CN112941000B - 一种大肠杆菌菌株及其生物合成吡喃香豆素和呋喃香豆素的方法 - Google Patents

一种大肠杆菌菌株及其生物合成吡喃香豆素和呋喃香豆素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌菌株及其生物合成吡喃香豆素和呋喃香豆素的方法，所述菌株为含有苯并吡喃生物合成相关基因的大肠杆菌BL21(DE3)；所述的苯并吡喃生物合成相关基因包括ximD和ximE基因中的至少一种。本发明将经过含有FAD依赖的单加氧酶XimD和环化酶XimE引入大肠杆菌，通过诱导表达这两个基因，同时添加底物在大肠杆菌中产生吡喃香豆素和呋喃香豆素。本发明首次实现了呋喃香豆素和吡喃香豆素在为微生物中的生物合成。

Description

一种大肠杆菌菌株及其生物合成吡喃香豆素和呋喃香豆素的 方法
技术领域
本发明属于合成生物学领域，涉及一种大肠杆菌菌株及其生物合成吡喃香豆素和呋喃香豆素的方法。
背景技术
呋喃香豆素（印度榅桲素、二氢欧山芹素）和吡喃香豆素（日本前胡醇和lomatin）是来源于植物的天然产物。实验表明，呋喃香豆素通常具有抗昆虫幼虫活性，印度榅桲素在紫外辐射时表现出了对于DNA的光修复活性（Miyazawa, M., Tsukamoto, T., Anzai, J.,and Ishikawa, Y. (2004) Insecticidal Effect of Phthalides and Furanocoumarinsfrom Angelica acutiloba Against Drosophila Melanogaster, J. Agric. Food Chem.52, 4401-4405; Beier, R. C. (1990) Natural Pesticides and BioactiveComponents in Foods, Rev. Environ. Contam. Toxicol.113, 47-137）。线性吡喃香豆素日本前胡醇通常被认为是传统中药当归的活性成分，在治疗多种癌症、炎症、神经紊乱、真菌感染、骨质疏松、健忘症、过敏、抑郁症等疾病中发货着重要的作用（Reddy, C. S.,Kim, S. C., Hur, M., Kim, Y. B., Park, C. G., Lee, W. M., Jang, J. K., andKoo, S. C. (2017) Natural Korean Medicine Dang-Gui: Biosynthesis, EffectiveExtraction and Formulations of Major Active Pyranocoumarins, Their MolecularAction Mechanism in Cancer, and Other Biological Activities, Molecules22,2170）。而角型吡喃香豆素Lomatin是治疗HIV疾病药物主要成分的前体（Kostova, I.,Raleva, S., Genova, P., and Argirova, R. (2006) Structure-ActivityRelationships of Synthetic Coumarins as HIV-1 Inhibitors, Bioinorg Chem Appl,68274）。
印度榅桲素、二氢欧山芹素、日本前胡醇和lomatin在植物中的含量是很低，且从植物提取这些化合物的过程中，提取和纯化过程复杂且成本贵。除此之外，植物的种植还受到气候、农业、地理环境的影响，这也会导致不同批次分离得到的化合物有可能是一不致的。因此利用微生物作为宿主，运用合成生物学手段合成这些植物源天然产物具有潜在的应用价值。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种大肠杆菌菌株及其生物合成吡喃香豆素和呋喃香豆素的方法，具体包括利用大肠杆菌异源合成印度榅桲素、二氢欧山芹素、日本前胡醇和lomatin方法的菌株。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明提供了一种大肠杆菌菌株，所述菌株为含有苯并吡喃生物合成相关基因的大肠杆菌BL21（DE3）；所述的苯并吡喃生物合成相关基因包括ximD和ximE基因中的至少一种。
所述ximD和ximE为将7-去甲基软木花椒素和王草酚转化为印度榅桲素、二氢欧山芹素、日本前胡醇和lomatin的基因。
所述的苯并吡喃生物合成合成相关基因优选为来源于Streptomyces xiamenensis318 的ximD（AGY49246.1）和ximE（AGY49249.1）。
优选地，所述的ximE基因还可以是经过密码子优化的ximE基因，如ximEsyn基因，序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述菌株为含有质粒pCDF-ximD或pCDF-ximD-ximE的菌株。
优选地，所述质粒pCDF-Duet -ximD的序列如SEQ ID NO.2所示；所述质粒pCDF-Duet -ximD-ximE的序列如SEQ ID NO.3所示。
所述质粒pCDF-Duet-ximD以pCDF-Duet-1为骨架，复制子为CloDF13复制子，包括有T7启动子控制的ximD基因。
所述质粒pCDF-Duet-ximD-ximE以pCDF-Duet-1为骨架，复制子为CloDF13复制子，包括有T7启动子控制的ximD基因，以及由另一T7启动子控制的ximE基因。
第二方面，本发明提供了一种大肠杆菌菌株在生产吡喃香豆素和呋喃香豆素中的应用。
第三方面，本发明提供了一种吡喃香豆素和呋喃香豆素的生产方法，包括以下步骤：将前述的大肠杆菌菌株接入培养基中培养，并喂养底物，然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，萃取即得。
优选地，所述大肠杆菌菌株接入含0.2%葡萄糖的LB培养基中；所述诱导过程为：待OD600达到0.6-1.0时加入终浓度为0.05 mM的IPTG诱导，且在诱导1小时后加入底物。
优选地，所述诱导的温度为20°C，摇床转速为160 rpm。
优选地，所述底物为终浓度50 mg/L 的7-去甲基软木花椒素或王草酚。
优选地，所述LB培养基中还包括100 μg/mL链霉素。
优选地，所述呋喃香豆素包括印度榅桲素、二氢欧山芹素；所述吡喃香豆素包括日本前胡醇、lomatin。
本发明的方法是将苯并吡喃生物合成所需的两个基因，包括单加氧酶和环化酶，导入大肠杆菌 BL21(DE3)；通过诱导表达这两个基因和喂养相应的底物，在大肠杆菌中合成印度榅桲素、二氢欧山芹素、日本前胡醇和lomatin。尤其本发明利用合成生物学技术构建的大肠杆菌基因工程菌合成印度榅桲素、日本前胡醇的产量分别为3.7 mg/L和3.6 mg/L。本发明第一次实现了印度榅桲素、二氢欧山芹素、日本前胡醇和lomatin在大肠杆菌中的生物合成。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明利用外源的苯并吡喃生物合成途径中的酶获得了稳定生产印度榅桲素、二氢欧山芹素、日本前胡醇和lomatin的大肠杆菌。本发明构建的微生物能够稳定产生印度榅桲素、二氢欧山芹素、日本前胡醇和lomatin，为后续进一步合成利用微生物生产印度榅桲素、二氢欧山芹素、日本前胡醇和lomatin奠定了基础，具有潜在的应用前景。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是印度榅桲素、二氢欧山芹素、日本前胡醇和lomatin异源合成示意图；
图2是质粒pCDF-Duet-ximD示意图；
图3是质粒pCDF-Duet-ximD-ximE示意图；
图4是HPLC检测印度榅桲素和日本前胡醇示意图；其中，图4a和4b为印度榅桲素和日本前胡醇标准品HPLC图谱；图4c为阴性对照菌株（含空载的Rosetta（DE3）菌株）的HPLC图谱；图4d为产印度榅桲素和日本前胡醇菌株XL02发酵液HPLC图谱；图4e为产印度榅桲素菌株XL01发酵液HPLC图谱；
图5是HPLC检测二氢欧山芹素和lomatin示意图；其中，图5b为阴性对照菌株（含空载的Rosetta（DE3）菌株）的HPLC图谱；图5c为产厦门霉素菌株XL01发酵液HPLC图谱；图5d为产厦门霉素菌株XL02发酵液HPLC图谱；
图6是印度榅桲素和日本前胡醇UPLC-MS检测示意图；其中，图6a为菌株合成印度榅桲素的MS图；图6b为菌株合成日本前胡醇的MS图；
图7是二氢欧山芹素检测示意图；其中，图7a为菌株合成二氢欧山芹素的MS图；图7b为菌株合成lomatin的MS图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
以下实施例中，所述质粒pCDF-Duet购买自TAKARA公司，大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）购买自TAKARA公司。
实施例1 印度榅桲素、二氢欧山芹素、日本前胡醇和lomatin合成途径质粒构建
质粒pCDF-Duet-ximD含有苯并吡喃生物合成基因簇中的1个基因：来源于Streptomyces xiamenensis 318的ximD基因（单加氧酶）；质粒pCDF-Duet-ximD-ximE含有苯并吡喃生物合成基因簇中的2个基因：来源于Streptomyces xiamenensis318的ximD和ximE基因（环化酶）。所有基因均通过PCR扩增获得，其中ximD基因以Streptomyces xiamenensis 318基因组为模板扩增而来，ximE基因为针对大肠杆菌密码子优化后得到的基因（ximEsyn），其序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述的印度榅桲素、二氢欧山芹素、日本前胡醇和lomatin异源合成示意图如图1所示。
实施例中所用质粒及引物见表1：
表1引物列表
Figure 10000233334477
Figure 10000233359142
Figure 10000233387211
Figure 10000233417602
Figure 10000233443264
Figure 10000233465373
具体构建方法如下：
（1）pCDF-Duet-ximD构建
以ximD-F/ximD-R为引物， Streptomyces xiamenensis 318基因组为模板，扩增ximD基因。PCR产物经回收后和质粒pCDF-Duet分别酶切，按照目的片段：载体=5：1的摩尔比连接后转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子验证后得到重组载体pCDF-Duet-ximD（图2），序列如SEQ ID NO.2所示。
（2）质粒pCDF-Duet-ximD-ximE的构建
以ximE-F/ximE-R为引物，所合成的基因ximE为模板，扩增ximE基因。PCR产物经回收后和质粒pCDF-Duet-ximD分别酶切，按照目的片段：载体=5：1的摩尔比连接后转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子验证后得到重组载体pCDF-Duet-ximD-ximE（图3），序列如SEQ IDNO.3所示。
实施例2 印度榅桲素、二氢欧山芹素生产菌株的构建
直接将质粒pCDF-Duet-ximD通过热激钙转化的方法转入大肠杆菌BL21（DE3）中，获得菌株XL01。
实施例3 日本前胡醇和lomatin生产菌株的构建
将质粒pCDF-Duet-ximD-ximE通过热激钙转化的方法转入大肠杆菌BL21（DE3）中，获得菌株XL02。
实施例4摇瓶发酵生产印度榅桲素、日本前胡醇
将37°C过夜活化后的重组菌株XL01和XL02分别转接到三瓶50 mL 含100 μg/mL链霉素的液体LB培养基（含0.2%葡萄糖）中，待OD600达到0.6时加入终浓度为0.05 mM的IPTG诱导，诱导1小时后加入终浓度为50 mg/L 的7-去甲基软木花椒素，每组三个平行。20°C，160rpm诱导24小时。乙酸乙酯萃取后HPLC检测。
HPLC条件如下：安捷伦C18反相柱 (Extend-C18 reverse phase columnAgilent, 150 x 4.6 mm)；溶剂 A: 水, 含 0.5‰ 三氟乙酸; 溶剂B: 乙腈, 含0.5‰ 三氟乙酸; 流动相: 0-5min, 25% 乙腈; 5-30 min, 25%-90% 乙腈; 30-35.1 min, 100%乙腈; 35.1-43 min, 25% 乙腈; 流速: 1 mL/min; 检测波长: 190-800 nm.
经HPLC检测（图4），在诱导后的重组菌株XL01中检测到印度榅桲素；在诱导后的重组菌株XL02中检测到印度榅桲素和日本前胡醇，产量分别为3.7 mg/L和3.6 mg/L。
印度榅桲素和日本前胡醇UPLC-MS检测结果如图6和7所示，其结果显示，XL01菌株成功合成印度榅桲素；XL02菌株成功合成印度榅桲素和日本前胡醇。
实施例5摇瓶发酵生产二氢欧山芹素和lomatin
将37°C过夜活化后的重组菌株XL01和XL02分别转接到三瓶50 mL 含100 μg/mL链霉素的液体LB培养基（含0.2%葡萄糖）中，待OD600达到0.6时加入终浓度为0.05 mM的IPTG诱导，诱导1小时后加入终浓度为50 mg/L 的王草酚，每组三个平行。20°C，160rpm诱导24小时。乙酸乙酯萃取后HPLC检测。
经HPLC检测（图5），在诱导后的重组菌株XL01中检测到二氢欧山芹素，在诱导后的重组菌株XL02中检测到二氢欧山芹素和lomatin。
结论：
在重组菌株中检测到印度榅桲素、二氢欧山芹素、日本前胡醇和lomatin，证明利用厦门霉素合成基因ximD和ximE在异源宿主大肠杆菌中合成这些化合物是可行的。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种大肠杆菌菌株及其生物合成吡喃香豆素和呋喃香豆素的方法
<130> KAG41474
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggtcaga ctacgcacac cgcactggat cgttacatgg agctggcaga ccgtgcagta 60
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caaagagttc ctccgccgct ggacctacca aggcaacgct atgttctctt gcttttgtca 2460
gcaagatagc cagatcaatg tcgatcgtgg ctggctcgaa gatacctgca agaatgtcat 2520
tgcgctgcca ttctccaaat tgcagttcgc gcttagctgg ataacgccac ggaatgatgt 2580
cgtcgtgcac aacaatggtg acttctacag cgcggagaat ctcgctctct ccaggggaag 2640
ccgaagtttc caaaaggtcg ttgatcaaag ctcgccgcgt tgtttcatca agccttacgg 2700
tcaccgtaac cagcaaatca atatcactgt gtggcttcag gccgccatcc actgcggagc 2760
cgtacaaatg tacggccagc aacgtcggtt cgagatggcg ctcgatgacg ccaactacct 2820
ctgatagttg agtcgatact tcggcgatca ccgcttccct catactcttc ctttttcaat 2880
attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt 2940
agaaaaataa acaaatagct agctcactcg gtcgctacgc tccgggcgtg agactgcggc 3000
gggcgctgcg gacacataca aagttaccca cagattccgt ggataagcag gggactaaca 3060
tgtgaggcaa aacagcaggg ccgcgccggt ggcgtttttc cataggctcc gccctcctgc 3120
cagagttcac ataaacagac gcttttccgg tgcatctgtg ggagccgtga ggctcaacca 3180
tgaatctgac agtacgggcg aaacccgaca ggacttaaag atccccaccg tttccggcgg 3240
gtcgctccct cttgcgctct cctgttccga ccctgccgtt taccggatac ctgttccgcc 3300
tttctccctt acgggaagtg tggcgctttc tcatagctca cacactggta tctcggctcg 3360
gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt aagcaagaac tccccgttca gcccgactgc 3420
tgcgccttat ccggtaactg ttcacttgag tccaacccgg aaaagcacgg taaaacgcca 3480
ctggcagcag ccattggtaa ctgggagttc gcagaggatt tgtttagcta aacacgcggt 3540
tgctcttgaa gtgtgcgcca aagtccggct acactggaag gacagatttg gttgctgtgc 3600
tctgcgaaag ccagttacca cggttaagca gttccccaac tgacttaacc ttcgatcaaa 3660
ccacctcccc aggtggtttt ttcgtttaca gggcaaaaga ttacgcgcag aaaaaaagga 3720
tctcaagaag atcctttgat cttttctact gaaccgctct agatttcagt gcaatttatc 3780
tcttcaaatg tagcacctga agtcagcccc atacgatata agttgtaatt ctcatgttag 3840
tcatgccccg cgcccaccgg aaggagctga ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc 3900
gagatcccgg tgcctaatga gtgagctaac ttacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 3960
ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 4020
gaggcggttt gcgtattggg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga gacgggcaac 4080
agctgattgc ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc cacgctggtt 4140
tgccccagca ggcgaaaatc ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata acatgagctg 4200
tcttcggtat cgtcgtatcc cactaccgag atgtccgcac caacgcgcag cccggactcg 4260
gtaatggcgc gcattgcgcc cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat cgcagtggga 4320
acgatgccct cattcagcat ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc actccagtcg 4380
ccttcccgtt ccgctatcgg ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg ccagccagcc 4440
agacgcagac gcgccgagac agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat ttgctggtga 4500
cccaatgcga ccagatgctc cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga gaaaataata 4560
ctgttgatgg gtgtctggtc agagacatca agaaataacg ccggaacatt agtgcaggca 4620
gcttccacag caatggcatc ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag cccactgacg 4680
cgttgcgcga gaagattgtg caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct tcgttctacc 4740
atcgacacca ccacgctggc acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc cgcgacaatt 4800
tgcgacggcg cgtgcagggc cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa cgactgtttg 4860
cccgccagtt gttgtgccac gcggttggga atgtaattca gctccgccat cgccgcttcc 4920
actttttccc gcgttttcgc agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg ggaaacggtc 4980
tgataagaga caccggcata ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt cacattcacc 5040
accctgaatt gactctcttc cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt tttgcgccat 5100
tcgatggtgt ccgggatctc gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaaattaat 5160
acgactcact ata 5173
<210> 3
<211> 5497
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60
gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgatgccgaa 120
ctctcccgcc gcggtcttcg agcggctcac caccaccgtc ccgccggtcc gcatcgaggt 180
tcgtctcggc accgcctgcg tgctcggcgg cggcgtcgcc ggcctggtcg cggcccgcgt 240
actcgcggac cacgccaacc gtgtcgtgat catcgagccc gacctgccgg aagccgcgct 300
cagcggcgcg gctcgtcccg gcgtcccgca gggctcccag gtgcacctcc tgctgcccgg 360
cggacgcgcg cagctcgaac gcttcttccc cggtgtcgtg gcagaggccc tcgccggggg 420
tgctgtgtcg tgcggtccgg agcgcaccgc cacctacctc gacgacatcg agcagatcgc 480
cacgcccaac gcgcggttcc tggggagcag tcgccccttc ctggagacgc tgatccgtcg 540
gcgcgcgctc gcactgccca acgtcgagct ggtgagtgga cgcgtcattg ggctgcggta 600
cgcgcgcggc gccgtcgagt cggtgcgcta cgcggttggc ggcgaccacg tcgtcgcccc 660
agccgacttc gtcgtcgacg cctccggccg cggcagcagg ctgagtgact ggctggagca 720
gggcggctgg ccccgaccgg agacgcaacg gctccagacc gacatccgct acttgtctgc 780
ccgtttcacg cgctcggccg actgggacgg ccccctcagc ggcatctccc gctacagccc 840
gcatttcccg aaggacatcg ccggagcggc ggtcaacccg atcgagaacc aacagtgggt 900
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ccggtgccgt gagctgccac cgatcttcca ggaagccgtc aagggcgaaa tcgtcggcga 1020
ggttgtcccg taccgccacc ccgacagcag gtggcgccac ttcgaggcgc tcgaccgctt 1080
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aggtatgtcc tcggccgcgc tccacgcctc ctgcctgtcg gagttcctgc gctctggccc 1200
cgacctggac gccccggccc ggcacttcct cgagctggaa aaggtcgtcg tcgaagccgc 1260
gtggcagacg tccacggccg gcgacgccat ccggctgggc ctggcaacgc caccggccac 1320
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gatggcaccg gatttggtgc ttcgcgcggc gcgggtcaat ggtgtgccgg aggagcggat 1500
ccggcaggag tacacgatga tggagacgac gtgaaagctt gcggccgcat aatgcttaag 1560
tcgaacagaa agtaatcgta ttgtacacgg ccgcataatc gaaattaata cgactcacta 1620
taggggaatt gtgagcggat aacaattccc catcttagta tattagttaa gtataagaag 1680
gagatataca tatgatgggt cagactacgc acaccgcact ggatcgttac atggagctgg 1740
cagaccgtgc agtacgtgac cctagcgcac tggctgaact gccgactatc ttcgctccgg 1800
atgctactgt aacgctgcgt gatgagccgg ttaccggtat gccagctatc atggaattct 1860
accgcgtgtt tgtcgcggcg gtggctgaat ccaaacacta ctggaccacc acgatcctgg 1920
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tgaccgcggc cggtgttgaa catgccactg ttgacaccga cggcctgatt accaacctgc 2040
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ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt 2220
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tgccgactac cttggtgatc tcgcctttca cgtagtggac aaattcttcc aactgatctg 2460
cgcgcgaggc caagcgatct tcttcttgtc caagataagc ctgtctagct tcaagtatga 2520
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cgattttgcc ggttactgcg ctgtaccaaa tgcgggacaa cgtaagcact acatttcgct 2640
catcgccagc ccagtcgggc ggcgagttcc atagcgttaa ggtttcattt agcgcctcaa 2700
atagatcctg ttcaggaacc ggatcaaaga gttcctccgc cgctggacct accaaggcaa 2760
cgctatgttc tcttgctttt gtcagcaaga tagccagatc aatgtcgatc gtggctggct 2820
cgaagatacc tgcaagaatg tcattgcgct gccattctcc aaattgcagt tcgcgcttag 2880
ctggataacg ccacggaatg atgtcgtcgt gcacaacaat ggtgacttct acagcgcgga 2940
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acgctccggg cgtgagactg cggcgggcgc tgcggacaca tacaaagtta cccacagatt 3360
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cgtttaccgg atacctgttc cgcctttctc ccttacggga agtgtggcgc tttctcatag 3660
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gaactccccg ttcagcccga ctgctgcgcc ttatccggta actgttcact tgagtccaac 3780
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gaaggacaga tttggttgct gtgctctgcg aaagccagtt accacggtta agcagttccc 3960
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ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt tcgcagaaac gtggctggcc 5280
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aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct cttccgggcg ctatcatgcc 5400
ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga tctcgacgct ctcccttatg 5460
cgactcctgc attaggaaat taatacgact cactata 5497
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggaattcca tatgatgggt cagactacgc acacc 35
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgctcgagt tagcccggag tgcgggtata 30

Claims (9)

1.一种大肠杆菌菌株，其特征在于，所述菌株为具有一个苯并吡喃生物合成相关基因的大肠杆菌BL21，所述的苯并吡喃生物合成相关基因是ximD基因；
或者，所述菌株为具有两个苯并吡喃生物合成相关基因的大肠杆菌BL21，所述的苯并吡喃生物合成相关基因是ximE基因和ximD基因；
所述的苯并吡喃生物合成合成相关基因为来源于Streptomyces xiamenensis318 的ximD和ximE，其中ximD基因的序列为序列SEQ ID NO.2的第113-1534位所示，ximE基因的序列为序列SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌菌株，其特征在于，所述菌株为含有质粒pCDF-Duet-ximD或pCDF-Duet-ximD-ximE的菌株。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌菌株，其特征在于，所述质粒pCDF-Duet-ximD的序列如SEQ ID NO.2所示；所述质粒pCDF-Duet-ximD-ximE的序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种根据权利要求1-3任一项所述的大肠杆菌菌株在生产吡喃香豆素和呋喃香豆素中的应用，其特征在于，所述的应用为：具有一个苯并吡喃生物合成相关基因的大肠杆菌菌株生产的呋喃香豆素为印度榅桲素或二氢欧山芹素；具有两个苯并吡喃生物合成相关基因的大肠杆菌菌株生产的吡喃香豆素为日本前胡醇或lomatin。
5.一种吡喃香豆素和呋喃香豆素的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1-3任一项所述的大肠杆菌菌株接入培养基中培养，然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后，并喂养底物，萃取即得；具有一个苯并吡喃生物合成相关基因的大肠杆菌菌株生产的呋喃香豆素为印度榅桲素或二氢欧山芹素，具有两个苯并吡喃生物合成相关基因的大肠杆菌菌株生产的吡喃香豆素为日本前胡醇或lomatin。
6.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述大肠杆菌菌株接入含0.2%葡萄糖的LB培养基中；所述诱导过程为：待OD600达到0.6-1.0时加入终浓度为0.02-0.05 mM的IPTG诱导，且在诱导1-2小时后加入底物。
7.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述诱导的温度为16-20℃，摇床转速为160-200 rpm。
8.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述底物为终浓度50-100 mg/L 的7-去甲基软木花椒素或王草酚。
9.根据权利要求5或6所述的生产方法，其特征在于，所述培养基中还包括100 μg/mL链霉素。
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