CN108645921B - 一种中成药“消糜栓”的hplc指纹图谱的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中成药“消糜栓”HPLC指纹图谱的构建方法，包括供试品溶液的制备，对照品溶液的制备，色谱条件限定，分别精密吸取供试品溶液,各10μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得HPLC指纹图谱。本发明的积极效果是：在同一色谱条件下同时检测多味药材化学成分，从指纹图谱的相似度判断批量之间的质量一致性。还可追根溯源，寻找工艺操作中的问题。指纹图谱与对照图谱的相似度均大于0.9，能有效的反映成品批与批之间的质量，有利于全面监控产品的质量。避免了质量控制的单一性和片面性。并具有方便、快捷、稳定、精密、重现性好等特点。

Description

一种中成药“消糜栓”的HPLC指纹图谱的构建方法

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及中成药HPLC指纹图谱的构建方法。

背景技术

中国药典2015年版一部公开了由人参茎叶皂苷、紫草、黄柏、苦参、枯矾、 冰片、儿茶七味组成的清热解毒中成药(商品名：消糜栓)的质量控制方法，包 括栓剂的性状；冰片及儿茶皮的薄层鉴别；人参皂苷Re的含量测定。其质量标 准只控制一味药的一种成分的含量测定及单一成分的定性鉴别，难以从整体上反 应产品的质量或从整体上控制产品的质量。

中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的， 能提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方 法都不足以解决这一问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种中成药“消糜栓”HPLC指纹图谱的构建方法，用 于消糜栓生产中的质量控制，克服现有技术的上述不足。

本发明的消糜栓指纹图谱的构建方法包括如下步骤：

1、供试品溶液的制备：取消糜栓样品，剪碎，取约2～5g，精密称定，置 具塞锥形瓶中，精密加入20～50％甲醇水溶液25～100mL，称定重量，置30～ 70℃水浴中加热使充分溶散，取出，放冷，超声处理(功率250W，频率50kHZ) 10～60min，放冷，再称定重量，用20～50％甲醇水溶液补足减失的重量，密 塞，置冰箱中在0～5℃下放置1～3h，取出，取上清液迅速滤过，精密吸取续 滤液5～10mL，用20～50％甲醇水溶液定容25～50mL，摇匀，过滤，即得；

2、对照品溶液的制备：分别取苦参碱、儿茶素、表儿茶素、盐酸小檗碱4 个对照品适量，用20～50％甲醇水溶解，制成每1mL含苦参碱、儿茶素、表儿 茶素及盐酸小檗碱80μg、70μg、70μg、70μg的溶液。作为对照品溶液；

3、色谱条件：采用AgilentZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱， 流动相A为乙腈，流动相B为0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1mL/min， 波长为228nm～270nm；柱温30℃～40℃；

4、测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定， 得到消糜栓的指纹图谱。

本发明消糜栓的指纹图谱的最佳建立方法如下：

1、供试品溶液的制备：取消糜栓样品，剪碎，取约3g，精密称定，置具 塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇水溶液50mL，称定重量，置50℃水浴中加热 使充分溶散，取出，放冷，超声处理(功率250W，频率50kHZ)30min，放冷， 再称定重量，放冷，再称定重量，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，密塞， 置冰箱中在0～5℃下放置3h，取出，取上清液迅速滤过，精密吸取续滤液510mL， 用50％甲醇水溶液定容25mL，摇匀，过滤，即得；

2、对照品溶液的制备：分别取苦参碱、儿茶素、表儿茶素、盐酸小檗碱4 个对照品适量，用50％甲醇水溶解，制成每1mL含苦参碱、儿茶素、表儿茶素 及盐酸小檗碱80μg、70μg、70μg、70μg的溶液。作为对照品溶液；

3、色谱条件：采用AgilentZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱 柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1mL/min， 波长为254nm；柱温35℃；

梯度洗脱过程中，流动相A、B的比例变化为：0～18min，A相5％～16％，B 相95％～84％；18～20min，A相16％～24％，B相84％～76％；20～41min，A相24％， B相76％；41～63min，A相24％～85％,B相76％～15％；63～78min，A相85％,B 相15％；78～79min，A相85％～5％，B15％～95％；79～100min，A相5％，B相 95％。

即梯度洗脱程序梯度洗脱程序以如下体积比浓度配置进行：

表1梯度洗脱程序表

4、测定：精密吸取供试品溶液5～20μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱 法测定，得到消糜栓的指纹图谱。

用前述消糜栓图谱的构建方法建立10批次消糜栓HPLC指纹图谱，采用国家药典委员 会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)”生成有13个共有峰构成的消糜栓HPLC标准指纹图谱。其中5号为儿茶素、6号为表儿茶素、7号分别苦参碱、10号为盐酸 小檗碱。如图1～3所示。

在标准指纹图谱中，以儿茶素峰为参照峰S峰，计算各共有峰与S峰的相对 保留时间，所述相对保留时间在第一规定值的±3％之内，所述第一规定值为： 0.28(峰1)、047(峰S)、0.50(峰3)、0.61(峰4)、1.00(峰5)、1.07(峰6)、 1.22(峰7)、1.30(峰8)、1.42(峰9)、2.15(峰10)、2.34(峰11)、3.87(峰 12)、4.04(峰13)；所述共有峰的峰面积在第二规定值的±5％之内，所述第二规 定值为：0.03(峰1)、071(峰S)、0.09(峰3)、0.52(峰4)、1.00(峰5)、0.47 (峰6)、2.11(峰7)、1.34(峰8)、1.48(峰9)、0.16(峰10)、0.23(峰11)、 0.10(峰12)、0.74(峰13)；

取消糜栓样品，按上述同法操作，得到消糜栓样品指纹图谱，采用国家药典 委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)”软件对消糜栓标准指 纹图谱和样品指纹图谱进行分析，相似度大于0.90。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)用本发明所提供的方法构建的消糜栓粒HPLC指纹图谱与对照图谱的相 似度大于0.90，能有效的表征其质量，有利于全面监控产品质量。

(2)指纹图谱注重各特征峰的关联性及指纹图谱的整体的面貌特征，避免了 消糜栓质量控制的单一性和片面性。减少了人为处理样品质量达标的可能性。

(3)本发明具有方便、快捷、精密度高、重现性好等优点，可准确可靠的控 制消糜栓的质量。

附图说明

图1是一种中成药“消糜栓”的HPLC指纹图谱

图2是一种中成药“消糜栓”的10批次样品叠加图

(图中，R为共有模式；S1～S10为10批“消糜栓”指纹图谱)

图3是一种中成药“消糜栓”的对照指纹图谱

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：消糜栓基于指纹图谱的质量控制方法。

仪器：UltiMate 3000高效液相色谱仪，紫外DAD检测器；Mettler AE240十 万分之一分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；AB204-E电子天平 (上海梅特勒-托利多仪器有限公司)等。

试剂：甲醇等为分析纯，磷酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水。

试药：儿茶素、表儿茶素、苦参碱、盐酸小檗碱(均来自中国食品药品鉴 定研究院)，“消糜栓”由通药制药集团股份有限公司提供。

供试品溶液的制备：取消糜栓样品，剪碎，取约3g，精密称定，置具塞锥 形瓶中，精密加入50％甲醇水溶液50mL，称定重量，置50℃水浴中加热使充 分溶散，取出，放冷，超声处理(功率250W，频率50kHZ)30min，放冷，再 称定重量，放冷，再称定重量，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，密塞，置 冰箱中在0～5℃下放置3h，取出，取上清液迅速滤过，精密吸取续滤液10mL， 用50％甲醇水溶液定容25mL，摇匀，过滤，即得；

对照品溶液的制备：分别取苦参碱、儿茶素、表儿茶素、盐酸小檗碱4个 对照品适量，用50％甲醇水溶解，制成每1mL含苦参碱、儿茶素、表儿茶素及 盐酸小檗碱80μg、70μg、70μg、70μg的溶液。作为对照品溶液；

色谱条件：采用AgilentZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱， 流动相A为乙腈，流动相B为0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1mL/min， 波长为254nm；柱温35℃。梯度洗脱程序的体积比浓度配置如下：

测定：精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定， 得到消糜栓的指纹图谱。如图1所示。

供试品指纹图谱与消糜栓标准指纹图谱相似度不低于0.90，参照峰为5号 峰儿茶素、6号为表儿茶素、7号分别苦参碱、10号为盐酸小檗碱。

实施例2：消糜栓基于指纹图谱的质量控制方法。

仪器：L3000-Rigol高效液相色谱仪，紫外检测器；MS205DU型分析天平 (上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；

试剂：甲醇等为分析纯，磷酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水。

试药：儿茶素、表儿茶素、苦参碱、盐酸小檗碱(均来自中国食品药品鉴 定研究院)，“消糜栓”由通药制药集团股份有限公司提供。

供试品溶液的制备：取消糜栓样品，剪碎，取约5g，精密称定，置具塞锥 形瓶中，精密加入50％甲醇水溶液100mL，称定重量，置70℃水浴中加热使 充分溶散，取出，放冷，超声处理(功率250W，频率50kHZ)60min，放冷， 再称定重量，放冷，再称定重量，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，密塞， 置冰箱中在0～5℃下放置2h，取出，取上清液迅速滤过，精密吸取续滤液10mL， 用50％甲醇水溶液定容50mL，摇匀，过滤，即得；

对照品溶液的制备：分别取苦参碱、儿茶素、表儿茶素、盐酸小檗碱4个 对照品适量，用50％甲醇水溶解，制成每1mL含苦参碱、儿茶素、表儿茶素及 盐酸小檗碱80μg、70μg、70μg、70μg的溶液。作为对照品溶液；

色谱条件：采用AgilentZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱， 流动相A为乙腈，流动相B为0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1mL/min， 波长为270nm；柱温40℃。梯度洗脱程序的体积比浓度配置如下：

测定：精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定， 得到消糜栓的指纹图谱。如图1所示。

供试品指纹图谱与消糜栓标准指纹图谱相似度不低于0.90，参照峰为5号 峰儿茶素、6号为表儿茶素、7号分别苦参碱、10号为盐酸小檗碱。

实施例3：一种中成药“消糜栓”的指纹图谱方法的建立。

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪，紫外检测器；MS205DU型分析天平 (上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；

试剂：甲醇等为分析纯，磷酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水。

试药：儿茶素、表儿茶素、苦参碱、盐酸小檗碱(均来自中国食品药品鉴 定研究院)，“消糜栓”由通药制药集团股份有限公司提供。

供试品溶液的制备：取消糜栓样品，剪碎，取约2g，精密称定，置具塞锥 形瓶中，精密加入20％甲醇水溶液25mL，称定重量，置70℃水浴中加热使充 分溶散，取出，放冷，超声处理(功率250W，频率50kHZ)10min，放冷，再 称定重量，放冷，再称定重量，用20％甲醇水溶液补足减失的重量，密塞，置 冰箱中在0～5℃下放置1h，取出，取上清液迅速滤过，精密吸取续滤液5mL， 用50％甲醇水溶液定容50mL，摇匀，过滤，即得；

对照品溶液的制备：分别取苦参碱、儿茶素、表儿茶素、盐酸小檗碱4个 对照品适量，用20％甲醇水溶解，制成每1mL含苦参碱、儿茶素、表儿茶素及 盐酸小檗碱80μg、70μg、70μg、70μg的溶液。作为对照品溶液；

色谱条件：采用AgilentZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱， 流动相A为乙腈，流动相B为0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1mL/min， 波长为228nm；柱温30℃。梯度洗脱程序的体积比浓度配置如下：

测定：精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定， 得到消糜栓的指纹图谱。如图1所示。

供试品指纹图谱与消糜栓标准指纹图谱相似度不低于0.90，参照峰为5号 峰儿茶素、6号为表儿茶素、7号分别苦参碱、10号为盐酸小檗碱。

实施例4：消糜栓标准指纹图谱的建立

采用实施例1所述的方法测定共10个批次消糜栓(批号分别为：160402、 160403、160405、160411、161201、161202、161203、161204、161205、161206； 由通药制药集团股份有限公司提供)。

10个批次消糜栓的指纹图谱及共有模式如图2所示。

通过10个批次消糜栓HPLC指纹图谱的比较，进行相似度评价：采用国家药 典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)”对10批次消糜栓 指纹图谱进行相似度计算，10批次消糜栓指纹图谱与对照指纹图谱(10批次消糜 栓生成的共有模式R)相似度均大于0.98。

消糜栓相似度比较结果

通过上述方法所建立的消糜栓标准指纹图谱如图3所示。

为了说明一种中成药“消糜栓”的指纹图谱构建方法的精密性及准确性，对 本方法进行的方法学验证

精密度

取同一份供试品，按特征图谱测定方法，连续进样6次，进行测定。比较各 主要共有峰的相对保留时间及相对峰面积，计算结果RSD值均小于3％，表明仪 器测试精度符合要求。结果见下表。

精密度试验

稳定性试验

取同一份供试品溶液，按分别在0、2、4、8、10、16、20、24小时依法进 行测定，结果，特征图谱中各共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD值均小 于3.0％，表明供试品溶液在24小时内稳定。结果见下表。

稳定性试验相对保留时间

稳定性试验相对峰面积

重复性试验

取同一批供试品，依法制备6份供试品溶液，进行测定，结果，6次测定特 征图谱中各共有峰的相对保留时间RSD值均小于3.0％。表明方法的重复性较好。 结果见下表。

重复性试验结果

根据方法学研究数据表明，本发明具精密度高、稳定性好、重现性好等特 点，可准确可靠的控制一种中成药“消糜栓”的质量。

除以上实施例外，本发明还可以有其他实施方式，凡采用等同替换或等效 变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种中成药“消糜栓”的HPLC指纹图谱的构建方法，其特征是包括下述步骤：

(1)供试品溶液的制备：取消糜栓样品，剪碎，取2～5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20～50％甲醇水溶液25～100mL，称定重量，置30～70℃水浴中加热使充分溶散，取出，放冷，超声处理10～60min，功率250W，频率50kHZ，放冷，再称定重量，用20～50％甲醇水溶液补足减失的重量，密塞，置冰箱中在0～5℃下放置1～3h，取出，取上清液迅速滤过，精密吸取续滤液5～10mL，用20～50％甲醇水溶液定容25～50mL，摇匀，过滤，即得；

(2)对照品溶液的制备：分别取苦参碱、儿茶素、表儿茶素、盐酸小檗碱4个对照品，用20～50％甲醇水溶解，制成每1mL含苦参碱、儿茶素、表儿茶素及盐酸小檗碱80μg、70μg、70μg、70μg的溶液，作为对照品溶液；

(3)色谱条件：采用AgilentZORBAXSB-C18，4.6mm×250mm，5μm的色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1mL/min，波长为228nm～270nm；柱温30℃～40℃；

梯度洗脱过程中，流动相A、B的比例变化为：0～18min，A相5％～16％，B相95％～84％；18～20min，A相16％～24％，B相84％～76％；20～41min，A相24％，B相76％；41～63min，A相24％～85％,B相76％～15％；63～78min，A相85％,B相15％；78～79min，A相85％～5％，B15％～95％；79～100min，A相5％，B相95％；

(4)测定：精密吸取供试品溶液5～20μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到消糜栓的指纹图谱。

2.根据权利要求1所述一种中成药“消糜栓”的HPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取消糜栓样品，剪碎，取3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇水溶液50mL，称定重量，置50℃水浴中加热使充分溶散，取出，放冷，超声处理30min，功率250W，频率50kHZ，放冷，再称定重量，放冷，再称定重量，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，密塞，置冰箱中在0～5℃下放置3h，取出，取上清液迅速滤过，精密吸取续滤液5mL，用50％甲醇水溶液定容25mL，摇匀，过滤，即得；

(2)对照品溶液的制备：分别取苦参碱、儿茶素、表儿茶素、盐酸小檗碱4个对照品，用50％甲醇水溶解，制成每1mL含苦参碱、儿茶素、表儿茶素及盐酸小檗碱80μg、70μg、70μg、70μg的溶液，作为对照品溶液；

(3)色谱条件：采用AgilentZORBAXSB-C18，4.6mm×250mm，5μm的色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1mL/min，波长为254nm；柱温35℃；

梯度洗脱过程中，流动相A、B的比例变化为：0～18min，A相5％～16％，B相95％～84％；18～20min，A相16％～24％，B相84％～76％；20～41min，A相24％，B相76％；41～63min，A相24％～85％,B相76％～15％；63～78min，A相85％,B相15％；78～79min，A相85％～5％，B15％～95％；79～100min，A相5％，B相95％；

(4)测定：精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到消糜栓的指纹图谱。

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