CN111041073B - 一种端粒长度的高通量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种端粒长度的高通量检测方法，包括：将多个待测试者的口腔脱落细胞分别加入各自的离心管中，每个离心管上设有一个唯一的识别码，对所有的离心管进行离心；离心后，保留下层溶液，再将离心管放入第一板架中，向每个离心管中加入裂解液，然后震荡；从每个离心管中吸取预设容量的液体至吸附柱上，对吸附柱中每个柱孔内的液体进行离心、抽滤，以获取待测试者的DNA；将吸附柱中待测试者的DNA转移至第二板架的板孔中，进行qPCR反应，得到原始测试数据；对原始数据进行处理，以得到与每个识别码一一对应的端粒长度T/S值。本发明能够保证样本的采集编码与其最后的数据结果相一致、以及保证数据的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种端粒长度的高通量检测方法。
背景技术
端粒是位于染色体末端的重复的TTAGGG的DNA序列，端粒和一些相关蛋白组成了一个端粒蛋白复合体(Shelterin complexes)，保护染色体末端不受降解以及不会发生末端融合，而且这些蛋白通过与telomerase相互作用，可以起到调节端粒延长或缩短的作用。
在人体所有的细胞内，端粒处于染色体的末端，常被视作保护帽，保护人体的基因。它们会随着细胞分裂次数的增多和年龄的增长而缩短，当端粒缩短到一定程度时，细胞就无法继续分裂而死亡，这就是身体衰老过程的开始。
临床研究表明，端粒长度除了能够反映人体的衰老程度，还与患肿瘤、糖尿病、心血管等疾病的风险有关，因此，端粒长度已被认为是一个重要的人体机能指标，是重要的“有丝分裂钟”或“分子钟”，端粒的缩短被认为与细胞额衰老和癌症等疾病的发生密切相关，因此建立一种通用的高通量端粒长度检测方法，对于预防衰老和癌症都会起到很大的帮助。
随着分子生物学技术的发展，2003年Cawthon RM将荧光定量PCR技术应用到了端粒长度检测中，该技术的原理是设计两对特异性的引物，其中一对引物检测特异性的端粒信号(T)，另一对引物检测特异性的单拷贝基因(S)，根据两个基因的得到的Ct值，并与提供的参照品比较，计算T/S比值。在最初的研究中，T与S是在分开的两个孔内进行的，但Cawthon RM在2009年提出了一种被称作MMQPCR的荧光定量PCR方法(也称qPCR)，可以实现在一个反应管内完成T和S两个信号的采集，大大减少了反应的误差。
qPCR方法不仅快速，而且对样品的需求量比较低，仅需几个纳克的基因组DNA就可以完成检测，qPCR是依赖检测样品的T/S比值与参考样品的T/S比值计算得到的一个相对端粒长度。
在使用qPCR进行高通量检测时，由于检测样本较多，若对检测样本一个个进行测试，费时费力；而批量进行检测，如何保证样本的采集编码与其最后的数据结果相一致、以及如何保证数据的准确性是一个技术难题。
发明内容
鉴于上述状况，本发明提供一种端粒长度的高通量检测方法，以保证样本的采集编码与其最后的数据结果相一致、以及保证数据的准确性。
一种端粒长度的高通量检测方法，包括：
将多个待测试者的口腔脱落细胞分别加入各自的离心管中，每个离心管上设有一个唯一的识别码，每个待测试者对应一个识别码，然后对所有的离心管进行离心；
离心后，保留下层溶液，再将离心管放入第一板架中，第一板架上贴有标签纸，使第一板架分为左右对等的第一区域和第二区域，且使第一板架上的每个板孔具有唯一的标签码，且该标签码与离心管上的识别码一一对应；
向每个离心管中加入裂解液，然后震荡；
从每个离心管中吸取预设容量的液体至吸附柱上，吸附柱上柱孔的数量与离心管的数量一致，吸附柱上贴有标签纸，且吸附柱贴设的标签纸与第一板架上贴设的标签纸一致，吸附柱具有左右对等的第一区域和第二区域；
对吸附柱中每个柱孔内的液体进行离心、抽滤，以获取待测试者的DNA；
将吸附柱中第一区域内的待测试者的DNA以及吸附柱中第二区域内的待测试者的DNA分别转移至两个第二板架的板孔中，第二板架上板孔的数量是第一板架上板孔数量的4倍，且每个待测试者的DNA均被转移到第二板架上的6个板孔中；
将两个第二板架放入PCR仪器中进行qPCR反应，得到原始测试数据；
对原始数据进行处理，以得到与每个识别码一一对应的端粒长度T/S值。
根据本发明提供的端粒长度的高通量检测方法，在初始的放置了待测试者口腔脱落细胞的离心管设置一个唯一的识别码，后续在反应、转移过程中，只需设置与识别码对应的标签码，并通过一定的转移规则，能够保证数据的一致性，最终通过qPCR反应，并对qPCR反应得到的原始测试数据进行处理，能够得到与每个识别码一一对应的端粒长度T/S值。能够保证样本的采集编码与其最后的数据结果的一致性，确保数据的准确性，本方法能够对大批量的样本同时进行测试，满足高通量检测的需求，本方法能实现一次录入唯一识别码，就能够快速得到相对应的测试数据，能够节省人力成本和时间成本。
另外，根据本发明上述的端粒长度的高通量检测方法，还可以具有如下附加的技术特征：
进一步的，第二板架具有从上至下循环层叠设置的T-Cp行和S-Cp行，吸附柱中第一个待测试者的DNA被转移至位于首层的T-Cp行的前3个板孔、以及位于首层的S-Cp行的前3个板孔中，吸附柱中第二个待测试者的DNA被转移至位于首层的T-Cp行的第4至6板孔、以及位于首层的S-Cp行的第4至6个板孔中，并以此类推。
进一步的，qPCR反应完成之后，第二板架中T-Cp行对应的原始测试数据为T-Cp值，第二板架中S-Cp行对应的原始测试数据为S-Cp值。
进一步的，对原始数据进行处理，以得到与每个识别码一一对应的端粒长度T/S值的步骤中，采用下式计算T/S值：
T/S值＝2E；
E＝D-F；
F为设定值，D＝H-P；
H为平均S-Cp值，P为平均T-Cp值。
进一步的，当待测试者为男性时，F为8.86，当待测试者为女性时，F为9.19。
进一步的，在收集待测试者的口腔脱落细胞时，获取并存储待测试者的身份信息，以及建立待测试者的身份信息与唯一的识别码之间的映射关系，待测试者的身份信息至少包括待测试者的实际年龄和性别。
进一步的，第一板架上板孔的数量、吸附柱上柱孔的数量均为96，第二板架上板孔的数量为384。
进一步的，第一板架上的板孔具有8行12列，其中，左侧的8行6列为第一板架的第一区域，右侧的8行6列为第一板架的第二区域。
进一步的，第二板架上的板孔具有16行24列，其中，左侧的16行18列用于放置待测试者的DNA，右侧的16行6列用于放置对照品。
附图说明
图1为第一板架上板孔的排布示意图；
图2为第二板架A上板孔的排布示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明实施例提供的端粒长度的高通量检测方法，所述方法包括步骤S1～S4：
S1，将多个待测试者的口腔脱落细胞分别加入各自的离心管中，每个离心管上设有一个唯一的识别码，每个待测试者对应一个识别码，然后对所有的离心管进行离心。
其中，在收集待测试者的口腔脱落细胞时，获取并存储待测试者的身份信息，以及建立待测试者的身份信息与唯一的识别码之间的映射关系，待测试者的身份信息至少包括待测试者的实际年龄和性别。
例如，测试者王某某，男性，实际年龄(即身份证上的年龄)为23岁，其对应的唯一的识别码为TP100001，收集到此人的口腔脱落细胞，将其口腔脱落细胞加入至一个离心管中，在该离心管上贴上标签TP100001。同理，对其他人也做同样的操作，然后对所有的离心管在15,600Xg离心1min。
S2，离心后，保留下层溶液，再将离心管放入第一板架中，第一板架上贴有标签纸，使第一板架分为左右对等的第一区域和第二区域，且使第一板架上的每个板孔具有唯一的标签码，且该标签码与离心管上的识别码一一对应。
其中，离心完后，将上清液倒掉，保留下层溶液，工作人员在接收到离心管，可以使用扫码器识别管体上的标签，用于记录；然后工作人员再将离心管放在第一板架中，具体的，第一板架上板孔的数量为96，即，每次测试时，可以同时对96个测试者进行测试。
请参考图1，第一板架上板孔的排布方式为8行12列，其中，左侧的8行6列为第一板架的第一区域，右侧的8行6列为第一板架的第二区域。具体的，将第一区域命名为A区域，A区域中，行的标签纸为A、B、C、D、E、F、G、H，列的标签纸为1、2、3、4、5、6；将第二区域命令为B区域，A区域中，行的标签纸为A、B、C、D、E、F、G、H，列的标签纸为7、8、9、10、11、12。
S3向每个离心管中加入裂解液，然后震荡。
其中，具体的吸取500μl裂解液，加入到第一板架上的每个板孔中；然后2750rpm、run mode振荡30s；振荡后静置5min。
S4，从每个离心管中吸取预设容量的液体至吸附柱上，吸附柱上柱孔的数量与离心管的数量一致，吸附柱上贴有标签纸，且吸附柱贴设的标签纸与第一板架上贴设的标签纸一致，吸附柱具有左右对等的第一区域和第二区域。
其中，吸附柱上板孔的数量也为96，吸附柱上板孔的排布方式和第一板架一致(也可参考图1)，也为8行12列，其中，左侧的8行6列为吸附柱的第一区域，右侧的8行6列为吸附柱的第二区域。具体的，将第一区域命名为A区域，A区域中，行的标签纸为A、B、C、D、E、F、G、H，列的标签纸为1、2、3、4、5、6；将第二区域命令为B区域，A区域中，行的标签纸为A、B、C、D、E、F、G、H，列的标签纸为7、8、9、10、11、12。吸附柱中的A区域、B区域和第一板架中的A区域、B区域完全对应。
具体的，首先将上述标签纸贴在96孔的吸附柱上，然后从每个离心管中吸取250μl的液体至吸附柱上对应的孔中，第一板架中A1孔内的液体吸至吸附柱A1孔中，以此类型。
S5，对吸附柱中每个柱孔内的液体进行离心、抽滤，以获取待测试者的DNA。
其中，步骤S5具体包括：
a)吸取800μl洗涤液依次加入96孔的吸附柱中；
b)抽滤1.5min；
c)重复清洗步骤4次，最后一次清洗3min；
d)最后一次抽滤后，静置5min；
e)100X g空转离心96孔吸附柱1min；
f)离心后将96孔吸附柱放在0.36ml收集管上；
g)吸取70μl无核酶水按列依次加入96孔的吸附柱中；
h)计时静置2min；
i)抽滤1.5min；
j)取出0.36ml收集管，贴上相应封孔膜，收集获得DNA。
k)获取待测试者的DNA可以存放中4度冰箱中。
S6，将吸附柱中第一区域内的待测试者的DNA以及吸附柱中第二区域内的待测试者的DNA分别转移至两个第二板架的板孔中，第二板架上板孔的数量是第一板架上板孔数量的4倍，且每个待测试者的DNA均被转移到第二板架上的6个板孔中。
其中，第二板架上板孔的数量为384，两个第二板架分别为第二板架A和第二板架B。
第二板架上的板孔具有16行24列，其中，左侧的16行18列用于放置待测试者的DNA，右侧的16行6列用于放置对照品。
具体的，将吸附柱中第一区域(即A区域)内的待测试者的DNA转移至第二板架A中，将吸附柱中第一区域(即B区域)内的待测试者的DNA转移至第二板架B中，将吸附柱中第一区域(即A区域)内的待测试者的DNA转移至第二板架A中。
其中，第二板架(包括第二板架A和第二板架B)具有从上至下循环层叠设置的T-Cp行和S-Cp行，吸附柱中第一个待测试者的DNA被转移至位于首层的T-Cp行的前3个板孔、以及位于首层的S-Cp行的前3个板孔中，吸附柱中第二个待测试者的DNA被转移至位于首层的T-Cp行的第4至6板孔、以及位于首层的S-Cp行的第4至6个板孔中，并以此类推。例如，吸附柱中第一区域内的第一个待测试者(例如此人的唯一的识别码为TP100001)的DNA被转移至第二板架A中位于首层的T-Cp行的前3个板孔、以及位于首层的S-Cp行的前3个板孔中，吸附柱中第一区域内的第二个待测试者(例如此人的唯一的识别码为TP100002)的DNA被转移至第二板架A位于首层的T-Cp行的第4至6板孔、以及位于首层的S-Cp行的第4至6个板孔中。
请参阅图2，以第二板架A为例，第二板架A上的板孔排布为16行24列，16行被命名为A-P，24列被命名为1-24，A、C、E、G、I、K、M、O这8行为T-Cp行，B、D、F、H、J、L、N、P这8行为S-Cp行，识别码为TP100001的待测试者DNA被转移A1、A2、A3、B1、B2、B3这六个孔中。识别码为TP100002的待测试者DNA被转移A4、A5、A6、B4、B5、B6这六个孔中，以此类推，但右侧的16行6列(即A19～A24、B19～B24……P19～P24这些孔)不放DNA，只用于放置对照品。
S7，将两个第二板架放入PCR仪器中进行qPCR反应，得到原始测试数据。
其中，具体将SYBR Green Mix加到两个第二板架中，然后将两个第二板架封膜，离心后进行qPCR反应，通过PCR仪器可以直接读取到原始测试数据。请参阅图2，同样以第二板架A为例，PCR仪器得到的数据是第二板架A中，A1～A24、B2～B24……P1～P24这些孔对应的数据。
qPCR反应完成之后，第二板架中T-Cp行对应的原始测试数据为T-Cp值，第二板架中S-Cp行对应的原始测试数据为S-Cp值。
请参阅图2，同样以第二板架A为例，A、C、E、G、I、K、M、O这8行中每个孔的测试结果均为T-Cp值(即A1～A24这些孔对应的数据为T-Cp值，C1～C24这些孔对应的数据为T-Cp值，以此类推)，B、D、F、H、J、L、N、P这8行中每个孔的测试结果均为S-Cp值(即B1～B24这些孔对应的数据为T-Cp值，D1～D24这些孔对应的数据为T-Cp值，以此类推)。
根据上述的转移规则，每个人会有3个T-Cp值，3个S-Cp值，对这3个T-Cp值求平均，即得到此人的平均T-Cp值，同理，对这3个S-Cp值求平均，即得到此人的平均S-Cp值。例如，会得到TP100001对应的3个T-Cp值(即A1、A2、A3这三个孔测试结果)，3个S-Cp值(即B1、B2、B3这三个孔测试结果)，以及TP100002对应的3个T-Cp值(即A4、A5、A6这三个孔测试结果)，3个S-Cp值(即B4、B5、B6这三个孔测试结果)，然后可以得到TP100001对应的平均T-Cp值、平均S-Cp值，以及TP100000对应的平均T-Cp值、平均S-Cp值。
S8，对原始数据进行处理，以得到与每个识别码一一对应的端粒长度T/S值。
其中，具体采用下式计算T/S值：
T/S值＝2E；
E＝D-F；
F为设定值，D＝H-P；
H为平均S-Cp值，P为平均T-Cp值。
当待测试者为男性时，F为8.86，当待测试者为女性时，F为9.19。由于步骤S1中建立了待测试者的身份信息与唯一的识别码之间的映射关系，因此，可以获知每个识别码对应的性别，例如识别码TP100001为男性。
最终，能够得到识别码TP100001和TP100002对应的端粒长度T/S值，以此类推，可以得到本次测试的96个人中每个人的端粒长度T/S值。
根据本实施例提供的端粒长度的高通量检测方法，在初始的放置了待测试者口腔脱落细胞的离心管设置一个唯一的识别码，后续在反应、转移过程中，只需设置与识别码对应的标签码，并通过一定的转移规则，能够保证数据的一致性，最终通过qPCR反应，并对qPCR反应得到的原始测试数据进行处理，能够得到与每个识别码一一对应的端粒长度T/S值。能够保证样本的采集编码与其最后的数据结果的一致性，确保数据的准确性，本方法能够对大批量的样本同时进行测试，满足高通量检测的需求，本方法能实现一次录入唯一识别码，就能够快速得到相对应的测试数据，能够节省人力成本和时间成本。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (2)
1.一种非治疗或诊断疾病目的的端粒长度的高通量检测方法，其特征在于，所述方法包括：
将多个待测试者的口腔脱落细胞分别加入各自的离心管中，每个离心管上设有一个唯一的识别码，每个待测试者对应一个识别码，然后对所有的离心管进行离心；
离心后，保留下层溶液，再将离心管放入第一板架中，第一板架上贴有标签纸，使第一板架分为左右对等的第一区域和第二区域，且使第一板架上的每个板孔具有唯一的标签码，且该标签码与离心管上的识别码一一对应；
向每个离心管中加入裂解液，然后震荡；
从每个离心管中吸取预设容量的液体至吸附柱上，吸附柱上柱孔的数量与离心管的数量一致，吸附柱上贴有标签纸，且吸附柱贴设的标签纸与第一板架上贴设的标签纸一致，吸附柱具有左右对等的第一区域和第二区域；
对吸附柱中每个柱孔内的液体进行离心、抽滤，以获取待测试者的DNA；
将吸附柱中第一区域内的待测试者的DNA以及吸附柱中第二区域内的待测试者的DNA分别转移至两个第二板架的板孔中，第二板架上板孔的数量是第一板架上板孔数量的4倍，且每个待测试者的DNA均被转移到第二板架上的6个板孔中；
将两个第二板架放入PCR仪器中进行qPCR反应，得到原始测试数据；
对原始数据进行处理，以得到与每个识别码一一对应的端粒长度T/S值；
第二板架具有从上至下循环层叠设置的T-Cp行和S-Cp行，吸附柱中第一个待测试者的DNA被转移至位于首层的T-Cp行的前3个板孔、以及位于首层的S-Cp行的前3个板孔中，吸附柱中第二个待测试者的DNA被转移至位于首层的T-Cp行的第4至6板孔、以及位于首层的S-Cp行的第4至6个板孔中，并以此类推；
qPCR反应完成之后，第二板架中T-Cp行对应的原始测试数据为T-Cp值，第二板架中S-Cp行对应的原始测试数据为S-Cp值；
对原始数据进行处理，以得到与每个识别码一一对应的端粒长度T/S值的步骤中，采用下式计算T/S值：
T/S值＝2E；
E＝D-F；
F为设定值，D＝H-P；
H为平均S-Cp值，P为平均T-Cp值；
当待测试者为男性时，F为8.86，当待测试者为女性时，F为9.19；
第一板架上板孔的数量、吸附柱上柱孔的数量均为96，第二板架上板孔的数量为384；
第一板架上的板孔具有8行12列，其中，左侧的8行6列为第一板架的第一区域，右侧的8行6列为第一板架的第二区域；
第二板架上的板孔具有16行24列，其中，左侧的16行18列用于放置待测试者的DNA，右侧的16行6列用于放置对照品。
2.根据权利要求1所述的非治疗或诊断疾病目的的端粒长度的高通量检测方法，其特征在于，在收集待测试者的口腔脱落细胞时，获取并存储待测试者的身份信息，以及建立待测试者的身份信息与唯一的识别码之间的映射关系，待测试者的身份信息至少包括待测试者的实际年龄和性别。
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