CN112940999A - 一种厦门链霉菌及其生物合成苯并吡喃类和4-氢喹啉类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种厦门链霉菌及其生物合成苯并吡喃类和4‑氢喹啉类化合物的方法。所述厦门链霉菌通过将质粒pIB1884‑xim2转移至菌株Streptomyces xiamenensisΔximΔika中构建得到；所述厦门链霉菌含有厦门霉素合成相关基因，包括ximB、ximC、ximD和ximE基因。通过组成型表达这些基因，同时添加4羟基苯甲酸的类似物，在厦门链霉菌中合成苯并吡喃类化合物和4‑氢喹啉类化合物。苯并吡喃类化合物和4‑氢喹啉类化合物的产量分别为48.9mg/L、27.7mg/L和25.9mg/L。

Description

一种厦门链霉菌及其生物合成苯并吡喃类和4-氢喹啉类化合 物的方法

技术领域

本发明属于合成生物学领域，涉及一种厦门链霉菌及其生物合成苯并吡喃类和4-氢喹啉类化合物的方法。

背景技术

具有苯并吡喃骨架的化合物通常具有重要的生物活性。实验表明，厦门霉素B是厦门链霉菌产生的苯并吡喃类化合物。动物实验表明，其能够抑制纤维原细胞的收缩能力，并且能够很明显的减弱增生性瘢痕(Liu XJ,Xu MJ,Fan ST,et al.Xiamenmycin attenuateshypertrophic scars by suppressing local inflammation and the effects ofmechanical stress.J Invest Dermatol 2013,133(5):1351-60.)。目前，纤维化疾病以及心血管纤维化等已严重危害人类的健康。我们已证实厦门霉素是具有抗纤维化活性的新型小分子药物候选化合物。

在此基础上利用厦门霉素合成所需酶的底物多样性，进一步丰富厦门霉素结构多样性具有潜在的应用价值。

4-氢喹啉类化合物是一类重要的活性天然产物，是具有神经保护作用，具有治疗神经疾病的潜力(Nakagawa,A.,Iwai,Y.,Hashimoto,H.,Miyazaki,N.,Oiwa,R.,Takahashi,Y.,Hirano,A.,Shibukawa,N.,Kojima,Y.,and Omura,S.(1981)Virantmycin,ANew Antiviral Antibiotic Produced by A Strain of Streptomyces,J.Antibiot.(Tokyo)34,1408-1415；Kim,W.G.,Ryoo,I.J.,Park,J.S.,and Yoo,I.D.(2001)Benzastatins H and I,New Benzastatin Derivatives with Neuronal CellProtecting Activity from Streptomyces nitrosporeus,J.Antibiot.(Tokyo)54,513-516)，近年来对该类化合物的合成和活性研究已成为热点(Tsutsumi,H.,Katsuyama,Y.,Izumikawa,M.,Takagi,M.,Fujie,M.,Satoh,N.,Shin-ya,K.,and Ohnishi,Y.(2018)Unprecedented Cyclization Catalyzed by a Cytochrome P450in BenzastatinBiosynthesis,J.Am.Chem.Soc.140,6631-6639)。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是一种厦门链霉菌及其生物合成苯并吡喃类和4-氢喹啉类化合物的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明提供了一种厦门链霉菌，通过将质粒pIB1884-xim2转移至菌株Streptomyces xiamenensisΔximΔika中构建得到；所述厦门链霉菌含有厦门霉素合成相关基因；所述的厦门霉素相关基因包括ximB、ximC、ximD和ximE基因。

所述ximB为将4-羟基苯甲酸的类似物和牻牛儿基焦磷酸缩合为3-香叶草基-4-羟基苯甲酸类似物的基因；所述ximD和ximE为将3-香叶草基-4-羟基苯甲酸类似物转化为苯并吡喃类化合物和4-氢喹啉类化合物的基因；所述ximC为将分支酸裂解为4-羟基苯甲酸的基因。

优选地，所述质粒pIB1884-xim2的序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述质粒pIB1884-xim2的构建方法包括以下步骤：

S1、合成含有内源性组成型启动子18840p以及同尾酶的DNA片段，并克隆至pIB139的NsiI/EcoRI位点生成质粒pIB1884；

S2、以Streptomyces xiamenensis 318基因组为模板，扩增含厦门霉素合成基因ximB、ximC、XimD和XimE的目的片段；

S3、将步骤S2得到的目的片段与质粒pIB1884重组，然后转化，即得质粒pIB1884-xim2。

所述质粒pIB1884-xim2以质粒pIB139或pSET152(pIB139为pSET152衍生而来)为骨架，启动子为替换了原来的启动子ermEp*的18840p强启动子，复制子为自带的ColE1复制子，含有ximB、ximC、ximD和ximE基因。

优选地，步骤S2中，所述扩增采用的引物对序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

优选地，所述菌株Streptomyces xiamenensisΔximΔika的构建方法包括以下步骤：

A1、以厦门链霉菌基因组DNA为模板，分别PCR扩增厦门霉素生物合成基因簇(xim)上下游的片段，然后通过酶切连接克隆至pJTU1278的XbaI/HindIII酶切位点，获得过渡质粒；然后以pIB139为模板，PCR扩增编码阿泊拉霉素的抗性基因aac(3)IV，克隆至前述过渡质粒的KpnI酶切位点从而获得基因敲除质粒pDxim，将质粒pDxim导入野生型厦门链霉菌318中，筛选得到基因簇xim被同框敲除菌株Δxim；

A2、以厦门链霉菌基因组DNA为模板，分别PCR扩增多环稠合大环内酰胺化合物合成基因簇(ika)上下游的片段以及一段包含attB位点的序列，然后隆至pJTU1278的XbaI/HindIII酶切位点获得过渡质粒；然后将编码阿泊拉霉素的抗性基因aac(3)IV克隆至该过渡质粒的KpnI酶切位点，从而获得基因敲除质粒pKIattB；

A3、将质粒pKIattB通过接合转移导入步骤A1得到的菌株Δxim中，筛选获得基因簇ika被attB替换的突变菌株，即得菌株Streptomyces xiamenensisΔximΔika。

第二方面，本发明提供了一种厦门链霉菌菌株在生产苯并吡喃类化合物和4-氢喹啉类化合物中的应用。

第三方面，本发明提供了一种苯并吡喃类化合物和4-氢喹啉类化合物的生产方法，包括以下步骤：将前述的厦门链霉菌株接入培养基中预培养，然后进行发酵培养并喂养相应4羟基苯甲酸类似物，培养后，萃取即得。

优选地，生产苯并吡喃类化合物时，所述发酵培养过程为：30℃，220rpm培养10天；且在培养1天后加入终浓度为110mg/L的2,4-二羟基苯甲酸或2-氯-4-羟基苯甲酸。

优选地，生产4-氢喹啉类化合物时，所述发酵培养过程为：30℃，220rpm培养10天；且在培养1天后加入终浓度为110mg/L的4-氨基苯甲酸。

优选地，所述预培养采用的培养基为含50μg/mL阿泊拉霉素的TSB培养基，培养36小时。

优选地，所述GYMO培养基的组成为：15g/L葡萄糖、10g/L酵母浸膏和15g/L麦芽浸膏，且包括50μg/mL阿泊拉霉素。

本发明的方法是将厦门霉素合成所需的四个基因，包括异戊烯基转移酶、分支酸裂解酶基因、单加氧酶和环化酶，导入厦门链霉菌ΔximΔika；通过组成型表达这四个基因，并添加4羟基苯甲酸，在厦门链霉菌中合成苯并吡喃类化合物和4-氢喹啉类化合物。本发明利用代谢工程技术构建的厦门链霉菌基因工程菌合成苯并吡喃类化合物和4-氢喹啉类化合物，产量分别为48.9mg/L、27.7mg/L和25.9mg/L。本发明第一次实现了厦门霉素B类似的苯并吡喃类衍生物和4-氢喹啉类化合物在厦门链霉菌中的生物合成。尤其是4-氢喹啉类化合物在厦门链霉菌中的生物合成是未见有任何报道的，而本发明通过构建厦门链霉菌基因工程菌，并采用特定培养方法从而得到了4-氢喹啉类化合物。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明利用了厦门霉素合成途径获得了稳定生产苯并吡喃类化合物和4-氢喹啉类化合物的厦门链霉菌菌株。本发明构建的微生物能够稳定产生苯并吡喃类化合物和4-氢喹啉类化合物，为后续进一步合成利用微生物生产苯并吡喃类化合物和4-氢喹啉类化合物奠定了基础，具有潜在的应用前景。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是苯并吡喃类化合物(1和2)和4-氢喹啉类化合物(3)途径示意图；

图2是质粒pIB1884-xim2示意图；

图3是HPLC检测苯并吡喃类化合物(1和2)和4-氢喹啉类化合物(3)示意图；

图4是苯并吡喃类化合物(1和2)和4-氢喹啉类化合物(3)UPLC-MS检测示意图；其中，图4a为菌株XL01合成苯并吡喃类化合物(1)的MS图；图4b为菌株XL01合成苯并吡喃类化合物(2)的MS图；图4c为菌株XL01合成4-氢喹啉类化合物(3)的MS图；

图5是苯并吡喃类化合物(1和2)和4-氢喹啉类化合物(3)产量图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

以下实施例中，所述质粒pIB139(参见文献Wilkinson CJ,Hughes-Thomas ZA,Martin CJ,Bohm I,Mironenko T,Deacon M,Wheatcroft M,Wirtz G,Staunton J,LeadlayPF.2002.Increasing the efficiency of heterologous promoters inactinomycetes.J Mol Microbiol Biotechnol 4:417–426.)，大肠杆菌DH5α购买自TAKARA，大肠杆菌ET12567/pUZ8002(参见文献Kieser T,Bibb MJ,Buttner MJ,Chater KF,Hopwood DA.2000.Practical Streptomyces genetics.The John Innes Foundation,Norwich,United Kingdom.)。

实施例1苯并吡喃类化合物(1和2)和4-氢喹啉类化合物(3)合成途径质粒构建

质粒pIB1884-xim2由pIB139改造而来，含有同尾酶Xba I/Spe I酶切位点。质粒pIB1884-xim2(序列如SEQ ID NO.1所示)含有厦门霉素合成基因簇中的四个基因：来源于Streptomyces xiamenensis 318的ximB基因(4-羟基苯甲酸异戊烯基转移酶)、ximC基因(分支酸裂解酶)ximD基因(单加氧酶)和ximE基因(环化酶)。所有基因均以Streptomycesxiamenensis 318基因组为模板通过PCR扩增而来。

本发明所述的厦门霉素合成示意图如图1所示，所述3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素异源合成示意图如图2所示。

实施例中构建质粒pIB1884-xim2的引物见表1：

表1引物列表

具体构建方法如下：

(1)质粒pIB1884-xim2的构建

含有内源性组成型启动子18840p以及同尾酶的DNA片段被合成，并且克隆至pIB139的NsiI/EcoRI位点生成pIB1884。然后使用引物pIB1884-xim2_F和pIB1884-xim2_F，以Streptomyces xiamenensis 318基因组为模板，扩增含厦门霉素合成基因ximB、ximC、XimD和XimE目的片段；PCR产物经回收后和线性化后的质粒pIB1884，按照目的片段：载体＝1：1的摩尔比，一步克隆法重组后，转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子验证后分别得到重组载体pIB1884-xim2(图2)。

实施例2苯并吡喃类化合物(1和2)和4-氢喹啉类化合物(3)生产菌株的构建

直接将质粒pIB1884-xim2转入通过热激钙转化法转至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，然后将含有质粒的大肠杆菌ET12567/pUZ8002和ΔximΔika菌株进行接合转移，将质粒pIB1884-xim2转移至菌株Streptomyces xiamenensisΔximΔika中，质粒pIB1884-xim2整合到菌株的染色体上，获得菌株XL01。

所述菌株Streptomyces xiamenensisΔximΔika的构建过程如下：

以厦门链霉菌基因组DNA为模板，分别PCR扩增厦门霉素生物合成基因簇(xim)上下游的片段作为上游同源臂UHA(1.8kb)和下游同源臂DHA(1.8kb)，然后通过酶切连接克隆至pJTU1278(参见文献He Y,Wang Z,Bai L,Liang J,Zhou X,Deng Z.2010.Two pHZ1358-derivative vectors for efficient gene knockout in Streptomyces.J MicrobiolBiotechnol 20:678–682)的XbaI/HindIII酶切位点，获得过渡质粒；然后，以pIB139为模板，PCR扩增编码阿泊拉霉素的抗性基因aac(3)IV,然后克隆至该过渡质粒的KpnI酶切位点从而获得基因敲除质粒pDxim。将该质粒通过接合转移导入野生型厦门链霉菌318中，经过单交换验证，无抗松弛培养，PCR验证，筛选获得基因簇xim被同框敲除菌株Δxim。

再以厦门链霉菌基因组DNA为模板，分别PCR扩增多环稠合大环内酰胺化合物合成基因簇(ika)上下游的片段作为上游同源臂UHA(1571bp)和下游同源臂DHA(1611bp)以及一段包含attB位点的序列；然后，通过一步法克隆至pJTU1278的XbaI/HindIII酶切位点获得过渡质粒，然后将编码阿泊拉霉素的抗性基因aac(3)IV克隆至该过渡质粒的KpnI酶切位点，从而获得基因敲除质粒pKIattB。将该质粒通过接合转移导入突变菌株Δxim中，经过单交换验证，无抗松弛培养，PCR验证，筛选获得基因簇ika被attB替换的突变菌株ΔximΔika，即菌株Streptomyces xiamenensisΔximΔika。

构建基因敲除质粒pDxim所用引物序列如下：

XimUH_F(SEQ ID NO.4):GCTCTAGAgaccgctgcctttcggcgggttc

XimUH_R(SEQ ID NO.5):CGGAATTCCCGGGCAACGTTGCGCCATTATG

XimDH_F(SEQ ID NO.6):CGGAATTCccagacccggcgtacaggccttcg

XimDH_R(SEQ ID NO.7):CCCAAGCTT CGCACCGTCCCGATGATCGGCAC

apra_F(SEQ ID NO.8):GGGGTACCTGGTTCATGTGCAGCTCCATC

apra_R(SEQ ID NO.9):GGGGTACCTGAGCTCAGCCAATCGACTG

质粒pDxim序列如SEQ ID NO.10所示。

构建质粒pKIattB所用引物序列如下所示：

ikaUH_F(SEQ ID NO.11):

ggagctccaccgcggtggcggccgctctagaTGGGGATCATCGAGCCGGGTCTGCT

ikaUH_R(SEQ ID NO.12):GCCCAACACGCTGGCCCTTTCCGCT

ikaDH_F(SEQ ID NO.13):CGTGAGAATCCTTGGGTGATGGCGC

ikaDH_R(SEQ ID NO.14):

ccccctcgaggtcgacggtatcgataagcttGAGCGTCACCGTCAGGGTCAGGGCC

质粒pKIattB序列如SEQ ID NO.15所示。

实施例3摇瓶发酵生产苯并吡喃类化合物(1和2)和4-氢喹啉类化合物(3)

将菌株XL01在含50μg/mL阿泊拉霉素的TSB培养基中进行预培养，36小时后，将培养物以发酵培养基的10％的接种至三瓶100mL发酵培养基GYMO(组成为：15g/L葡萄糖、10g/L酵母浸膏和15g/L麦芽浸膏，且包括50μg/mL阿泊拉霉素。)中。30℃，220rpm培养24小时，添加终浓度为110mg/L的2,4-二羟基苯甲酸或2-氯-4-羟基苯甲酸或4-氨基苯甲酸，然后继续培养9天。取发酵液、乙酸乙酯萃取后HPLC检测。

HPLC条件如下：安捷伦C18反相柱(Extend-C18 reverse phase column Agilent,150x 4.6mm)；溶剂A:水,含0.5‰三氟乙酸；溶剂B:乙腈,含0.5‰三氟乙酸；流动相:0-5min,25％乙腈；5-30min,25％-90％乙腈；30-35.1min,100％乙腈；35.1-43min,25％乙腈；流速:1mL/min；检测波长:190-800nm.

经HPLC检测(图3)，在图3中，展示了以出发菌株ΔximΔika的发酵液为对照(图中的ΔximΔika)，同时在XL01菌株发酵过程中不添加相应的4-羟基苯甲酸类似物作为对照(图中的XL01)，当添加相应的4-羟基苯甲酸类似物时可以产生对应的苯并吡喃类化合物和4-氢喹啉类化合物。在培养后的重组菌株XL01中苯并吡喃类化合物(1和2)和4-氢喹啉类化合物(3)的产量分别为48.9mg/L、27.7mg/L和25.9mg/L(图5)。

苯并吡喃类化合物(1和2)和4-氢喹啉类化合物(3)的UPLC-MS检测结果如图4所示，其结果显示，XL01菌株成功合成苯并吡喃类化合物(1和2)和4-氢喹啉类化合物(3)。

结论：

在重组菌株中检测到苯并吡喃类化合物(1和2)和4-氢喹啉类化合物(3)，证明利用厦门霉素合成基因簇在厦门链霉菌中合成苯并吡喃类化合物和4-氢喹啉类化合物是可行的。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种厦门链霉菌及其生物合成苯并吡喃类和4-氢喹啉类化合物的方法

<130> KAG41473

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10158

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atctacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg acctgatgca 60

gctctcgcag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt 120

cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttg atcggcactt 180

tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt ggggaattta tgcggtgtga 240

aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct 300

gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 360

agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 420

ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgg gctgcaggtc gactctagta tgcattggtt 480

ctgcagttgg attccatatg ggaatcgctc tagattagcg ccacacggtg caggaggcca 540

gcgccaggag cggcgccccg atcaccagca gacagcccgc gcccaccagc aggcggtcga 600

tcggggcggc gaaccggtgc ggctgggccg ggggacggac ggagaactcg ggcacggtga 660

acggtccttc cggggatcgg ggaggttttc accgtagggc agagaacttc gtgaagtttt 720

tcacatgggc gtgccgcggg gaacgggtga caacggccga atcgtgatcc acaggacccc 780

gcggcgcacc tcagggcacc cgtgtcacat cccctcgcgg gacaaccccg caggtcgcgg 840

cggtaagggg tggaaagggg cgcgcagtat atcagagggg tccggaatcc ttgtgaaggg 900

cctcacgagg tccccctcgg ggatgggtgg atactcgatg gcggatccgg acacgagcct 960

gcgcgcctac gtcgtcgccg ccgcggcacc cggctcgtcc gacgaagggc cggtgcgggg 1020

tgacgacgcg ctcgccgccg aattggtcga gctcgcccga tccaccctgt cctggtacaa 1080

ggttccgcag gacgtcgtat ggctggacac actgccccgc aacggcaacg gcaaattgct 1140

gcgcagggta ctccgcgcac agggcgacga gttcatccag ccccatcgtc actatccggc 1200

gtcgaatgcg cctcgaacgt gaacacggtt cggcaaacac cgttaggaca aggcggcgtt 1260

gacgcaacgg cttactgcgc cgccaacgaa tcgatggccc atcaggaaga caccacagcc 1320

gacaaattga ggataacggg acgagatcgg cgcggcgcga acaaacgtgt ccgagatcac 1380

ggggaaaccg tgttagccga ggtgggcttt ctgcaagagt cacaacaata accctcgccc 1440

ggtcaggtga tcgatatttc cgctcaaccc tcgcagcaga gcacgcgata tcggttcgtc 1500

gtgccgagca tcgcggcgtc ggtcgtgccg agtgcgccga aggccgtcct cccctatcta 1560

caactggcgc gtatgcacgc gcccataggc agttggctgt acctcctccc cggcctgtgg 1620

gggatcgcgc tcgcctcggc ggggctgccc gactggcgcc aggtgctgct gttcacggtc 1680

ggtggggtgc tggtgcgcgg cttcggctgc gtcgtcaacg accttgccga ccgcaagttc 1740

gacgcccggg tggcacgtac cgtcgggagg ccgctcgtgg ccggtacggt cacggtcacg 1800

ggagcgcttg tcttcgccgt ggtgcaggcg gtggcggggc tgctcgtgct ggctgcggcc 1860

agcgttccgg cggcggtgtt cgtggccgcc tcctatccgc tcgtggtcgc gtacccgttc 1920

atgaagcgga tcacctactg gccgcaggcc tggctgggga tggtcttcgg ctgctacatc 1980

ctcgcgggtt ggctcgcggt ggccgggagg atcgagactc ccgcgctcct gctcttcgtc 2040

gccggtgtct tctggacgct ggggtacgac acgatctacg cccaccagga caaggcggac 2100

gacgtgcagg tgggggtgaa gtccctcgcg ctgcgcctcg gcagggcgac ccggccctgg 2160

gtcgccgggt tttacggggc gaccgtggtc gggatcgtgg ctgccggagc cgtcgccgat 2220

ctgcactgga cgttctacgc gctgtttctg ccgggcgtgg cacacctgct ctggcaggtg 2280

gtgacggtgg acatcgacag ccctgccgac tgccgggaaa agttcatggc aaaccgtttc 2340

ttcgggtggc tcgtgctcgt cgccatcgtt gcggggagag tcttttgagg cgcggccacg 2400

cggtcgcacc ggagcgacgg cggaggagat acatgtatgc aggcccctgg tccgtgcgca 2460

cggagtcgcg cagcctggcc cagttcgtgg cgctcttgcg ggagccggcg agtttggcca 2520

ccgaggtgct ggaggagtgg tgcggtgctc cggtcaccgc ggagatccgc caccgcgcgg 2580

atggccaatt actcgtcccg ccggctgagc ggacattcgg cgggggttcg gcgcaggcgg 2640

agcgagcccc cttcttaccg ccggagcggg tggccgaact gatgcggctc tcgacgggtg 2700

cccgtgtgca gttccgcacc gtttacctgc gcgccgggac cgaaaaggtc gtcaccgcgg 2760

gcgccgtcgt ggcgctcgag cgcataagcc ccgaggaaca cgccgtgctc agcaccacca 2820

acgcaccgct ggggccggtg ctggccgcgg gcggtggagt gcggcgcgtg atggtcacgt 2880

ccgaaccgac ccgcctcgac cccgccgtgc gaccgccctg cgacgccgac gctcccgtgc 2940

tgaccgtcac cgcgctgctg tgtcgtggaa ccatgcccgt cggcctcgtg cgggaggctt 3000

tcctgccgtg tctcctcgat cgagacgccg tccacgacgc atgagggatc ccatgccgaa 3060

ctctcccgcc gcggtcttcg agcggctcac caccaccgtc ccgccggtcc gcatcgaggt 3120

tcgtctcggc accgcctgcg tgctcggcgg cggcgtcgcc ggcctggtcg cggcccgcgt 3180

actcgcggac cacgccaacc gtgtcgtgat catcgagccc gacctgccgg aagccgcgct 3240

cagcggcgcg gctcgtcccg gcgtcccgca gggctcccag gtgcacctcc tgctgcccgg 3300

cggacgcgcg cagctcgaac gcttcttccc cggtgtcgtg gcagaggccc tcgccggggg 3360

tgctgtgtcg tgcggtccgg agcgcaccgc cacctacctc gacgacatcg agcagatcgc 3420

cacgcccaac gcgcggttcc tggggagcag tcgccccttc ctggagacgc tgatccgtcg 3480

gcgcgcgctc gcactgccca acgtcgagct ggtgagtgga cgcgtcattg ggctgcggta 3540

cgcgcgcggc gccgtcgagt cggtgcgcta cgcggttggc ggcgaccacg tcgtcgcccc 3600

agccgacttc gtcgtcgacg cctccggccg cggcagcagg ctgagtgact ggctggagca 3660

gggcggctgg ccccgaccgg agacgcaacg gctccagacc gacatccgct acttgtctgc 3720

ccgtttcacg cgctcggccg actgggacgg ccccctcagc ggcatctccc gctacagccc 3780

gcatttcccg aaggacatcg ccggagcggc ggtcaacccg atcgagaacc aacagtgggt 3840

ggtgatgctc gcccacttcg gcaacggcgc cgagggccgc acggccgacg agttcgtcgc 3900

ccggtgccgt gagctgccac cgatcttcca ggaagccgtc aagggcgaaa tcgtcggcga 3960

ggttgtcccg taccgccacc ccgacagcag gtggcgccac ttcgaggcgc tcgaccgctt 4020

ccccgcccgc ctggcggtcc tcggcgacgc cgtcgcctcg ttcaaccccc tgtacgggca 4080

aggtatgtcc tcggccgcgc tccacgcctc ctgcctgtcg gagttcctgc gctctggccc 4140

cgacctggac gccccggccc ggcacttcct cgagctggaa aaggtcgtcg tcgaagccgc 4200

gtggcagacg tccacggccg gcgacgccat ccggctgggc ctggcaacgc caccggccac 4260

cgatcagggg cggcggcagg cgtgggccct gcgacaggta cgggaggcag cgggccggga 4320

cgagcaggtc ggcacggccc tgcgggcggt ggggttcatg accgcccatc cggcgtcgct 4380

gatggcaccg gatttggtgc ttcgcgcggc gcgggtcaat ggtgtgccgg aggagcggat 4440

ccggcaggag tacacgatga tggagacgac gtgatgggcc agacgacgca cacagcactc 4500

gaccgctaca tggagctcgc cgaccgcgcc gtgcgggacc cctcggcgct ggcggagctc 4560

cccacgatct tcgcgcccga cgccaccgtg acgctgcgcg acgagccggt gaccggcatg 4620

cccgccatca tggagttcta ccgggtgttc gtggcggcgg tggccgagag caagcactac 4680

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgactcggtg ccactttttc aagttgaatt ctcagcccgg cgtacgggtg taccgg 56

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gctctagaga ccgctgcctt tcggcgggtt c 31

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<211> 31

<212> DNA

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cggaattccc gggcaacgtt gcgccattat g 31

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cggaattccc agacccggcg tacaggcctt cg 32

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<211> 32

<212> DNA

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cccaagcttc gcaccgtccc gatgatcggc ac 32

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggggtacctg gttcatgtgc agctccatc 29

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<212> DNA

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ggggtacctg agctcagcca atcgactg 28

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<211> 13716

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

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cattctgcta accagtaagg caaccccgcc agcctagccg ggtcctcaac gacaggagca 7260

cgatcatgcg cacccgtcag atccagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac 7320

cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt 7380

atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttcccgca cgatcagcgt cccgccgacc 7440

aggagcagtg cggccagcac tgccgctaac gcctggtcct ggtcccggtc ctggtggtgc 7500

atcagtcctc cccgtgatca cttcggcacc caccgtagtg atcacccccg acagcggatc 7560

aaggggtttg cgggtcccgg tcggcgccgg gcgggggagg caggagccgc cgacgctgcc 7620

tctgggacgg gccggacggc agggggaccg gcggccgggc gagctgcagc cgggggtccg 7680

gcagggccgg agcgggcgga accgtgctct gacctgcggc ccgagtttcg tcacgtgacg 7740

gaatggaagg ctgctgcatt tcgtcacgtg acgtatctcg gcgagcgact gccgacgcca 7800

cggcggacac gatcgcctcg cgctggcgcc gggcctcgta cgcccgctgg cggcaggagc 7860

ggcggcagta gtcccggctc cggccgacgc cggattgctt gatctccgag ccgcaccagg 7920

cgcagagctt cgcgccgtcg gcgtccctgg gggtggtggt gctcatggcc gacgaccgta 7980

cgcggcacgt ctcgtagcga ggcgagtcgg gcgcgagcgc ctgcacgaag tgccggcggg 8040

gccgaccccg ggcgagtaat cccaggatta ctcccgcggc ttcgaccccg gccgccgtcg 8100

ccgcgtacgt caccgacccc cgccgtacgt caccgggatg acgtacggcg ggggggagcg 8160

agttagtgcg aagtgggccc acttgcgagc cgggcgatgt gccgggcggc ccgctcctgg 8220

cggtcgtcgg cgtcgtcgtc ctggtcgtcg tcctgctctc gccgtcggcg tgcagttgct 8280

tcctcgcggc gctgggcgag ggcggcgagc atgtcggcgt acgcctcggc cacctccccc 8340

gccgtgagca ccaccactgt gtcggccgcg tcggccagcg ccaggacctc ccgcacccgt 8400

tcgcccacgg ccgccgaatc ctcgttgccg tccttgcctt cggcggcccg ggtcgcctcg 8460

aggtcgaggg cgcggcgggt gaccgcgtgc catccgtcct cggtcacggc gaccccggcc 8520

cgcagctccc cgccgtcggc gtcggccgcc aggagcagat cgaggtcgtc ggcctcggtg 8580

tcgccgccgt cgagcccgag catctgccgc aggtagcggg tccattcgat ggcccggcgt 8640

ccccgggttg cccgctcgta ctcgtgccag cgcgagaggt tccactccag cgagccgacc 8700

ccggcggcgt cgtcctcggt catgccgccg gtcaggtccc cgatccgtcc gaggagttcg 8760

aacggggcga cgttcccgcc ggtcgccgtc ttgaggtcgg cgcgggcgag ttcgagggcg 8820

ggcgccttcc cgtcctgggt cttggcgatg tactcggcga ggtcgttggc gtcgcgctcg 8880

gtctccagcc gcttgaagtc gacgccgtgc cggtcgtcgg gcgtgaaggc ggggttgacc 8940

ttgcgcaggg cggcggtcca cacggaccgc cagtgcccct gccactcgtc gagcgcggcg 9000

ccggtcggct cgaaggtggc gacgatctgc ttcgcggacc gctccccctc ggtccggccg 9060

ccgaccagga cgatcgcgtg gatgtgcggg tgccagccgt tgatctgccc cacggtgact 9120

tcggtcgcgc ggatcatgcc gacgtacccg atccggtctc ggatgccctc gcggtcggcg 9180

gcccggtgcc cgtccttggc ccggcgtccg gcccacgtgc cgcccgtgat cagtcgctgg 9240

taggcgcccg gccgccgggg gctgtccggc gtcttccggg tgccctggag ggcgtccatg 9300

aggtccgcga gccggtccgt gtgcccatgg cgggccgtga aggtgaccag gtaggcggtc 9360

cccccgcgct tgatccactc gaccacggcg gcggtgatct cctcggcccg cttgtgccgg 9420

atcgtggcgg cgcagaccgg gcagagccag atccgcccgc accgcatcag gcccaggacc 9480

acggacgttc cggccgccgt ctgggcgacg atcacgccgg aggcagggtc catcagggcg 9540

cggccgcagc ccttgcacgc ggcgtccccg ctgatccgcc acagcgtccg gcggcggctg 9600

taccgggcgg ctttccgcag tcgggcagcg tcgctccgcg acgtgcttcc tacttccgag 9660

aggctgtcgc ctctcgggct ctccccatcc accccgtccg gagaaaccgc aggtcggagg 9720

ggtgcgggaa actctgttgt ttctttccca aggtgttcgc ttttgcctcg ggcggcatct 9780

cgcgtcacac gcgcgatcgc ccgcttcgct gccatccggc agcggtctga gcagtagata 9840

cgcggccgtt tgcccggtgt gtgggcaatt gcggtcccgc agtggcagcg gggcccggcg 9900

ggccgatctg gcaatgcctc ggcatcgctc cgtactctgg gcacgagcaa cgttcctgtc 9960

tcgcccggct aaggggcgcg agtctgggag cggacgggtc ggaggtgcga agtccggccc 10020

gttgctcttt ggtctggtgg gaatcctggc accaatcggg ccagaggttc cctccgccac 10080

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cggcggggct ttgacgtgcg gtcagtgcgt gtgtcggcga gcgatggcca cgaggccctg 10200

gaagccgagc ggtccggcga agtcggccca gtcgcaaccg ggctcagcgc agtgggcgga 10260

ccagccaccg ccgttgtggg tcctggacca ggttcacggt cccctcggtc aggcgtccgt 10320

cgaagtcggt catggtcggt ctcctggtgg gtgggggcgg ggcgccagca cgaagtgccg 10380

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cgtagggtgt cacaccccag gaatcgcgtc actgaacaca gcagccggta ggacgaccat 10800

gactgagttg gacaccatcg caaatccgtc cgatcccgcg gtgcagcgga tcatcgatgt 10860

caccaagccg tcgcgatcca acataaagac aacgttgatc gaggacgtcg agcccctcat 10920

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tccatctgag ttgctggatc tgtgcgggcg gcagaacata ccggtccgcc tcatcgactc 11040

ctcgatcgtc aaccagttgt tcaaggggga gcggaaggcc aagacattcg gcatcgcccg 11100

cgtccctcgc ccggccaggt tcggcgatat cgcgagccgg cgtggggacg tcgtcgttct 11160

cgacggggtg aagatcgtcg ggaacatcgg cgcgatagta cgcacgtcgc tcgcgctcgg 11220

agcgtcgggg atcatcctgg tcgacagtga catcaccagc atcgcggacc ggcgtctcca 11280

aagggccagc cgaggttacg tcttctccct tcccgtcgtt ctctccggtc gcgaggaggc 11340

catcgccttc attcgggaca gcggtatgca gctgatgacg ctcaaggcgg atggcgacat 11400

ttccgtgaag gaactcgggg acaatccgga tcggctggcc ttgctgttcg gcagcgaaaa 11460

gggtgggcct tccgacctgt tcgaggaggc gtcttccgcc tcggtttcca tccccatgat 11520

gagccagacc gagtctctca acgtttccgt ttccctcgga atcgcgctgc acgagaggat 11580

cgacaggaat ctcgcggcca accgataagc gcctctgttc ctcggacgct cggttcctcg 11640

acctcgattc gtcagtgatg atcagacgtc gaaggtgtag tgccgggtgt ggtccagcag 11700

ggccgccggg gtggtgtcgt tccacggctt catcgtctcg ttgaggtcga ccaaagcggc 11760

catcgtgcct ccccactcct gcagatccct gcaggtcgac ggatcttttc cgctgcataa 11820

ccctgcttcg gggtcattat agcgattttt tcggtatatc catccttttt cgcacgatat 11880

acaggatttt gccaaagggt tcgtgtagac tttccttggt gtatccaacg gcgtcagccg 11940

ggcaggatag gtgaagtagg cccacccgcg agcgggtgtt ccttcttcac tgtcccttat 12000

tcgcacctgg cggtgctcaa cgggaatcct gctctgcgag gctggccggc taccgccggc 12060

gtaacagatg agggcaagcg gatggctgat gaaaccaagc caaccaggaa gggcagccca 12120

cctatcaagg tgtactgcct tccagacgaa cgaagagcga ttgaggaaaa ggcggcggcg 12180

gccggcatga gcctgtcggc ctacctgctg gccgtcggcc agggctacaa aatcacgggc 12240

gtcgtggact atgagcacgt ccgcgagctg gcccgcatca atggcgacct gggccgcctg 12300

ggcggcctgc tgaaactctg gctcaccgac gacccgcgca cggcgcggtt cggtgatgcc 12360

acgatcctcg ccctgctggc gaagatcgaa gagaagcagg acgagcttgg caaggtcatg 12420

atgggcgtgg tccgcccgag ggcagagcca tgactttttt agccgctaaa acggccgggg 12480

ggtgcgcgtg attgccaagc acgtccccat gcgctccatc aagaagagcg acttcgcgga 12540

gctggtgaag tacatcaccg acgagcaagg caagaccgat ccccggggac ctgcaggtcg 12600

actctagcta gacacgtctg aagctagctt cgaggaactt tcggcggctt tgctgtgcga 12660

caggctcacg tctaaaagga aataaatcat gggtcataaa attatcacgt tgtccggcgc 12720

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ttctaaatct ggcacagccg aattgcgcga gcttggtttt gctgaaacca gacacacagc 12840

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cgttgaacac ctggtcaata cgcgttttgg tgagcagcaa tattgcgctt cgatgacgct 12960

tggcgttgag attgatacct ctgctgcaca aaaggcaatc gacgagctgg accagcgcat 13020

tcgtgacacc gtctccttcg aacttattcg caatggagtg tcattcatca aggacgccgc 13080

tatcgcaaat ggtgctatcc acgcagcggc aatcgaaaca cctcagccgg tgaccaatat 13140

ctacaacatc agccttggta tccagcgtga tgagccagcg cagaacaagg taaccgtcag 13200

tgccgataag ttcaaagtta aacctggtgt tgataccaac attgaaacgt tgatcgaaaa 13260

cgcgctgaaa aacgctgctg aatgtgcggc gctggatgtc acaaagcaaa tggcagcaga 13320

caagaaagcg atggatgaac tggcttccta tgtccgcacg gccatcatga tggaatgttt 13380

ccccggtggt gttatctggc agcagtgccg tcgatagtat gcaattgata attattatca 13440

tttgcgggtc ctttccggcg atccgccttg ttacggggcg gcgacctcgc gggttttcgc 13500

tatttatgaa aattttccgg tttaaggcgt ttccgttctt cttcgtcata acttaatgtt 13560

tttatttaaa ataccctctg aaaagaaagg aaacgacagg tgctgaaagc gagctttttg 13620

gcctctgtcg tttcctttct ctgtttttgt ccgtggaatg aacaatggaa gtcaacaaaa 13680

agcagagctt atcgatgata agcggtcaaa catgag 13716

<210> 11

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggagctccac cgcggtggcg gccgctctag atggggatca tcgagccggg tctgct 56

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcccaacacg ctggcccttt ccgct 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgtgagaatc cttgggtgat ggcgc 25

<210> 14

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccccctcgag gtcgacggta tcgataagct tgagcgtcac cgtcagggtc agggcc 56

<210> 15

<211> 14441

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aattgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg 60

cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag 120

ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga 180

attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagcgc 240

gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag ctggagctcc accgcggtgg cggccgctct 300

agatggggat catcgagccg ggtctgctcc gcacgcacct ggcccaggga gccgccggcg 360

ttcccatgcc actcgcagcg atcgaacagt tcctcacgac cgaggcatgg ctgcacgccc 420

tccaccgtgc cccggccctt gtctggaccc gggaggaaaa cgcccatgtc tgatccgccc 480

gcgcatgcca cctgtccccc gagcgtccgc gcggtggacc tcgggcatgt cctggttctc 540

atcaactacc gttctggcag ggcacaatgc ctcctgcccg ccgctgcgcc gcggtggtgt 600

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gacctgggtc tgattgttcc cacagagcac ccccagccgt ggcccgtccc catcccggcc 720

actgcccgag tcggtggagg cggcgacgag caccgcgccg gtatcgtccg gccggcccat 780

gtccctctgc gctctgttgt ccgagcgggc gcggctctcg cccgggtctt catggtcacc 840

agggggactc agggcatgca gcggatcatc tccctgctca actacgccaa caccaatgtc 900

cgctgcaacc gcccggctac cgaggccgaa gccaccgccg ccgtgcaggc ggtccgccgg 960

gcaggctggt actcgccggg cagaaccgcg tgtctggagg agtcggctgc cgccctgctg 1020

ctgctggccg ctcagggccg cagggcccag tggtgtcatg gcgtcgcgcc agacccggtg 1080

cggctccatg cctgggtgca gactgtggac ggcgccaccg tcgccgagcc ggggtccacc 1140

ggcgcctaca cccccgtcct caccatcgga gaccgccatc agcaccccga ctgacccgat 1200

tctgtggctg cgcaacgaga agtgcggcct cggcccgtac cgtaccgacc tcgtcgagac 1260

ctactggcgg tgggagcagg acccagccct catgatcgga tacggccgcc aggcccccga 1320

aagtctcgac gccaggaccg agggcatgcg ccggcagcag ggcggcgaca atatccgctt 1380

caccctctac gacctcacca ccggcggtga gccgacgccg gccggggtgg ccactctgct 1440

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gcacggcctg gggacggccg ccacccggct cgttctggac tacgcctggc acgtcacgaa 1560

cctgcggatg gtctggctct ccgtcctcgc cccgaacgcc gccgcgatcc gcgcctacga 1620

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gtgcgacgag atcatcatgg acgccctcgc atcggacttc acgggtctct ccgtcatctc 1740

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tccgcgcggt cggcagcgca tagcgccggc cctttccgcg tgtgaagaaa gcggaaaggg 1860

ccagcgtgtt gggcaccagc tcctccggcg gggcctcgat gtggagcagg ccggagcccg 1920

cggtcatcca ctgggtgtcg ccgtccttga tgacgccgcc accgccctcg gagtcctggt 1980

ggacgaaggt gccgtccagg aggtacgtga cggtctcgaa gccgcggtgc gggtgccagg 2040

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accccacccg ccacacagtc cggatcggcg tggtcgagat gcgccgcgcc accggcgtcg 3480

tgcgcgggcg cggcggcctc cgtgtgatgc gcgggggaga tgacgacccc cggcgcgagc 3540

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gctatgatcg actgatgtca tcagcggtgg agtgcaatgt cgtgcaatac gaatggcgaa 4020

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ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 5100

atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 5160

taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 5220

cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 5280

aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 5340

aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 5400

tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtgttg acgccgggca agagcaactc 5460

ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag 5520

catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 5580

aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 5640

ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa 5700

gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgcag caatggcaac aacgttgcgc 5760

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gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 5940

gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 6000

gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 6060

gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 6120

atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 6180

ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 6240

ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 6300

ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 6360

ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 6420

ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 6480

tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 6540

tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 6600

tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 6660

tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 6720

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 6780

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 6840

ttcctggcct tttgctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 6900

cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 6960

gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc tgacttccgc 7020

gtttccagac tttacgaaac acggaaaccg aagaccattc atgttgttgc tcaggtcgca 7080

gacgttttgc agcagcagtc gcttcacgtt cgctcgcgta tcggtgattc attctgctaa 7140

ccagtaaggc aaccccgcca gcctagccgg gtcctcaacg acaggagcac gatcatgcgc 7200

acccgtcaga tccagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa 7260

tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca 7320

ttataagctg caataaacaa gttcccgcac gatcagcgtc ccgccgacca ggagcagtgc 7380

ggccagcact gccgctaacg cctggtcctg gtcccggtcc tggtggtgca tcagtcctcc 7440

ccgtgatcac ttcggcaccc accgtagtga tcacccccga cagcggatca aggggtttgc 7500

gggtcccggt cggcgccggg cgggggaggc aggagccgcc gacgctgcct ctgggacggg 7560

ccggacggca gggggaccgg cggccgggcg agctgcagcc gggggtccgg cagggccgga 7620

gcgggcggaa ccgtgctctg acctgcggcc cgagtttcgt cacgtgacgg aatggaaggc 7680

tgctgcattt cgtcacgtga cgtatctcgg cgagcgactg ccgacgccac ggcggacacg 7740

atcgcctcgc gctggcgccg ggcctcgtac gcccgctggc ggcaggagcg gcggcagtag 7800

tcccggctcc ggccgacgcc ggattgcttg atctccgagc cgcaccaggc gcagagcttc 7860

gcgccgtcgg cgtccctggg ggtggtggtg ctcatggccg acgaccgtac gcggcacgtc 7920

tcgtagcgag gcgagtcggg cgcgagcgcc tgcacgaagt gccggcgggg ccgaccccgg 7980

gcgagtaatc ccaggattac tcccgcggct tcgaccccgg ccgccgtcgc cgcgtacgtc 8040

accgaccccc gccgtacgtc accgggatga cgtacggcgg gggggagcga gttagtgcga 8100

agtgggccca cttgcgagcc gggcgatgtg ccgggcggcc cgctcctggc ggtcgtcggc 8160

gtcgtcgtcc tggtcgtcgt cctgctctcg ccgtcggcgt gcagttgctt cctcgcggcg 8220

ctgggcgagg gcggcgagca tgtcggcgta cgcctcggcc acctcccccg ccgtgagcac 8280

caccactgtg tcggccgcgt cggccagcgc caggacctcc cgcacccgtt cgcccacggc 8340

cgccgaatcc tcgttgccgt ccttgccttc ggcggcccgg gtcgcctcga ggtcgagggc 8400

gcggcgggtg accgcgtgcc atccgtcctc ggtcacggcg accccggccc gcagctcccc 8460

gccgtcggcg tcggccgcca ggagcagatc gaggtcgtcg gcctcggtgt cgccgccgtc 8520

gagcccgagc atctgccgca ggtagcgggt ccattcgatg gcccggcgtc cccgggttgc 8580

ccgctcgtac tcgtgccagc gcgagaggtt ccactccagc gagccgaccc cggcggcgtc 8640

gtcctcggtc atgccgccgg tcaggtcccc gatccgtccg aggagttcga acggggcgac 8700

gttcccgccg gtcgccgtct tgaggtcggc gcgggcgagt tcgagggcgg gcgccttccc 8760

gtcctgggtc ttggcgatgt actcggcgag gtcgttggcg tcgcgctcgg tctccagccg 8820

cttgaagtcg acgccgtgcc ggtcgtcggg cgtgaaggcg gggttgacct tgcgcagggc 8880

ggcggtccac acggaccgcc agtgcccctg ccactcgtcg agcgcggcgc cggtcggctc 8940

gaaggtggcg acgatctgct tcgcggaccg ctccccctcg gtccggccgc cgaccaggac 9000

gatcgcgtgg atgtgcgggt gccagccgtt gatctgcccc acggtgactt cggtcgcgcg 9060

gatcatgccg acgtacccga tccggtctcg gatgccctcg cggtcggcgg cccggtgccc 9120

gtccttggcc cggcgtccgg cccacgtgcc gcccgtgatc agtcgctggt aggcgcccgg 9180

ccgccggggg ctgtccggcg tcttccgggt gccctggagg gcgtccatga ggtccgcgag 9240

ccggtccgtg tgcccatggc gggccgtgaa ggtgaccagg taggcggtcc ccccgcgctt 9300

gatccactcg accacggcgg cggtgatctc ctcggcccgc ttgtgccgga tcgtggcggc 9360

gcagaccggg cagagccaga tccgcccgca ccgcatcagg cccaggacca cggacgttcc 9420

ggccgccgtc tgggcgacga tcacgccgga ggcagggtcc atcagggcgc ggccgcagcc 9480

cttgcacgcg gcgtccccgc tgatccgcca cagcgtccgg cggcggctgt accgggcggc 9540

tttccgcagt cgggcagcgt cgctccgcga cgtgcttcct acttccgaga ggctgtcgcc 9600

tctcgggctc tccccatcca ccccgtccgg agaaaccgca ggtcggaggg gtgcgggaaa 9660

ctctgttgtt tctttcccaa ggtgttcgct tttgcctcgg gcggcatctc gcgtcacacg 9720

cgcgatcgcc cgcttcgctg ccatccggca gcggtctgag cagtagatac gcggccgttt 9780

gcccggtgtg tgggcaattg cggtcccgca gtggcagcgg ggcccggcgg gccgatctgg 9840

caatgcctcg gcatcgctcc gtactctggg cacgagcaac gttcctgtct cgcccggcta 9900

aggggcgcga gtctgggagc ggacgggtcg gaggtgcgaa gtccggcccg ttgctctttg 9960

gtctggtggg aatcctggca ccaatcgggc cagaggttcc ctccgccact cccgacgccc 10020

cttggggctg gtgtgacttg gagggccgaa gagagccccg ccggtgatcc ggcggggctt 10080

tgacgtgcgg tcagtgcgtg tgtcggcgag cgatggccac gaggccctgg aagccgagcg 10140

gtccggcgaa gtcggcccag tcgcaaccgg gctcagcgca gtgggcggac cagccaccgc 10200

cgttgtgggt cctggaccag gttcacggtc ccctcggtca ggcgtccgtc gaagtcggtc 10260

atggtcggtc tcctggtggg tgggggcggg gcgccagcac gaagtgccgg cgccccgcgg 10320

gggttggtcg ggtcaggcgc cgaaccggcg ggcggcggcg gcgaccaggc cgtcggcggc 10380

ggccatggcg cggtcgcggt cggtggtgag ggcggtgcgg tcggcggcgg cccgcaggtc 10440

gtaggccgct tgggcggcgg cggtcgctgc gggggcgagg gcgggggcga gcaccgacac 10500

ggtggtgagg ggcgcggtga tcgcggagcg ggtgatcaag gcgaatactt catatgcctc 10560

cgtgacgagc cacgcggcgg tgtcgtcggc accgcgctcg acgacgcggg ggacggggat 10620

cggcggggcc tgggacggcg cctcgccgtc gcagaaccag gcggtggcgt acaccgtcgc 10680

ctcggtcggc ccgtagagat tggcgatccc gaccgcagca ccaccgagaa cgtccccgac 10740

gtggccgacc agcccgtcat cgtcaacgcc tgatccgcgg tgcggacagg ccgtgtcgcg 10800

accggccgtg cggaattaag ccggcccgta ccctgtgaat agaggtccgc tgtgacacaa 10860

gaatccctgt tacttctcga ccgtattgat tcggatgatt cctacgcgag cctgcggaac 10920

gaccaggaat tctgggagcc gctggcccgc cgagccctgg aggagctcgg gctgccggtg 10980

ccgccggtgc tgcgggtgcc cggcgagagc accaaccccg tactggtcgg cgagcccggc 11040

ccggtgatca agctgttcgg cgagcactgg tgcggtccgg agagcctcgc gtcggagtcg 11100

gaggcgtacg cggtcctggc ggacgccccg gtgccggtgc cccgcctcct cggccgcggc 11160

gagctgcggc ccggcaccgg agcctggccg tggccctacc tggtgatgag ccggatgacc 11220

ggcaccacct ggcggtccgc gatggacggc acgaccgacc ggaacgcgct gctcgccctg 11280

gcccgcgaac tcggccgggt gctcggccgg ctgcacaggg tgccgctgac cgggaacacc 11340

gtgctcaccc cccattccga ggtcttcccg gaactgctgc gggaacgccg cgcggcgacc 11400

gtcgaggacc accgcgggtg gggctacctc tcgccccggc tgctggaccg cctggaggac 11460

tggctgccgg acgtggacac gctgctggcc ggccgcgaac cccggttcgt ccacggcgac 11520

ctgcacggga ccaacatctt cgtggacctg gccgcgaccg aggtcaccgg gatcgtcgac 11580

ttcaccgacg tctatgcggg agactcccgc tacagcctgg tgcaactgca tctcaacgcc 11640

ttccggggcg accgcgagat cctggccgcg ctgctcgacg gggcgcagtg gaagcggacc 11700

gaggacttcg cccgcgaact gctcgccttc accttcctgc acgacttcga ggtgttcgag 11760

gagaccccgc tggatctctc cggcttcacc gatccggagg aactggcgca gttcctctgg 11820

gggccgccgg acaccgcccc cggcgcctga gatatcgcga gccggcgtgg ggacgtcgtc 11880

gttctcgacg gggtgaagat cgtcgggaac atcggcgcga tagtacgcac gtcgctcgcg 11940

ctcggagcgt cggggatcat cctggtcgac agtgacatca ccagcatcgc ggaccggcgt 12000

ctccaaaggg ccagccgagg ttacgtcttc tcccttcccg tcgttctctc cggtcgcgag 12060

gaggccatcg ccttcattcg ggacagcggt atgcagctga tgacgctcaa ggcggatggc 12120

gacatttccg tgaaggaact cggggacaat ccggatcggc tggccttgct gttcggcagc 12180

gaaaagggtg ggccttccga cctgttcgag gaggcgtctt ccgcctcggt ttccatcccc 12240

atgatgagcc agaccgagtc tctcaacgtt tccgtttccc tcggaatcgc gctgcacgag 12300

aggatcgaca ggaatctcgc ggccaaccga taagcgcctc tgttcctcgg acgctcggtt 12360

cctcgacctc gattcgtcag tgatgatcag acgtcgaagg tgtagtgccg ggtgtggtcc 12420

agcagggccg ccggggtggt gtcgttccac ggcttcatcg tctcgttgag gtcgaccaaa 12480

gcggccatcg tgcctcccca ctcctgcaga tccctgcagg tcgacggatc ttttccgctg 12540

cataaccctg cttcggggtc attatagcga ttttttcggt atatccatcc tttttcgcac 12600

gatatacagg attttgccaa agggttcgtg tagactttcc ttggtgtatc caacggcgtc 12660

agccgggcag gataggtgaa gtaggcccac ccgcgagcgg gtgttccttc ttcactgtcc 12720

cttattcgca cctggcggtg ctcaacggga atcctgctct gcgaggctgg ccggctaccg 12780

ccggcgtaac agatgagggc aagcggatgg ctgatgaaac caagccaacc aggaagggca 12840

gcccacctat caaggtgtac tgccttccag acgaacgaag agcgattgag gaaaaggcgg 12900

cggcggccgg catgagcctg tcggcctacc tgctggccgt cggccagggc tacaaaatca 12960

cgggcgtcgt ggactatgag cacgtccgcg agctggcccg catcaatggc gacctgggcc 13020

gcctgggcgg cctgctgaaa ctctggctca ccgacgaccc gcgcacggcg cggttcggtg 13080

atgccacgat cctcgccctg ctggcgaaga tcgaagagaa gcaggacgag cttggcaagg 13140

tcatgatggg cgtggtccgc ccgagggcag agccatgact tttttagccg ctaaaacggc 13200

cggggggtgc gcgtgattgc caagcacgtc cccatgcgct ccatcaagaa gagcgacttc 13260

gcggagctgg tgaagtacat caccgacgag caaggcaaga ccgatccccg gggacctgca 13320

ggtcgactct agctagacac gtctgaagct agcttcgagg aactttcggc ggctttgctg 13380

tgcgacaggc tcacgtctaa aaggaaataa atcatgggtc ataaaattat cacgttgtcc 13440

ggcgcggcga cggatgttct gtatgcgctg tttttccgtg gcgcgttgct gtctggtgat 13500

ctgccttcta aatctggcac agccgaattg cgcgagcttg gttttgctga aaccagacac 13560

acagcaactg aataccagaa agaaaatcac tttacctttc tgacatcaga agggcagaaa 13620

tttgccgttg aacacctggt caatacgcgt tttggtgagc agcaatattg cgcttcgatg 13680

acgcttggcg ttgagattga tacctctgct gcacaaaagg caatcgacga gctggaccag 13740

cgcattcgtg acaccgtctc cttcgaactt attcgcaatg gagtgtcatt catcaaggac 13800

gccgctatcg caaatggtgc tatccacgca gcggcaatcg aaacacctca gccggtgacc 13860

aatatctaca acatcagcct tggtatccag cgtgatgagc cagcgcagaa caaggtaacc 13920

gtcagtgccg ataagttcaa agttaaacct ggtgttgata ccaacattga aacgttgatc 13980

gaaaacgcgc tgaaaaacgc tgctgaatgt gcggcgctgg atgtcacaaa gcaaatggca 14040

gcagacaaga aagcgatgga tgaactggct tcctatgtcc gcacggccat catgatggaa 14100

tgtttccccg gtggtgttat ctggcagcag tgccgtcgat agtatgcaat tgataattat 14160

tatcatttgc gggtcctttc cggcgatccg ccttgttacg gggcggcgac ctcgcgggtt 14220

ttcgctattt atgaaaattt tccggtttaa ggcgtttccg ttcttcttcg tcataactta 14280

atgtttttat ttaaaatacc ctctgaaaag aaaggaaacg acaggtgctg aaagcgagct 14340

ttttggcctc tgtcgtttcc tttctctgtt tttgtccgtg gaatgaacaa tggaagtcaa 14400

caaaaagcag agcttatcga tgataagcgg tcaaacatga g 14441

Claims (10)

1.一种厦门链霉菌，其特征在于，通过将质粒pIB1884-xim2转移至菌株StreptomycesxiamenensisΔximΔika中构建得到；所述厦门链霉菌含有厦门霉素合成相关基因；所述的厦门霉素相关基因包括ximB、ximC、ximD和ximE基因。

2.根据权利要求1所述的厦门链霉菌菌株，其特征在于，所述质粒pIB1884-xim2的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的厦门链霉菌菌株，其特征在于，所述质粒pIB1884-xim2的构建方法包括以下步骤：

S1、合成含有内源性组成型启动子18840p以及同尾酶的DNA片段，并克隆至pIB139的NsiI/EcoRI位点生成质粒pIB1884；

S2、以Streptomyces xiamenensis 318基因组为模板，扩增含厦门霉素合成基因ximB、ximC、XimD和XimE的目的片段；

S3、将步骤S2得到的目的片段与质粒pIB1884重组，然后转化，即得质粒pIB1884-xim2。

4.根据权利要求3所述的厦门链霉菌菌株，其特征在于，步骤S2中，所述扩增采用的引物对序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求1所述的厦门链霉菌菌株，其特征在于，所述菌株StreptomycesxiamenensisΔximΔika的构建方法包括以下步骤：

A1、以厦门链霉菌基因组DNA为模板，分别PCR扩增厦门霉素生物合成基因簇(xim)上下游的片段，然后通过酶切连接克隆至pJTU1278的XbaI/HindIII酶切位点，获得过渡质粒；然后以pIB139为模板，PCR扩增编码阿泊拉霉素的抗性基因aac(3)IV，克隆至前述过渡质粒的KpnI酶切位点从而获得基因敲除质粒pDxim，将质粒pDxim导入野生型厦门链霉菌318中，筛选得到基因簇xim被同框敲除菌株Δxim；

A2、以厦门链霉菌基因组DNA为模板，分别PCR扩增多环稠合大环内酰胺化合物合成基因簇(ika)上下游的片段以及一段包含attB位点的序列，然后隆至pJTU1278的XbaI/HindIII酶切位点获得过渡质粒；然后将编码阿泊拉霉素的抗性基因aac(3)IV克隆至该过渡质粒的KpnI酶切位点，从而获得基因敲除质粒pKIattB；

A3、将质粒pKIattB通过接合转移导入步骤A1得到的菌株Δxim中，筛选获得基因簇ika被attB替换的突变菌株，即得菌株Streptomyces xiamenensisΔximΔika。

6.一种根据权利要求1-5任一项所述的厦门链霉菌菌株在生产苯并吡喃类化合物和4-氢喹啉类化合物中的应用。

7.一种苯并吡喃类化合物和4-氢喹啉类化合物的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1-5任一项所述的厦门链霉菌株接入培养基中预培养，然后进行发酵培养并喂养相应4羟基苯甲酸类似物，培养后，萃取即得。

8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，生产苯并吡喃类化合物时，所述发酵培养过程为：28～30℃之间，200～220rpm之间培养6-10天；且在培养1天后加入终浓度为50～110mg/L的2,4-二羟基苯甲酸或2-氯-4-羟基苯甲酸。

9.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，生产4-氢喹啉类化合物时，所述发酵培养过程为：28～30℃之间，200～220rpm之间培养6-10天；且在培养1天后加入终浓度为50～110mg/L的4-氨基苯甲酸。

10.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，所述预培养采用的培养基为含30～50μg/mL阿泊拉霉素的TSB培养基，培养28～36小时。

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