CN108872463A - 一种杜仲口服液的质量检验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供杜仲口服液的质量检验方法,包括对杜仲口服液进行定性分析和定量检测,其中定性分析包括采用薄层色谱法对杜仲口服液中的杜仲胶和异嗪皮啶分别进行鉴定,定量检测包括对杜仲口服液中的杜仲胶含量和总糖含量分别采用高效液相色谱法和紫外‑可见分光光度法进行检测。与灵芪加口服液的质量检验方法相比,本发明的检验方法专属性、重复性、准确性良好,可用于对杜仲口服液的质量进行综合评价,从而有效控制该产品的质量,保证其临床使用的安全、有效和稳定。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域,具体涉及一种杜仲口服液的质量检验方法,该方法可用于对杜仲口服液的质量进行综合评价。
背景技术
随着养殖业向集约化和工厂化发展,畜禽对病原微生物的易感性不断增加,病害频繁发生,为了防治疾病,传统做法是大量使用抗生素类药物,结果使耐药菌株不断增多,导致畜禽免疫功能急剧下降、生长受阻,抗生素的滥用还导致疫苗接种反应增强,副作用加大或使免疫接种失败,给养殖业造成很大的经济损失。
免疫增强剂是一类单独或与抗原同时使用增强动物机体非特异性和特异性免疫的物质,目前使用的免疫增强剂种类很多,包括生物性免疫增强剂,如干扰素;化学性免疫增强剂,如左旋咪唑等,其存在着高剂量产生免疫抑制或对机体有害等缺点,研制开发无毒害、作用强的新型中药免疫增强剂已成为迫切需要。
杜仲口服液由黄芪和刺五加两味中药组成,处方来源于《国家中成药标准》中的灵芪加口服液,灵芪加口服液由灵芝、黄芪和刺五加三味中药组成,从节约养殖成本上考虑去除价格昂贵的灵芝,并通过小鼠脾脏淋巴细胞增殖试验筛选出黄芪与刺五加的最佳比例。本处方具有补中益气、扶正祛邪的功能,临床用于提高机体免疫力,配合疫苗使用提高疫苗免疫效果。临床试验结果表明,杜仲口服液以每升水1ml混饮,连用7日,能够提高鸡非特异性免疫能力、鸡新城疫和禽流感(H9)抗体水平以及鸡的生产性能。
杜仲口服液是根据传统中医理论开发的中药免疫增强剂,尚无质量标准,不利于控制其质量,为保证临床使用安全、有效和稳定,有必要建立一个完善的质量标准及其检验方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种杜仲口服液的质量检验方法。通过建立和实施该检验方法,可增强该药的有效性、质量可控性和稳定性。
本发明提供的杜仲口服液的质量检验方法,包括对杜仲口服液进行定性分析和定量检测,其中定性分析包括采用薄层色谱法对杜仲口服液中的杜仲胶和异嗪皮啶的分别鉴定,定量检测包括对杜仲口服液中的杜仲胶含量和总糖含量分别采用高效液相色谱法和紫外-可见分光光度法进行检测。
本发明中杜仲口服液的处方为:黄芪800g,刺五加200g。
本发明的杜仲口服液的质量检验方法包括如下内容:
一、黄芪的鉴定
由于杜仲胶是黄芪的特征化学成分,因此本发明中对杜仲口服液中的黄芪进行鉴定主要是鉴定其中的杜仲胶。采用的鉴定方法为薄层色谱法,包括如下步骤:
(1)制备待测样品溶液
取杜仲口服液3ml,加水27ml,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次20ml,合并正丁醇液,用水洗涤2次,每次20ml,弃去水液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇1ml使之溶解,作为待测样品溶液。
(2)制备对照样品溶液
取杜仲胶对照样品,加甲醇制成每1ml甲醇含0.5mg杜仲胶的溶液,作为对照样品溶液。
(3)采用薄层色谱法鉴定杜仲口服液中的黄芪
吸取上述步骤(1)和(2)中的两种溶液各4μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(体积比为13∶7∶2)的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%(v/v)硫酸乙醇溶液,在105℃条件下加热至斑点显色清晰。如果待测样品色谱中,在与对照样品色谱相应的位置上,显示与对照样品相同颜色的斑点,则说明待测样品中含有杜仲胶,即含有黄芪。
二、刺五加的鉴定
由于异嗪皮啶是刺五加的特征化学成分,因此本发明中对杜仲口服液中的刺五加进行鉴定主要是鉴定其中的异嗪皮啶。采用的鉴定方法为薄层色谱法,包括如下步骤:
(1)制备待测样品
取杜仲口服液30ml,用三氯甲烷振摇提取2次,每次15ml,合并三氯甲烷液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为待测样品溶液。
(2)制备对照样品溶液
取异嗪皮啶对照样品,加甲醇制成每1ml甲醇含0.5mg异嗪皮啶的溶液,作为对照样品溶液。
(3)采用薄层色谱法鉴定杜仲口服液中的刺五加
吸取上述步骤(1)和(2)中的两种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(体积比为19∶1∶0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,置于紫外光灯(365nm)下进行检视。如果待测样品色谱中,在与对照样品色谱相应的位置上,显示与对照样品相同的蓝色荧光斑点,则说明待测样品中含有异嗪皮啶,即含有刺五加。
三、杜仲胶含量的检测
由于杜仲是杜仲口服液中的君药,杜仲胶是其特征有效成份,药理研究表明杜仲胶具有增强机体免疫力的作用。因此,检测杜仲口服液中杜仲胶的含量可以用于评价杜仲口服液的质量。采用的检测方法为高效液相色谱法,包括如下步骤:
(1)进行色谱条件选择与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈-水(体积比为35∶65)为流动相,采用蒸发光散射检测器检测,理论塔板数按杜仲胶峰计算应不低于4000。
(2)制备对照样品溶液
取杜仲胶对照样品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml甲醇含0.5mg杜仲胶的溶液,即得。
(3)制备待测样品溶液
精密量取杜仲口服液5ml,加水5ml,用水饱和的正丁醇振摇提取4次,每次40ml,合并正丁醇液,用氨试液充分洗涤2次,每次约40ml,弃去氨液,将正丁醇液蒸干,残渣加甲醇溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
(4)检测待测样品中的杜仲胶含量
分别精密吸取对照样品溶液5μl、15μl,待测样品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,用外标两点法对数方程计算,即得到待测样品中的杜仲胶含量。
四、总糖含量的检测
杜仲口服液中总糖含量为刺五加所含糖类成分和黄芪所含糖类成分的总和。由于刺五加和黄芪都含有多糖和寡糖等糖类成分,现代药理学研究表明这些多糖类和寡糖类成分均有增强免疫功能的作用。因此,检测杜仲口服液中刺五加和黄芪的总含糖量可以用于评价杜仲口服液的质量。采用的检测方法为紫外-可见分光光度法,包括如下步骤:
(1)制备对照样品溶液
取无水葡萄糖对照样品适量,精密称定,加水制成每1ml水含无水葡萄糖0.6mg的溶液,即得。
(2)制备待测样品溶液
精密量取本品5ml,置于100ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,精密量取5ml,置于50ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,即得。
(3)检测待测样品中的总糖含量
精密量取对照样品溶液与待测样品溶液各2ml,置于25ml量瓶中,精密加入5%苯酚溶液1ml,摇匀,迅速精密加入硫酸5ml,摇匀,置于水浴中保温15min,取出,置于冰水浴中冷却3min,加水稀释至近刻度,再置于冰水浴中冷却3min,取出,加水至刻度,摇匀;另量取水2ml,同上平行操作作为空白对照,采用紫外-可见分光光度法,在490nm波长处测定吸光度,按外标法以吸光度值计算待测样品中的总糖含量。
与灵芪加口服液的质量检验方法相比,本发明的检验方法使用了高效液相色谱法检测杜仲胶含量,并增加了总糖含量的检测方法,同时采用薄层色谱法分别鉴定杜仲口服液中的杜仲胶和异嗪皮啶。该检验方法专属性、重复性、准确性良好,可用于对杜仲口服液的质量进行综合评价,从而有效控制该产品的质量,保证其临床使用安全、有效和稳定。
附图说明
图1是实施例2中黄芪鉴定薄层色谱图;
图中附图标记如下:1杜仲胶;2~4待测样品;5阴性对照。
图2是实施例2中刺五加鉴定薄层色谱图;
图中附图标记如下:1异嗪皮啶;2~4待测样品;5阴性对照。
图3是实施例3中采用高效液相色谱法检测杜仲胶含量的专属性试验色谱图。
图中附图标记如下:1杜仲胶对照样品色谱图;2待测样品色谱图;5阴性对照色谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例和附图进一步详细说明本发明。
实施例1制备杜仲口服液
杜仲口服液:处方包括黄芪800g和刺五加200g。
制法:将以上2味中药粉碎成最粗粉,加8倍量水,浸泡1h,煎煮回流提取2h,过滤,滤渣再加水提取2次,每次加8倍量水并回流提取2h,分次过滤,合并滤液,趁热(50~60℃)离心,上清液浓缩至相对密度1.05~1.08(≤70℃),冷藏12~24h,离心,上清液减压浓缩至相对密度1.15~1.23(≤70℃),再冷藏12~24h,离心,上清液加纯化水至1000ml,搅匀,滤过,分装,即得。
实施例2杜仲口服液鉴定方法专属性考察
(1)试剂与样品
对照样品:杜仲胶,批号:110781-200613,购自中国食品药品检定研究院;异嗪皮啶,批号:110837-200304,购自中国食品药品检定研究院。
杜仲口服液:实施例1制备。
阴性对照样品:按照实施例1方法制备各鉴定项阴性对照样品。
(2)黄芪的鉴定
取实施例1制备的样品3ml,加水27ml,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次20ml,合并正丁醇液,用水洗涤2次,每次20ml,弃去水液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇1ml使之溶解,作为待测样品溶液;另取杜仲胶对照样品,加甲醇制成每1mL甲醇含0.5mg杜仲胶的溶液,作为对照样品溶液;按处方配比称取刺五加并按实施例1制备工艺制备样品作为阴性对照样品,取阴性对照样品同法操作制备阴性对照溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述三种溶液各4μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(体积比为13∶7∶2)的下层溶液作为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%(v/v)硫酸乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰,结果如图1所示。
从图1可见:在与对照样品色谱相应的位置上,待测样品显示相同颜色的斑点,阴性对照不显示斑点,表明方法专属性良好。
(3)刺五加的鉴定
取实施例1制备的样品30ml,用三氯甲烷振摇提取2次,每次15ml,合并三氯甲烷液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为待测样品溶液;另取异嗪皮啶对照样品,加甲醇制成每1ml甲醇含0.5mg异嗪皮啶的溶液,作为对照样品溶液;按处方配比称取黄芪并按实施例1制备工艺制备样品作为阴性对照样品,取阴性对照样品同法操作制备阴性对照溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述三种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(体积比为19∶1∶0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,置于紫外光灯(365nm)下检视,结果如图2所示。
从图2可见:在与对照样品色谱相应的位置上,待测样品显示相同的蓝色荧光斑点,阴性对照无干扰,表明方法专属性良好。
实施例3杜仲胶含量检测方法学考察
(1)仪器与试剂、样品
仪器:
高效液相色谱仪,e2695型,美国沃特世公司;蒸发光散射检测器,2424型,美国沃特世公司;电子分析天平,AB135-S型,梅特勒托利多公司。
试剂:乙腈为色谱纯;水为二次重蒸水;其他试剂均为分析纯。
对照样品:杜仲胶,批号:110781-200613,购自中国食品药品检定研究院。
杜仲口服液:实施例1制备。
(2)色谱条件
色谱柱为Kromasil100-5C18柱(150×4.6mm,5μm);流动相为乙腈-水(35∶65);蒸发光散射检测器检测,漂移管温度为60℃,喷雾器温度为36℃;柱温为30℃;流速为1.0ml/min。
(3)溶液的制备
对照样品溶液的制备精密称取杜仲胶对照样品25.4mg,置于50ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,即得。
待测样品溶液的制备精密量取实施例1制备的样品5ml,加水5ml,用水饱和的正丁醇振摇提取4次,每次40ml,合并正丁醇液,用氨试液充分洗涤2次,每次约40ml,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
阴性对照溶液的制备:按照实施例1的制备方法制备缺黄芪的阴性对照样品,取阴性对照样品,再按照待测样品溶液的制备方法制备阴性对照溶液,即得。
(4)专属性试验
分别精密吸取对照样品溶液15μl、待测样品溶液10μl、阴性对照溶液10μl,注入液相色谱仪,按上述色谱条件进行试验,记录色谱图,结果如图3所示。从图3可见:待测样品色谱中杜仲胶的保留时间与对照样品一致,而阴性对照在对照样品、待测样品色谱峰相应的位置上无干扰,方法专属性良好。
(5)线性范围考察
精密称取杜仲胶对照样品25.4mg,加甲醇制成0.508mg/ml的溶液,按上述色谱条件分别进样3μl、5μl、10μl、15μl、20μl测定。以峰面积对数(y)为纵坐标,以进样量对数(x)为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程y=1.4828x+5.312,r=0.9991,结果表明,在1.524μg~10.16μg范围内,杜仲胶峰面积对数与进样量对数有良好的线性关系。
(6)重复性试验
取实施例1制备的同一批样品,按照本实施例(3)中待测样品溶液的制备方法制备待测样品溶液,平行制备6份,精密吸取6份待测样品溶液各10μl,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定,记录峰面积并计算含量,结果测得杜仲胶含量RSD%为2.9,表明方法精密度良好。
(7)回收率试验
精密量取已知含量的杜仲口服液25ml,置于50ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,精密量取5ml,平行操作6份,各精密加入0.394mg/ml的杜仲胶对照样品甲醇溶液5ml,混匀后蒸干溶剂,残渣加水10ml溶解,按上述样品制备方法制备待测样品溶液,按含量测定方法测定峰面积并计算回收率,结果平均回收率为98.3%,RSD%为3.8,表明该方法准确度良好。
(8)三批样品含量测定
取按照实施例1制备的3批杜仲口服液(批号分别为:20120301、20120302、20120303),按照本发明建立的含量测定方法检测杜仲胶的含量,其结果分别为0.80mg/ml、0.88mg/ml和0.89mg/ml。
实施例4总糖含量检测方法学考察
(1)仪器与试剂、样品
仪器:
紫外-可见分光光度计,UV-2100型,北京瑞利分析仪器公司;
电子分析天平,AB135-S型,梅特勒托利多公司。
试剂:水为纯化水;其他试剂均为分析纯。
对照样品:D-无水葡萄糖,批号:110833-200904,购自中国食品药品检定研究院。
杜仲口服液:实施例1制备。
(2)测定方法
对照样品溶液的制备取无水葡萄糖对照样品适量,精密称定,加水制成每1ml水含无水葡萄糖0.6mg的溶液,即得。
待测样品溶液的制备精密量取实施例1制备的样品5ml,置于100ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,精密量取5ml,置于50ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,即得。
测定法精密量取对照样品溶液与待测样品溶液各2ml,置于25ml量瓶中,精密加入5%苯酚溶液1ml,摇匀,迅速精密加入硫酸5ml,摇匀,置于水浴中保温15min,取出,置于冰水浴中冷却3min,加水稀释至近刻度,再置于冰水浴中冷却3min,取出,加水至刻度,摇匀;另量取水2ml,同上平行操作作为空白对照,照紫外-可见分光光度法,在490nm波长处测定吸光度,按外标法以吸光度值计算待测样品的总糖含量。
(3)线性范围考察
称取无水葡萄糖对照样品5份,分别为17.1mg、21.9mg、31.9mg、41.7mg、51.7mg,分别置于50ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取5个不同浓度的对照样品溶液各2ml,分别置于25ml量瓶中,各精密加入5%苯酚溶液1ml,硫酸5ml,摇匀,置于水浴中加热15min,冰水浴冷却3min,加水至近刻度处再冰水冷却3min,取出用水稀释至刻度,摇匀,照紫外-可见分光光度计法,在490nm波长处测定吸收度,以吸光度(y)为纵坐标,以无水葡萄糖对照样品溶液浓度(x)为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程为y=0.7933x-0.0289,r=0.9994,结果表明,在0.342mg/ml~1.034mg/ml范围内,吸光度与浓度有良好的线性关系
(4)重复性试验
取实施例1制备的同一批样品,按照本实施例(2)中测定方法测定吸光度并计算含量,平行操作6份,结果测得总糖含量RSD%为0.7,表明方法重复性良好。
(5)回收率试验
精密量取已知含量的杜仲口服液25ml,置于50ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀后,精密量取5ml,置于50ml量瓶中,平行操作6份,分别向各份精密加入无水葡萄糖对照样品储备液5ml(浓度为84.264mg/ml),按本实施例(2)中测定方法测定吸光度,计算回收率,结果平均回收率为98.0%,RSD%为3.0,表明该方法准确度良好。
(6)三批样品含量测定
取按照实施例1制备的3批杜仲口服液(批号分别为:20120301、20120302、20120303),按照本发明建立的含量测定方法检测总糖含量,其结果分别为171mg/ml、169mg/ml和166mg/ml。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种杜仲口服液的质量检验方法,包括对杜仲口服液进行定性分析和定量检测,所述定量检测包括检测杜仲口服液中的黄芪甲苷含量以及杜仲口服液中的总糖含量。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述杜仲口服液中总糖含量为杜仲口服液中的刺五加所含糖类成分和黄芪所含糖类成分的总和。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述检测总糖含量以无水葡萄糖为对照样品,采用紫外-可见分光光度法,在490nm波长处测定对照样品和杜仲口服液待测样品的吸光度,并按外标法以吸光度值计算而得。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述检测杜仲胶含量以杜仲胶为对照样品,采用高效液相色谱法测定。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的方法,其特征在于,所述对杜仲口服液进行定性分析包括对刺五加进行鉴定和对黄芪进行鉴定。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述对刺五加进行鉴定和对黄芪进行鉴定通过采用薄层色谱法分别鉴定杜仲口服液中的异嗪皮啶和杜仲胶。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述采用薄层色谱法鉴定杜仲口服液中的异嗪皮啶包括以异嗪皮啶为对照样品,以甲醇为溶剂,以三氯甲烷-甲醇-水为展开剂,将对照样品溶液和杜仲口服液待测样品溶液在同一硅胶G薄层板上点样展开,并置于紫外光灯下进行检视。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述展开剂中三氯甲烷-甲醇-水的体积比为19∶1∶0.1。
9.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述采用薄层色谱法鉴定杜仲口服液中的杜仲胶包括以杜仲胶为对照样品,以甲醇为溶剂,以三氯甲烷-甲醇-水为展开剂,将对照样品溶液和杜仲口服液待测样品溶液在同一硅胶G薄层板上点样展开,并喷以硫酸乙醇溶液,加热至斑点显色清晰。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于1所述展开剂中三氯甲烷-甲醇-水的体积比为13∶7∶2。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20181123 |
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