CN108486221B

CN108486221B - 检测端粒长度的方法

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Publication number: CN108486221B
Application number: CN201810482515.8A
Authority: CN
Inventors: 颜晓梅; 周颖星; 高恺旻
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2038-05-18
Also published as: CN108486221A

Abstract

本公开涉及一种检测端粒长度的方法，该方法包括以下步骤：S1.对待测细胞样本进行预处理，得到待测细胞样本的M期染色体悬液；S2.将所述染色体悬液离心并去除上清，得到含有M期染色体的第一沉淀，将所述第一沉淀与含有端粒特异肽核酸荧光探针的杂交液混合，进行变性并杂交，得到含有杂交染色体的悬浮液；S3.将所述杂交染色体悬浮液进行洗涤、离心并去除上清，得到含有杂交染色体的第二沉淀，将所述第二沉淀用悬浮介质悬浮，得到检测上样悬浮液；S4.使用超高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液中的染色体的荧光信号在单颗粒水平进行逐一检测。该方法能够实现对单染色体水平的人类端粒长度及短端粒比率的快速、精确、定量检测。

Description

检测端粒长度的方法

技术领域

本公开涉及一种检测端粒长度的方法。

背景技术

2009年的诺贝尔生理学或医学奖被授予伊丽莎白·布莱克本、卡罗尔·格雷德和杰克·绍斯塔克三位学者，以表彰他们发现端粒的特殊结构、端粒的染色体保护功能和端粒酶及其作用机制。

端粒是真核细胞染色体末端由重复性的DNA序列和特殊的端粒结合蛋白所组成的一段特殊结构，其中脊椎动物的端粒由富含G的短双链重复序列 TTAGGG串联组成。端粒能够防止染色体末端的降解、融合和重排，从而维持染色体的独立性、完整性和稳定性。虽然端粒不具备编码功能，却被科学家称为“生命的时钟”，因为端粒的长度和稳定性控制着细胞的寿命，并与细胞的癌变和衰老密切相关。

在正常人类体细胞中，端粒的长度会随着细胞分裂而逐渐缩短，细胞每分裂一次，端粒长度缩短一截，损失20～30个核苷酸，当端粒缩短到一定程度时，会诱导核蛋白结构的缺失，触发复制性衰老，出现细胞增殖减慢、生长停滞、干性减退、丧失分化能力等现象。同时，缩短的端粒上某些端粒特殊结合蛋白的丢失还会导致细胞将端粒末端错误识别为DNA断裂位点，从而启动DNA修复功能，导致短端粒染色体之间的末端融合，染色体的融合会造成细胞有丝分裂异常，细胞周期停滞，进而引发由p53蛋白诱导的细胞凋亡。此外，p53等基因突变导致细胞周期检测点缺陷的细胞会跃过复制性衰老，持续分裂最终进入危机期，这个时期极少数细胞表达端粒酶，激活端粒酶活性，修复并维持细胞端粒长度，使得细胞永生化为癌细胞。在诸如直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等90％癌细胞中发现端粒过度缩短和端粒酶活性。端粒异常导致的疾病还包括白血病、再生障碍性贫血、骨髓增生异常和先天性角化不良等。端粒在人类的衰老与疾病的发生进程中扮演着极其重要的角色，端粒重复序列的长度变化决定着细胞的命运，因此端粒长度检测是端粒生物学研究中的重要实验方法。此外，端粒长度检测在衰老疾病和肿瘤中也具有重要的诊断价值。由于种属差异，人类染色体的端粒长度(双链区长度一般在0.5～20kb)远小于大多数实验室模型生物；且不同个体不同细胞中的端粒缩短程度不一样，细胞内不同染色体的端粒缩短程度也不一样；而长度小于等于3kb的端粒被定义为短端粒，最短的端粒而非平均端粒长度在端粒功能丧失，诱发DNA损伤和限制细胞存活中扮演重要角色。因此，亟需一种能够在单个染色体水平精确、简单、快速、高通量地检测人类端粒长度和短端粒比率的方法。

目前，端粒长度的代表性检测方法包括：末端限制性片段分析(terminalrestriction fragment,TRF)，定量PCR(qPCR)，单链端粒长度分析(single telomerelength analysis,STELA)，定量荧光原位杂交(quantitative fluorescence in situhybridization,Q-FISH)，流式荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization andflow cytometry,Flow-FISH)等。

末端限制性片段分析(TRF)是最早最经典的端粒长度检测方法，被认为是端粒长度检测的金标准。该方法的原理是，根据端粒序列特异且重复的特性，用一对限制性内切酶(如HinfI和RsaI)消化基因组DNA，基因组 DNA被消化成短片段，而由于在端粒和亚端粒区域(亚端粒是临近端粒的由高序列相似性的低拷贝重复DNA构成的分段重复DNA片段，主要由亚端粒特有重复区域、近着丝粒重复区域和一种或多种间隙染色体基因座构成) 缺乏内切酶的识别位点，因此端粒DNA不被切割而以较长的片段保留。不同长度的DNA消化产物在琼脂糖凝胶上分离，用端粒DNA特异的探针通过Southern Blotting进行检测，不同长度的端粒产生弥散的信号通过软件与已知分子量DNA梯度条带比较来评估平均端粒长度。此方法测定端粒长度时，提取的基因组DNA完整性对定量端粒长度十分关键，DNA降解会导致端粒长度评估的不准确；选用不同的限制性内切酶组合，会导致不同的结果；探针与短端粒结合效率低，从而导致对短端粒的检测不敏感；由于端粒和亚端粒区域均没有限制性内切酶识别位点，因此检测端粒长度会包含亚端粒 DNA长度，评估结果会大于实际端粒长度；此方法只能用于评估群体细胞的平均端粒长度，无法获得端粒长度的分布和短端粒比率。

定量PCR(qPCR)用与端粒C链和G链都能退火但与其他碱基不匹配的引物通过PCR扩增端粒，前两个循环用低温退火使引物与端粒DNA模板配对产生端粒产物，其余循环用高温退火确保仅扩增前两个循环得到的端粒产物。用端粒扩增产物(T)的量与另一管中扩增的单拷贝基因的量(S)的比值对端粒长度进行相对定量。与TRF一样，基于PCR的方法需要高品质、没有被降解的基因组DNA；此方法在配制T反应管和S反应管溶液时，吸取体积产生的误差会降低检测的精确性，对实验环境洁净度和实验操作技术要求高；且qPCR需要扩增对照基因，对照基因拷贝数的变异和染色体的复制会改变基因拷贝数从而显著改变T/S值，只适合用于二倍体和核型稳定的细胞和样本，而对于转化细胞系和肿瘤组织细胞等核型不稳定样本不适合；此外，与TRF一样，此方法只能评估平均端粒长度，且样本内和样本间差异较高，精确性和稳定性不足。

单链端粒长度分析(STELA)是基于PCR技术，以端粒末端突出的富含G的3'单链为模板，退火并连接一个接头(telorette)到端粒的5'末端，以接头引物和该条染色体上的特异性亚端粒引物扩增单个染色体端粒单链区，扩增产物用Southern Blotting分析。由于不是所有染色体末端都有适用于设计亚端粒引物的特异性序列，故此方法仅适于几条特征性染色体Xp、 Yp、2p、7q、11q、12q、16q、16p和17p的检测，无法对所有端粒长度进行分析，因此也就无法分析整体端粒长度；对于较长端粒(>20kb，如小鼠)，很难进行PCR，也就无法分析。此方法是一种低通量的单个染色体端粒长度检测方法，对技术要求较高，不适合临床应用。

定量荧光原位杂交(Q-FISH)是用荧光标记的可识别端粒区域的肽核酸探针与分裂中期细胞的变性端粒DNA重复序列杂交，荧光信号可以被荧光显微镜检测，通过软件与已知端粒长度的标准品(标准品端粒长度由TRF 获得)比对来分析端粒长度。此方法操作繁琐耗时，通量低，需要显微镜的灵敏度和稳定性高，直接得到的结果为荧光强度，只适用于检测有丝分裂指数高且细胞量较少的细胞端粒长度。

流式荧光原位杂交分析法(Flow-FISH)是用荧光标记的特异识别端粒区域的肽核酸探针与固定、打孔的细胞杂交，端粒荧光信号用流式细胞仪分析，与标准品对比获得单个细胞内的整体端粒平均长度。此方法是第一个用于临床诊断的端粒长度检测方法，是目前最快、最敏感的检测人血液中粒细胞、T细胞、B细胞和天然杀伤细胞平均端粒长度的方法。此方法只适用于具有完整细胞核的二倍体和核型已知且稳定的有丝分裂间期细胞和样本，对于细胞核型高度变异的肿瘤细胞误差极大；PNA探针会非特异结合细胞胞浆中的物质，所以最好是选用完整的细胞核，而不是细胞；此外，此方法也只能评估单个细胞内的平均端粒长度，无法提供短端粒的信息，且对技术要求较高，耗时不易操作。

上述方法的局限性在于：1)受限于方法原理，只能检测端粒平均长度，且无法获得短端粒比率，例如TRF、qPCR和Flow-FISH；2)受限于检测探针结合效率和/或检测技术灵敏度，无法检测较短端粒，例如TRF、qPCR 和Flow-FISH；3)受限于光漂白和/或缺少好的参照标准品，无法准确测定端粒长度，例如Q-FISH和Flow-FISH；4)具有特异性，但不具有广谱性，只能检测特定几种染色体端粒长度，例如STELA；5)能检测单个染色体异常短的端粒，但不适用于流行病学研究(不高通)，例如Q-FISH。因此，目前没有任何一种单一的方法可以精确、简单、快速、高通量地检测端粒长度及其分布和短端粒比率。

发明内容

本公开的目的是提供一种检测端粒长度的方法，该方法能够实现对单染色体水平的人类端粒长度及短端粒比率的快速、精确、定量检测。

为了实现上述目的，本公开提供一种检测端粒长度的方法，该方法包括以下步骤：

S1.对待测细胞样本进行预处理，得到待测细胞样本的M期染色体悬液；

S2.将所述染色体悬液离心并去除上清，得到含有M期染色体的第一沉淀，将所述第一沉淀与含有端粒特异肽核酸荧光探针的杂交液混合，进行变性并杂交，得到含有杂交染色体的悬浮液；

S3.将所述杂交染色体悬浮液进行洗涤、离心并去除上清，得到含有杂交染色体的第二沉淀，将所述第二沉淀用悬浮介质悬浮，得到检测上样悬浮液；

S4.使用超高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液中的染色体的荧光信号在单颗粒水平进行逐一检测，根据所述检测上样悬浮液中的染色体的荧光信号的强度计算所述待测细胞样本的单个染色体水平的端粒长度以及所述待测细胞样本的端粒长度分布。

可选地，步骤S1中，所述预处理包括：

S101.采用秋水仙素对待测细胞样本进行刺激处理3～12h，得到M期细胞悬液；

S102.将所述M期细胞悬液离心并去除上清，得到含有M期细胞的第三沉淀，将所述第三沉淀用低渗液悬浮进行低渗处理15～30min，得到低渗处理后的细胞悬液；

S103.将所述低渗处理后的细胞悬液与打孔处理液混合进行通透处理15～120min，得到通透处理后的细胞悬液，将所述通透处理后的细胞悬液进行裂解处理，得到所述M期染色体悬液。

可选地，步骤S101中，所述秋水仙素的浓度为0.1～100mg/L；

步骤S102中，所述低渗液为含有1～100mmol/L的KCl、1～100mmol/L 的MgSO₄、1～100mmol/L的HEPES和1～100mmol/L的β-巯基乙醇的水溶液；

步骤S103中，所述打孔处理液为含有染色体固定剂和表面活性剂的水溶液，所述染色体固定剂为选自乙酸、甲醇、甲醛和戊二醛中的至少一种，所述表面活性剂为选自Triton X-100、Tween 20、Tween 80、NP-40、SDS、 CTAB、sarcosyl和Chelex-100中的至少一种；

步骤S103中，所述裂解处理为选自超声裂解、冻融裂解、匀浆裂解和微波裂解中的至少一种。

可选地，步骤S103中，所述打孔处理液为含有乙酸和Triton X-100的水溶液，以1mL细胞浓度为(1～10)×10⁸cells/L的所述低渗处理后的细胞悬液为基准，所述乙酸的用量为1～250μL，所述Triton X-100的用量为 0.5～5μL。

可选地，步骤S2中，以1mL染色体浓度为1×10¹¹/L的所述第一沉淀和杂交液的混合溶液为基准，所述端粒特异肽核酸荧光探针的用量为10～1000 nmol/L；

所述杂交液为含有端粒特异肽核酸荧光探针、甲酰胺、BSA、MgCl₂和鲑鱼精DNA的水溶液；

所述端粒特异肽核酸荧光探针为5’-Fluorescent Dye-(CCCTAA)_n-3’或 5’-Fluorescent Dye-(TTAGGG)_n-3’，其中，n为1～10的正整数；Fluorescent Dye 为选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 647、Cy3、Cy5、FITC、 FAM和TMR中的一种。

可选地，步骤S2中，所述变性的温度为70～90℃，时间为2～10min；所述杂交的温度为1～40℃，时间为1～6h。

可选地，步骤S3中，所述洗涤所用的洗液为含有甲酰胺、BSA和MgCl₂的水溶液；

所述悬浮介质为含有KCl、MgSO₄、HEPES和β-巯基乙醇的水溶液。

可选地，步骤S4中，使用超高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液中的染色体的散射光信号和荧光信号的强度在单颗粒水平进行检测；并且根据所述检测上样悬浮液中的染色体的荧光信号的强度计算所述待测细胞样本的单个染色体端粒长度以及所述待测细胞样本的端粒长度分布。

可选地，所述超高灵敏流式细胞术的操作包括：

a.使用鞘液通过流体动力学聚焦将所述检测上样悬浮液压缩成样品液流，其中，所述样品液流含有待检测的杂交染色体，且所述杂交染色体在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动；

b.向所述样品液流照射测量激光，所述测量激光的激发波长位于 300～800nm之间；

c.将接受测量激光照射的所述样品液流的区域定义为探测区，通过透镜系统收集由接受测量激光照射的探测区发出的光信号；

d.将通过透镜系统收集得到的光信号通过检测器进行检测，分别获取所述样品液流中的单个杂交染色体所发出的散射光信号和荧光信号的强度；

e.根据所述荧光信号的强度对所述染色体的端粒长度进行计算。

可选地，步骤S4中，根据所述检测上样悬浮液中的染色体的荧光信号的强度计算所述待测细胞样本的单个染色体水平的端粒长度的步骤包括：

将所述荧光信号的强度代入荧光染料当量标准工作曲线方程，计算得到所述荧光信号的强度对应的荧光染料当量，再按照下式计算所述待测细胞样本的单个染色体水平的端粒长度：

通过上述技术方案，本公开首先对待测细胞样本进行预处理，以获得纯净的染色体，然后利用荧光原位杂交技术使得染色体端粒结合特异荧光肽核酸探针，再使用超高灵敏流式细胞术检测单个染色体水平的端粒的荧光信号强度，以对端粒长度进行定量计算。本公开的方法具有以下优势：

(1)只检测端粒区域碱基对数目，无亚端粒区域干扰；

(2)超高灵敏流式细胞术灵敏度高，检测端粒长度无背景干扰；

(3)能够在单个染色体水平对端粒长度进行精确定量检测；

(4)适用于各种具备有丝分裂活性的细胞样品，包括各种实验细胞株、临床血液细胞和组织细胞等。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是实施例1中在单个染色体水平对端粒长度进行定量检测的流程示意图；其中，(a)为采用秋水仙素对待测细胞样本进行刺激处理，(b)为将(a)上清中的M期细胞悬液离心后获得的含有M期细胞的第三沉淀，(c) 为将(b)用低渗液进行低渗处理并用含有乙酸和Triton X-100的打孔处理液进行通透处理后的细胞悬液，(d)为将(c)进行超声裂解处理后的M期染色体悬浮液，(e)为将(d)进行离心后的含有M期染色体的第一沉淀，(f) 为将(e)与含有端粒特异肽核酸荧光探针的杂交液混合，进行变性并杂交后得到的含有杂交染色体的悬浮液，(g)为将(f)洗涤、离心并去除上清，将离心所得的含有杂交染色体的第二沉淀用悬浮介质悬浮，得到的检测上样悬浮液，(h)为采用超高灵敏流式细胞术对(g)的检测上样悬浮液检测后得到的散射和荧光二维散点图结果；

图2是本公开使用的超高灵敏流式细胞术的光路示意图；

图3是实施例1中用端粒特异肽核酸荧光探针(阳性探针)和改变3个碱基的肽核酸荧光探针(阴性探针)考察非特异性吸附的实验数据，a为空白对照(不加肽核酸荧光探针)的检测结果，b为加入阴性探针(改变3个碱基的肽核酸荧光探针)进行杂交后染色体的检测结果，c为加入端粒特异肽核酸荧光探针(阳性探针)进行杂交后染色体的检测结果；

图4是实施例2中对实验室培养的HeLa、A549、HEK293T、SMMC-7721 和HepG2五个实验细胞株的端粒长度和短端粒(≤3kb)比率的检测结果， a为采用本公开的方法对HeLa细胞的检测结果，b为采用本公开的方法对 A549细胞的检测结果，c为采用本公开的方法对HEK293T细胞的检测结果， d为采用本公开的方法对SMMC-7721细胞的检测结果，e为采用本公开的方法对HepG2细胞的检测结果，f为采用“金标准”末端限制性片段分析法对5 种实验细胞株的端粒长度检测结果(其中M表示DNA Marker，1～5条带分别代表A549、HeLa、HepG2、SMMC-7721和HEK293T)，h为本公开的方法与端粒末端限制性片段分析法所得端粒长度检测结果的线性关系，此处对比的是两种方法测得的端粒平均长度；

图5是实施例3中对正常人外周血淋巴细胞的端粒长度和短端粒比率的检测结果；

图6是实施例4中对临床新发慢性粒细胞白血病患者外周血淋巴细胞的端粒长度和短端粒比率的检测结果；

图3a1-c1、图5a1和图6a1是染色体样品的散射光信号图，图中横坐标代表时间，纵坐标代表散射光信号强度，每一个峰代表一个通过探测区的颗粒；

图3a2-c2、图5a2和图6a2是染色体样品的荧光信号图，图中横坐标代表时间，纵坐标代表荧光信号强度，每一个峰代表一个通过探测区的荧光标记的颗粒；

图3a3-c3、图5b和图6b是染色体样品的散射光信号与荧光信号的双变量散点图，图中横坐标代表散射光信号，纵坐标代表荧光信号，每一个散点代表一个染色体；

图4a-e、图5c和图6c是染色体样品的端粒长度分布及短端粒比率的统计直方图，图中横坐标代表端粒长度，纵坐标代表相应端粒长度的染色体数量。

附图标记说明

1 激光器 2 反光镜

3 消色差双透镜 4 流通池

5 物镜 6 二向色滤光片

7 第一光电倍增管 8 边缘滤波器

9 带通滤波器 10 第二光电倍增管

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开提供一种检测端粒长度的方法，该方法包括以下步骤：

脊椎动物的端粒DNA序列是由富含G的短双链重复序列TTAGGG串联组成，不同物种的端粒初始长度差异很大，在人类中端粒长度大约为5～18 kb，在大鼠中一般为20～100kb，在小鼠中可长达30～150kb。由于人类的端粒长度较短，目前已知的各种方法尚不具备在单染色体水平高通量、高灵敏检测人类端粒长度的能力。本公开基于荧光原位杂交的原理，将染色体与荧光染料标记的特异识别端粒序列的肽核酸探针进行杂交，使用超高灵敏流式细胞术(HSFCM)对单个染色体端粒的荧光信号进行检测，能够排除亚端粒区域的干扰，实现在单个染色体水平对人类端粒长度的快速定量分析；高通量检测的同时，不但能评估待测细胞样本中不同染色体端粒长度的差异，而且可以分析特别是短端粒(≤3kb)的比率。

根据本公开，正常培养的细胞中M期细胞的比例低于10％，大量非M 期的细胞会干扰染色体样品的制备，也造成细胞样本的浪费，严重影响对端粒的检测。为了进一步获得纯净的染色体，同时去除细胞碎片和细胞内容物等杂质的干扰，步骤S1中，所述预处理可以包括：

S103.将所述低渗处理后的细胞悬液与打孔处理液混合进行通透处理 15～120min，得到通透处理后的细胞悬液，将所述通透处理后的细胞悬液进行裂解处理，得到所述M期染色体悬液。

根据本公开，按照上述步骤得到的M期染色体悬液的重复性好，适用于不同种类具有有丝分裂活性的细胞样品。

根据本公开，步骤S101中，采用秋水仙素对培养的待测细胞进行刺激处理可以有效阻碍M期细胞的着丝粒分裂，使细胞停滞于M期，从而增加 M期细胞的比例，所获得的M期细胞的比例至少可达到60％以上。所述秋水仙素的浓度可以在较大范围内变化，例如可以为0.1～100mg/L。M期细胞失去贴壁能力，悬浮于培养基中，可通过收集细胞培养基获得，此时收集的 M期细胞样本中会存在大量细胞代谢产物、死细胞和死细胞碎片等杂质。

根据本公开，步骤S102中，将收集的M期细胞悬液进行低速离心以去除杂质和培养基，所述离心的速度可以为100～1000rcf，离心的时间可以为 5～10min。经过离心后仍会存在少量杂质残留，但不影响后续染色体样本的制备。将所述第三沉淀用低渗液悬浮进行低渗处理，能够使细胞膨胀，有利于后续细胞的破碎，所述低渗处理中，所述低渗液可以为含有1～100mmol/L 的KCl、1～100mmol/L的MgSO₄、1～100mmol/L的HEPES和1～100mmol/L的β-巯基乙醇的水溶液，M期细胞重悬于低渗液的浓度可以为(1～10) ×10⁸cells/L。

由于单纯的低渗处理不足以使细胞破碎，因此需进行步骤S103中的通透处理。其中，所述打孔处理液为含有染色体固定剂和表面活性剂的水溶液。所述染色体固定剂可以包括但不限于乙酸、甲醇、甲醛和戊二醛中的至少一种，其可以固定染色体结构，防止其解旋、断裂；所述表面活性剂可以包括但不限于Triton X-100、Tween 20、Tween 80、NP-40、SDS、CTAB、sarcosyl 和Chelex-100中的至少一种，其可以对膜结构进行打孔破坏，有利于后续细胞膜和其它膜状细胞器的破碎。在本公开的一种优选实施方式中，所述打孔处理液为含有乙酸和Triton X-100的水溶液，以1mL细胞浓度为(1～10) ×10⁸cells/L的所述低渗处理后的细胞悬液为基准，所述乙酸的用量为 1～250μL，所述Triton X-100的用量为0.5～5μL。

根据本公开，步骤S103中，所述裂解处理可以为本领域常规裂解细胞以获得染色体的处理方式，例如可以包括但不限于超声裂解、冻融裂解、匀浆裂解和微波裂解中的至少一种。优选地，所述裂解处理为超声裂解，超声裂解能有效破碎低渗处理和通透处理后的细胞膜和膜状细胞器，所述超声裂解的时间不可过长，否则会造成染色体解旋断裂，例如可以为1～5min。

根据本公开，步骤S2中，将M期染色体悬液进行离心并去除上清，可以去除细胞破碎后释放的细胞碎片和内容物，从而获得较为纯净的染色体样本，所述离心的速度可以为50～1000rcf，时间可以为5～20min。

根据本公开，步骤S2中，以1mL染色体浓度为1×10¹¹/L的所述第一沉淀和杂交液的混合溶液为基准，所述端粒特异肽核酸荧光探针的用量为 10～1000nmol/L，优选为40～100nmol/L。所述杂交液可以为含有端粒特异肽核酸荧光探针、甲酰胺、BSA、MgCl₂和鲑鱼精DNA的水溶液，所述甲酰胺的浓度可以为50～80％(v/v)，所述BSA的浓度可以为100～500mg/L，所述MgCl₂的浓度可以为0.1～10mmol/L，所述鲑鱼精DNA的浓度可以为1～10 mg/L。所述端粒特异肽核酸荧光探针可以为5’-Fluorescent Dye-(CCCTAA)_n-3’或5’-Fluorescent Dye-(TTAGGG)_n-3’，其中，n为1～10的正整数；Fluorescent Dye可以包括但不限于Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 647、 Cy3、Cy5、FITC、FAM和TMR中的一种。

根据本公开，步骤S2中，变性和杂交可以使端粒序列双链解链并与探针结合。所述变性的温度可以为70～90℃，时间可以为2～10min；所述杂交的温度可以为1～40℃，时间可以为1～6h。

根据本公开，步骤S3中，将所述杂交染色体悬浮液进行洗涤、离心并去除上清的次数可以为2～3次。所述洗涤所用的洗液可以为含有甲酰胺、BSA 和MgCl₂的水溶液，其中，所述甲酰胺的浓度可以为50～80％(v/v)，所述 BSA的浓度可以为100～500mg/L，所述MgCl₂的浓度可以为0.1～10mmol/L。

根据本公开，步骤S3中，所述悬浮介质可以为含有KCl、MgSO₄、HEPES 和β-巯基乙醇的水溶液，其中，所述KCl的浓度可以为1～100mmol/L，所述MgSO₄的浓度可以为1～100mmol/L，所述HEPES的浓度可以为1～100 mmol/L，所述β-巯基乙醇的浓度可以为1～100mmol/L。

根据本公开，使用超高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液中的染色体的散射光信号和荧光信号的强度在单颗粒水平进行检测；并且根据所述检测上样悬浮液中的染色体的荧光信号的强度计算所述待测细胞样本的单个染色体端粒长度以及所述待测细胞样本的端粒长度分布。

根据本公开，所述超高灵敏流式细胞术的操作包括：

其中，步骤a中，所述鞘液可以为流式细胞术中常规使用的各种鞘液，例如为去离子水、生理盐水和磷酸盐缓冲液中的一种，优选地，使用去离子水作为鞘液。所述流体动力学聚焦具有流式细胞术中常规的定义，具体是指所述鞘液包绕着样品液体流动，样品液体在所述鞘液的作用下形成液流，即样品液流。可以通过流式细胞术领域常规的调节方法，调节所述染色体在所述检测上样悬浮液中的浓度，使得所述染色体在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动。

根据本公开，步骤b中，所述测量激光的波长根据所述端粒特异肽核酸荧光探针所标记的荧光染料的激发波长进行选择，该选择方式为本领域技术人员所熟知。例如，所述端粒特异肽核酸荧光探针为5’-Alexa Fluor 488-(CCCTAA)₃-3’时，根据荧光染料(AlexaFluor 488)的光谱学特征，激发波长可以采用480～500nm的激光，检测的发射波长可以为500～550nm范围内的荧光。所述超高灵敏流式细胞术使用的激光器的波长可以为488nm，所述超高灵敏流式细胞术使用的荧光通道的带通滤波器可以为FB520/35(实际检测波长范围为502.5～537.5nm之间的荧光信号)。

根据本公开，由于端粒荧光信号的强度无法直接转换为端粒长度，故需要利用一套已知荧光当量的标准微球绘制荧光信号的强度和荧光染料当量的标准工作曲线，进一步将采集到的端粒荧光信号的强度进行碱基对数目转换(1个染色体上有4个端粒，1个已知碱基数的端粒特异肽核酸探针连有1 个荧光染料分子)，最终获得端粒长度和短端粒比率。因此，步骤S4中，根据所述检测上样悬浮液中的染色体的荧光信号的强度计算所述待测细胞样本的单个染色体水平的端粒长度的步骤包括：

其中，绘制标准工作曲线的具体实施细节按照文献“Chen C.X.,Zhang X., ZhangS.Y.,et al.Quantification of protein copy number in single mitochondria: TheBcl-2family proteins.Biosensors&Bioelectronics,2015,74:476-482.”中所述执行。上述公式中的n与所述端粒特异肽核酸荧光探针中碱基序列的重复次数相同，即为端粒特异肽核酸荧光探针5’-Fluorescent Dye-(CCCTAA)_n-3’或5’-Fluorescent Dye-(TTAGGG)_n-3’中的n。

根据本公开，根据计算得到的所述待测细胞样本的单个染色体水平的端粒长度，可以进一步统计得到所述待测细胞样本的端粒长度分布，例如短端粒(≤3kb)比率、端粒平均长度等。短端粒比率的计算公式可以为

其中x表示端粒长度(kb)，f(x)表示端粒长度为x 时的端粒个数，N表示所测定的端粒总数。端粒平均长度的计算公式可以为

其中x_i表示所测得第i个端粒的长度，

和x_i的单位为kb。

本公开提供的方法适用于检测各种具有有丝分裂活性的细胞样本，例如，所述细胞样本包括但不限于HeLa、A549、HepG2、CCRF-CEM、SMMC-7721、 HEK293T、正常人外周血淋巴细胞和髓系白血病患者外周血淋巴细胞中的至少一种。本公开对细胞样板的生长状态、细胞类型和来源等没有特殊的限制，例如可以包括悬浮生长、半贴壁生长和贴壁生长等细胞生长状态，也可以包括肿瘤细胞和正常细胞等细胞类型，还可以包括实验细胞株和临床血液细胞等细胞来源。

本公开使用超高灵敏流式细胞术对染色体进行逐一检测，可获得染色体散射光信号和其端粒荧光信号的二维散点图和端粒长度的统计直方图，适用于临床实际样品的检测。

本公开的方法可采用任何散射和荧光通道的检测灵敏度足够高的商品化或实验室自行搭建的流式细胞仪进行。

以下通过实施例进一步详细说明本公开。

以下实施例中所采用的实验室搭建的超高灵敏流式细胞仪仅为一示例性说明，其并不对本公开构成任何限制。参考图2所示的光路系统，用压力为150kPa的氮气将待测的样品液体压入密闭的样品管，调节氮气的压力，使得样品液流的流量为5nL/min。其中，所述样品管为内径为40μm外径为 240μm的石英毛细管，毛细管末端被处理成约12°的锥形喷嘴。所述样品管轴向平行自上而下地插入鞘液室，所述鞘液室为由石英玻璃形成的截面为 250μm×250μm且轴向长度为20mm的长方体腔体，所述样品管的末端位于所述鞘液室轴向且距离上端8mm处的位置。所述鞘液室中自上而下流动着流速为5cm/sec的鞘液。所述样品管的末端以上的样品液流的截面的半径大约为1μm。波长为488nm的激光经Thorlabs公司的型号为AC050-010-A1 的消色差双合透镜，聚焦成束腰直径为10μm的激光光束。探测区的体积为0.8pL，所述样品液流中的单个细菌接受测量光照射的时间为0.8毫秒。

由激光器1(购自Newport Corp.,Irvine,CA型号488)发出的488nm的激光经反光镜2、消色差双透镜3后照射至位于流通池4的样品管内，待测样品由激光照射后发出光信号，物镜5(购自Thorlabs，型号40×，NA＝0.68) 收集，被二向色滤光片6(购自SemrockInc.,Rochester,NY，型号DicF-500) 分成两束，波长小于500nm的光信号(散射光)被90°反射入第一光电倍增管7(购自Hamamatsu,Japan，型号R928)中检测，大于500nm的光信号经过边缘滤波器8(购自Semrock，型号LP03-488RS)后，经过带通滤波器9(购自Semrock，型号BP520/35)滤除杂散光进入第二光电倍增管10 (购自Hamamatsu,Japan，型号R928)检测(该通道检测的荧光信号为染色体的荧光信号)。

实施例1

本实施例用于说明使用端粒特异肽核酸荧光探针(阳性探针：5’-Alexa Fluor488-(CCCTAA)₃-3’)和改变3个碱基的肽核酸荧光探针(阴性探针： 5’-Alexa Fluor 488-(GCCTAA)₃-3’)验证探针不存在非特异性吸附和错配，不会对检测结果产生影响。本实施例的操作流程图参考图1。

本实施例采用的实验室培养细胞株为HeLa，其培养方法为：将细胞置于含有6mL的DMEM培养基的培养皿中贴壁培养24h，后向培养皿中加入浓度为1mg/L的秋水仙素对细胞进行刺激处理8h。

将6mL上述含有M期HeLa悬浮细胞的培养基进行离心富集，离心的速度为350rcf，离心的时间为5min，将所得沉淀用含有50mmol/L的KCl、 10mmol/L的MgSO₄、5mmol/L的HEPES和3mmol/L的β-巯基乙醇的低渗液悬浮进行低渗处理，M期细胞重悬于低渗液的浓度为5×10⁸cells/L，处理的时间为20min。然后采用含有乙酸和Triton X-100的打孔处理液对低渗处理后的细胞悬液进行通透处理，处理的时间为30min，以1mL细胞浓度为(1～10)×10⁸cells/L的低渗处理后的细胞悬液为基准，乙酸的用量为10μL， Triton X-100的用量为2.25μL。将通透处理后的细胞悬液进行超声裂解4min，得到M期染色体悬液。

将上述1mLM期染色体悬液均等分成多份，每份中染色体的量为1×10⁷个，取其中3份染色体悬液在350rcf的速度下离心7min并去除上清，将离心所得沉淀分别用80℃预热的空白、含有阴性探针和含有阳性探针的杂交液悬浮并于80℃进行变性处理5min，杂交液为含有甲酰胺、BSA、MgCl₂和鲑鱼精DNA的水溶液(甲酰胺的浓度为70％(v/v)，BSA的浓度为250mg/L， MgCl₂的浓度为1mmol/L，鲑鱼精DNA的浓度为1mg/L)，端粒特异肽核酸荧光探针的用量为60nmol/L，将变性后的染色体悬液置于20℃进行杂交处理3h。

将杂交处理后的含有杂交染色体的染色体悬液用洗液进行洗涤、离心并去除上清处理共3次，洗液为含有甲酰胺、BSA和MgCl₂的水溶液(甲酰胺的浓度为70％(v/v)，BSA的浓度为250mg/L，MgCl₂的浓度为1mmol/L)，离心的速度为1700rcf，离心的时间为12min，将第3次离心所得沉淀用含有KCl、MgSO₄、HEPES、和β-巯基乙醇的悬浮介质(KCl的浓度为50mmol/L， MgSO₄的浓度为10mmol/L，HEPES的浓度为5mmol/L，β-巯基乙醇的浓度为3mmol/L)悬浮得到检测上样悬浮液。为进一步纯化染色体，去除细胞碎片、解旋染色体和团聚染色体对检测的干扰，可对检测上样悬浮液进行密度梯度离心处理，梯度液为加入蔗糖的悬浮介质，蔗糖的浓度为40％(w/v)，离心的速度为50rcf，离心的时间为15min。

使用超高灵敏流式细胞术在488nm激光激发下对其进行染色体Alexa Fluor 488荧光(FB520/35)和散射光检测。检测结果如图3所示。

可见，在不含有探针和含有阴性探针的杂交系统中，检测上样悬浮液在散射光通道可以检测到染色体的散射信号(如图3a1和3b1所示)，而在荧光通道，染色体散射信号对应的位置并没有检测到荧光信号(如图3a2和3b2 所示)，散射和荧光的二维散点图上的荧光信号均很弱(如图3a3和3b3)。而在含有阳性探针的杂交系统中，检测上样悬浮液在散射光通道可以检测到染色体的散射信号(如图3c1所示)，在荧光通道，可以检测到与染色体散射信号位置一一对应的荧光信号(如图3c2所示)，在散射和荧光的二维散点图上可以看到明显的荧光信号(如图3c3所示)。所以，采用本公开提供的方法制得的上样悬浮液探针的非特异性吸附和错配可以忽略不计，检测到的荧光信号均来自单个染色体上端粒区域。

实施例2

本实施例用于说明本公开提供的方法对5种实验室培养细胞株的端粒长度和短端粒比率的检测，以及本公开提供的方法得到的5种实验室细胞株的端粒平均长度与“金标准”端粒末端限制性片段分析法的检测结果的对比。

选用的5种实验室细胞株为HeLa、A549、HEK293T、SMMC-7721和 HepG2，所述HEK293T为半贴壁生长的永生细胞，其它4种为贴壁生长的肿瘤细胞。

本实施例中，实验室制备染色体样本和探针杂交的方法与实施例1一致。采用与实施例1一致的细胞培养方法培养5种实验室细胞株，其中所述HeLa、 HEK293T和HepG2使用DMEM培养基，其中所述A549和SMMC-7721使用RPMI-1640培养基。

将5种细胞分别置于含有6mL的各自所需培养基的培养皿中培养24h，后向培养皿中加入浓度为1mg/L的秋水仙素对细胞进行刺激处理8h。将上述5种细胞的各自6mL含有M期悬浮细胞的培养基进行离心富集，离心的速度为350rcf，离心的时间为5min，将所得沉淀用含有50mmol/L的KCl、10mmol/L的MgSO₄、5mmol/L的HEPES和3mmol/L的β-巯基乙醇的低渗液悬浮进行低渗处理M期细胞重悬于低渗液的浓度为5×10⁸cells/L，处理的时间为20min。然后采用含有乙酸和Triton X-100的打孔处理液对低渗处理后的细胞悬液进行通透处理30min，以1mL细胞浓度为(1～10)×10⁸cells/L 的低渗处理后的细胞悬液为基准，乙酸的用量为10μL，Triton X-100的用量为2.25μL。将通透处理后的细胞悬液进行超声裂解4min得到M期染色体悬液。分别将上述5种细胞的1mL染色体悬液均等分成多份，每份中染色体的量为1×10⁷个，在350rcf的速度下离心7min并去除上清，将离心所得沉淀分别用80℃预热的含有浓度为60nmol/L的端粒特异肽核酸荧光探针“5’-Alexa Fluor 488-(CCCTAA)₃-3’”的杂交液悬浮并于80℃进行变性处理 5min，杂交液为含有甲酰胺、BSA、MgCl₂和鲑鱼精DNA的水溶液(甲酰胺的浓度为70％(v/v)，BSA的浓度为250mg/L，MgCl₂的浓度为1mmol/L，鲑鱼精DNA的浓度为1mg/L)，将变性后的染色体悬液置于20℃进行杂交处理3h。将杂交处理后的含有杂交染色体的染色体悬液用洗液进行洗涤、离心并去除上清处理共3次，洗液为含有甲酰胺、BSA和MgCl₂的水溶液(甲酰胺的浓度为70％(v/v)，BSA的浓度为250mg/L，MgCl₂的浓度为1mmol/L)，离心的速度为1700rcf，离心的时间为12min，将第3次离心所得沉淀用含有KCl、MgSO₄、HEPES、和β-巯基乙醇的悬浮介质(KCl的浓度为50mmol/L， MgSO₄的浓度为10mmol/L，HEPES的浓度为5mmol/L，β-巯基乙醇的浓度为3mmol/L)悬浮得到检测上样悬浮液。为进一步纯化染色体，可对检测上样悬浮液进行密度梯度离心处理，梯度液为加入蔗糖的悬浮介质，蔗糖的浓度为40％(w/v)，离心的速度为50rcf，离心的时间为15min。使用超高灵敏流式细胞术在488nm激光激发下对其进行染色体Alexa Fluor 488荧光 (FB520/35)和散射光检测。按照文献“Chen C.X.,Zhang X.,Zhang S.Y.,et al.Quantification ofprotein copy number in single mitochondria:The Bcl-2 familyproteins.Biosensors&Bioelectronics,2015,74:476-482.”绘制标准工作曲线，根据检测得到的荧光信号的强度计算得到对应的荧光染料当量，再根据计算出的荧光染料当量进一步计算待测细胞样本的单个染色体水平的端粒长度，计算公式为：

检测结果如图4所示。

检测得到，Hela的端粒平均长度为1.67kb，短端粒比率为80.4％，A549 的端粒平均长度为2.72kb，短端粒比率为54.2％，HEK293T的端粒平均长度为2.11kb，短端粒比率为78.5％，SMMC-7721的端粒平均长度为3.15kb，短端粒比率为59.6％，HepG2的端粒平均长度为6.59kb，短端粒比率为25.0％。 5种实验室细胞株的端粒长度分布如图4a-e所示。

取同样条件培养的5种实验室细胞株(不经秋水仙素处理)，分别收取全部生长的细胞，按照文献“Harley,C.B.；Futcher,A.B.；Greider,C.W., Telomeres shorten duringageing of human fibroblasts.Nature1990,345(6274), 458-460.”中的端粒末端限制性片段分析法进行检测，检测结果如图4f所示。采用端粒末端限制性片段分析法检测得到的端粒平均长度分别为：HeLa为 4.88kb，A549为5.03kb，HEK293T为5.26kb，SMMC-7721为7.79kb， HepG2为15.66kb。

分别采用本公开的方法和末端限制性片段分析法对5种实验室细胞株进行检测，得到两种方法对端粒平均长度检测结果的线性关系，如图4h所示，横坐标代表采用本公开的方法的检测结果，纵坐标代表采用末端限制性片段分析法得到的检测结果，可见二者具有良好的线性关系，R²等于0.953。与文献报道的其它检测端粒平均长度的方法进行比对，本公开的方法与末端限制性片段分析法检测端粒平均长度对比得到的R²高于绝大多数其它方法。

本实施可以证明，本公开的方法检测得到的端粒平均长度和传统方法的检测结果基本一致，本公开的方法还可以同时获得单个染色体水平的端粒长度，细胞样本的端粒长度分布和短端粒的比率。

实施例3

本实施例用于说明本公开提供的方法对正常人外周血淋巴细胞的端粒长度和短端粒比率的检测。

本实施例采用的正常人外周血样本来自一名健康成人，性别男，年龄25 岁。正常人外周血的采集采用含肝素抗凝剂的真空采血管，采用肘窝静脉采血，外周血采血量可以为5～10mL，本实施例的采血量为10mL。

本实施例采用的细胞为所述外周血单核细胞中的淋巴细胞，外周血单核细胞分离采用Ficoll-Paque PREMIUM(density:1.077g/mL)分离液(购自 GE公司)，外周血单核细胞的提取方法按照GE公司Ficoll-Paque PREMIUM (density:1.077g/mL)产品的使用说明书所述执行。

本实施例中，实验室培养外周血淋巴细胞的方法为：提取的外周血单核细胞悬浮于RPMI-1640培养基中培养4～12h，去除贴壁生长的非淋巴单核细胞，后加入植物凝集素PHA(购自Sigma-Aldrich公司)刺激处理淋巴细胞增殖，植物凝集素PHA的用量可以为0.1～100mg/L，优选为5～10mg/L，植物凝集素PHA刺激处理的时间为3～4天。

本实施例中，实验室制备染色体样本和探针杂交的方法与实施例1一致。在培养最后一天向淋巴细胞培养皿中加入浓度为1mg/L的秋水仙素对细胞进行刺激处理6h，刺激处理后M期淋巴细胞的比例可以达到60％，将上述含有M期淋巴细胞的培养基进行离心富集，离心的速度为350rcf，离心的时间为5min，将所得沉淀用含有50mmol/L的KCl、10mmol/L的MgSO₄、 5mmol/L的HEPES和3mmol/L的β-巯基乙醇的低渗液悬浮进行低渗处理， M期细胞重悬于低渗液的浓度为5×10⁸cells/L，处理的时间为15min。然后采用含有乙酸和Triton X-100的打孔处理液对低渗处理后的细胞悬液进行通透处理30min，以1mL细胞浓度为(1～10)×10⁸cells/L的低渗处理后的细胞悬液为基准，乙酸的用量为10μL，Triton X-100的用量为2.25μL。将通透处理后的细胞悬液进行超声裂解4min得到M期染色体悬液。将上述M 期淋巴细胞的染色体悬液均等分成多份，每份中染色体的量为1×10⁷个，在 350rcf的速度下离心7min并去除上清，将离心所得沉淀分别用80℃预热的含有浓度为60nmol/L的端粒特异肽核酸荧光探针“5’-Alexa Fluor 488-(CCCTAA)₃-3’”的杂交液悬浮并于80℃进行变性处理5min，杂交液为含有甲酰胺、BSA、MgCl₂和鲑鱼精DNA的水溶液(甲酰胺的浓度为70％(v/v)，BSA的浓度为250mg/L，MgCl₂的浓度为1mmol/L，鲑鱼精DNA的浓度为 1mg/L)，将变性后的染色体悬液置于20℃进行杂交处理3h。将杂交处理后的含有杂交染色体的染色体悬液用洗液进行洗涤、离心并去除上清处理共 3次，洗液为含有甲酰胺、BSA和MgCl₂的水溶液(甲酰胺的浓度为70％(v/v)， BSA的浓度为250mg/L，MgCl₂的浓度为1mmol/L)，离心的速度为1700rcf，离心的时间为12min，将第3次离心所得沉淀用含有KCl、MgSO₄、HEPES、和β-巯基乙醇的悬浮介质(KCl的浓度为50mmol/L，MgSO₄的浓度为10 mmol/L，HEPES的浓度为5mmol/L，β-巯基乙醇的浓度为3mmol/L)悬浮得到检测上样悬浮液。为进一步纯化染色体，可对检测上样悬浮液进行密度梯度离心处理，梯度液为加入蔗糖的悬浮介质，蔗糖的浓度为40％(w/v)，离心的速度为50rcf，离心的时间为15min。使用超高灵敏流式细胞术在488 nm激光激发下对其进行染色体Alexa Fluor 488荧光(FB520/35)和散射光检测，按照文献“Chen C.X.,Zhang X.,Zhang S.Y.,et al.Quantification of protein copy number in singlemitochondria:The Bcl-2family proteins. Biosensors&Bioelectronics,2015,74:476-482.”绘制标准工作曲线，根据检测得到的荧光信号的强度计算得到对应的荧光染料当量，再根据计算出的荧光染料当量进一步计算待测细胞样本的单个染色体水平的端粒长度，计算公式为：

检测结果如图5所示。

检测得到，所述1例正常人外周血淋巴细胞的端粒平均长度为9.12kb，短端粒比率为9.1％，端粒长度分布如图5c所示。

本实施例可以证明，采用本公开的方法能够检测正常人外周血淋巴细胞的端粒长度和短端粒比率，适用于临床实际样品的检测。

实施例4

本实施例用于说明本公开提供的方法对临床新发慢性粒细胞白血病患者外周血淋巴细胞的端粒长度和短端粒比率的检测。

本实施例采用的临床新发慢性粒细胞白血病患者外周血样本来自一名临床新发慢性粒细胞白血病患者，性别男，年龄40岁。患者外周血的采集采用含肝素抗凝剂的真空采血管，采用肘窝静脉采血，外周血采血量可以为 5～10mL，本实施例的采血量为10mL。

本实施例采用的细胞和外周血单核细胞分离的方法与实施例3一致。

本实施例中，实验室培养外周血淋巴细胞的方法与实施例3一致。

本实施例中，实验室制备染色体样本和探针杂交的方法与实施例3一致。在培养最后一天向淋巴细胞培养皿中加入浓度为1mg/L的秋水仙素对细胞进行刺激处理6h，刺激处理后M期淋巴细胞的比例可以达到60％，将上述含有M期淋巴细胞的培养基进行离心富集，离心的速度为350rcf，离心的时间为5min，将所得沉淀用含有50mmol/L的KCl、10mmol/L的MgSO₄、 5mmol/L的HEPES和3mmol/L的β-巯基乙醇的低渗液悬浮进行低渗处理， M期细胞重悬于低渗液的浓度为5×10⁸cells/L，处理的时间为15min。然后采用含有乙酸和Triton X-100的打孔处理液对低渗处理后的细胞悬液进行通透处理30min，以1mL细胞浓度为(1～10)×10⁸cells/L的低渗处理后的细胞悬液为基准，乙酸的用量为10μL，TritonX-100的用量为2.25μL。将通透处理后的细胞悬液进行超声裂解4min得到M期染色体悬液。将上述M 期淋巴细胞的染色体悬液均等分成多份，每份中染色体的量为1×10⁷个，在 350rcf的速度下离心7min并去除上清，将离心所得沉淀分别用80℃预热的含有浓度为60nmol/L的端粒特异肽核酸荧光探针“5’-Alexa Fluor 488-(CCCTAA)₃-3’”的杂交液悬浮并于80℃进行变性处理5min，杂交液为含有甲酰胺、BSA、MgCl₂和鲑鱼精DNA的水溶液(甲酰胺的浓度为70％(v/v)，BSA的浓度为250mg/L，MgCl₂的浓度为1mmol/L，鲑鱼精DNA的浓度为 1mg/L)，将变性后的染色体悬液置于20℃进行杂交处理3h。将杂交处理后的含有杂交染色体的染色体悬液用洗液进行洗涤、离心并去除上清处理共 3次，洗液为含有甲酰胺、BSA和MgCl₂的水溶液(甲酰胺的浓度为70％(v/v)， BSA的浓度为250mg/L，MgCl₂的浓度为1mmol/L)，离心的速度为1700rcf，离心的时间为12min，将第3次离心所得沉淀用含有KCl、MgSO₄、HEPES、和β-巯基乙醇的悬浮介质(KCl的浓度为50mmol/L，MgSO₄的浓度为10 mmol/L，HEPES的浓度为5mmol/L，β-巯基乙醇的浓度为3mmol/L)悬浮得到检测上样悬浮液。为进一步纯化染色体，可对检测上样悬浮液进行密度梯度离心处理，梯度液为加入蔗糖的悬浮介质，蔗糖的浓度为40％(w/v)，离心的速度为50rcf，离心的时间为15min。使用超高灵敏流式细胞术在488 nm激光激发下对其进行染色体Alexa Fluor 488荧光(FB520/35)和散射光检测，按照文献“Chen C.X.,Zhang X.,Zhang S.Y.,et al.Quantification of protein copy number in singlemitochondria:The Bcl-2family proteins. Biosensors&Bioelectronics,2015,74:476-482.”绘制标准工作曲线，根据检测得到的荧光信号的强度计算得到对应的荧光染料当量，再根据计算出的荧光染料当量进一步计算待测细胞样本的单个染色体水平的端粒长度，计算公式为：

检测结果如图6所示。

检测得到，所述1例临床新发慢性粒细胞白血病患者外周血淋巴细胞的端粒平均长度为3.78kb，短端粒比率为61.1％，端粒长度分布如图6c所示。

本实施例可以证明，采用本公开的方法能够检测临床血液病等疾病患者外周血淋巴细胞的端粒长度和短端粒比率，并且可发现慢性粒细胞白血病患者的端粒长度低于正常人水平，短端粒比率远高于正常人水平。

进一步通过分析大量本公开的方法检测的不同年龄正常人和慢性粒细胞白血病患者的端粒结果，证明本公开的方法具有对端粒长度相关临床疾病快速诊断和治疗监测的应用潜力。

由实施例1～4可见，本公开的方法能检测各种具有有丝分裂活性的细胞样本，检测结果精确，进一步由实施例3～4可见，本公开的方法适用于临床实际样本的检测。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims

1.一种用于非诊断目的的基于单个染色体水平检测端粒长度的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S4.使用超高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液中的染色体的荧光信号在单颗粒水平进行逐一检测，根据所述检测上样悬浮液中的染色体的荧光信号的强度计算所述待测细胞样本的单个染色体水平的端粒长度以及所述待测细胞样本的端粒长度分布；

其中，所述超高灵敏流式细胞术的操作包括：

b.向所述样品液流照射测量激光，所述测量激光的激发波长位于300～800nm之间；

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S1中，所述预处理包括：

3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤S101中，所述秋水仙素的浓度为0.1～100mg/L；

步骤S102中，所述低渗液为含有1～100mmol/L的KCl、1～100mmol/L的MgSO₄、1～100mmol/L的HEPES和1～100mmol/L的β-巯基乙醇的水溶液；

步骤S103中，所述打孔处理液为含有染色体固定剂和表面活性剂的水溶液，所述染色体固定剂为选自乙酸、甲醇、甲醛和戊二醛中的至少一种，所述表面活性剂为选自TritonX-100、Tween20、Tween 80、NP-40、SDS、CTAB、sarcosyl和Chelex-100中的至少一种；

4.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤S103中，所述打孔处理液为含有乙酸和Triton X-100的水溶液，以1mL细胞浓度为(1～10)×10⁸cells/L的所述低渗处理后的细胞悬液为基准，所述乙酸的用量为1～250μL，所述Triton X-100的用量为0.5～5μL。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S2中，以1mL染色体浓度为1×10¹¹/L的所述第一沉淀和杂交液的混合溶液为基准，所述端粒特异肽核酸荧光探针的用量为10～1000nmol/L；

所述端粒特异肽核酸荧光探针为5’-Fluorescent Dye-(CCCTAA)_n-3’或5’-Fluorescent Dye-(TTAGGG)_n-3’，其中，n为1～10的正整数；Fluorescent Dye为选自AlexaFluor 488、Alexa Flour 532、Alexa Fluor 647、Cy3、Cy5、FITC、FAM和TMR中的一种。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S2中，所述变性的温度为70～90℃，时间为2～10min；所述杂交的温度为1～40℃，时间为1～6h。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S3中，所述洗涤所用的洗液为含有甲酰胺、BSA和MgCl₂的水溶液；

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S4中，使用超高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液中的染色体的散射光信号和荧光信号的强度在单颗粒水平进行检测；并且根据所述检测上样悬浮液中的染色体的荧光信号的强度计算所述待测细胞样本的单个染色体端粒长度以及所述待测细胞样本的端粒长度分布。

9.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤S4中，根据所述检测上样悬浮液中的染色体的荧光信号的强度计算所述待测细胞样本的单个染色体水平的端粒长度的步骤包括：