CN108553475A - 一种达玛烷型皂苷类化合物在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用 - Google Patents
一种达玛烷型皂苷类化合物在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药的技术领域,公开了一种达玛烷型皂苷类化合物在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。所述达玛烷型皂苷类化合物为GPLVI,其结构式如式Ⅰ。所述达玛烷型皂苷类化合物用于制备抗动脉粥样硬化药物,特别是抗巨噬细胞泡沫化药物。本发明的达玛烷型皂苷类化合物能够预防和治疗动脉粥样硬化,并具有非常好的疗效。同时本发明的GPLVI的用药剂量低,在有效用药剂量范围内毒性较低。
Description
技术领域
本发明属于生物医药的技术领域,具体涉及一种达玛烷型皂苷类化合物在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。
背景技术
心脑血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)是一类严重危害人类健康和生命的重大疾病,在世界范围内,每年约有1670万人死于CVD,占全球死亡率第一位,而动脉粥样硬化是CVD发生发展的重要病理基础。动脉粥样硬化(AS)也是发达国家和许多发展中国家主要死亡原因。巨噬细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞这三类细胞在AS的发生发展中发挥重要作用。在这三种类型的细胞中,又以研究巨噬细胞为最。应用天然产物尤其是植物治疗多种心血管疾病已有多年的实践经验,并发现天然产物占现代药物的一半以上。
绞股蓝(Gynostemma Pentaphylium Makino)是葫芦科绞股蓝属植物的干燥根茎或者全草,又名“五叶参”、“七叶胆”等,在日本有“长寿草”、“福音草”的美称。现代药理学表明绞股蓝具有抗肿瘤、降血脂、抗氧化、调节免疫、护肝、抗炎、镇静等功效。AS是多种心血管疾病的病理基础,研究证明绞股蓝与三七配伍可明显抑制血管平滑肌细胞的增殖,抑制细胞外基质的增生。
绞股蓝皂苷被认为是绞股蓝的主要活性物质,迄今为止,从绞股蓝中已经分离得到180多种皂苷并用光谱法进行结构鉴定。达玛烷型皂苷类化合物gypenoside LVI(GPLVI)为绞股蓝皂苷中一种,其对人肺癌细胞A549具有显著的抑制作用。然而,GPLVI在抗动脉粥样硬化方面还未有过报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中临床上抗动脉粥样硬化药物的用药剂量高、药效不理想、缺乏选择性、产生耐药性等缺点和不足,提供一种达玛烷型皂苷类化合物在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现:
一种达玛烷型皂苷类化合物在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用,所述的达玛烷型皂苷类化合物为GPLVI,其结构式如式Ⅰ:
所述抗动脉粥样硬化药物优选为抗巨噬细胞泡沫化药物,作为巨噬细胞泡沫化的抑制剂;
所述的达玛烷型皂苷类化合物GPLVI可作为新型的抗动脉粥样硬化药物。
一种抗动脉粥样硬化药物,含有上述达玛烷型皂苷类化合物GPLVI。
本发明的原理:ox-LDL是AS(动脉粥样硬化)的关键因素,能够通过多种途径促进AS的发生发展。ox-LDL可诱导巨噬细胞在斑块内富集并转化为泡沫细胞,也能诱导免疫反应并促进分泌炎症因子进一步激活巨隨细胞加剧炎症反应。ox-LDL是动脉壁中单核细胞/巨噬细胞的诱导,激活和增殖的关键,巨噬细胞转化为泡沫细胞是动脉粥样硬化的重要的病理性标志。本发明中,达玛烷型皂苷类化合物GPLVI可显著抑制巨噬细胞泡沫化,且该化合物的使用剂量低(6.25-100μg/mL),最大使用剂量为100μg/mL,在同样剂量下的毒副作用也较低。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明的达玛烷型皂苷类化合物GPLVI在体外能显著抑制ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞泡沫化;
(2)本发明的达玛烷型皂苷类化合物GPLVI在体外能显著降低ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞甘油三酯(TG)和CE/TC的含量;
(3)本发明的达玛烷型皂苷类化合物GPLVI在体外能显著抑制ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6,TNF-α和IL-1β的释放;
(4)本发明的达玛烷型皂苷类化合物GPLVI在体外能显著抑制RAW264.7巨噬细胞对Dil标记的ox-LDL的摄取;
(5)本发明的达玛烷型皂苷类化合物GPLVI在体外能显著促进HDL介导的RAW264.7巨噬细胞胆固醇外流;
(6)本发明的达玛烷型皂苷类化合物GPLVI在体外能显著促进ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞ABCG1,SRB1和LXRαmRNA的表达;
(7)本发明的达玛烷型皂苷类化合物GPLVI在体外能显著促进ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞内ABCG1,SRB1,LXRα蛋白的表达,显著抑制ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞内ERK和JNK蛋白的磷酸化。
总之,本发明的的达玛烷型皂苷类化合物能够预防和治疗动脉粥样硬化,并具有非常好的疗效。同时本发明的GPLVI的用药剂量低,在有效用药剂量范围内毒性较低。
附图说明
图1为是实施例1制备的GPLVI对小鼠巨噬细胞RAW264.7的毒性作用图;
图2是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞泡沫化的抑制作用图;Control-对照组(即空白组),ox-LDL-只添加ox-LDL的组,GPLVI(25、50、100μg/mL)-添加ox-LDL+GPLVI的组;
图3是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞TG含量的抑制作用图;Con-对照组(即空白组),ox-LDL-只添加ox-LDL的组,GPLVI(25、50、100μg/mL)-添加ox-LDL+GPLVI的组;
图4是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞CE/TC的抑制作用图;Con-对照组(即空白组),ox-LDL-只添加ox-LDL的组,GPLVI(25、50、100μg/mL)-添加ox-LDL+GPLVI的组;
图5是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6,TNF-α和IL-1β释放量的抑制作用图;
图6是实施例1制备的GPLVI对RAW264.7巨噬细胞摄取Dil标记的ox-LDL的抑制作用图;空白对照组-Control组,Dil-ox-LDL-只添加Dil标记ox-LDL的组,GPLVI(25、50、100μg/mL)-添加Dil标记ox-LDL+GPLVI的组;
图7是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞胆固醇外流的促进作用图;
图8是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞ABCG1mRNA表达的促进作用图;
图9是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞SRB1mRNA表达的促进作用图;
图10是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞LXRαmRNA表达的促进作用图;
图11是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞ABCG1蛋白表达的促进作用图;
图12是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞SRB1蛋白表达的促进作用图;
图13是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞LXRα蛋白表达的促进作用图;
图14是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞ERK蛋白磷酸化的抑制作用图;
图15是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞JNK蛋白磷酸化的抑制作用图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。实施例中,小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心;绞股蓝购于广州清平药材市场,产地为陕西。
达玛烷型皂苷类化合物gypenoside LVI(GPLVI)从绞股蓝中制备得到;
实施例1 从绞股蓝中制备达玛烷型皂苷类化合物GPLVI
(1)称取干燥的绞股蓝原料5kg,经粉碎过筛后按料液比1:15(g/mL),用体积分数为75%的乙醇水溶液加热回流提取3次,每次2h,真空抽滤,弃去残渣,合并浸提液,用旋转蒸发仪在温度45℃、真空度0.095MPa的条件下减压浓缩提取液至棕黑色膏状,得到绞股蓝乙醇粗提物浸膏;
(2)将步骤(1)的绞股蓝乙醇粗提物浸膏用蒸馏水充分溶解,转移至分液漏斗中,加入等体积的石油醚溶剂,充分震动混匀,静置1h,待两相溶剂完全分层后,取出上层的石油醚相,向下层水相中加入石油醚继续进行萃取,如此重复萃取三次,将最终石油醚萃取后的下层水相进行下一步操作;将石油醚相合并,用旋转蒸发仪在温度45℃、真空度0.075MPa的条件下减压浓缩蒸干,回收石油醚,浓缩后得到的黑色油状物即为石油醚相萃取物;
(3)向步骤(2)中石油醚萃取后的下层水相中加入等体积的乙酸乙酯溶剂,充分震动混匀,静置1h,待两相溶剂完全分层后,取出上层的乙酸乙酯相(即乙酸乙酯萃取液);重复萃取三次,合并乙酸乙酯萃取液,用旋转蒸发仪在温度45℃、真空度0.075MPa的条件下减压浓缩蒸干,回收乙酸乙酯,浓缩蒸干后得到的黑紫色浸膏即为乙酸乙酯相萃取物;
(4)称烘干的乙酸乙酯相萃取物30g,甲醇充分溶解;取60g 100-200目的硅胶,并与乙酸乙酯相萃取物均匀混合,晾干后准备上样,经过硅胶柱(柱体积4L)层析,用氯仿-甲醇系统洗脱,根据薄层色谱法(TLC)摸索的分离条件设置8个梯度;每个梯度洗脱5个柱体积,每1L收集一次,收集的馏分经减压浓缩之后用少量的甲醇溶解,转移到试管中,做好标记;用TLC对收集的馏分进行检测,合并相同的馏分,共得到8个组分,依次标记为氯仿:甲醇100:16(组分1)、90:20(组分2)、80:20(组分3)、3:1(组分4)、10:4(组分5)、10:5(组分6)、50:50(组分7)和0:100(组分8)。组分4用纯甲醇洗脱,反复过凝胶柱后用硅胶柱层析,氯仿-甲醇(3:1)洗脱得到白色粉末化合物1(75mg)。
实施例2 确定化合物1的结构
实施例1制备的化合物1为白色无定型粉末,冬天在室温下呈透明果冻状。用氯仿-甲醇-水系统(体积比2.1:0.7:0.14)在硅胶板上展开,在254nm和365nm紫外光下没有明显的紫外吸收。把硅胶板放置在装有碘颗粒的碘缸中,呈现一个明亮的黄棕色斑点。待颜色退去,喷10%的硫酸乙醇显色剂,加热至105℃有一个紫色亮点。ESI-MS m/z:1093.5828,结合1H-NMR和13C-NMR的数据,确定该化合物分子式为C53H90O23。氢谱显示高场区有8个甲基信号δH0.92(6H,s),0,98(3H,s),1.00(3H,s),1.12(3H,s),1.36(3H,s),1.62(3H,s),1.68(3H,s)。氢谱中还显示有4个糖端基质子信号δH4.29(1H,d,J=8.5Hz),4.44(1H,d,J=7.5Hz),4.56(1H,d,J=7.8Hz),4.75(1H,d,J=7.6Hz)和1个三取代烯基质子信号δH5.13(1H,m)。根据糖端基质子耦合常数的值(7.3,7.5,7.8,7.6),判定糖的构型为β型。碳谱显示53个碳原子信号,说明化合物中含有53个碳原子。两个烯碳原子信号δC132.19,126.07和达玛烷型三萜类皂苷C-24,C-25的烯碳原子信号非常相近。根据碳骨架信号δC96.68(C-3),68.11(C-2),推测分别和C-3、C-2相连的有羟基基团,C-2的质子偶合常数(9.3Hz)表明其构型为α型。化合物1的1H-NMR和13C-NMR数据和报道的数据相似,故化合物1被确定为gypenoside LVI(GPLVI),结构式见式I。
式Ⅰ:
实施例3 MTT法检测GPLVI对巨噬细胞毒性的影响
用胰酶消化处于对数生长期的RAW264.7细胞,用含质量分数为10%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞数为5×104个/mL,每孔100μL接种于96孔细胞培养板中,置于5%CO2培养箱中,37℃培养24h。待细胞完全贴壁之后,弃去上清液,各组分别加入含有GPLVI的DMEM培养基(GPLVI终浓度分别为6.25、12.5、25、50和100μg/mL)。在37℃、5%CO2培养箱中培养24h,倒置显微镜观察细胞形态的变化,然后弃去上清液,PBS清洗两次,每孔加入200μL不含血清的DMEM培养基和20μL噻唑蓝(MTT),放入培养箱中孵育4h,弃去上清液,每孔加入150μL二甲基亚砜,避光放置于微量振荡器均匀震荡10min,用多功能酶标仪检测在490nm波长下的吸光值,计算细胞活力。
MTT比色法测定GPLVI对RAW264.7细胞活力的影响如图1所示。图1是实施例1制备的GPLVI对小鼠巨噬细胞RAW264.7的毒性作用图。
从图1可知,当GPLVI浓度低于100μg/mL时,GPLVI干预培养下的巨噬细胞存活率均大于90%。因此,后续的实验设定GPLVI的作用浓度为100、50、25、12.5、6.25μg/mL。
实施例4 油红O染色检测GPLVI对ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化的影响
常规培养细胞,取对生长数期的RAW264.7细胞,按30万/孔细胞数接种于6孔板,孵育24h后,吸弃上清,按如下分组要求给药,每组设3个复孔。Control组,ox-LDL(ox-LDL,终浓度为80μg/mL)组,ox-LDL(终浓度为80μg/mL)+GPLVI(实施例1制备得到的达玛烷型皂苷类化合物GPLVI,终浓度为25、50和100μg/mL)组,对照组添加同体积的培养基。给药后,置于37℃,5%CO2培养箱,继续培养24h。然后取出细胞在电子显微镜下拍照。
测试结果如图2所示,图2是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞泡沫化的抑制作用图。染色结果显示,与对照组相比,其余各组使用ox-LDL诱导后均能观察到脂滴形成,其中,ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞内可见大量脂滴,不同浓度的GPLVI处理过的细胞脂滴相较ox-LDL组明显减少,且随着GPLVI浓度的升高,减少的程度更加明显。
实施例5 GPLVI对ox-LDL诱导的巨噬细胞甘油三酯含量的影响
常规培养细胞,取对生长数期的RAW264.7细胞,按30万/孔细胞数接种于24孔板,孵育24h后,吸弃上清,按如下分组要求给药,每组设3个复孔。Control组,ox-LDL(ox-LDL,终浓度为80μg/mL)组,ox-LDL(终浓度为80μg/mL)+GPLVI(实施例1制备得到的GPLVI,终浓度为25、50和100μg/mL)组,对照组添加同体积的培养基。给药后,置于37℃,5%CO2培养箱,继续培养24h。24h后,分别收集孔板中的细胞,按照甘油三酯测定试剂盒(南京建成)中的操作方法检测甘油三酯含量。
测试结果如图3所示,图3是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞TG含量的抑制作用图。图3可见,GPLVI可显著降低ox-LDL诱导的巨噬细胞内甘油三酯的含量,且具有浓度依赖性。
实施例6 GPLVI对ox-LDL诱导的巨噬细胞CE/TC含量的影响
常规培养细胞,取对生长数期的RAW264.7细胞,按30万/孔细胞数接种于24孔板,孵育24h后,吸弃上清,按如下分组要求给药,每组设3个复孔。Control组,ox-LDL(ox-LDL,终浓度为80μg/mL)组,ox-LDL(终浓度为80μg/mL)+GPLVI(实施例1制备得到的GPLVI,终浓度为25、50和100μg/mL)组,对照组添加同体积的培养基。给药后,置于37℃,5%CO2培养箱,继续培养24h。分别取各孔细胞上清按照小鼠IL-6ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司,武汉)和小鼠TNF-αELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司,武汉)操作方法检测细胞因子的释放情况。
常规培养细胞,取对生长数期的RAW264.7细胞,按30万/孔细胞数接种于24孔板,孵育24h后,吸弃上清,按如下分组要求给药,每组设3个复孔。Control组,ox-LDL(ox-LDL,终浓度为80μg/mL)组,ox-LDL(终浓度为80μg/mL)+GPLVI(实施例1制备得到的达玛烷型皂苷类化合物gypenoside LVI,终浓度为25、50和100μg/mL)组,对照组添加同体积的培养基。给药后,置于37℃,5%CO2培养箱,继续培养24h。24h后,按照总胆固醇(普利莱基因技术有限公司,北京)和游离胆固醇试剂盒(普利莱基因技术有限公司,北京)中的操作方法检测巨噬细胞内总胆固醇和游离胆固醇的含量。
测试结果如图4所示,图4是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞CE/TC的抑制作用图。从图4可见,GPLVI可显著降低CE/TC水平,抑制巨噬细胞胆固醇酯化。
实施例7 GPLVI对ox-LDL诱导的巨噬细胞IL-6,TNF-α和IL-1β释放的影响
常规培养细胞,取对生长数期的RAW264.7细胞,按30万/孔细胞数接种于24孔板,孵育24h后,吸弃上清,按如下分组要求给药,每组设3个复孔。Control组,ox-LDL(ox-LDL,终浓度为80μg/mL)组,ox-LDL(终浓度为80μg/mL)+GPLVI(实施例1制备得到的GPLVI,终浓度为25、50和100μg/mL)组,对照组添加同体积的培养基。给药后,置于37℃,5%CO2培养箱,继续培养24h。分别取各孔细胞上清按照小鼠IL-6ELISA试剂盒和小鼠TNF-αELISA试剂盒操作方法检测细胞因子的释放情况。
测试结果如图5所示,图5是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞释放IL-6,TNF-α和IL-1β的影响图。GPLVI能不同程序地抑制RAW264.7巨噬细胞IL-6,TNF-α和IL-1β的释放,其中GPLVI对IL-6和IL-1β的抑制作用明显优于TNF-α。
实施例8 流式细胞术检测GPLVI对巨噬细胞摄取Dil-ox-LDL的影响
常规培养细胞,取对生长数期的RAW264.7细胞,按30万/孔细胞数接种于激光共聚焦小皿,孵育24h后,吸弃上清,按如下分组要求给药,每组设3个复孔。Control组,Dil-ox-LDL(Dil-ox-LDL,终浓度为10μg/mL)组,Dil-ox-LDL(终浓度为10μg/mL)+GPLVI(实施例1制备得到的GPLVI,终浓度为25、50和100μg/mL)组,对照组添加同体积的培养基。给药后,置于37℃,5%CO2培养箱,继续培养4h。4h后,流式细胞仪检测巨噬细胞摄取Dil标记的ox-LDL情况。
测试结果如图6所示,图6是实施例1制备的GPLVI对RAW264.7巨噬细胞摄取Dil标记的ox-LDL的抑制作用图。结果表明,GPLVI可显著抑制巨噬细胞RAW264.7对Dil标记的ox-LDL的摄取。
实施例9 GPLVI对ox-LDL诱导的巨噬细胞胆固醇外流的影响
常规培养细胞,取对生长数期的RAW264.7细胞,按50万/孔细胞数接种于12孔板,孵育24h后,吸弃上清,按如下分组要求给药,每组设3个复孔。Control组,ox-LDL(广州奕源生物有限公司)(ox-LDL,终浓度为80μg/mL)组,ox-LDL(终浓度为80μg/mL)+GPLVI(实施例1制备得到的达玛烷型皂苷类化合物gypenoside LVI,终浓度为25、50和100μg/mL)组,对照组添加同体积的培养基。给药后,置于37℃,5%CO2培养箱,继续培养24h。然后吸弃上清液,用PBS清洗3次,各孔均加入25-NBD(Sigma,美国)(25-NBD的终浓度为5μmol/L),继续37℃孵育4h,吸弃上清,用PBS洗3次,各孔加入HDL(广州奕源生物有限公司)(HDL的终浓度为50μg/mL),继续37℃孵育4h,孵育结束后,收集诱导外流液,12000g离心10min,除去细胞碎片,将等量的诱导外流液加入黑色96孔酶标板中。PBS洗涤细胞3次,使用0.1%Triton X-100(Sigma,美国)裂解细胞30min,将细胞裂解液收集到1.5mL离心管中,12000g离心10min,收集上清液加入96孔黑色酶标板中,使用荧光酶标仪检测诱导外流液和细胞裂解液的荧光强度。
荧光强度(FI)测定:荧光NBD胆固醇的浓度与其荧光信号强度成正比。因此巨噬细胞胆固醇外流液和细胞裂解液中的荧光信号强度代表NBD胆固醇的浓度,设定荧光酶标仪激发波长469nm与发射光波长537nm检测外流液及细胞裂解液的应该信号强度。
计算巨噬细胞胆固醇外流率:胆固醇外流率=FI诱导外流液/(FI诱导外流液+FI细胞裂解液)*100%,为了计算净胆固醇外流率,应将诱导外流液诱导的胆固醇外流率减去未加诱导液的基础的胆固醇外流率。
测试结果如图7所示,图7是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞胆固醇外流的促进作用图。结果表明,GPLVI(50μg/mL)可显著增加HDL介导的巨噬细胞胆固醇外流率。
实施例10 GPLVI对ox-LDL诱导的巨噬细胞ABCG1,SRB1和LXRαmRNA表达的影响
常规培养细胞,取对生长数期的RAW264.7细胞,按100万/孔细胞数接种于6孔板,孵育24h后,吸弃上清,按如下分组要求给药,每组设3个复孔。Control组,ox-LDL(ox-LDL,终浓度为80μg/mL)组,ox-LDL(终浓度为80μg/mL)+GPLVI(实施例1制备得到的达玛烷型皂苷类化合物gypenoside LVI,终浓度为25、50和100μg/mL)组,对照组添加同体积的培养基。给药后,置于37℃,5%CO2培养箱,继续培养24h。作用24h后,吸弃细胞上清,PBS洗2次。每孔加入Trizol(Roche,广州聚研生物有限公司)1mL,静置5min,吸管吹打至液体无粘稠物,吸取细胞裂解液转入EP管,每管加入0.2mL氯仿,盖上EP管盖,手持用力上下震荡10s,室温静置5min,4℃以12,000rpm离心15min,离心后转移上层水相至另一EP管中,加入0.5mL异丙醇,室温静置10min,4℃离心机以12,000rpm离心10min,小心吸弃去上清,用冷体积分数75%的乙醇1mL清洗2次,分别4℃条件下以7,500rpm离心5min,小心吸弃上清,空气吹干,约15min,加入0~50μL RNase-free纯水(北京鼎国昌盛生物技术有限公司,北京),60℃加热10min溶解沉淀。测定mRNA的纯度和浓度。并用RevertAid First Strand cnthesis Kit(Thermo公司)反转录试剂盒,20μL反应体系,对RNA进行逆转录。采用DyNAmo Flash SYRBGreen qPCR Kit(Thermo公司)试剂盒,ABI实时荧光定量PCR仪(Rrism 7500,AppliedBiosystems,Foster City,CA,USA)对mRNA进行扩增,扩增后用ABI PRISM 7500 SDS软件中Relative Quantification(ddCt)Study法进行自动分析以获得目的基因的相对表达量。相关基因mRNA引物序列为ABCG1(forward,5-CAAGACCCTTTTGAAAGGGATCTC-3,reverse,5-GCCAGAATATTCATGAGTGTGGAC-3),SRB1(forward,5-GCAAATTTGGCCTGTTTGTT-3,reverse,5-GATCTTGCTGAGTCCGTTCC-3),LXRα(forward,5-AGGAGTGTCGACTTCGCAAA-3,reverse,5-CTCTTCTTGCCGCTTCAGTTT-3)和GAPDH(forward,5-TTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATG-3,reverse,5-TGGGATAGGGCCTCTCTTGC-3)。
测试结果如图8-10所示,图8是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞ABCG1mRNA表达的促进作用图;图9是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞SRB1mRNA表达的促进作用图;图10是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞LXRαmRNA表达的促进作用图。
与control组相比,ox-LDL组的ABCG1、SRB1和LXRαmRNA表达量显著增加(p<0.01)。GPLVI可以显著促进ABCG1 mRNA(图8)、SRB1 mRNA(图9)和LXRαmRNA(图10)的表达(p<0.05)。
实施例11GPLVI对ox-LDL诱导的巨噬细胞ABCG1,SRB1,LXRα,p-ERK和p-JNK蛋白表达的影响
常规培养细胞,取对生长数期的RAW264.7细胞,按100万/孔细胞数接种于6孔板,孵育24h后,吸弃上清,按如下分组要求给药,每组设3个复孔。Control组,ox-LDL(ox-LDL,终浓度为80μg/mL)组,ox-LDL(终浓度为80μg/mL)+GPLVI(实施例1制备得到的GPLVI,终浓度为25、50和100μg/mL)组,对照组添加同体积的培养基。作用24h后,吸弃细胞上清,并且用预冷的PBS清洗两次,收集细胞至1.5mL离心管中,加入60μL的RIPA裂解液(含磷酸酶抑制剂(PhosSTOP,Roche)和蛋白酶抑制剂(cOmplete ULTRA Tablets,Mini,EDTA-free,EASYpack,Roche)),用1mL的注射器吸取裂解液反复吹打细胞至充分混匀,于冰上放置30min,每隔10min于涡旋振荡器上振荡30s。以12000rpm离心15min,将上清转移至新的1.5mL离心管中,置于冰上待测定蛋白浓度。采用BCA法检测蛋白浓度(按照BCA ProteinAssay Kit说明书进行):先将浓度为2mg/mL的BSA溶液予超纯去离子水稀释为系列质量浓度(0μg/mL、25μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL)的标准品溶液,再根据需要配置一定量的工作液(BCA Solution:4%(体积分数)Cupric Sulfate=200:4)。取一块无底物的96孔板,每孔分别加入已稀释好的系列标准品溶液25μL,以及需要检测的蛋白溶液25μL(已稀释5倍),每组均设置复孔。同时加入200μL/孔工作液,轻轻震荡混匀,置于37℃孵育30min后,取出,于多标记微孔板检测仪570nm处检测OD值。根据标准品蛋白溶液所测OD值绘制标准曲线,计算出待测蛋白溶液浓度。根据BCA法测得的蛋白浓度,计算出40μg总蛋白所需蛋白体积,同时加5μL 5×SDS-PAGE上样缓冲液,再补充相应体积的超纯去离子水至总体积为25μL,混匀,充分离心,使液体聚集在底部,100℃加热变性10min,离心,置于冰上备用。选择10%(体积分数)分离胶和5%(体积分数)浓缩胶,将已变性好的蛋白样品依次加入各泳道,样品两侧的泳道分别加入5μL Marker。电泳槽中加入足够量的TGS缓冲液,电泳条件为:100V,约150min,直至溴酚蓝指示剂跑至距胶下缘约0.5cm时,停止电泳。然后在冰浴中以100V的电压转膜100min。用含5%(质量分数)脱脂奶粉的TBST封闭,缓慢摇荡1h。一抗抗体分别为:GAPDH(14c10)Rabbit mAb、p-ERK、p-JNK、ABCG1、SRB1和LXRα,二抗抗体为山羊抗兔(HRP标记),购自聚研生物科技有限公司。按照说明书推荐的稀释比例(1:1000),配制一抗,室温下轻摇孵育4h或4℃静置过夜。一抗孵育结束后,更换二抗,HRP标记的二抗按相应比例稀释(1:2000),室温轻摇1h。二抗结束后,加入发光液(购自BioFuture公司)并利用凝胶成像仪蛋白条带显影。
测试结果如图11-15所示,图11是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞ABCG1蛋白表达的促进作用图;图12是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞SRB1蛋白表达的促进作用图;图13是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞LXRα蛋白表达的促进作用图;图14是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞ERK蛋白磷酸化的抑制作用图;图15是实施例1制备的GPLVI对ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞JNK蛋白磷酸化的抑制作用图。
GPLVI(gypenoside LVI)显著促进ox-LDL诱导的巨噬细胞内ABCG1(图11),SRB1(图12)和LXRα(图13)蛋白的表达。正常组RAW264.7巨噬细胞内磷酸化的ERK和JNK蛋白表达较低,当80μg/mL的ox-LDL作用细胞24h,细胞内磷酸化的ERK和JNK蛋白表达显著上调(P<0.01),从而激活MAPK信号通路。gypenoside LVI可以显著下调p-ERK(图14)和p-JNK(图15)蛋白的表达。其中KD表示蛋白分子量大小。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种达玛烷型皂苷类化合物在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ABCG1 forward
<400> 1
caagaccctt ttgaaaggga tctc 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ABCG1 reverse
<400> 2
gccagaatat tcatgagtgt ggac 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SRB1 forward
<400> 3
gcaaatttgg cctgtttgtt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SRB1 reverse
<400> 4
gatcttgctg agtccgttcc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LXRα forward
<400> 5
aggagtgtcg acttcgcaaa 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LXRα reverse
<400> 6
ctcttcttgc cgcttcagtt t 21
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GAPDH forward
<400> 7
tttgtcaagc tcatttcctg gtatg 25
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GAPDH reverse
<400> 8
tgggataggg cctctcttgc 20
Claims (3)
1.一种达玛烷型皂苷类化合物在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用,其特征在于:所述达玛烷型皂苷类化合物为GPLVI,其结构式如式Ⅰ:
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述抗动脉粥样硬化药物为抗巨噬细胞泡沫化药物。
3.一种抗动脉粥样硬化药物,其特征在于:含有权利要求1所定义的达玛烷型皂苷类化合物GPLVI。
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-
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