CN108865961A - 一种利用大肠杆菌合成3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素的方法 - Google Patents

一种利用大肠杆菌合成3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用大肠杆菌合成3‑香叶草基‑4‑羟基苯甲酸和厦门霉素的方法，所采用的大肠杆菌菌株含有部分或全部经过密码子优化的厦门霉素合成相关基因及甲羟戊酸途径相关基因。该方法将厦门霉素合成所需的三个基因导入大肠杆菌；通过诱导表达这三个基因，在大肠杆菌中合成GBA和厦门霉素。进一步通过引入甲羟戊酸合成途径提高大肠杆菌胞内牻牛儿基焦磷酸的供给；并通过向发酵培养基中加入4‑羟基苯甲酸进一步提高GBA的产量。本发明合成3‑香叶草基‑4‑羟基苯甲酸的产量达到94mg/L，合成厦门霉素的产量达到11mg/L。本发明首次实现了3‑香叶草基‑4‑羟基苯甲酸和厦门霉素在大肠杆菌中的生物合成。

Description

一种利用大肠杆菌合成3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉 素的方法
技术领域
本发明属于合成生物学领域，涉及一种生产3-香叶草基-4-羟基苯甲酸及其终产物厦门霉素的菌株。
背景技术
厦门霉素是厦门链霉菌产生的苯并吡喃类化合物。动物实验表明，其能够抑制纤维原细胞的收缩能力，并且能够很明显的减弱增生性瘢痕。目前，纤维化疾病以及心血管纤维化等已严重危害人类的健康。我们已证实厦门霉素是具有抗纤维化活性的新型小分子药物候选化合物。
厦门霉素在野生型厦门链霉菌中的产量约为10mg/L，且生产周期长。构建能高效合成厦门霉素的前体及终产物的基因工程菌具有潜在的应用价值。
3-香叶草基-4-羟基苯甲酸是一类重要的活性天然产物，是beta-secretase-1抑制剂，具有治疗阿尔兹海默症的潜力，近年来对该类化合物的化学合成和活性研究已成为热点。如现有文献名称为“Bioactive prenylated phenyl derivatives derived frommarine natural products:novel scaffolds for the design of BACE inhibitors”中公开了GBA及其衍生物的化学合成方法，通过初步的构效关系研究发现该类化合物是治疗阿尔兹海默症的活性先导化合物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，首次提供一种利用大肠杆菌生产厦门霉素的前体3-香叶草基-4-羟基苯甲酸的菌株，并进一步异源合成厦门霉素。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种大肠杆菌菌株，所述菌株含有部分或全部经过密码子优化的厦门霉素合成相关基因及甲羟戊酸途径相关基因；所述的厦门霉素相关基因包括IDS2，ximB,ximD和ximE基因；所述的甲羟戊酸途径相关的基因包括mvaE,mvaS,ERG12，ERG8，MVD1和idI基因。
所述IDS2为将异戊二烯焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸缩合为牻牛儿基焦磷酸的基因；所述ximB为将4-羟基苯甲酸和牻牛儿基焦磷酸缩合为3-香叶草基-4-羟基苯甲酸的基因；所述ximD和ximE为将3-香叶草基-4-羟基苯甲酸转化为厦门霉素的基因；所述mvaE为将乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A的基因；所述mvaS为将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合为HMG-CoA的基因；所述mvaE为将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因；所述ERG12为将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因；所述ERG8为将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因；所述MVD1为将甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊二烯焦磷酸的基因；所述idI为将异戊二烯焦磷酸异构为二甲基丙烯基焦磷酸的基因。
所述的厦门霉素合成相关基因优选为来源于Streptomyces xiamenensis 318的ximB(AGY49248.1)，ximD(AGY49246.1)和ximE(AGY49249.1)，
以及IDS2优选为来源于以Picea abies的IDS2(ACA21458.2)基因为基础进行密码子优化并截短后得到，其序列如SEQ ID NO.5。
所述的甲羟戊酸途径相关基因优选为来源于Enterococcus.Faecalis的mvaE(CP022488.1：1180790-1183201、mvaS(CP022488.1：1179453-1180604)，和来源于酿酒酵母的ERG12(329138949：684467-685798)、ERG8(329138949：712316-713671)、MVD1(329138953：701895-703085)和来源于大肠杆菌BL21(DE3)的idI(CPC001509.3：2863926-2864474)基因。
优选地，所述的ximE基因经过密码子优化(即ximEsyn基因)，其序列如SEQ IDNO.1所示。优化后的IDS2和ximE基因更利于基因的表达；如果采用未优化的IDS2和/或ximE用于本发明中，可能的不利影响在于目的化合物的产量会降低。
优选地，所述菌株为含有质粒pXM-IDS2-ximB和质粒pMVA的菌株或含有质粒pXM4和质粒pMVA的菌株。
优选地，所述质粒pXM-IDS2-ximB的序列如SEQ ID NO.2所示；所述质粒pXM4的序列如SEQ ID NO.3所示；所述质粒pMVA的序列如SEQ ID NO.4所示。
所述质粒pXM-IDS2-ximB以pET24b(+)为骨架，启动子为T7强启动子，复制子为自带的pBR322复制子，T7启动子下游的Xba I酶切位点转移至T7启动子上游、Bgl II下游，包括IDS2和ximB基因。
所述质粒pXM4以pET24b(+)为骨架，启动子为T7强启动子，复制子为自带的pBR322复制子，T7启动子下游的Xba I酶切位点转移至T7启动子上游、Bgl II下游，包括IDS2、ximB、ximD和ximE基因。
所述质粒pMVA以pCDF-Duet-1为骨架，复制子为CloDF13复制子，包括有T7启动子控制的mvaE和mvaS基因，以及由另一T7启动子控制的ERG12、ERG8、MVD1和idI基因。
第二方面，本发明提供了一种大肠杆菌菌株在生产3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素中的应用。
优选地，所述生产3-香叶草基-4-羟基苯甲酸的大肠杆菌菌株为含有质粒pXM-IDS2-ximB和质粒pMVA的菌株；所述生产厦门霉素的大肠杆菌菌株为含有质粒pXM4和质粒pMVA的菌株。
第三方面，本发明提供了一种3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素的生产方法，包括以下步骤：将权利要求1-4任一项所述的大肠杆菌菌株接入培养基中培养，然后加入IPTG诱导后，萃取即得。
优选地，生产3-香叶草基-4-羟基苯甲酸时，所述活化后的大肠杆菌菌株接入含葡萄糖的LB培养基中；所述诱导过程为：待OD600达到0.6-1.0时加入IPTG诱导，然后加入终浓度为100-500mg/L的4-羟基苯甲酸。
更优选地，所述含葡萄糖的LB培养基中，葡萄糖的含量为0.2％，所述培养基中包括50μg/mL卡那霉素、34μg/mL氯霉素；
所述诱导过程为：待OD600达到0.6-1.0时加入终浓度为0.05mM的IPTG诱导，30℃，180rpm诱导24小时；且在诱导1小时后加入终浓度为100-500mg/L的4-羟基苯甲酸。
更优选地，所述4-羟基苯甲酸的加入终浓度为250mg/L。3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素的产量达到最大。
优选地，生产厦门霉素时，所述大肠杆菌菌株先接入LB培养基中，过夜培养；然后接种到含葡萄糖的YTG2培养基中，培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG诱导后，再加入终浓度为100-500mg/L的4-羟基苯甲酸发酵。
更优选地，所述LB培养基中包括34μg/mL氯霉素，50μg/mL卡那霉素，100μg/mL链霉素；
所述过夜培养于37℃，220rpm下进行；然后按1％接种量接种到含葡萄糖的YTG2培养基中，37℃，220rpm培养至OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.05mM的IPTG诱导，30℃，180rpm诱导2小时后，再加入终浓度为100-500mg/L的4-羟基苯甲酸发酵24小时。
更优选地，所述YTG2培养基中，含有2g/L葡萄糖、0.2％甘油。
本发明的方法是将厦门霉素合成所需的三个基因，包括异戊烯基转移酶、单加氧酶和环化酶，导入大肠杆菌Rosetta(DE3)；通过诱导表达这三个基因，在大肠杆菌中合成3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素。进一步通过引入甲羟戊酸合成途径，提高大肠杆菌胞内牻牛儿基焦磷酸的供给；并通过向发酵培养基中加入4-羟基苯甲酸，可进一步提高厦门霉素的产量。本发明利用代谢工程技术构建的大肠杆菌基因工程菌合成3-香叶草基-4-羟基苯甲酸的产量达到94mg/L，合成厦门霉素的产量达到11mg/L。本发明第一次实现了3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素在大肠杆菌中的生物合成。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明利用外源的组合而来的甲羟戊酸途径和厦门霉素合成途径获得了稳定生产3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素的大肠杆菌。本发明构建的微生物能够稳定产生3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素，为后续进一步合成利用微生物生产厦门霉素和3-香叶草基-4-羟基苯甲酸奠定了基础，具有潜在的应用前景。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是厦门霉素合成途径示意图；
图2是3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素异源合成示意图；
图3是质粒pXM示意图；
图4是质粒pXM-ximB示意图；
图5是质粒pXM-ximD示意图；
图6是质粒pXM-ximE示意图；
图7是质粒pXM3示意图；
图8是质粒pXM-IDS2-ximB示意图；
图9是质粒pXM4示意图；
图10是pMVA示意图；
图11是HPLC检测3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素示意图；其中，图11a为阴性对照菌株(含空载的Rosetta(DE3)菌株)的HPLC图谱；图11b为产厦门霉素菌株XM03发酵液HPLC图谱；图11c为厦门霉素标准品HPLC图谱；
图12是3-香叶草基-4-羟基苯甲酸UPLC-MS检测示意图；其中，图12a为3-香叶草基-4-羟基苯甲酸标准品MS图；图12b为菌株XM02合成GBA的MS图；
图13是厦门霉素UPLC-MS检测示意图；其中，图13a为厦门霉素标准品MS图；图13b为菌株XM03合成的厦门霉素的MS图；
图14是3-香叶草基-4-羟基苯甲酸产量图；其中图14a为菌株XM01与XMO2的产量对比图；图14b为菌株XMO2不同4-羟基苯甲酸浓度下的产量对比图；
图15是3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素产量图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1 3-香叶草基-4-羟基苯甲酸及其终产物厦门霉素合成途径质粒构建
质粒pXM由pET24b(+)(Novagen,Darmstadt,Germany)改造而来，含有同尾酶XbaI/Spe I酶切位点。质粒pXM3含有厦门霉素合成基因簇中的三个基因：来源于Streptomycesxiamenensis 318的ximB基因(4-羟基苯甲酸异戊烯基转移酶)、ximD基因(单加氧酶)和ximE基因(环化酶)。所有基因均通过PCR扩增获得，其中ximB基因、ximD基因以Streptomyces xiamenensis 318基因组为模板扩增而来，ximEsyn基因为针对大肠杆菌密码子优化后基因。
本发明所述的厦门霉素合成示意图如图1所示，所述3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素异源合成示意图如图2所示。
实施例中所用引物见表1：
表1引物列表
具体构建方法如下：
(1)质粒pXM的构建
利用常规的突变的方法将pET24b(+)(Novagen,Darmstadt,Germany)载体上核糖体结合位点(RBS)上游和lac operator下游之间的Xba I酶切位点突变，删除此酶切位点，而在Bgl II酶切位点和T7启动子之间引入Xba I酶切位点。以pET24b(+)载体为模板，用引物Xba I F/BgI II和Xba I R/Nde I扩增得到目的片段。胶回收目的片段后，将pET24b(+)载体和目的片段分别用Bgl II和Nde I双酶切，纯化酶切产物后，按照目的片段：载体＝5：1的摩尔比连接后转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子验证后获得质粒pET24b/XbaI。
用引物Spe I F-1/SpeI和Spe I R/Dra III，以pET24b(+)为模板，PCR扩增得到PCR产物。再以此PCR产物为模板，以Spe I F-2/Bpu1102I和Spe I R/Dra III为引物，扩增得到二次PCR产物，将质粒pET24b/XbaI和第二次扩增得到的二次PCR产物分别用Bpu1102I和Dra III双酶切，纯化酶切产物后，按照目的片段：载体＝5：1的摩尔比连接后转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子验证后得到质粒pXM(图3)。
(2)质粒pXM3的构建
用引物ximB-F和ximB-R、引物ximD-F和ximD-R，以Streptomyces xiamenensis318基因组为模板，扩增含相应酶切位点的目的片段；ximEsyn为密码子优化后序列(SEQ IDNO.1)，由上海生工合成，以ximE-F，ximE-R为引物扩增含酶切位点的片段。PCR产物经回收后和质粒pXM分别酶切，按照目的片段：载体＝5：1的摩尔比连接后转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子验证后分别得到重组载体pXM-ximB(图4)、pXM-ximD(图5)、pXM-ximE(图6)。以引物pXM-F和pXM-R为扩增引物，pXM-ximD质粒为扩增模板扩增含有T7启动子和T7终止子的ximD目的片段。PCR产物回收后Bgl II/Spe I双酶切，载体pXM-ximE以Bgl II/Xba I双酶切，按照目的片段：载体＝5：1的摩尔比连接后转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子验证后得到质粒pXM-ximD-ximE。再按照上述同尾酶方法构建重组载体pXM-ximB-ximD-ximE，命名为pXM3(图7)。
(3)pXM-IDS2-ximB构建
以IDS2-F/IDS2-R为引物，质粒GlgA1-Ptrc-GPPS-FNI-MK-PMD-PMK-SmR-psbA2(Addgene plasmid#73340)为模板，扩增经密码子优化并截短后的IDS2基因(序列为SEQ IDNO.5，本实施例采用的该基因直接购买自addgene：http://www.addgene.org/73340/)。PCR产物经回收后和质粒pXM分别酶切，按照目的片段：载体＝5：1的摩尔比连接后转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子验证后得到重组载体pXM-IDS2，再按照上述同尾酶方法构建重组载体pXM-IDS2-ximB(SEQ ID NO.2)(图8)。
(4)质粒pMVA的构建
以Gibson-MvaE-F/Gibson-MvaE-R和Gibson-MvaS-F/Gibson-MvaS-R为扩增引物，pSMART-Mev1(Addgene plasmid#65815)为模板，分别扩增mvaE、mvaS基因，组装至Nde I/Xho I线性化处理后的pCDF-Duet-1(Novagen)质粒上得到pCDF-mvaE-mvaS质粒。ERG12,ERG8和MVD1基因分别以pair Gibson-ERG12-F1/Gibson-ERG12-R1,Gibson-ERG8-F1/Gibson-ERG8-R1和MVD1-F/MVD1-R为引物，以pMBIS(Martin,V.,et al.,2003.Engineeringa mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids,Naturebiotechnology 21,796-802)为模板扩增得到。idI基因以idI-F/idI-R为模板，以E.coliBL21(DE3)基因组为模板扩增得到。MVD1和idI通过重叠PCR得到MVD1-idI片段，EGR12，ERG8和MVD1-idI三个片段以吉布森组装方法组装到Sac I/Not I线性化后的pCDF-mvaE-mvaS质粒上得到pMVA(SEQ ID NO.4)(图10)。
(5)质粒pXM4的构建
以引物pXM-F和pXM-R为扩增引物，以pXM3质粒为模板扩增得到PCR产物。PCR产物回收后Bgl II/Spe I双酶切，载体pXM-IDS2以Bgl II/Xba I双酶切，按照目的片段：载体＝5：1的摩尔比连接后转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子验证后得到质粒pXM4(SEQ ID NO.3)(图9)。
实施例2 3-香叶草基-4-羟基苯甲酸生产菌株的构建
直接将质粒pXM-IDS2-ximB转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，获得菌株XM01，再将pMVA转入菌株XM01得到XM02菌株。
实施例3厦门霉素生产菌株的构建
将质粒pXM4和pMVA转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，获得菌株XM03。
实施例4摇瓶发酵生产3-香叶草基4-羟基苯甲酸
将37℃过夜活化后的重组菌株XM01转接到三瓶50mL含50μg/mL卡那霉素、34μg/mL氯霉素的液体LB培养基(含0.2％葡萄糖)中，待OD600达到0.6-0.8时加入终浓度为0.05mM的IPTG诱导，30℃，180rpm诱导24小时。乙酸乙酯萃取后HPLC检测。
菌株XM02过夜活化后转接到50mL含50μg/mL卡那霉素、100μg/mL链霉素、34μg/mL氯霉素的液体LB培养基(含0.2％葡萄糖)中，待OD600达到0.6-0.8时加入终浓度为0.05mM的IPTG诱导，诱导1小时后分别加入终浓度为100,200,250,300和500mg/L的4-羟基苯甲酸，每组三个平行。诱导24小时后乙酸乙酯萃取，HPLC--MS检测。
HPLC条件如下：安捷伦C18反相柱(Extend-C18reverse phase column Agilent,150x 4.6mm)；溶剂A:水,含0.5‰三氟乙酸；溶剂B:甲醇,含0.5‰三氟乙酸；流动相:0-5min,20％甲醇；5-30min,20％-100％甲醇；35-35.1min,100％-20％甲醇；35.1-43min,20％甲醇；流速:1mL/min；检测波长:190-800nm.
经HPLC检测(图14(a))，在诱导后的重组菌株XM01中3-香叶草基-4-羟基苯甲酸的产量为0.63mg/L，XM02菌株中3-香叶草基-4-羟基苯甲酸的最高产量为94.30mg/L(图14(b))，产量相比XM01提高148倍。
3-香叶草基-4-羟基苯甲酸UPLC-MS检测结果如图12所示，其结果显示，XM02菌株成功合成3-香叶草基-4-羟基苯甲酸。3-香叶草基-4-羟基苯甲酸产量如图14所示，结果显示，在添加250mg/L 4-HBA苯甲酸时，XM02菌株中3-香叶草基-4-羟基苯甲酸的产量达到94.3mg/L。
实施例5摇瓶发酵生产厦门霉素
挑取三个XM03菌株的单菌落到LB培养基中(同时含有34μg/mL氯霉素，50μg/mL卡那霉素，100μg/mL链霉素)，于37℃，220rpm过夜培养。随后按1％(v/v)接种量分别接种到50mL如下培养基：YTG2(2×YT含0.2％甘油、2g/L葡萄糖)、RM培养基(5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、15g/L甘油,10g/L NaCl以及100mM HEPES,pH 7.6)、SOB2培养基(SOB培养基含2g/L葡萄糖)、TB1(TB培养基含2g/L葡萄糖)、LB2培养基(LB含1g/L葡萄糖)，37℃，220rpm培养至OD600约为0.6-0.8时，加入终浓度为0.05mM的IPTG进行诱导表达，并添加250mg/L 4-HBA，于30℃，诱导24h后乙酸乙酯萃取，HPLC分析。
以厦门霉素标品作为对照，HPLC检测结果显示(图11)，经24h诱导发酵后，厦门霉素产量在YTG2培养基中最高，约为11.36mg/L，其中有48.5mg/L的3-香叶草基-4-羟基苯甲酸未完全转化(图15)。
厦门霉素UPLC-MS检测结果如图13所示，其结果显示，XM03菌株成功合成厦门霉素。厦门霉素产量如图15所示，结果显示，在YTG2培养基中厦门霉素的产量达到11.36mg/L。
结论：
在重组菌株中检测到厦门霉素，证明将厦门霉素合成基因簇引入异源宿主大肠杆菌中是可行的。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种利用大肠杆菌合成3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素的方法
<130> DAG36244
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggtcaga ctacgcacac cgcactggat cgttacatgg agctggcaga ccgtgcagta 60
cgtgacccta gcgcactggc tgaactgccg actatcttcg ctccggatgc tactgtaacg 120
ctgcgtgatg agccggttac cggtatgcca gctatcatgg aattctaccg cgtgtttgtc 180
gcggcggtgg ctgaatccaa acactactgg accaccacga tcctggaaga cggcaccatt 240
gaatctcact gggtggttgc ggcccgtcgt gcggatggtt ctctgatgac cgcggccggt 300
gttgaacatg ccactgttga caccgacggc ctgattacca acctgcgtaa tcgctatacc 360
cgcactccgg gctaa 375
<210> 2
<211> 7443
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atccggaact agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtcaaaag actctccccg 180
caacgatggc gacgagcacg agccacccga agaaacggtt tgccatgaac ttttcccggc 240
agtcggcagg gctgtcgatg tccaccgtca ccacctgcca gagcaggtgt gccacgcccg 300
gcagaaacag cgcgtagaac gtccagtgca gatcggcgac ggctccggca gccacgatcc 360
cgaccacggt cgccccgtaa aacccggcga cccagggccg ggtcgccctg ccgaggcgca 420
gcgcgaggga cttcaccccc acctgcacgt cgtccgcctt gtcctggtgg gcgtagatcg 480
tgtcgtaccc cagcgtccag aagacaccgg cgacgaagag caggagcgcg ggagtctcga 540
tcctcccggc caccgcgagc caacccgcga ggatgtagca gccgaagacc atccccagcc 600
aggcctgcgg ccagtaggtg atccgcttca tgaacgggta cgcgaccacg agcggatagg 660
aggcggccac gaacaccgcc gccggaacgc tggccgcagc cagcacgagc agccccgcca 720
ccgcctgcac cacggcgaag acaagcgctc ccgtgaccgt gaccgtaccg gccacgagcg 780
gcctcccgac ggtacgtgcc acccgggcgt cgaacttgcg gtcggcaagg tcgttgacga 840
cgcagccgaa gccgcgcacc agcaccccac cgaccgtgaa cagcagcacc tggcgccagt 900
cgggcagccc cgccgaggcg agcgcgatcc cccacaggcc ggggaggagg tacagccaac 960
tgcctatggg cgcgtgcata cgcgccagtt gtagataggg gaggacggcc ttcggcgcac 1020
tcggcacgac cgacgccgcg atgctcggca cgacgaaccg atatcgcgtg ctctgctgcg 1080
agggttgagc ggaaatatcg atcaccatat gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat 1140
tatttgtaga ggggaattgt tatccgctca caattcccct atagtgagtc gtattaattt 1200
tttctagttc ctcctttcag caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt 1260
tatgctagtt attgctcagc ggtggcagca gccaactcag cttcctttcg ggctttgtta 1320
gcagccggat ctcagtggtg gtggtggtgg tgctcgagtg cggccgcaag cttttaattc 1380
tgacgagatg caatgtagtc tgctaacgca aatagaggtg ctgctttggt aggatcaaaa 1440
caactaagtt cctgttttcc acggttcagt aattcatcgg caaattcctt cgctttttcc 1500
aaacccatga gtttgggata ggtggctttg tcagaaatca aatctttccc agcagtcttt 1560
ccgagttctt ccgaggactg gcttacatcc aaaatatcat cgacaacttg gaaaagcaat 1620
cctacacagc gagcgtaccg tctagcacgc tcgatgtcgt cctcgctggc accccccata 1680
attgcgccac acacgacact gcattccaac aacacagccg ttttatgaat atggacccat 1740
tccagcgttt ctaagtctat actgggatca ccttcgcttt caatatccac cacttgacca 1800
cccatcacgc cctcacttcc tgtggcgcgt ccaatttcgg atagcaaccg taaaataatg 1860
tcagtaccta gggtacgact ggtgctcacg gctacatgtt caaaggccaa tgacaataat 1920
gcatcgccag caatgatcgc cgtgtcttca ccaaaaactt tgtggttggt aggcttaccg 1980
cgacgcaaat catcgttatc aatatagggc aaatcgtcat gaatcaaact catagtgtga 2040
atcatctcga tggcacaagc cgtaggcatg gcaagttcct cagtcccccc cattagctca 2100
caggccgcaa tacataaaat tggtcgaacc ctcttcccgc cggctaggag ggaatagcgc 2160
atactttcat agattttttg aggatagcgg gggggaataa ctttatctaa ggcctcatta 2220
accgcaatgg ccttggagtg catatacttg tcaaaatcaa attccaccac gttttttact 2280
tgttcggata gatcagctag ttggaccaag gccttactgc tgcgcgtcat cggatcccga 2340
cccatttgct gtccaccagt catgctagcc atatgtatat ctccttctta aagttaaaca 2400
aaattatttg tagaggggaa ttgttatccg ctcacaattc ccctatagtg agtcgtatta 2460
attttttcta gacgagatct cgatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg 2520
cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc 2580
tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc 2640
cgggggactg ttgggcgcca tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa 2700
cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg 2760
agatcccgga caccatcgaa tggcgcaaaa cctttcgcgg tatggcatga tagcgcccgg 2820
aagagagtca attcagggtg gtgaatgtga aaccagtaac gttatacgat gtcgcagagt 2880
atgccggtgt ctcttatcag accgtttccc gcgtggtgaa ccaggccagc cacgtttctg 2940
cgaaaacgcg ggaaaaagtg gaagcggcga tggcggagct gaattacatt cccaaccgcg 3000
tggcacaaca actggcgggc aaacagtcgt tgctgattgg cgttgccacc tccagtctgg 3060
ccctgcacgc gccgtcgcaa attgtcgcgg cgattaaatc tcgcgccgat caactgggtg 3120
ccagcgtggt ggtgtcgatg gtagaacgaa gcggcgtcga agcctgtaaa gcggcggtgc 3180
acaatcttct cgcgcaacgc gtcagtgggc tgatcattaa ctatccgctg gatgaccagg 3240
atgccattgc tgtggaagct gcctgcacta atgttccggc gttatttctt gatgtctctg 3300
accagacacc catcaacagt attattttct cccatgaaga cggtacgcga ctgggcgtgg 3360
agcatctggt cgcattgggt caccagcaaa tcgcgctgtt agcgggccca ttaagttctg 3420
tctcggcgcg tctgcgtctg gctggctggc ataaatatct cactcgcaat caaattcagc 3480
cgatagcgga acgggaaggc gactggagtg ccatgtccgg ttttcaacaa accatgcaaa 3540
tgctgaatga gggcatcgtt cccactgcga tgctggttgc caacgatcag atggcgctgg 3600
gcgcaatgcg cgccattacc gagtccgggc tgcgcgttgg tgcggatatc tcggtagtgg 3660
gatacgacga taccgaagac agctcatgtt atatcccgcc gttaaccacc atcaaacagg 3720
attttcgcct gctggggcaa accagcgtgg accgcttgct gcaactctct cagggccagg 3780
cggtgaaggg caatcagctg ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc accctggcgc 3840
ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac 3900
aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtaag ttagctcact 3960
cattaggcac cgggatctcg accgatgccc ttgagagcct tcaacccagt cagctccttc 4020
cggtgggcgc ggggcatgac tatcgtcgcc gcacttatga ctgtcttctt tatcatgcaa 4080
ctcgtaggac aggtgccggc agcgctctgg gtcattttcg gcgaggaccg ctttcgctgg 4140
agcgcgacga tgatcggcct gtcgcttgcg gtattcggaa tcttgcacgc cctcgctcaa 4200
gccttcgtca ctggtcccgc caccaaacgt ttcggcgaga agcaggccat tatcgccggc 4260
atggcggccc cacgggtgcg catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg gctaggctgg 4320
cggggttgcc ttactggtta gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac 4380
tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt 4440
tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc 4500
gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa gcgctggcat 4560
tgaccctgag tgatttttct ctggtcccgc cgcatccata ccgccagttg tttaccctca 4620
caacgttcca gtaaccgggc atgttcatca tcagtaaccc gtatcgtgag catcctctct 4680
cgtttcatcg gtatcattac ccccatgaac agaaatcccc cttacacgga ggcatcagtg 4740
accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg 4800
cttctggaga aactcaacga gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt 4860
cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 4920
aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 4980
agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 5040
acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 5100
ttgtactgag agtgcaccat atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 5160
ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 5220
gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 5280
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 5340
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 5400
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 5460
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 5520
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 5580
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 5640
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 5700
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 5760
gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 5820
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 5880
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 5940
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 6000
acgttaaggg attttggtca tgaacaataa aactgtctgc ttacataaac agtaatacaa 6060
ggggtgttat gagccatatt caacgggaaa cgtcttgctc taggccgcga ttaaattcca 6120
acatggatgc tgatttatat gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg 6180
cgacaatcta tcgattgtat gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca 6240
aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat 6300
ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca 6360
ccactgcgat ccccgggaaa acagcattcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg 6420
aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta 6480
attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata 6540
acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag 6600
tctggaaaga aatgcataaa cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg 6660
atttctcact tgataacctt atttttgacg aggggaaatt aataggttgt attgatgttg 6720
gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg 6780
agttttctcc ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata 6840
tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt ctaagaatta attcatgagc 6900
ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 6960
cgaaaagtgc cacctgaaat tgtaaacgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt 7020
tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca 7080
aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta 7140
aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta 7200
cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg 7260
aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga 7320
aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg 7380
ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg 7440
cca 7443
<210> 3
<211> 9755
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atccggaact agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagttagccc ggagtgcggg 180
tatagcgatt acgcaggttg gtaatcaggc cgtcggtgtc aacagtggca tgttcaacac 240
cggccgcggt catcagagaa ccatccgcac gacgggccgc aaccacccag tgagattcaa 300
tggtgccgtc ttccaggatc gtggtggtcc agtagtgttt ggattcagcc accgccgcga 360
caaacacgcg gtagaattcc atgatagctg gcataccggt aaccggctca tcacgcagcg 420
ttacagtagc atccggagcg aagatagtcg gcagttcagc cagtgcgcta gggtcacgta 480
ctgcacggtc tgccagctcc atgtaacgat ccagtgcggt gtgcgtagtc tgacccatca 540
tatgtatatc tccttcttaa agttaaacaa aattatttgt agaggggaat tgttatccgc 600
tcacaattcc cctatagtga gtcgtattaa ttttttctag ttcctccttt cagcaaaaaa 660
cccctcaaga cccgtttaga ggccccaagg ggttatgcta gttattgctc agcggtggca 720
gcagccaact cagcttcctt tcgggctttg ttagcagccg gatctcagtg gtggtggtgg 780
tggtgctcga gtgcggccgc aagcttcgtc gtctccatca tcgtgtactc ctgccggatc 840
cgctcctccg gcacaccatt gacccgcgcc gcgcgaagca ccaaatccgg tgccatcagc 900
gacgccggat gggcggtcat gaaccccacc gcccgcaggg ccgtgccgac ctgctcgtcc 960
cggcccgctg cctcccgtac ctgtcgcagg gcccacgcct gccgccgccc ctgatcggtg 1020
gccggtggcg ttgccaggcc cagccggatg gcgtcgccgg ccgtggacgt ctgccacgcg 1080
gcttcgacga cgaccttttc cagctcgagg aagtgccggg ccggggcgtc caggtcgggg 1140
ccagagcgca ggaactccga caggcaggag gcgtggagcg cggccgagga cataccttgc 1200
ccgtacaggg ggttgaacga ggcgacggcg tcgccgagga ccgccaggcg ggcggggaag 1260
cggtcgagcg cctcgaagtg gcgccacctg ctgtcggggt ggcggtacgg gacaacctcg 1320
ccgacgattt cgcccttgac ggcttcctgg aagatcggtg gcagctcacg gcaccgggcg 1380
acgaactcgt cggccgtgcg gccctcggcg ccgttgccga agtgggcgag catcaccacc 1440
cactgttggt tctcgatcgg gttgaccgcc gctccggcga tgtccttcgg gaaatgcggg 1500
ctgtagcggg agatgccgct gagggggccg tcccagtcgg ccgagcgcgt gaaacgggca 1560
gacaagtagc ggatgtcggt ctggagccgt tgcgtctccg gtcggggcca gccgccctgc 1620
tccagccagt cactcagcct gctgccgcgg ccggaggcgt cgacgacgaa gtcggctggg 1680
gcgacgacgt ggtcgccgcc aaccgcgtag cgcaccgact cgacggcgcc gcgcgcgtac 1740
cgcagcccaa tgacgcgtcc actcaccagc tcgacgttgg gcagtgcgag cgcgcgccga 1800
cggatcagcg tctccaggaa ggggcgactg ctccccagga accgcgcgtt gggcgtggcg 1860
atctgctcga tgtcgtcgag gtaggtggcg gtgcgctccg gaccgcacga cacagcaccc 1920
ccggcgaggg cctctgccac gacaccgggg aagaagcgtt cgagctgcgc gcgtccgccg 1980
ggcagcagga ggtgcacctg ggagccctgc gggacgccgg gacgagccgc gccgctgagc 2040
gcggcttccg gcaggtcggg ctcgatgatc acgacacggt tggcgtggtc cgcgagtacg 2100
cgggccgcga ccaggccggc gacgccgccg ccgagcacgc aggcggtgcc gagacgaacc 2160
tcgatgcgga ccggcgggac ggtggtggtg agccgctcga agaccgcggc gggagagttc 2220
ggcatatgta tatctccttc ttaaagttaa acaaaattat ttgtagaggg gaattgttat 2280
ccgctcacaa ttcccctata gtgagtcgta ttaatttttt ctagttcctc ctttcagcaa 2340
aaaacccctc aagacccgtt tagaggcccc aaggggttat gctagttatt gctcagcggt 2400
ggcagcagcc aactcagctt cctttcgggc tttgttagca gccggatctc agtggtggtg 2460
gtggtggtgc tcgagtcaaa agactctccc cgcaacgatg gcgacgagca cgagccaccc 2520
gaagaaacgg tttgccatga acttttcccg gcagtcggca gggctgtcga tgtccaccgt 2580
caccacctgc cagagcaggt gtgccacgcc cggcagaaac agcgcgtaga acgtccagtg 2640
cagatcggcg acggctccgg cagccacgat cccgaccacg gtcgccccgt aaaacccggc 2700
gacccagggc cgggtcgccc tgccgaggcg cagcgcgagg gacttcaccc ccacctgcac 2760
gtcgtccgcc ttgtcctggt gggcgtagat cgtgtcgtac cccagcgtcc agaagacacc 2820
ggcgacgaag agcaggagcg cgggagtctc gatcctcccg gccaccgcga gccaacccgc 2880
gaggatgtag cagccgaaga ccatccccag ccaggcctgc ggccagtagg tgatccgctt 2940
catgaacggg tacgcgacca cgagcggata ggaggcggcc acgaacaccg ccgccggaac 3000
gctggccgca gccagcacga gcagccccgc caccgcctgc accacggcga agacaagcgc 3060
tcccgtgacc gtgaccgtac cggccacgag cggcctcccg acggtacgtg ccacccgggc 3120
gtcgaacttg cggtcggcaa ggtcgttgac gacgcagccg aagccgcgca ccagcacccc 3180
accgaccgtg aacagcagca cctggcgcca gtcgggcagc cccgccgagg cgagcgcgat 3240
cccccacagg ccggggagga ggtacagcca actgcctatg ggcgcgtgca tacgcgccag 3300
ttgtagatag gggaggacgg ccttcggcgc actcggcacg accgacgccg cgatgctcgg 3360
cacgacgaac cgatatcgcg tgctctgctg cgagggttga gcggaaatat cgatcaccat 3420
atgtatatct ccttcttaaa gttaaacaaa attatttgta gaggggaatt gttatccgct 3480
cacaattccc ctatagtgag tcgtattaat tttttctagt tcctcctttc agcaaaaaac 3540
ccctcaagac ccgtttagag gccccaaggg gttatgctag ttattgctca gcggtggcag 3600
cagccaactc agcttccttt cgggctttgt tagcagccgg atctcagtgg tggtggtggt 3660
ggtgctcgag tgcggccgca agcttttaat tctgacgaga tgcaatgtag tctgctaacg 3720
caaatagagg tgctgctttg gtaggatcaa aacaactaag ttcctgtttt ccacggttca 3780
gtaattcatc ggcaaattcc ttcgcttttt ccaaacccat gagtttggga taggtggctt 3840
tgtcagaaat caaatctttc ccagcagtct ttccgagttc ttccgaggac tggcttacat 3900
ccaaaatatc atcgacaact tggaaaagca atcctacaca gcgagcgtac cgtctagcac 3960
gctcgatgtc gtcctcgctg gcacccccca taattgcgcc acacacgaca ctgcattcca 4020
acaacacagc cgttttatga atatggaccc attccagcgt ttctaagtct atactgggat 4080
caccttcgct ttcaatatcc accacttgac cacccatcac gccctcactt cctgtggcgc 4140
gtccaatttc ggatagcaac cgtaaaataa tgtcagtacc tagggtacga ctggtgctca 4200
cggctacatg ttcaaaggcc aatgacaata atgcatcgcc agcaatgatc gccgtgtctt 4260
caccaaaaac tttgtggttg gtaggcttac cgcgacgcaa atcatcgtta tcaatatagg 4320
gcaaatcgtc atgaatcaaa ctcatagtgt gaatcatctc gatggcacaa gccgtaggca 4380
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ccctcttccc gccggctagg agggaatagc gcatactttc atagattttt tgaggatagc 4500
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ccatatgtat atctccttct taaagttaaa caaaattatt tgtagagggg aattgttatc 4740
cgctcacaat tcccctatag tgagtcgtat taattttttc tagacgagat ctcgatcctc 4800
tacgccggac gcatcgtggc cggcatcacc ggcgccacag gtgcggttgc tggcgcctat 4860
atcgccgaca tcaccgatgg ggaagatcgg gctcgccact tcgggctcat gagcgcttgt 4920
ttcggcgtgg gtatggtggc aggccccgtg gccgggggac tgttgggcgc catctccttg 4980
catgcaccat tccttgcggc ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggctgcttc 5040
ctaatgcagg agtcgcataa gggagagcgt cgagatcccg gacaccatcg aatggcgcaa 5100
aacctttcgc ggtatggcat gatagcgccc ggaagagagt caattcaggg tggtgaatgt 5160
gaaaccagta acgttatacg atgtcgcaga gtatgccggt gtctcttatc agaccgtttc 5220
ccgcgtggtg aaccaggcca gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc 5280
gatggcggag ctgaattaca ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc 5340
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ggcgattaaa tctcgcgccg atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg 5460
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taatgttccg gcgttatttc ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt 5640
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gcataaatat ctcactcgca atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag 5820
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gatgctggtt gccaacgatc agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg 5940
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cgccctgcac cattatgttc cggatctgca tcgcaggatg ctgctggcta ccctgtggaa 6840
cacctacatc tgtattaacg aagcgctggc attgaccctg agtgattttt ctctggtccc 6900
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tggcccgctt tatcagaagc cagacattaa cgcttctgga gaaactcaac gagctggacg 7140
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gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga 7260
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atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatatgcgg 7440
tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc 7500
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 7560
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 7620
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 7680
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 7740
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 7800
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ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt 8760
cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt 8820
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cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca 9060
ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct 9120
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cgatgagttt ttctaagaat taattcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 9240
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ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat 9360
aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg 9420
ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc 9480
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cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg 9660
gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc 9720
ttaatgcgcc gctacagggc gcgtcccatt cgcca 9755
<210> 4
<211> 11824
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60
gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattcgag 120
ctcgatgtca ttaccgttct taacttctgc accgggaaag gttattattt ttggtgaaca 180
ctctgctgtg tacaacaagc ctgccgtcgc tgctagtgtg tctgcgttga gaacctacct 240
gctaataagc gagtcatctg caccagatac tattgaattg gacttcccgg acattagctt 300
taatcataag tggtccatca atgatttcaa tgccatcacc gaggatcaag taaactccca 360
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tttacccatc ggtgctgggt tgggctcaag cgcctctatt tctgtatcac tggccttagc 600
tatggcctac ttgggggggt taataggatc taatgacttg gaaaagctgt cagaaaacga 660
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gatcctaacc tatactagaa ttccaaggtc tacaaaagat cttgttgctc gcgttcgtgt 900
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cgatgatttg agaattggct ccacaaaact taccggtgct ggtggcggcg gttgctcttt 1200
gactttgtta cgaagagaca ttactcaaga gcaaattgac agcttcaaaa agaaattgca 1260
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cggttcattg caagggtctg ataagtttga agtgcgtgtg aaaagtaaac aatttaaaga 1680
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catggacgac tactgcaata gaaacttgtt cgttattgat attttctctg atgatgccta 1860
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acaagaaaca aacgaatctt tgattgacgc aaagactggt ctaccaaagg aataattctc 4080
catacccgtt ttttgggcta acaaggagat taaatgcaaa cggaacacgt cattttattg 4140
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ggcgtcccac cggtcatcca tatccgatgg ttgatggtcc tctgtccaat gaaacttata 7860
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attacgacgc tctggctttt cacattccat acacgaaaat gggcaaaaaa gccctcttag 7980
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agtggacaaa ttcttccaac tgatctgcgc gcgaggccaa gcgatcttct tcttgtccaa 8820
gataagcctg tctagcttca agtatgacgg gctgatactg ggccggcagg cgctccattg 8880
cccagtcggc agcgacatcc ttcggcgcga ttttgccggt tactgcgctg taccaaatgc 8940
gggacaacgt aagcactaca tttcgctcat cgccagccca gtcgggcggc gagttccata 9000
gcgttaaggt ttcatttagc gcctcaaata gatcctgttc aggaaccgga tcaaagagtt 9060
cctccgccgc tggacctacc aaggcaacgc tatgttctct tgcttttgtc agcaagatag 9120
ccagatcaat gtcgatcgtg gctggctcga agatacctgc aagaatgtca ttgcgctgcc 9180
attctccaaa ttgcagttcg cgcttagctg gataacgcca cggaatgatg tcgtcgtgca 9240
caacaatggt gacttctaca gcgcggagaa tctcgctctc tccaggggaa gccgaagttt 9300
ccaaaaggtc gttgatcaaa gctcgccgcg ttgtttcatc aagccttacg gtcaccgtaa 9360
ccagcaaatc aatatcactg tgtggcttca ggccgccatc cactgcggag ccgtacaaat 9420
gtacggccag caacgtcggt tcgagatggc gctcgatgac gccaactacc tctgatagtt 9480
gagtcgatac ttcggcgatc accgcttccc tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 9540
gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 9600
aacaaatagc tagctcactc ggtcgctacg ctccgggcgt gagactgcgg cgggcgctgc 9660
ggacacatac aaagttaccc acagattccg tggataagca ggggactaac atgtgaggca 9720
aaacagcagg gccgcgccgg tggcgttttt ccataggctc cgccctcctg ccagagttca 9780
cataaacaga cgcttttccg gtgcatctgt gggagccgtg aggctcaacc atgaatctga 9840
cagtacgggc gaaacccgac aggacttaaa gatccccacc gtttccggcg ggtcgctccc 9900
tcttgcgctc tcctgttccg accctgccgt ttaccggata cctgttccgc ctttctccct 9960
tacgggaagt gtggcgcttt ctcatagctc acacactggt atctcggctc ggtgtaggtc 10020
gttcgctcca agctgggctg taagcaagaa ctccccgttc agcccgactg ctgcgcctta 10080
tccggtaact gttcacttga gtccaacccg gaaaagcacg gtaaaacgcc actggcagca 10140
gccattggta actgggagtt cgcagaggat ttgtttagct aaacacgcgg ttgctcttga 10200
agtgtgcgcc aaagtccggc tacactggaa ggacagattt ggttgctgtg ctctgcgaaa 10260
gccagttacc acggttaagc agttccccaa ctgacttaac cttcgatcaa accacctccc 10320
caggtggttt tttcgtttac agggcaaaag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 10380
gatcctttga tcttttctac tgaaccgctc tagatttcag tgcaatttat ctcttcaaat 10440
gtagcacctg aagtcagccc catacgatat aagttgtaat tctcatgtta gtcatgcccc 10500
gcgcccaccg gaaggagctg actgggttga aggctctcaa gggcatcggt cgagatcccg 10560
gtgcctaatg agtgagctaa cttacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 10620
cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 10680
tgcgtattgg gcgccagggt ggtttttctt ttcaccagtg agacgggcaa cagctgattg 10740
cccttcaccg cctggccctg agagagttgc agcaagcggt ccacgctggt ttgccccagc 10800
aggcgaaaat cctgtttgat ggtggttaac ggcgggatat aacatgagct gtcttcggta 10860
tcgtcgtatc ccactaccga gatgtccgca ccaacgcgca gcccggactc ggtaatggcg 10920
cgcattgcgc ccagcgccat ctgatcgttg gcaaccagca tcgcagtggg aacgatgccc 10980
tcattcagca tttgcatggt ttgttgaaaa ccggacatgg cactccagtc gccttcccgt 11040
tccgctatcg gctgaatttg attgcgagtg agatatttat gccagccagc cagacgcaga 11100
cgcgccgaga cagaacttaa tgggcccgct aacagcgcga tttgctggtg acccaatgcg 11160
accagatgct ccacgcccag tcgcgtaccg tcttcatggg agaaaataat actgttgatg 11220
ggtgtctggt cagagacatc aagaaataac gccggaacat tagtgcaggc agcttccaca 11280
gcaatggcat cctggtcatc cagcggatag ttaatgatca gcccactgac gcgttgcgcg 11340
agaagattgt gcaccgccgc tttacaggct tcgacgccgc ttcgttctac catcgacacc 11400
accacgctgg cacccagttg atcggcgcga gatttaatcg ccgcgacaat ttgcgacggc 11460
gcgtgcaggg ccagactgga ggtggcaacg ccaatcagca acgactgttt gcccgccagt 11520
tgttgtgcca cgcggttggg aatgtaattc agctccgcca tcgccgcttc cactttttcc 11580
cgcgttttcg cagaaacgtg gctggcctgg ttcaccacgc gggaaacggt ctgataagag 11640
acaccggcat actctgcgac atcgtataac gttactggtt tcacattcac caccctgaat 11700
tgactctctt ccgggcgcta tcatgccata ccgcgaaagg ttttgcgcca ttcgatggtg 11760
tccgggatct cgacgctctc ccttatgcga ctcctgcatt aggaaattaa tacgactcac 11820
tata 11824
<210> 5
<211> 957
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgacgcgca gcagtaaggc cttggtccaa ctagctgatc tatccgaaca agtaaaaaac 60
gtggtggaat ttgattttga caagtatatg cactccaagg ccattgcggt taatgaggcc 120
ttagataaag ttattccccc ccgctatcct caaaaaatct atgaaagtat gcgctattcc 180
ctcctagccg gcgggaagag ggttcgacca attttatgta ttgcggcctg tgagctaatg 240
ggggggactg aggaacttgc catgcctacg gcttgtgcca tcgagatgat tcacactatg 300
agtttgattc atgacgattt gccctatatt gataacgatg atttgcgtcg cggtaagcct 360
accaaccaca aagtttttgg tgaagacacg gcgatcattg ctggcgatgc attattgtca 420
ttggcctttg aacatgtagc cgtgagcacc agtcgtaccc taggtactga cattatttta 480
cggttgctat ccgaaattgg acgcgccaca ggaagtgagg gcgtgatggg tggtcaagtg 540
gtggatattg aaagcgaagg tgatcccagt atagacttag aaacgctgga atgggtccat 600
attcataaaa cggctgtgtt gttggaatgc agtgtcgtgt gtggcgcaat tatggggggt 660
gccagcgagg acgacatcga gcgtgctaga cggtacgctc gctgtgtagg attgcttttc 720
caagttgtcg atgatatttt ggatgtaagc cagtcctcgg aagaactcgg aaagactgct 780
gggaaagatt tgatttctga caaagccacc tatcccaaac tcatgggttt ggaaaaagcg 840
aaggaatttg ccgatgaatt actgaaccgt ggaaaacagg aacttagttg ttttgatcct 900
accaaagcag cacctctatt tgcgttagca gactacattg catctcgtca gaattaa 957
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaagatctgc tctagaaacc gcgaaattaa tacg 34
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggaattcca tatgtatatc tccttcttaa agttaaacaa aattatttgt agaggggaat 60
tgtt 64
<210> 8
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag gaactagttc cggattggcg aatggg 56
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt 60
tttg 64
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcccactac gtgaaccatc 20
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gggaattcca tatggtgatc gatatttccg ctca 34
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccgctcgagt caaaagactc tccccgcaa 29
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgcggatccg atgacgcgca gcagtaagg 29
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccaagcttt taattctgac gagatgcaat 30
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gccgccgcaa ggaatggtgc a 21
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaaagcgaaa ggagcgggcg c 21
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggaattccat atgccgaact ctcccgccgc ggt 33
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgcaagcttt cacgtcgtct ccatcatcg 29
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gggaattcca tatgatgggt cagactacgc acacc 35
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccgctcgagt tagcccggag tgcgggtata 30
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttagtatatt agttaagtat aagaaggaga tatacatatg aagacggtag ttattatcg 59
<210> 22
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caatcccaat ggtcatgata ttctccttct taaagttact gtttgcgcag gtcattgag 59
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctttaagaag gagaatatca tgaccattgg gattgataaa atc 43
<210> 24
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aatttcgcag cagcggtttc tttaccagac tcgagctaat tgcgatagga gcggacgg 58
<210> 25
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aaaacgacgg ccagtgaatt caaataattt tgtttaactt taaaaggaga tataatgtca 60
gagttgagag cc 72
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
actaagatgg ctatttatca agataagttt ccggatct 38
<210> 27
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgataaatag ccatcttagt atattagtta agtataagaa ggagaatata atgaccgttt 60
acacagca 68
<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgggtatgga gaattattcc tttggtagac cagtctttg 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggaataattc tccatacccg ttttttgggc taacaaggag attaaatgca aacggaacac 60
gtca 64
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctagaggat ccccgggtac cttatttaag ctgggtaaat gcagataa 48
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agccaggatc cgaattcgag ctcgatgtca ttaccgttct taac 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ccttttaaag ttaaacaaaa ttatttctat gaagtccatg gtaaat 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaataatttt gtttaacttt aaaaggagat ataatgtcag agttgagagc ctt 53
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttatactta actaatatac taagatggct atttatcaag ataagttt 48
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccatcttagt atattagtta agtataagaa ggagatataa tgaccgttta cacagcatcc 60
gt 62
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ctttctgttc gacttaagca ttatgcggcc gcttatttaa gctgggtaaa tgca 54

Claims (10)

1.一种大肠杆菌菌株，其特征在于，所述菌株含有部分或全部经过密码子优化的厦门霉素合成相关基因及甲羟戊酸途径相关基因；所述的厦门霉素相关基因包括IDS2，ximB,ximD和ximE基因；所述的甲羟戊酸途径相关的基因包括mvaE,mvaS,ERG12，ERG8，MVD1和idI基因。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌菌株，其特征在于，所述的ximE基因经过密码子优化，其序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌菌株，其特征在于，所述菌株为含有质粒pXM-IDS2-ximB和质粒pMVA的菌株或含有质粒pXM4和质粒pMVA的菌株。
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌菌株，其特征在于，所述质粒pXM-IDS2-ximB的序列如SEQ ID NO.2所示；所述质粒pXM4的序列如SEQ ID NO.3所示；所述质粒pMVA的序列如SEQID NO.4所示。
5.一种根据权利要求1-4任一项所述的大肠杆菌菌株在生产3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生产3-香叶草基-4-羟基苯甲酸的大肠杆菌菌株为含有质粒pXM-IDS2-ximB和质粒pMVA的菌株；所述生产厦门霉素的大肠杆菌菌株为含有质粒pXM4和质粒pMVA的菌株。
7.一种3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1-4任一项所述的大肠杆菌菌株接入培养基中培养，然后加入IPTG诱导后，萃取即得。
8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，生产3-香叶草基-4-羟基苯甲酸时，所述活化后的大肠杆菌菌株接入含葡萄糖的LB培养基中；所述诱导过程为：待OD600达到0.6-1.0时加入IPTG诱导，然后加入终浓度为100-500mg/L的4-羟基苯甲酸。
9.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，生产厦门霉素时，所述大肠杆菌菌株先接入LB培养基中，过夜培养；然后接种到含葡萄糖的YTG2培养基中，培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG诱导后，再加入终浓度为100-500mg/L的4-羟基苯甲酸发酵。
10.根据权利要求9所述的生产方法，其特征在于，所述YTG2培养基中，含有2g/L葡萄糖、0.2％甘油。
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