamente relacionada à quantidade de espaço vazio que existia antes da impregnação.

[299] Se a ocupação do polímero alvo não for alcançada, serão revisitados os parâmetros e, usando os dados obtidos do conjunto inicial de experimentos, analisar o impacto e efeito de cada fator de entrada, bem como as interações do fator de entrada na ocupação e distribuição do polímero. Irá se continuar a testar essa metodologia por meio de uma estratégia experimental de operações evolutivas iterativas (EVOL) para melhoria contínua até que se tenha identificado as condições de impregnação eficazes para cada polímero.

[300] Caso se tenha dificuldades em obter uma quantidade suficiente de pele doadora dos bancos de tecidos parceiros, com o objetivo de determinar a viabilidade de criar um ABG permeado com polímero, será utilizado o enxerto cirúrgico de colágeno AlloMaxTM de Bard, um ABG amplamente utilizado e disponível comercialmente. Serão feitos arranjos alternativos e será usada apenas pele humana descelularizada conforme descrito neste documento.

[301] Determinar as condições que produzem uma ocupação de polímero no enxerto que é >5% da área do enxerto e têm uma distribuição de polímero de forma que a ocupação normalizada do polímero seja ± 40% da média. Sem querer limitar-se pela teoria, um aumento de 5% do material dentro do enxerto será suficiente para alterar as propriedades mecânicas. A ocupação normalizada do polímero deve estar dentro de 40% da média com base em uma análise de Monte Carlo para um enxerto discretizado no qual a ocupação de ECM e a ocupação de polímero para cada região foram designadas aleatoriamente dentro dos intervalos de 20-50% e 1-40%, respectivamente. Apenas enxertos que atendam a esses parâmetros serão usados.

[302] (2) Caracterização das propriedades mecânicas dos ABGs impregnados com polímero. Serão testados todos os enxertos de pele acelular impregnados com polímero descritos neste documento que atendem aos critérios de ocupação descritos neste documento. Serão correlacionadas as propriedades mecânicas ao método de impregnação. Testes aqueles estabelecidos na técnica que incluem, mas não estão limitados a, teste de tração, teste de estouro de bola e teste de retirada de sutura. Marco: Serão determinados os tipos e condições de polímero que são úteis para otimizar as propriedades do enxerto; por exemplo, o enxerto permeado com polímero alvo tem um módulo de Young e resistência à tração >10 MPa, que é maior do que o ABGs84-86 não impregnado com polímero existente.

[303] Esta seção aborda que uma impregnação de polímero de um ABG aumentará as propriedades mecânicas do enxerto, permitindo que ele seja mais durável do que um enxerto não impregnado. Sem limitar- se pela teoria, um ABG impregnado com polímero ideal terá um módulo de Young e resistência à tração de >10 MPa, com base em valores da literatura de pele humana excisada e in vivo, bem como valores para ABGs não impregnados com polímero existentes84-86, 99, 100. Serão examinados os enxertos que atendem aos requisitos de impregnação de polímero da Seção 1 (supra), e apenas os enxertos com características favoráveis serão usados nos estudos descritos abaixo. Se vários pontos de tempo para um determinado par de polímero/concentração avançarem da Seção 1, apenas o enxerto de teste com a maior ocupação de polímero avançará. Portanto, um máximo de nove combinações de parâmetros (em triplicado, para n = 27 enxertos) avançarão para o teste do Objetivo 2.

[304] Serão correlacionadas as propriedades mecânicas com metodologia de impregnação. Os dados coletados neste objetivo também informarão os esforços para desenvolver enxertos ajustáveis e personalizados com diferentes propriedades mecânicas. As propriedades mecânicas serão medidas por tração uniaxial, estouro de bola e teste de retirada de sutura. O teste de tração uniaxial mede propriedades como o módulo de Young (tensão longitudinal: razão de deformação para medir a capacidade de suportar a tensão ou compressão longitudinal), resistência à tração final, resistência ao escoamento, alongamento e coeficiente de Poisson. O teste de estouro de bola é usado para medir a resistência de um material à deformação e falha. O teste de retirada de sutura é comumente usado para medir a resistência de um material, como enxertos cirúrgicos e malhas, à falha nos pontos de ligação da sutura.

[305] Abordagem Experimental: Os testes de tração uniaxial, estouro da bola e extração da sutura serão realizados pela Exponent, Inc. (Philadelphia, PA). Para testes mecânicos, os enxertos impregnados com polímero terão 6,4 cm x 1 cm, conforme necessário para o encaixe do instrumento. Embora maiores do que os enxertos usados no objetivo 1, uma vez que a espessura do enxerto será consistente, espera-se que a difusão forçada do polímero através dos enxertos seja consistente, apesar das diferenças de área de superfície. ABGs comercialmente disponíveis serão incluídos como controles para comparação.

[306] (a) Teste Não Axial: Esses testes serão realizados de acordo com ASTM D638101. As amostras serão cortadas em formato de osso de cachorro e a amostra será testada com um extensômetro de vídeo para identificar a cepa. Os módulos elásticos, o alongamento na ruptura e a resistência à tração final serão determinados.

[307] (b) Teste de Estouro de Bola: Esses testes serão realizados de acordo com ASTM D6797-15102 e Freytes et al103. As amostras serão cortadas em 2 x 2 cm e rompidas em um teste de pressão de estouro da bola da sonda com uma sonda de 5,56 mm de diâmetro e um orifício de folga de 9,75 mm de diâmetro a uma taxa de 25,4 mm/min.

[308] (c) Teste de Extração de Sutura: O teste de extração de sutura será realizado de acordo com ASTM F543104. Uma sutura será passada pelo enxerto uma vez e as pontas soltas serão amarradas e amarradas ao redor de um dispositivo de arrancamento de sutura. O enxerto de pele será estacionário, preso à base do quadro de reação de forma que a direção da carga aplicada da sutura seja paralela ao enxerto. Uma carga de tração será aplicada às amostras a 5 mm/min até que ocorra a falha. A força de tração axial do corpo de prova será determinada.

[309] Se os testes acima provarem ser ineficazes para determinar as propriedades mecânicas dos ABGs devido às condições de teste limitadas (ou seja, temperatura, pré-condicionamento, taxa de deformação) ou adequação dos testes para o material (ou seja, elástico, viscoelástico, assimetria), será usada a análise mecânica dinâmica (DMA). O DMA é usado para medir a viscoelasticidade do polímero determinando o módulo complexo (relação tensão: cepa sob condições vibratórias), módulo de Young e resistência à tração final. O DMA é uma alternativa aos testes de tração uniaxial e estouro da bola. Se necessário, uma varredura de frequência será conduzida em um espécime por amostra a uma temperatura fixa de 20°C e frequências variadas entre -0,1 Hz e 10 Hz, para determinar o Young, armazenamento dinâmico e módulos de perda, resistência à tração e tan (d) como em função da frequência.

[310] Determinação de quais polímeros e condições otimizam as propriedades do enxerto: o enxerto permeado com polímero ideal tem um módulo de Young e resistência à tração de >10 MPa, que é maior do que os ABGs83-85 não impregnados com polímero existentes.

[311] (3) Caracterizar a bioatividade in vitro dos ABGs impregnados com polímero. Será medida a bioatividade dos enxertos de pele acelular impregnados com polímero da Parte 1 deste documento que atendeu aos critérios semeando enxertos in vitro com fibroblastos uterinos primários humanos e, em seguida, determinar a porcentagem de viabilidade celular, proliferação e apoptose. Também será avaliada a capacidade das células de migrar para o enxerto.

[312] Sem desejar limitar-se pela teoria, um ABG impregnado com polímero é bioativo e irá apoiar a migração celular, que é essencial para eventual uso clínico. Serão examinados os enxertos que atendem aos requisitos da Seção 1; somente os enxertos com características favoráveis serão utilizados nos estudos descritos a seguir. Um máximo de nove combinações de parâmetros (em triplicado, para n = 27 enxertos) avançarão para o teste da Seção 3 descrito neste documento. Esta é a única seção que discute o uso de células humanas em combinação com o enxerto.

[313] Será medida a bioatividade dos enxertos impregnados com polímero semeando enxertos in vitro com fibroblastos uterinos primários humanos e, em seguida, avaliando a proliferação celular, apoptose e migração. Anteriormente, foram realizados ensaios semelhantes após semear células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea do NHP (BMSCs) na derme NHP descelularizada71. Esses dados mostraram menos de 1% das células sendo apoptóticas e aproximadamente 65% da população de células permanecendo proliferativa durante a totalidade do estudo, sem alterações observadas entre os dias71.

[314] A coloração de viabilidade celular será realizada. O trabalho de microscopia será conduzido pelo pessoal do Laboratório de Serviços de Microscopia da Universidade da Carolina do Norte - Chapel Hill. A coloração Ki-67, EdU e TUNEL e a captura de imagem serão realizadas por HistoWiz (Brooklyn, NY). Os inventores farão todas as análises. Para todos os ensaios de bioatividade, a significância estatística será determinada com ANOVA bicaudal com a = 0,05. Os resultados numéricos serão dados como média ± erro padrão da média.

[315] Abordagem Experimental: Os enxertos acelulares serão pré- condicionados com meio de crescimento celular em uma incubadora de cultura de células em condições padrão de cultura de células de mamíferos (37°C/5% de dióxido de carbono) por 30 minutos antes da semeadura. Cada enxerto terá 1 cm X 1 cm e será semeado com 1 x10 6 fibroblastos uterinos primários; cada enxerto será executado em triplicado. Essa densidade deve fornecer infiltração suficiente do enxerto de modo a permitir a presença de células suficientes dentro do enxerto, bem como boa resolução de célula única sem um sinal de fundo alto devido ao excesso de células. Os enxertos semeados serão cultivados por uma e duas semanas antes da análise. Para todas as manchas, cada enxerto semeado será cortado em pedaços de 5 mm X 5 mm para evitar a penetração insuficiente de anticorpo e corante no tecido. A viabilidade celular, proliferação e apoptose serão medidas por microscopia de fluorescência e quantificadas usando o software ImageJ. As medições serão feitas em 5 campos de visão aleatórios por amostra para cada ensaio de bioatividade e fundo subtraído. Sinais fora de foco de células que não estão no plano focal serão excluídos. Os enxertos semeados serão avaliados da seguinte forma:

[316] (a) Viabilidade Celular: A viabilidade será medida dentro do enxerto por coloração com calceína-AM e homodímero-1 de etídio (ensaio Thermo; LIVE/DEAD). Calcein-AM cora células vivas verdes com atividade esterase ativa, enquanto homodímero-1 de etídio cora os núcleos das células com perda de integridade da membrana.

[317] (b) Proliferação: A proliferação celular será medida por meio de coloração Ki-67 e incorporação de EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina). A IHC será realizada em seções de enxertos semeados com anti-Ki67 (Sinalização celular, camundongo) e coloração secundária conjugada com Alexa Fluor 488. O ensaio Click-iT EdU (Invitrogen) irá marcar células mitoticamente ativas através da incorporação de EdU com marcação fluorescente.

[318] (c) Apoptose: A apoptose será avaliada pelo ensaio de rotulagem nick-end dUTP (TUNEL) mediado por TdT (In Situ Cell Death Detection Kit - Fluorescein, Roche) como descrito anteriormente71, 73. As amostras tratadas com solução marcada sem enzima serão incluídas como controles negativos, enquanto as amostras tratadas com DNase I antes da coloração TUNEL servirão como controles positivos. Todas as amostras serão coradas com DAPI após a coloração TUNEL.

[319] (d) Migração Celular: Usando as imagens de lâmina capturadas no trabalho de histologia descrito acima, será avaliada a capacidade das células de migrar para os ABGs impregnados com polímero em comparação com os ABGs não tratados com polímero. Será contado o número relativo de células, conforme indicado pelos núcleos corados, dentro de cada enxerto.

[320] O estudo de migração celular quantificará o número de células por campo em função da distância da borda do enxerto a fim de gerar um valor de "migração". No entanto, os fibroblastos semeados em um único lado do enxerto irão provavelmente migrar para o enxerto nesse único lado. A maioria das células migratórias será da área onde o enxerto faz contato direto com a placa de cultura de células, e a distância migrada será distorcida dependendo da posição original das células em migração. Por esse motivo, será simplesmente contado o número de células migradas. Poderão ser feitas avaliações mais quantitativas da distância de migração quando o enxerto for implantado em um modelo in vivo.

[321] Estão sendo desenvolvidos ABGs impregnados com polímero para melhorar a função mecânica dos ABGs e entregar medicamentos localmente de uma maneira controlada para melhorar a cura e os resultados do paciente. O exemplo neste documento descreve esforços para produzir um enxerto de pele acelular impregnado com polímero. Os inventores irão misturar drogas selecionadas com o polímero biodegradável antes da impregnação do enxerto. Ao escolher materiais biodegradáveis sintonizáveis que devem se decompor no corpo ao longo do tempo, será permitida a administração sustentada do medicamento na área ao redor do enxerto. Será caracterizada a eficácia do encapsulamento e a cinética de liberação do medicamento, bem como a genotoxicidade do enxerto.

[322] Determinação de quais polímeros e condições otimizam as propriedades do enxerto: o enxerto permeado com polímero ideal suporta > 80% de células viáveis e > 50% de células proliferativas.

[323] O exemplo descreve neste documento atividades de caminho crítico que serão desenvolvidas para métodos para impregnar ABGs com polímeros biodegradáveis para melhorar a resistência mecânica de ABGs e permitir a distribuição localizada e prolongada de drogas. Essas atividades irão avançar o programa proposto de ABG impregnado com polímero do estágio de conceito ao estágio de protótipo. REFERÊNCIAS 1. Lowenstein L, Gamble T, Sanses TV, van Raalte H, Carberry C, Jakus S, Kambiss S, McAchranS, Pham T, Aschkenazi S, Hoskey K, Kenton K, Fellow's Pelvic Research N. Sexual function isrelated to body image perception in women with pelvic organ prolapse. J Sex Med.2009;6(8):2286-2291. 2. Fritel X, Varnoux N, Zins M, Breart G, Ringa V. Symptomatic pelvic organ prolapse at midlife,quality of life, and risk factors. Obstet Gynecol. 2009;113(3):609-616. 3. Chan SS, Cheung RY, Yiu KW, Lee LL, Pang AW, Chung TK. 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EQUIVALENTES

[324] Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar, usando não mais do que a experimentação de rotina, inúmeros equivalentes às substâncias e procedimentos específicos descritos neste documento. Tais equivalentes são considerados dentro do escopo desta invenção, e são cobertos pelas seguintes reivindicações.

Claims

1. Enxerto permeado por polímero que compreende um tecido descelularizado, caracterizado pelo fato de que: (1) é substancialmente livre de células, (2) a matriz extracelular (ECM) do tecido descelularizado e as moléculas de adesão celular do mesmo são substancialmente preservadas, (3) as referidas moléculas de adesão celular preservadas compreendem laminina, elastina, fibronectina, colágeno ou uma combinação dos mesmos, ou opcionalmente compreendem um colágeno Tipo I, um colágeno Tipo III, um colágeno Tipo IV, um colágeno Tipo VI ou uma combinação dos mesmos, (4) o tecido descelularizado é substancialmente livre de água e (5) o tecido descelularizado é permeado com um polímero, em que o referido polímero é substancialmente distribuído uniformemente no referido tecido.

2. Enxerto permeado por polímero, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido enxerto permeado por polímero é produzido por um método que compreende as seguintes etapas; (i) obter um tecido descelularizado que compreende água, é substancialmente livre de células e em que a matriz extracelular (ECM) e as moléculas de adesão celular da mesma são substancialmente preservadas, em que as referidas moléculas de adesão celular compreendem laminina, elastina, fibronectina, colágeno, ou uma combinação dos mesmos; (ii) opcionalmente, fixação do tecido descelularizado submergindo o tecido descelularizado em um fixador por um período de tempo suficiente para fixar o tecido; (iii) substituir substancialmente toda a água dentro do tecido por um solvente orgânico submergindo o tecido descelularizado no solvente orgânico por um período de tempo e a uma temperatura suficiente para substituir toda ou substancialmente toda a água dentro do tecido; (iv) opcionalmente, remover toda ou substancialmente toda a gordura dentro do tecido submergindo o tecido descelularizado em um solvente orgânico por um período de tempo e a uma temperatura suficiente para remover substancialmente todos os lipídios; (v) permear o tecido com um polímero submergindo o tecido no polímero e submetendo o tecido submerso ao vácuo por um período de tempo suficiente para permear o tecido com o polímero; e (vi) opcionalmente, fazer a reticulação do polímero permeado dentro do tecido; obtendo assim, o tecido permeado por polímero em que o polímero é substancialmente distribuído uniformemente no referido tecido.

3. Enxerto permeado por polímero, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polímero compreende: um polímero colorido; um polímero colorido que compreende melanina, um corante ou uma combinação dos mesmos; um polímero natural e/ou um polímero sintético; um polímero natural que compreende alginato ou colágeno; um polímero sintético que compreende cianoacrilato; um polímero compreendendo pelo menos uma célula viável, um polímero compreendendo pelo menos um antibiótico, um polímero biodegradável, um polímero não biodegradável, um polímero capaz de reticulação ou uma combinação dos mesmos; um polímero biodegradável, em que o polímero biodegradável compreende quitosana, colágeno, alginato, cianoacrilato ou “dermabond”; ou um polímero não biodegradável, em que o polímero não biodegradável compreende silício ou UHMWPE.

4. Enxerto permeado por polímero de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o tecido compreende um tecido dérmico e/ou um tecido epidérmico; ou compreende um órgão, um músculo, um ligamento, um osso, um mamilo, aréola, um mamilo ligado a uma aréola, um lábio, pele, um tendão, uma aorta ou um vaso sanguíneo.

5. Enxerto permeado por polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o enxerto compreende ainda células viáveis, em que as células foram introduzidas no enxerto sob condições propícias para repovoar o tecido com as células ou progênie das mesmas ; ou o enxerto compreende ainda células viáveis, em que as células viáveis foram introduzidas no enxerto sob condições propícias para repovoar o tecido com as células ou progênie das mesmas, e ainda em que as células compreendem células exógenas, células autólogas, células alogênicas; ou o enxerto compreende ainda células viáveis, em que as células viáveis foram introduzidas no enxerto sob condições propícias para repovoar o tecido com as células viáveis ou progênie das mesmas, e ainda em que as células viáveis compreendem células estromais, fibroblastos, células endoteliais, células progenitoras, células-tronco, células específicas de órgãos, células específicas de tecidos, queratinócitos, melanócitos, uma célula nervosa ou uma combinação dos mesmos.

6. Enxerto permeado por polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o tecido é substancialmente livre de pele, gordura e/ou tecido fibroso.

7. Enxerto permeado por polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que o enxerto compreende menos de cerca de 50% de polímero.

8. Enxerto permeado por polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o enxerto compreende cerca de 0,1% a cerca de 30% de polímero.

9. Método para fazer um enxerto permeado por polímero para uso in vivo, caracterizado pelo fato de que o método compreende as seguintes etapas: (i) obtenção de um tecido descelularizado, que é substancialmente livre de células e ainda em que a matriz extracelular (ECM) do tecido é substancialmente preservada e as moléculas de adesão celular do mesmo, cujas moléculas de adesão celular preservadas compreendem laminina, elastina, fibronectina, colágeno, ou uma combinação dos mesmos ou opcionalmente compreende um colágeno Tipo I, um colágeno Tipo III, um colágeno Tipo IV, um colágeno Tipo VI ou uma combinação dos mesmos; (ii) opcionalmente, fixação do tecido descelularizado, submergindo-o em um fixador por um período de tempo suficiente para fixar o tecido; (iii) substituir substancialmente toda a água dentro do tecido por um solvente orgânico submergindo o tecido descelularizado no solvente orgânico por um período de tempo e a uma temperatura suficiente para substituir toda ou substancialmente toda a água dentro do tecido; (iv) opcionalmente, remover toda ou substancialmente toda a gordura dentro do tecido submergindo o tecido descelularizado em um solvente orgânico por um período de tempo e a uma temperatura suficiente para remover substancialmente todos os lipídios; (v) permear o tecido com um polímero submergindo o tecido no polímero e submetendo o tecido submerso ao vácuo por um período de tempo suficiente para permear o tecido com o polímero; e (vi) opcionalmente, reticulação do polímero permeado dentro do tecido; em que o tecido permeado por polímero resultante compreende o polímero substancialmente distribuído uniformemente dentro do referido tecido; proporcionando assim um enxerto permeado por polímero adequado para uso in vivo.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender a fixação do tecido descelularizado pela submersão do tecido descelularizado em um fixador por um período de tempo suficiente para fixar o tecido.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de incluir a remoção de toda ou substancialmente toda a gordura dentro do tecido submergindo o tecido descelularizado em um solvente orgânico por um período de tempo e temperatura suficiente para remover substancialmente todos os lipídios.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de incluir a reticulação do polímero permeado no tecido.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de incluir a adição de um reticulador químico que foi misturado ao polímero antes de permear o tecido.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-13, caracterizado pelo fato de que compreende repovoar o tecido com células viáveis sob condições propícias para repovoar o tecido com as células viáveis ou sua progênie.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o repovoamento ocorre aproximadamente ao mesmo tempo que a etapa de permeação, ou o repovoamento ocorre opcionalmente após a etapa de permeação

16. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que as células viáveis repovoadas compreendem células exógenas, células autólogas ou células alogênicas.

17. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que as células viáveis repovoadas compreendem queratinócitos, melanócitos, células nervosas ou uma combinação dos mesmos.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 17, caracterizado pelo fato de incluir uma ou mais das seguintes características: (i) o fixador compreende glutaraldeído ou genipina; (ii) o solvente orgânico compreende acetona, xileno ou um álcool; (iii) o solvente orgânico compreende acetona, xileno, diclorometano, etanol ou metanol; (iv) o solvente orgânico compreende acetona, e o tecido descelularizado é incubado a cerca de -15°C a 25°C por um período de tempo; ou (v) a reticulação compreende reticulação UV ou reticulação química.

19. Enxerto permeado com polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, ou enxerto impregnado com polímero produzido de acordo com qualquer uma das reivindicações 918, caracterizado pelo fato de que é para uso para implantação em um local no sujeito; em que a implantação no local resulta no enxerto permeado por polímero sendo enxertado no local no sujeito.

20. Enxerto permeado com polímero para uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o sujeito sofre de POP.

21. Enxerto permeado por polímero para uso de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que o enxerto foi repovoado com células viáveis; opcionalmente, em que as células compreendam células exógenas, células autólogas ou células alogênicas.