CN108760938A - 一种高效检测禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的分析方法 - Google Patents

一种高效检测禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种高效检测禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的分析方法，本发明首次建立禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留超高效液相色谱‑串联质谱检测法，本发明的目标化合物出峰时间短（1min左右），灵敏度高（CAP、TAP、FF和FFA在禽蛋中的LOD分别为0.03、0.3、0.1、0.4µg/kg，LOQ分别为0.08、0.8、0.27、1.2µg/kg），四种目标化合物在禽蛋中添加浓度分别为LOQ、0.5MRL、1.0MRL、2.0MRL的回收率分别大于或等于90.31%、93.40%、92.32%和92.35%，日内、日间相对标准偏差分别低于4.33%和5.77%。同时该方法洗脱程序简单，溶剂消耗少，分析效率更高，耗时短（每个样品只需要4min），更适合在大批量样品分析中应用与推广。

Description

一种高效检测禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物 氟苯尼考胺多残留的分析方法
技术领域
本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种高效检测禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的分析方法。
背景技术
目前，国内外关于氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的检测方法有微生物法、免疫学检测方法、气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-串联质谱，但超高效液相色谱-串联质谱检测法(UPLC-MS/MS)检测禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的方法还尚未见报道。
发明内容
为了解决禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺分离的问题，本发明提供一种高效检测禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的分析方法，该方法的目标化合物出峰时间短，灵敏度高，洗脱程序简单，溶剂消耗少，分析效率更高，耗时短。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种高效检测禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)禽蛋样品提取与净化；
2)超高效液相色谱-串联质谱检测：
a.色谱条件：以Waters ACQUITY UPLC BEH C18为色谱柱；以A相：2mM乙酸铵的水溶液和B相：2mM乙酸铵的乙腈体系为流动相；流速：0.2mL/min；设置特定的梯度洗脱程序；
b.检测器为质谱检测器，电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子扫描FFA和负离子扫描 CAP、TAP、FF和d5-CAP；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾离子化电压IS：5000～5500 V正离子扫描、4000～4500V负离子扫描；离子源温度TEM：450～500℃；离子源喷雾气 Gas1:40～45psi正离子扫描、45～50psi负离子扫描；辅助加热气Gas2：45～50psi 正离子扫描、35～40psi负离子扫描；气帘气CUR：12～15psi正离子扫描、16～20psi 负离子扫描；碰撞气CAD：6～8psi；碰撞室出口电压CXP：5～6V正离子扫描、7～8V 负离子扫描；射入电压EP：6.5～7.5V正离子扫描、11～13V负离子扫描；每个定量离子对驻留时间：100.0ms，每个定性离子对驻留时间：100.0ms。
在步骤b中，CAP、TAP、FF、FFA和d5-CAP的保留时间和其它质谱参数如下：
注：*定量离子对。
步骤a中，所述特定的梯度洗脱程序如下：
分离禽蛋中CAP、TAP、FF、FFA和d5-CAP的梯度洗脱程序
步骤(1)具体过程为：准确称取均质好的空白禽蛋样品放于研钵中，并加入硅藻土研磨，装入萃取池中，在1500psi，80℃条件下用ASE萃取，每个萃取池用甲醇:氨水: 水溶液以97:2:1，V/V的比例静态萃取，氮气吹扫，收集萃取液待用；收集的萃取液转移至离心管，置于45～50℃离心浓缩仪上蒸发浓缩；萃取液蒸发浓缩后，加入纯乙腈，漩涡振荡混匀，加入正己烷漩涡混匀，去脂，静置，弃去上层正己烷，下层提取液重复提取一次，然后置于45～50℃氮吹仪上吹干；将氮吹后的样品用55％乙腈分两次漩涡振荡溶解，12100×g离心10～15min，过0.22μm有机相针式滤器，滤液供UPLC-MS/MS检测。
步骤a中，色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×50mm，1.7μm；保护柱：Waters VanGuardTM BEH C18，1.7μm。步骤a中，进样体积：10μL；柱温 25～30℃。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
相比目前报道的高效液相色谱荧光法、高效液相色谱-串联质谱法，本发明的目标化合物出峰时间短(1min左右)，灵敏度高(CAP、TAP、FF和FFA在禽蛋中的LOD分别为 0.03、0.3、0.1、0.4μg/kg，LOQ分别为0.08、0.8、0.27、1.2μg/kg)，四种目标化合物在禽蛋中添加浓度分别为LOQ、0.5MRL、1.0MRL、2.0MRL的回收率分别大于或等于90.31％、 93.40％、92.32％和92.35％，日内、日间相对标准偏差分别低于4.33％和5.77％。同时该方法洗脱程序简单，溶剂消耗少，分析效率更高，耗时短(每个样品只需要4min)，更适合在大批量样品分析中应用与推广。因此，本发明首次建立禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留超高效液相色谱-串联质谱检测法。
本发明中采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)色谱柱，以A 相：2mM乙酸铵的水溶液和B相：2mM乙酸铵的乙腈体系为流动相，梯度洗脱，流速为0.2mL/min，色谱峰峰型尖锐(即灵敏度高)，分析物保留时间适中，无其他杂质峰干扰。
本发明提供了一种超高效液相色谱-串联质谱检测(UPLC-MS/MS)方法。本发明在分析效率、溶剂消耗、回收率、精密度、灵敏度及重现性角度，与其它检测方法进行比较，发现本方法分析效率更高、流动相消耗少、回收率、准确度和灵敏度高，重现性好，适合在批量样品分析中应用与推广。该方法能高效、准确的检测禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺的残留，且满足中国农业部、美国(FDA)和欧盟(EU)兽药残留检测方法的要求。
附图说明
图1氯霉素标准品(50ng/mL)二级质谱图；
图2甲砜霉素标准品(50ng/mL)二级质谱图；
图3氟苯尼考标准品(50ng/mL)二级质谱图；
图4氟苯尼考胺标准品(50ng/mL)二级质谱图；
图5 d5-氯霉素标准品(50ng/mL)二级质谱图；
图6空白鸡蛋样品(a)和空白鸡蛋样品添加标准品(b)的总离子流色谱图(TIC) 和提取离子色谱图(XIC)；
图7空白鸭蛋样品(a)和空白鸭蛋样品添加标准品(b)的总离子流色谱图(TIC) 和提取离子色谱图(XIC)；
图8空白鹅蛋样品(a)和空白鹅蛋样品添加标准品(b)的总离子流色谱图(TIC) 和提取离子色谱图(XIC)；
图9空白鸽蛋样品(a)和空白鸽蛋样品添加标准品(b)的总离子流色谱图(TIC) 和提取离子色谱图(XIC)；
图10空白鹌鹑蛋样品(a)和空白鹌鹑蛋样品添加标准品(b)的总离子流色谱图(TIC) 和提取离子色谱图(XIC)；
图11鸡蛋中氯霉素(a)、甲砜霉素(b)、氟苯尼考(c)和氟苯尼考胺(d)的基质添加标准曲线；
图12鸭蛋中氯霉素(a)、甲砜霉素(b)、氟苯尼考(c)和氟苯尼考胺(d)的基质添加标准曲线；
图13鹅蛋中氯霉素(a)、甲砜霉素(b)、氟苯尼考(c)和氟苯尼考胺(d)的基质添加标准曲线；
图14鸽蛋中氯霉素(a)、甲砜霉素(b)、氟苯尼考(c)和氟苯尼考胺(d)的基质添加标准曲线；
图15鹌鹑蛋中氯霉素(a)、甲砜霉素(b)、氟苯尼考(c)和氟苯尼考胺(d)的基质添加标准曲线。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
1.实验家禽的饲养和样品采集
本试验随机选取28周龄产蛋京海黄鸡30只(江苏京海禽业集团有限公司)、28-30周龄产蛋高邮鸭(开产日龄110-140天)30只(江苏高邮鸭集团)、30周龄产蛋扬州鹅48只(江苏天歌鹅业发展有限公司)，35周龄产蛋白羽王鸽50对(6、7、8-10个月下蛋)(江苏江南鸽业有限公司)、20周龄产蛋白羽鹌鹑30只(开产日龄45-55天)(兴化市安丰镇鹌鹑养殖有限公司)，试验前预饲1周，饲喂不含任何药物的全价饲料(分别由江苏京海禽业集团有限公司饲料厂、扬州市扬大饲料厂和东台市绿兴饲料有限公司提供)，自由饮水。
试验期间均饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料，于每天17:30～18:00收集禽蛋，连续收集1周，共收集鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋、鹌鹑蛋分别为120个、120个、80个、120个、150个左右，将每天收集的禽蛋样品保存在低温蛋库中。样品采集后分别将鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋和鹌鹑蛋匀浆后分装贴好标签，分别作为空白样品，置于-34℃冰箱中保存。
2.本发明提取与净化步骤
1)准确称取(5.0±0.05)g均质好的空白样品放于研钵中，并加入4.0g硅藻土研磨，为了达到最佳的萃取效率，尽可能将样品研磨成小颗粒，装入22mL的萃取池中，用ASE进行萃取；
2)在1500psi，80℃萃取条件下，每个萃取池用甲醇:氨水:水溶液(97:2:1，V/V)静态萃取1次，静态萃取时间5min，氮气吹扫60s，收集萃取液待用；
3)将上述萃取收集的萃取液转移至50mL离心管，置于50℃离心浓缩仪(2000×g)上蒸发浓缩至1～2ml。萃取液蒸发浓缩后，加入1ml纯乙腈，漩涡振荡混匀1min，加入10mL正己烷(用纯乙腈饱和)漩涡混匀，去脂，静置5min，弃去上层正己烷，下层提取液重复提取一次，然后置于50℃氮吹仪上吹干，待用；
4)将氮吹后的样品用5.0mL 55％乙腈分两次漩涡振荡溶解，12100×g离心15min，过0.22 μm有机相针式滤器，滤液供UPLC-MS/MS检测。
3试验条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×50mm，1.7μm；保护柱：WatersVanGuardTM BEH C18，1.7μm；流动相：A相为2mM乙酸铵-水溶液；B相为2mM 乙酸铵-乙腈溶液；分离禽蛋中CAP、TAP、FF、FFA和d5-CAP的梯度洗脱程序见表1；流速：0.2mL/min；进样体积：10μL；柱温25℃。
表1分离禽蛋中CAP、TAP、FF、FFA和d5-CAP的梯度洗脱程序
检测器为质谱检测器，离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子扫描(FFA)和负离子扫描(CAP、TAP、FF和d5-CAP)；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾离子化电压(IS)：5500V(正离子扫描)、4500V(负离子扫描)；离子源温度(TEM)：500℃；离子源喷雾气(Gas1):45psi(正离子扫描)、50psi(负离子扫描)；辅助加热气(Gas2)：50 psi(正离子扫描)、35psi(负离子扫描)；气帘气(CUR)：15psi(正离子扫描)、20psi(负离子扫描)；碰撞气(CAD)：8psi；碰撞室出口电压(CXP)：6V(正离子扫描)、8V(负离子扫描)；射入电压(EP)：7.5V(正离子扫描)、13V(负离子扫描)；每个定量离子对驻留时间：100.0ms，每个定性离子对驻留时间：100.0ms。CAP、TAP、FF、FFA和d5-CAP的保留时间和其它质谱参数见表2。50ng/mL CAP、TAP、FF、FFA和d5-CAP的二级质谱图见附图1～5。
表2 CAP、TAP、FF和FFA的保留时间和优化质谱条件
注：*定量离子对
4定量方法
4.1标准曲线的绘制
分别准确称取10份(5.0±0.05)g匀浆后的鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋和鹌鹑蛋空白样品，按2本发明提取与净化步骤中的方法对上述空白样品进行前处理，制备空白基质提取液，备用。
分别取适量的空白鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋和鹌鹑蛋基质提取液将混合标准工作液稀释成一系列浓度(对应的在不同空白基质样品中浓度分别为CAP：0.08、0.5、1.0、5.0、10.0、 15.0、20.0、25.0μg/kg；TAP：0.8、5.0、10.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0μg/kg；FF： 0.27、1.0、10.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0μg/kg；FFA：1.2、5.0、10.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0μg/kg；同时，每个浓度水平的标准工作液中加入d5-CAP内标溶液，使其添加水平为5.0μg/kg)。
将上述处理的各混合浓度样品由低浓度依次到高浓度进行UPLC-MS/MS检测。每个混合浓度点重复测定3次，取平均值。以各分析物在空白基质样品中的浓度为横坐标(x)，定量离子(CAP，m/z 321.0/152.0；TAP，m/z 354.0/185.0；FF，m/z 356.0/336.0；FFA， m/z248.1/230.0)与同位素内标离子(d5-CAP，m/z 326.0/157.0)的峰面积比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。
表3鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋和鹌鹑蛋中CAP、TAP、FF、FFA回归方程、决定系数和线性范围
由表3和附图11～15可见，CAP、TAP、FF和FFA在空白鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋和鹌鹑蛋中添加浓度分别为0.08～25.0μg/kg、0.8～150.0μg/kg、0.27～250.0μg/kg和1.2～250.0 μg/kg范围内，CAP、TAP、FF和FFA的定量子离子(CAP：m/z 321.0/152.0；TAP：m/z354.0/185.0；FF：m/z 356.0/336.0；FFA：m/z 248.1/230.0)与同位素内标离子(d5-CAP：m/z 326.0/157.0)的峰面积比值与其浓度呈良好的线性关系；其中，线性回归方程、决定系数R2及线性范围见表3。如果分析的浓度超过样品的线性范围，需将分析的浓度稀释至该范围内，检测出的结果乘以稀释倍数得到原样品的浓度。
4.2回收率及精密度的测定
准确称取(5.0±0.05)g匀质好的空白样品，添加四种不同浓度的标准工作液各100μL (对应的在空白基质样品中添加浓度分别为CAP：0.08、0.15、0.3、0.6μg/kg；TAP：0.8、 25.0、50.0、100.0μg/kg；FF：0.27、50.0、100.0、200.0μg/kg；FFA：1.2、50.0、100.0、200.0μg/kg)，加入d5-CAP内标溶液(250μg/L)100μL，按2本发明提取与净化步骤中的方法制取加药基质提取液。每个浓度水平设置6个平行，漩涡振荡混匀，取10μL进样进行 UPLC-MS/MS检测。根据各分析物的定量离子对与内标的定量离子对的峰面积比带入到各分析物的标准曲线中去，计算出分析物的浓度，与实际添加的分析物的浓度相比求得添加回收率。
空白鸡蛋样品(a)和空白鸡蛋样品添加0.3μg/kg CAP、5.0μg/kg TAP、10.0μg/kgFF 和FFA、5.0μg/kg d5-CAP标准品(b)的总离子流色谱图(TIC)和提取离子色谱图(XIC)见图6；空白鸭蛋样品(a)和空白鸭蛋样品添加0.3μg/kg CAP、5.0μg/kg TAP、10.0μg/kg FF和FFA、5.0μg/kg d5-CAP标准品(b)的总离子流色谱图(TIC)和提取离子色谱图(XIC) 见图7；空白鹅蛋样品(a)和空白鹅蛋样品添加0.3μg/kg CAP、5.0μg/kg TAP、10.0μg/kg FF和FFA、5.0μg/kg d5-CAP标准品(b)的总离子流色谱图(TIC)和提取离子色谱图(XIC) 见图8；空白鸽蛋样品(a)和空白鸽蛋样品添加0.3μg/kg CAP、5.0μg/kg TAP、10.0μg/kg FF和FFA、5.0μg/kg d5-CAP标准品(b)的总离子流色谱图(TIC)和提取离子色谱图(XIC) 见图9；空白鹌鹑蛋样品(a)和空白鹌鹑蛋样品添加0.3μg/kg CAP、5.0μg/kg TAP、10.0 μg/kg FF和FFA、5.0μg/kg d5-CAP标准品(b)的总离子流色谱图(TIC)和提取离子色谱图(XIC)见图10。
日内精密度：在同一天不同时间点用同一台仪器和同一标准曲线对上述4个添加浓度进行测定，每个添加浓度设6个平行，求出日内RSD。
日间精密度：在7天内不同天、不同标准曲线(每天都绘制标准曲线)同一台仪器对上述4个添加浓度进行测定，每个添加浓度设6个平行，求出日间RSD。
在此条件下，本发明方法提取鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋和鹌鹑蛋中CAP、TAP、FF和FFA的添加回收率及精密度见表4～8。
表4空白鸡蛋中CAP、TAP、FF和FFA的添加回收率和精密度(n＝6)
表5空白鸭蛋中CAP、TAP、FF和FFA的添加回收率和精密度(n＝6)
表6空白鹅蛋中CAP、TAP、FF和FFA的添加回收率和精密度(n＝6)
表7空白鸽蛋中CAP、TAP、FF和FFA的添加回收率和精密度(n＝6)
表8空白鹌鹑蛋中CAP、TAP、FF和FFA的添加回收率和精密度(n＝6)
注：a.最低要求执行限量；b.最高残留限量
4.3检测限及定量限的确定
准确称取(5.0±0.05)g匀质好的空白样品，按2本发明提取与净化步骤中的方法制取空白基质提取液。用空白基质提取液逐级稀释低浓度的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺标准工作液，进行UPLC-MS/MS检测，重复进样6次，计算信噪比(S/N)。当S/N≥3时对应的目标化合物浓度即为检测限(LOD)，当S/N≥10时对应的目标化合物浓度，且该浓度下满足准确度和精密度的要求(一般要求回收率大于70％，相对标准偏差RSD≤20％) 即为定量限(LOQ)。
根据上述6个平行空白样品的添加回收试验，得到在现有条件下，CAP、TAP、FF和FFA 四种药物在禽蛋中的LOD分别为0.03、0.3、0.1、0.4μg/kg，LOQ分别为0.08、0.8、0.27、1.2μg/kg。
本发明所述的实例是对本发明的说明而不能限制本发明，在与本发明相当的含义和范围内的任何改变和调整，都应认为是在本发明的范围内。

Claims (6)

1.一种高效检测禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)禽蛋样品提取与净化；
2)超高效液相色谱-串联质谱检测：
a.色谱条件：以Waters ACQUITY UPLC BEH C18为色谱柱；以A相：2mM乙酸铵的水溶液和B相：2mM乙酸铵的乙腈体系为流动相；流速：0.2mL/min；设置特定的梯度洗脱程序；
b.检测器为质谱检测器，电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子扫描FFA和负离子扫描CAP、TAP、FF和d5-CAP；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾离子化电压IS：5000～5500V正离子扫描、4000～4500V负离子扫描；离子源温度TEM：450～500℃；离子源喷雾气Gas1:40～45psi正离子扫描、45～50psi负离子扫描；辅助加热气Gas2：45～50psi正离子扫描、35～40psi负离子扫描；气帘气CUR：12～15psi正离子扫描、16～20psi负离子扫描；碰撞气CAD：6～8psi；碰撞室出口电压CXP：5～6V正离子扫描、7～8V负离子扫描；射入电压EP：6.5～7.5V正离子扫描、11～13V负离子扫描；每个定量离子对驻留时间：100.0ms，每个定性离子对驻留时间：100.0ms。
2.根据权利要求1所述的一种高效检测禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的分析方法，其特征在于，在步骤b中，CAP、TAP、FF、FFA和d5-CAP的保留时间和其它质谱参数如下：
注：*定量离子对。
3.根据权利要求1所述的一种高效检测禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的分析方法，其特征在于，在步骤a中，所述特定的梯度洗脱程序如下：分离禽蛋中CAP、TAP、FF、FFA和d5-CAP的梯度洗脱程序
。
4.根据权利要求1所述的一种高效检测禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的分析方法，其特征在于，步骤(1)具体过程为：准确称取均质好的空白禽蛋样品放于研钵中，并加入硅藻土研磨，装入萃取池中，在1500psi，80℃条件下用ASE萃取，每个萃取池用甲醇:氨水:水溶液以97:2:1，V/V的比例静态萃取，氮气吹扫，收集萃取液待用；收集的萃取液转移至离心管，置于45～50℃离心浓缩仪上蒸发浓缩；萃取液蒸发浓缩后，加入纯乙腈，漩涡振荡混匀，加入正己烷漩涡混匀，去脂，静置，弃去上层正己烷，下层提取液重复提取一次，然后置于45～50℃氮吹仪上吹干；将氮吹后的样品用55％乙腈分两次漩涡振荡溶解，12100×g离心10～15min，过0.22μm有机相针式滤器，滤液供UPLC-MS/MS检测。
5.根据权利要求1所述的一种高效检测禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的分析方法，其特征在于，步骤a中，色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEHC18，2.1×50mm，1.7μm；保护柱：Waters VanGuardTM BEH C18，1.7μm。
6.根据权利要求1所述的一种高效检测禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的分析方法，其特征在于，步骤a中，进样体积：10μL；柱温25～30℃。
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