CN108795899B

CN108795899B - NtCCoAOMT基因在提高烟草产绿原酸中的应用

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Publication number: CN108795899B
Application number: CN201810662107.0A
Authority: CN
Inventors: 李世升; 向福; 李竟才; 项俊; 方元平; 陈娟
Original assignee: Huanggang Normal University
Current assignee: Huanggang Normal University
Priority date: 2018-06-25
Filing date: 2018-06-25
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2038-06-25
Also published as: CN108795899A

Abstract

本发明公开了NtCCoAOMT基因在提高烟草产绿原酸中的应用，属于植物基因工程领域。本发明通过研究发现NtCCoAOMT蛋白或其编码基因具有提高烟草产绿原酸中的应用，所述NtCCoAOMT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将NtCCoAOMT蛋白的编码基因序列构建到植物表达载体中获得能表达NtCCoAOMT蛋白的重组载体，将构建的重组载体转入烟草中使NtCCoAOMT过表达，达到提高烟草产绿原酸的目的。本发明发现了NtCCoAOMT在烟草中过表达能极大幅度地提高绿原酸的产量，为绿原酸的生产提供了新的途径。

Description

NtCCoAOMT基因在提高烟草产绿原酸中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及NtCCoAOMT基因在提高烟草产绿原酸中的应用。

背景技术

CCoAOMT基因是影响植物木质素合成的关键酶基因之一，在国内外有大量研究表明通过控制CCoAOMT基因的表达活性可以对植物木质素的合成产生非常大的影响。刘惠荣^[1]等的试验结果表明，来自毛白杨CCoAOMT cDNA的反义基因有效地抑制了烟草内源CCoAOMT基因的表达。吕萌等以具有代表性的陆地棉品种徐州142作为研究对象，系统研究了CCoAOMT基因家族在不同组织和不同发育时期纤维中的表达情况，并进行了较为准确的量化分析，为进一步了解各组织和纤维发育时期中木质素合成中间产物的种类，含量和构型提供了理论依据，同时也可以为棉纤维的品质改良提供一定的分子理论基础。刘红梅^[2]等通过以青扬为材料表明CCoAOMT基因对G型木质素合成有特异调节作用。谷振军^[3]等以赤桉为材料的研究也表明抑制CCoAOMT基因的表达能降低体内木质素含量、提高木质素单体S/G的比例，使得木质素在制浆中更容易去除，并且进一步探索赤桉CCoAOMT1基因可变剪接的作用为进一步研究细胞壁木质素沉积机制、木质素含量降低及木质素更容易去除的转基因育种研究提供理论依据和基因资源。另外也有大量研究表明了CCoAOMT基因在拟南芥、烟草^[5]、苎麻^[6,7]等植物中的木质素合成起关键作用，但很少有关于CCoAOMT基因在烟草绿原酸合成中是否起到调控作用的研究。

对于绿原酸，目前也有了大量关于其合成和代谢途径的研究，如李洋^[8]等通过超量表达烟草的NtC3H基因，得到了绿原酸含量显著提升的转基因烟草植株，确定了NtC3H基因对绿原酸合成的影响，另外其也研究而了NtHCT基因在绿原酸的合成中也起到了正向调控作用^[10]。张静茹^[9]等的研究表明了HQT的基因表达量与绿原酸的生物合成具有线性关系，HQT基因的表达对绿原酸合成具有正调控作用。蒋向辉^[11]不同的方面对金银花绿原酸生物合成过程中重要的三个关键酶基因LjHCT、LjC3H1及LjCCoAOMT1进行了相关研究，进一步为研究金银花绿原酸的生物合成机制奠定基础。

有研究表明NtCCoAOMT在木质素合成过程中发挥作用，但前人均未发现NtCCoAOMT与绿原酸合成间的关系，更不清楚NtCCoAOMT是否能够调控绿原酸在植物体内的含量。

参考文献：

[1]刘惠荣,赵华燕,魏建华,邵金旺,朱至清,宋艳茹.抑制CCoAOMT表达对烟草木质素生物合成的影响[J].中国农业科学,2002,(08):921-924.

[2]刘红梅,胡尚连,卢学琴,曹颖,任鹏.青杨CCoAOMT基因的克隆及其生物信息学分析[J].湖北农业科学,2014,53(11):2670-2674.

[3]谷振军,章怀云,张党权,谢耀坚,何含杰,陈丽莉,彭宽,刘果,杨丹.赤桉CCoAOMT亚家族的基因克隆及可变剪接分析[J].林业科学,2014,50(05):62-69.

[4]邓晶,刘峰,郭清泉,陈建荣,张学文.苎麻CCoAOMT基因干扰表达载体构建及对烟草的转化[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2008,(02):132-135.

[5]王玲,田敏,段红平,彭芳.反义CCoAOMT基因转化烟草调控木质素生物合成[J].江苏农业科学,2011,39(02):62-64.

[6]陈建荣,郭清泉,张学文,陈金军.苎麻咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因原核表达及其结构分析[J].中国农学通报,2008,24(12):50-53.

[7]黄春琼.反义CCoAOMT基因转化苎麻和烟草的研究[D].华南热带农业大学,2007.

[8]李洋,唐雪冰,李晓峰,李明,储昭辉,丁新华.NtC3H基因对烟草类黄酮及绿原酸合成的影响[J].中国烟草科学,2016,37(01):8-13.

[9]张静茹,吴敏琳,李卫东,白根本.金银花HQT基因在真核植物细胞中对绿原酸生物合成的调控[J].中草药,2016,47(20):3683-3687.

[10]李洋,李明,岳玮,丁新华,储昭辉.烟草NtHCT基因对次生代谢物质绿原酸和类黄酮合成的影响[J].中国烟草学报,2015,21(06):127-131.

[11]蒋向辉.金银花绿原酸合成途径关键酶基因克隆与功能分析[D].湖南大学,2013.

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟草来源的NtCCoAOMT蛋白或其编码基因在提高烟草产绿原酸中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种NtCCoAOMT蛋白或其编码基因在提高烟草产绿原酸中的应用。所述NtCCoAOMT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。

所述NtCCoAOMT蛋白或其编码基因在提高烟草产绿原酸中的应用。

一种提高烟草产绿原酸的方法，包括如下步骤：将所述NtCCoAOMT蛋白的编码基因序列构建到植物表达载体中获得能表达NtCCoAOMT蛋白的重组载体，将构建的重组载体转入烟草中使NtCCoAOMT过表达，达到提高烟草产绿原酸的目的。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现了NtCCoAOMT在烟草中过表达能极大幅度地提高绿原酸的产量。

(2)本发明所构建的转NtCCoAOMT基因烟草植株中绿原酸的含量是野生型烟草植株的23.6倍。

(3)本发明为绿原酸的生产提供了新的途径。

附图说明

图1是阳性转基因烟草植株的PCR鉴定结果图，从左至右依次第1泳道为MARKERDL2000、第2泳道为野生型烟草植株，其它为转基因烟草植株。

图2是定量PCR检测NtCCoAOMT在非转基因烟草(左)和转基因烟草(右)叶片中的表达量结果图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

一、NtCCoAOMT in PART27质粒的构建

(1)酶切PART27和NtCCoAOMT片段

提取烟草叶片的RNA，反转录成cDNA后作为模板，使用引物NtCCoAOMT_fs和NtCCoAOMT_fas进行PCR扩增获得NtCCoAOMT CDS片段。引物序列具体如下：

NtCCoAOMT_fs：5’-NNNNGAGCTCTACCGTCTCTTACCTTAATT-3’，

NtCCoAOMT_fas：5’-NNNNGGATCCTCAGCTGATGCGGCGGCAC-3’。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收。

按照下面体系配制酶切体系，使用Sac I和BamH I分别双酶切PART27和NtCCoAOMT片段，37℃反应过夜。

酶切体系：10×NBE(NEB)buffer3 2μL，10×BSA 2μL，Sac I 0.5μL，BamH I 0.5μL，PART27/NtCCoAOMT 15μL，总体积20μL。

(2)回收、连接PART27片段和NtCCoAOMT片段

酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收酶切后的PART27载体、NtCCoAOMT片段，按如下体系配制连接体系，于16℃反应3小时。

连接体系：10×MBI ligation buffer 1μL，MBI DNA ligase 1μL，NtCCoAOMT片段6μL，PART27片段2μL，总体积10μL。

(3)转化连接产物

1)高效率大肠杆菌感受态细胞的制备

①.挑取大肠杆菌DH5α单菌落，接种至25mL SOB培养液中，37℃、250rpm培养6-8h。

②.将上述初始培养物转接2mL于盛有250mL SOB培养液的1L锥形瓶中，于18℃、250rpm摇床培养。当OD₆₀₀值约为0.55时，将培养物置冰上预冷10min，摇震培养物使其迅速且均匀地冷却。

③.4℃、5500rpm(约2500g)离心10min收集菌体。倾去培养液，加80mL预冷的Inoue转化缓冲液重悬细菌沉淀。然后4℃、5500rpm离心10min再次收集菌体。

④.用20mL冰预冷的Inoune转化缓冲液重悬细胞沉淀，加1.5mL DMSO，轻轻混匀后置于冰上10min。

⑤.迅速将悬液分装至无菌的离心管中，液氮速冻后储存于-70℃备用。

2)连接产物的转化

取出一管制备好的大肠杆菌感受态细胞，置于冰上待自然解冻。将2μL连接产物加至感受态细胞，然后轻轻混匀连接产物和感受态细胞。42℃水浴热激90s，快速将管转移至冰浴中，使细胞冷却1～2min。加入800μL LB培养基，37℃、200rpm培养45min。将转化产物涂布至含100μg/μL卡那霉素的培养基(预涂布40μL IPTG和40μL X-gal母液)上37℃过夜培养。

(4)PCR鉴定转化菌落

1)在超净台上用灭菌的牙签分别挑取多个单菌落入5mL含卡那霉素LB液体培养基中。编好号并置于37℃振荡(250rpm)培养24小时。

2)在200μL薄壁管(Axygen,USA)中调制反应液并在PCR仪上反应。

反应液体系：10×EX Taq buffer(TAKARA)5μL，dNTPs mix(10mM each)1μL，NtCCoAOMT_fs 1μL，NtCCoAOMT_fas 1μL，EX Taq polymerase 0.2μL，菌液1μL，Distilledwater 40.8μL，总体积50μL。

反应条件：①95℃ 2min；②94℃ 20sec，③55℃ 20sec，④72℃ 70sec，②-④30cycles；⑤4℃ pause。

3)PCR完成后，取9μL PCR产物与1μL 10×Loading buffer(TaKaRa)混匀，在1％琼脂糖凝胶上电泳，检测PCR产物。

4)提取阳性克隆菌液的质粒，用Sac I和BamH I双酶切检测。

5)将酶切有阳性带的克隆送出测序，比对后获得构建好的NtCCoAOMT in PART27质粒。

二、ProCaMV35S:NtCCoAOMT质粒的构建

(1)酶切NtCCoAOMT in PART27质粒和ProCaMV35S启动子片段

以含有ProCaMV35S启动子片段的pCAMBIA1300载体为模板，使用引物35S-S和35S-AS进行PCR扩增获得ProCaMV35S启动子片段。引物序列具体如下：

35S-S：5’-NNNNGTCGACACCGCGCGAGGGGTCTAATC-3’，

35S-AS：5’-NNNNGAGCTCAGTCCCCCGTGTTCTCTCCA-3’。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收。

按如下体系配制酶切反应体系，使用Sal I和Sac I分别双酶切NtCCoAOMT inPART27质粒和ProCaMV35S，37℃反应过夜。

酶切反应体系：10×NBE buffer2 2μL，10×BSA 2μL，Sal I 0.5μL，Sac I 0.5μL，NtCCoAOMT in PART27/ProCaMV35S 15μL，总体积20μL。

(2)回收、连接NtCCoAOMT in PART27质粒和ProCaMV35S启动子片段

酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收酶切后的NtCCoAOMT in PART27载体、ProCaMV35S片段，按如下体系配制连接体系，于16℃反应2小时。

连接体系：10×MBI ligation buffer 1μL，MBI DNA ligase 1μL，ProCaMV35S启动子片段6μL，NtCCoAOMT in PART27片段2μL，总体积10μL。

参照上述转化连接产物、PCR鉴定转化菌落步骤，获得构建好的ProCaMV35S:NtCCoAOMT质粒。

实施例2

利用烟草叶盘转化法将ProCaMV35S:NtCCoAOMT质粒转化进烟草，烟草叶盘转化包括菌的选择到外植体的预培养、侵染、共培养、选择培养、生根培养等，具体过程参考文献(LiS1,HeY,ZhaoJ,ZhangL,SunMX.Polarproteintransportbetweenapicalandbasalcellsduringtobacco earlyembryogenesis..PlantCellReports,2013,32(2):285-291.)中记载的方法。

一、阳性转基因烟草植株的鉴定：

(1)待幼苗长好根后，使用CTAB快速基因组提取法提取叶子基因组。

1)将转基因苗取叶片，加入平底EP管中，加钢珠2颗，加入700μL CTAB抽提液，研磨仪上研磨10min，25次/min。

2)12000rpm/min离心1min，去泡沫，转移悬液至另一洁净EP管中。

3)65℃温浴45min。

4)取出EP管，待其降温后，加入350μL 24:1的氯仿/异戊醇，充分混匀2min。

5)12000rpm室温离心10min，回收上相。

6)加入0.7倍体积异丙醇，混匀，-20℃沉淀60min。

7)12000rpm室温离心10min，回收沉淀。

8)用70％乙醇洗净沉淀。

9)12000rpm室温离心4min，回收沉淀并烘干，各溶于50μL TE溶液中。

(2)PCR检测NtCCoAOMT基因是否插入。

PCR所用引物序列为：正向引物5’-ACTTGTCCGCCCTGCCGCTTCT-3’，反向引物5’-CTAGACCGGCTACACCTAACG-3’。PCR检测结果见图1，野生型烟草扩增不出目的条带、转基因烟草扩增出目的条带，表明NtCCoAOMT基因成功插入。

(3)选定确定插入NtCCoAOMT基因的转基因烟草幼苗练苗4天后转入土中栽培。

二、NtCCoAOMT表达量检测

取野生烟草植株和转基因烟草植株播种后生长两月的成熟叶片，提取总RNA进行反转录得到cDNA，再通过荧光实时定量PCR检测NtCCoAOMT的表达情况，以GADPH作为内参基因。定量PCR所用引物序列如下：

NtCCoAOMT_s：5’-CCTGCTTTGCCTGTTCTTGA-3’，

NtCCoAOMT_as：5’-GAGCCACCACAGAACCATTC-3’；

qGAPS：5’-AGGCTGGAGAAAGAAGCTACCTA-3’，

qGAP AS：5’-AGTCTGTGGACACCACATCATCT-3’。

结果见图2，显示NtCCoAOMT基因在转基因烟草叶片中表达量显著升高。

三、绿原酸含量测定

取野生烟草植株和转基因烟草植株播种后生长两月的成熟叶片各0.3g用液氮研磨至粉末，置于3mL色谱甲醇-20℃条件提取2h，每15min震荡1次，10000rpm离心取上清，将上清经0.22μm的微孔滤膜至样品管，取10μL滤液用于HPLC上样分析检测绿原酸含量。

野生烟草植株、转基因烟草植株叶片中的绿原酸含量分别为1.55×10^-4mg/g、3.66×10^-3mg/g。由绿原酸检测结果可以看出野生型烟草与转基因烟草的绿原酸含量发生显著变化，转基因烟草植株中绿原酸的含量是野生型烟草植株的23.6倍。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 黄冈师范学院

<120> NtCCoAOMT基因在提高烟草产绿原酸中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 240

<212> PRT

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 1

Met Ala Glu Asn Gly Ile Lys His Gln Glu Val Gly His Lys Ser Leu

1 5 10 15

Leu Gln Ser Asp Ala Leu Tyr Gln Tyr Ile Leu Glu Thr Ser Val Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Pro Glu Ser Met Lys Glu Leu Arg Glu Val Thr Ala Lys

35 40 45

His Pro Trp Asn Leu Met Thr Thr Ser Ala Asp Glu Gly Gln Phe Leu

50 55 60

Asn Met Leu Leu Lys Leu Ile Asn Ala Lys Asn Thr Met Glu Ile Gly

65 70 75 80

Val Tyr Thr Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ile Pro Asp

85 90 95

Asp Gly Lys Ile Leu Ala Met Asp Ile Asn Arg Glu Asn Tyr Glu Ile

100 105 110

Gly Leu Pro Ile Ile Glu Lys Ala Gly Val Ala His Lys Ile Glu Phe

115 120 125

Arg Glu Gly Pro Ala Leu Pro Val Leu Asp Gln Leu Val Glu Asp Lys

130 135 140

Lys Asn His Gly Thr Tyr Asp Phe Ile Phe Val Asp Ala Asp Lys Asp

145 150 155 160

Asn Tyr Ile Asn Tyr His Lys Arg Ile Ile Asp Leu Val Lys Val Gly

165 170 175

Gly Leu Ile Gly Tyr Asp Asn Thr Leu Trp Asn Gly Ser Val Val Ala

180 185 190

Pro Pro Asp Ala Pro Met Arg Lys Tyr Val Arg Tyr Tyr Arg Asp Phe

195 200 205

Val Leu Glu Leu Asn Lys Ala Leu Ala Val Asp Pro Arg Ile Glu Ile

210 215 220

Cys Met Leu Pro Val Gly Asp Gly Ile Thr Leu Cys Arg Arg Ile Ser

225 230 235 240

<210> 2

<211> 723

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 2

atggcagaga atggaattaa acaccaagag gttggccaca agagtctttt gcaaagtgac 60

gctctttacc agtacatact tgaaaccagt gtatacccaa gagagccaga atccatgaaa 120

gagctcaggg aggtgactgc taagcatcca tggaatttaa tgacaacatc agcggatgaa 180

ggacagttct tgaacatgtt gttgaagttg attaatgcta aaaatacaat ggagattgga 240

gtttacactg gctactccct ccttgctact gcccttgcta tccccgatga tggaaagata 300

ttagcaatgg acattaacag ggaaaattac gaaataggat tgcccataat agaaaaggcc 360

ggtgtggctc acaaaattga atttagagaa ggccctgctt tgcctgttct tgatcaattg 420

gttgaagata aaaagaatca tggcacatat gatttcatat ttgtggatgc tgacaaggac 480

aactacatta actatcacaa aaggataata gatttggtga aagttggtgg tttgattggg 540

tacgacaaca ccctatggaa tggttctgtg gtggctccac ccgatgcacc aatgaggaaa 600

tacgtaaggt attacaggga ctttgtattg gagcttaaca aagccctagc cgttgatcct 660

aggattgaga tttgtatgtt acctgttggt gatggcatta ccttgtgccg ccgcatcagc 720

tga 723

Claims

1.一种NtCCoAOMT蛋白在提高烟草产绿原酸中的应用，其特征在于：在烟草中过表达NtCCoAOMT蛋白，所述NtCCoAOMT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种NtCCoAOMT蛋白的编码基因在提高烟草产绿原酸中的应用，其特征在于：在烟草中过表达NtCCoAOMT蛋白，所述NtCCoAOMT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述NtCCoAOMT蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种提高烟草产绿原酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：将NtCCoAOMT蛋白的编码基因序列构建到植物表达载体中获得能表达NtCCoAOMT蛋白的重组载体，将构建的重组载体转入烟草中使NtCCoAOMT过表达，所述NtCCoAOMT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。