CN108485987A - 二苯并氧杂环庚酮类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

二苯并氧杂环庚酮类化合物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种海洋真菌WH4‑2来源的二苯并氧杂环庚酮类化合物及其制备方法和用途，本发明中的海洋真菌柄篮状菌具有高效的抗副溶血弧菌活性，且活性物质“含异戊烯基的二苯并氧杂环庚酮类化合物”的产量较大，有望应用于新型抗副溶血弧菌的药物开发，在进一步活性分析中发现该类化合物还具有抗枯草芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和屎肠球菌活性，有望开发成一类广谱抗菌药。

Description

二苯并氧杂环庚酮类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种化合物，具体涉及一株海洋真菌其二级代谢产物“含异戊烯基的二苯并氧杂环庚酮类化合物”在抗副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)及抗枯草芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和屎肠球菌活性方面的应用。
背景技术
副溶血弧菌系弧菌科弧菌属，形态为杆状、丝状或稍微弯曲状，属革兰氏阴性菌，嗜盐。分布极广，但主要分布在海水和海产品中，是海水养殖最常见致病菌，一旦爆发，进程快且不易控制。抗生素类药物是目前防治的主要手段，但长期大量使用大面积污染海洋水体环境的同时，也导致耐药菌株不断产生。人进食含副溶血性弧菌的食物可致食物中毒，重症患者可因脱水造成休克，少数可导致死亡。治疗方面，病情较重者可使用喹诺酮类抗菌药物，但喹诺酮类抗生素的大量使用，易导致细菌产生耐药性。新的、高效的、低毒的且环境友好的副溶血性弧菌药物研发迫在眉睫。
前期工作中从威海附近海域的底泥中分离并筛选到一株对多株病原菌均有抗菌活性的海洋真菌WH4-2，经ITS全序列分析鉴定为柄篮状菌。柄篮状菌的次生代谢产物研究目前只报道4篇。Lynn DG等人从柄篮状菌中获得可阻断钾离子外流，进而导致肌功能紊乱的具有螺缩酮结构的聚醚类化合物[Journal of the American Chemical Society,1982,104(25):7319-7322]。O'Sullivan等人从柄篮状菌中分离鉴定出柄状青霉酸，并探讨其生物合成途径[Bioorganic Chemistry,1995,23(2),131-143]。Zang Y等人从柄篮状菌中发现聚酮类化合物，其中一个聚酮对氯喹耐受的疟原虫具有显著的抗疟活性[Phytochemistry, 2015,119,70-75]。Zang Y等人同时还分离得到可显著抑制革兰氏阳性菌和Hela肿瘤细胞生长的聚酮类化合物[Journal of Natural Products,2016,79(12):2991-2996]。以前的文献和专利中从未发现真菌柄篮状菌发酵液粗提取物可抗副溶血性弧菌。本课题组通过进一步分析发现含异戊烯基的二苯并氧杂环庚酮类化合物是其抗菌有效成分，这也是首次报道从柄篮状菌中获得此类化合物。含异戊烯基的二苯并氧杂环庚酮类化合物到目前为止发现的天然产物只有17个，都分离自不同来源的真菌[Journal ofNatural Products, 2006,69(7),995-1000；Organic Letters,2013,15(8),2058-2061；Molecules,2016,21, 1184-1195]。含异戊烯基的二苯并氧杂环庚酮类化合物生物活性方面研究报道较少。二苯并氧杂环庚酮Arugosins H具有抗小球藻活性。抗菌方面二苯并氧杂环庚酮Arugosins A,B和H有一定抗菌活性；抗肿瘤方面二苯并氧杂环庚酮Arugosins A和B混合物在浓度10μg/mL时对多株肿瘤细胞表现出中等强度抑制活性[Journal of NaturalProducts, 2006,69(7),995-1000]。本专利抗菌活性物质含异戊烯基的二苯并氧杂环庚酮5R-Arugosin K、5S-Arugosin K、Arugosin N和CAS:160585-91-1的化合物在2016年曾从同属不同种的另一种中分离到，但该文章未做生物活性分析[Molecules,2016,21, 1184-1195]。化合物“Arugosin K”在另一文献中出现相同名称[Journal of Antibiotics,2017,70(2),174-178]，但结构不是我们分离得到的二苯并氧杂环庚酮Arugosin K，按照文章发表顺序，本发明采纳了该论文中结构对应的名称[Molecules,2016,21,1184-1195]。专利号为JP06271561的日本专利申请公开了分离自真菌青霉中的化合物(CAS: 160585-91-1)具有抑制白血病细胞HL-60活性(IC50为5μg/mL)，但未涉及任何抗菌活性研究。因此本专利是首次发现海洋真菌柄篮状菌具有高效抗副溶血性弧菌活性，并首次发现其二次代谢产物“含异戊烯基的二苯并氧杂环庚酮类化合物”具有显著抗副溶血性弧菌活性，并对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureusATCC29213)和屎肠球菌(Enterococcus faecium ATCC35667) 表现出一定的抗菌活性。
发明内容
目的：本发明提供一种海洋真菌来源的二苯并氧杂环庚酮类化合物及其制备方法和用途。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
本发明目的是获得具有显著抗副溶血性弧菌活性的海洋真菌，并从中分离鉴定到具有高效抑制副溶血性弧菌活性的含异戊烯基的二苯并氧杂环庚酮类化合物，进一步抗菌实验分析发现该类化合物对枯草芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和屎肠球菌也有一定的抑制活性。
本发明从采自山东威海附近海域的近海底泥中分离海洋真菌(采样时间为2015年10月)，采用滤纸片法对分离到的菌株发酵产物进行副溶血性弧菌抑制活性筛选，发现具有显著抑制副溶血性弧菌活性的菌株WH4-2，滤纸片法初筛显示其发酵液粗提物在 150μg/片时对测试菌有显著地抑制作用。ITS全序列分析(上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序分析)，发现菌株WH4-2与柄篮状菌Talaromyces stipitatus的相似性达98％，综合其菌落形态以及后期分离得到的化合物结构特征鉴定菌株WH4-2为柄篮状菌。GenBank序列号为MG877637。对该菌株进行规模化发酵，提取物经硅胶减压柱色谱，二氯甲烷洗脱下来的Fr.A在150μg/片时对副溶血性弧菌有显著地抑制作用。Fr.A 经硅胶常压柱色谱，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，其中石油醚：乙酸乙酯＝30:1洗脱下来的Fr.A-1和石油醚：乙酸乙酯＝3:1洗脱下来的Fr.A-5为抗副溶血性弧菌活性组分。 Fr.A-1经半制备HPLC纯化，流动相甲醇：水＝90:10得到化合物1(TA-4,100.0mg)。 Fr.A-5经半制备HPLC纯化，甲醇：水＝80:20得化合物2(TA-7,100.0mg)。化合物1 和化合物2都是含异戊烯基的二苯并氧杂环庚酮类化合物，化合物1是5R-Arugosin K 和5S-Arugosin K对映异构体的混合物，化合物2是Arugosin N和其异构体(CAS: 160585-91-1)的混合物。运用微量稀释法发现化合物1和化合物2的最小抑制浓度MIC 值分别为12.5和3.13μg/mL。进一步抗菌实验分析，发现化合物2对枯草芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和屎肠球菌表现出一定的抑制活性，最小抑制浓度MIC值分别为3.13,12.5和12.5μg/mL。
柄篮状菌WH4-2(Talaromyces stipitatus)2018年1月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏号为CGMCC NO.15280。
有益效果：本发明分离得到的海洋真菌具有高效抗副溶血性弧菌活性，制备得到的二苯并氧杂环庚酮类化合物，化合物1和化合物2的最小抑制浓度MIC值分别为12.5 和3.13μg/mL。该菌株活性成分的产量较大(5.0mg/L)，有望应用于抗副溶血性弧菌的药物开发。化合物2对枯草芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和屎肠球菌表现出一定的抑制活性，最小抑制浓度MIC值分别为3.13,12.5和12.5μg/mL，有望应用于广谱抗菌药物的开发。
附图说明
图1为菌株WH4-2的菌落特征图；
图2为化合物1的1H NMR谱图；
图3为化合物1的APT谱图；
图4为化合物1的HSQC谱图；
图5为化合物1的HMBC谱图；
图6为化合物1的HR-ESI-MS谱图；
图7为化合物2的1H NMR谱图；
图8为化合物2的HR-ESI-MS谱图。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
样品采集：2015年10月在山东威海附近海域的近海采集底泥样品，存放于无菌瓶中。
1菌株WH4-2的分离与培养
采用涂布稀释法。取底泥样品10mL，置于50mL的小烧杯中，加入10mL无菌海水充分混匀，静置10分钟。取其上清1mL用无菌水稀释10倍做为梯度对照。用移液枪分别取上清母液和其稀释10倍液各0.2mL加入含有抗生素的PDA(土豆200g/L, 葡萄糖20g/L、海盐30g/L和琼脂18g/L)和孟加拉红平板中，用涂布器十字涂布。每种培养基的每个浓度梯度分别做3个平行。用封口膜封好，于28℃的真菌培养箱中倒置培养2-3w。从培养的第3天开始观察真菌生长情况，每天观察3次，早中晚各观察一次，发现有新的菌落长出，用无菌竹签将其点接种到另一新的平板上，28℃恒温箱倒置培养 4-5d，重复以上过程直至获得菌落特征单一的单菌落。1000mL锥形瓶中装入500mL 的PDB(PDA配方中不加琼脂)液体培养基，高温灭菌，将分离到的菌株WH4-2和其它22株菌株从平板上用镊子挑取适量，分别接种到PDB养基中(每株菌接种2瓶)， 28℃，静置培养40d，获得发酵液1L。用含有5％丙酮的乙酸乙酯液萃取两次，收集乙酸乙酯，减压浓缩得粗提物375mg。
2抗菌活性筛选(滤纸片法)
将灭菌后的LB固体培养基(酵母膏5g，胰蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，纯水1000 mL，固体培养基加入18g琼脂粉)倒入培养皿中，将过夜液体培养后的副溶血性弧菌均匀涂布到固体培养基上，用甲醇将粗提物配制成浓度为50mg/mL的溶液，吸取3μL (即150μg/片)滴加到直径为6mm滤纸片上，挥干溶剂，将加药面贴服于培养基上，每个样品做两组平行，将贴好滤纸片的培养皿封口后置于28℃恒温培养箱中倒置培养 18-24h，测量抑菌圈直径达15mm。
3菌株WH4-2的鉴定
在PDA固体培养基上，菌落正面呈黄白色，菌丝体短，边缘呈轮纹状，菌落背面呈橘黄色(见图1)。测定了菌的ITS全序列分析(上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序分析)，序列进行BLAST检索，应用MEGA5软件，分析并构建系统进化树，并进行了1000次bootstraps检验，发现菌株WH4-2与柄篮状菌的相似性达98％。结合后面分离鉴定的化合物结构类型，鉴定菌株WH4-2为柄篮状菌，GenBank序列号为 MG877637。
4菌株规模化发酵
从-80℃超低温冰箱中取出保种的菌株，放置至室温，夹出含有菌丝的菌块，贴放于PDA培养基上，28℃倒置培养3-5d，获得纯菌落。250mL锥形瓶中装入100ml的 PDB液体培养基，120℃高温灭菌，接种适量复苏好的菌落，摇床28℃，120r/min振荡培养3d，获得种子液。1000mL锥形瓶中装入400ml的PDB液体培养基，高温灭菌，按照1:40的接种量加入种子液，接种100瓶，28℃，静置培养40d，获得发酵液约40 升。
5活性导向分离
发酵液过滤，收集培养液40L，用含有5％丙酮的乙酸乙酯液萃取2次，收集乙酸乙酯，减压浓缩得总浸膏18g，采用滤纸片法进行抗菌活性分析，抑菌圈直径15mm(150 μg/片)。浸膏经硅胶减压柱色谱，以氯仿/甲醇系统梯度洗脱，得到12个组分，其中二氯甲烷洗脱下来的Fr.A(1.5g)表现出强抑制活性，抑菌圈直径达19mm(150μg/片)。Fr.A 经硅胶常压柱色谱，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，得到5个组分，其中石油醚：乙酸乙酯＝30:1洗脱下来的Fr.A-1(400mg)和石油醚：乙酸乙酯＝3:1洗脱下来的Fr.A-5(200mg) 为抗菌活性组分，Fr.A-1和Fr.A-5抑菌圈直径分别为10和25mm(150μg/片)。Fr.A-1 经半制备HPLC纯化，流动相甲醇：水＝90:10得到化合物1(TA-4,100.0mg)。Fr.A-5 经半制备HPLC纯化，甲醇：水＝80:20得化合物2(TA-7,100.0mg)。
2.6化合物1和化合物2的结构鉴定
综合运用多种光谱法[核磁共振谱氢谱(1H NMR)、质子连接实验(APT)、氢同核化学位移相关谱(1H-1H COSY)、异核单量子相关谱(HSQC)、异核多键相关谱(HMBC)，高分辨质谱(HRESIMS)]，结合文献比对确定化合物1和化合物2均为含异戊烯基的二苯并氧杂环庚酮类化合物。其中化合物1(5R-Arugosin K和5S-Arugosin K)是一对对映异构体的混合物。化合物2(Arugosin N和CAS:160585-91-1)是一对互变异构体的混合物，HPLC不可分离，其互变原因是这两个化合物结构中都存在着不稳定的半缩醛(C-5) 片段，半缩醛开环，连接异戊烯基的苯环(A环)可通过C11-C12键发生旋转，当A环上间位的两个羟基(C-6和C-10)位置互换时，旋转过来的羟基又可以与C-5位进行羟醛缩合，形成其异构体(Molecules,2016,21,1184-1195)。化合物1和化合物2的光谱数据如下：
5R(S)Arugosin K,0°(c 0.5,CDCl3)，HRESI-MS m/z：377.1376[M+Na]+(calc.377.1359)。1H NMR(600MHz,CDCl3):δH 13.63(1H,s,10-OH),11.46(1H,s,14-OH),7.34(1H,d,J＝8.2Hz,H-8),6.94(1H,s,H-3),6.87(1H,s,H-15),6.57(1H,d,J＝8.2Hz, H-7),5.65(1H,s,H-5),5.24(1H,brt,J＝7.2Hz,H-2’),3.57(3H,s,5-OCH3),3.33(2H,d, J＝7.2Hz,H-1’),2.38(3H,s,H-1),1.77(3H,s,H-4’),1.73(3H,s,H-5’)。13C NMR(100 MHz,CDCl3):δC 197.6(C-12,C),162.9(C-10,C),162.5(C-14,C),154.7(C-6,C),147.3 (C-2,C),138.6(C-4,C),137.8(C-8,CH),133.4(C-3’,C),125.0(C-9,C),121.9(C-2’,CH),119.7(C-15,CH),117.0(C-3,CH),117.0(C-13,C),113.8(C-9,C),109.4(C-7,CH),103.5(C-5,CH),57.1(5-OCH3),28.0(C-1’,CH2),26.0(C-4’,CH3),22.0(C-1,CH3),17.9(C-5’,CH3)。
CAS:160585-91-1,HRESI-MS m/z：363.1206[M+Na]+(calc.363.1203)。1H NMR(600MHz,CDCl3):δH 13.61(1H,s,10-OH),11.54(1H,s,14-OH),7.32(1H,d,J＝8.2Hz, H-8),7.04(1H,s,H-3),6.89(1H,s,H-15),6.87(1H,s,H-15),6.53(1H,d,J＝8.2Hz,H-7),6.12(1H,s,H-5),5.31(1H,brt,J＝7.2Hz,H-2’),3.33(2H,d,J＝7.2Hz,H-1’),2.40(3H,s,H-1),1.76(3H,s,H-4’),1.72(3H,s,H-5’)。
Arugosin N,HRESI-MS m/z：363.1206[M+Na]+(calc.363.1203)。1H NMR(600MHz,CDCl3):δH 12.95(1H,s,6-OH),11.82(1H,s,14-OH),7.34(1H,d,J＝8.2Hz,H-8),7.07(1H,s,H-3),6.89(1H,s,H-15),6.71(1H,d,J＝8.2Hz,H-7),6.11(1H,s,H-5),5.24(1H,brt, J＝7.2Hz,H-2’),3.36(1H,m,H-1’a),3.32(1H,m,H-1’b),2.40(3H,s,H-1),1.76(3H,s, H-4’),1.74(3H,s,H-5’)。
2.7化合物1和化合物2抗菌活性测试(微量稀释法)
将备好的细菌种子培养液稀释为原来浓度的1:800。取96孔微量稀释板，在板的第一排加198μL菌液后加2μL样品，其他孔加100μL菌液，吸100μL第一排中混匀的样品及菌液，依次往下加，作二倍递减浓度稀释，最后每个孔补齐200μL，每个浓度设三个平行。设氨苄青霉素钠阳性对照，培养基空白对照组以及DMSO阴性对照，置28℃培养18-24h，用酶标仪600nm测吸光度，获得抑制率和最小抑菌浓度(MIC)。
体外抗菌实验发现化合物1和化合物2对副溶血性弧菌的抑制活性显著，MIC值分别为12.5和3.13μg/mL。发现化合物2对枯草芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和屎肠球菌表现出一定的抑制活性，最小抑制浓度MIC值分别为3.13,12.5和12.5μg/mL。
实施例1
2-(1-羟基正戊基)苯甲酸(III)的合成：
将1.24g(6.5mmol)NBP溶于10mL甲醇中，加入10mL 2M NaOH溶液，回流搅拌0.5h，减压蒸除甲醇，加10mL蒸馏水稀释，冷却至-5℃，剧烈搅拌下用5％稀盐酸酸化至pH 2-3，乙醚(15mL×3)萃取，未经任何纯化直接投入下一步反应。
实施例2
2-(1-乙酰基正戊基)苯甲酸的合成：
将上述含有III的乙醚溶液用200mL二氯甲烷稀释，分别加入2.7mL(19.6mmol) 三乙胺，0.5g DMAP，-10℃下滴加1.4mL(19.6mmol)乙酰氯，滴毕于-10℃下搅拌5h，加入10mL水，室温搅拌0.5h，分出有机层，Na2SO4干燥，过滤，浓缩得腊状固体，正己烷重结晶，得白色针状晶体1.06g，收率65％。mp 65-66℃.MS(ESI):m/z 249.1[M -H]-.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.93(t,3H,CH3,J＝8.5Hz),1.37–1.42(m,4H, 2×CH2),1.88–1.91(m,2H,CH2),2.13–2.33(m,3H,COCH3),6.61–6.72(m,1H,OCHCH2), 7.37–7.40(m,1H,ArH),7.56–7.62(m,2H,ArH),8.05(d,1H,ArH,J＝8.1Hz),10.98(brs, 1H,COOH).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ172.0,166.5,140.8,133.1,130.3,130.0,127.1, 125.7,74.8,41.0,36.3,27.8,22.4,13.8。
实施例3
2-(1-乙酰基正戊基)苯甲酸的基础上偶联二醇的一个代表性中间体V1的合成：
将2-(1-乙酰基正戊基)苯甲酸(2.50g,10.0mmol)溶于无水二氯甲烷(50mL)中，加入 EDAC(2.29g,12.0mmol)和催化量DMAP，室温搅拌0.5h，再加入乙二醇(0.62g,10.0mmol),室温搅拌5h，过滤，减压浓缩，经柱层析[石油醚:乙酸乙酯(v:v)＝30:1]得油状物1.71g，收率58％。MS(ESI):m/z 317.1[M+Na]+.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.807(t, 3H,CH3,J＝7.0Hz),1.181-1.356(m,4H,2×CH2),1.730-1.777(m,2H,CH2),1.965(s,3H, COCH3),3.823-3.862(m,2H,CH2),4.269-4.474(m,2H,CH2),5.206(s,1H,OH),6.452(t, 1H,COOCH,J＝6.7Hz),7.197-7.265(m,1H,ArH),7.441-7.444(m,2H,ArH),7.750-7.777 (m,1H,ArH).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ170.90,167.51,142.37,132.15,129.94,129.34, 127.39,126.46,72.79,67.05,60.88,36.32,27.90,22.42,21.18,13.92。
实施例4
2-(1-乙酰基正戊基)苯甲酸的基础上偶联二胺的代表性中间体V3的合成：
将2-(1-乙酰基正戊基)苯甲酸(2.50g,10.0mmol)溶于无水二氯甲烷(50mL)中，加入EDAC(2.29g,12.0mmol)和催化量DMAP，室温搅拌0.5h，再加入辛二胺(1.44g,10.0mmol),室温搅拌8h，过滤，减压浓缩，经柱层析[二氯甲烷:甲醇(v:v)＝10:1]得油状物1.92g，收率51％。
实施例5
替米沙坦偶联二胺的一个代表性中间体VI3的合成
将替米沙坦(2.57g,5.0mmol)溶于无水二氯甲烷(200mL)中，加入EDAC(1.15g,6.0mmol)和催化量DMAP，室温搅拌0.5h，再加入辛二胺(1.44g,10.0mmol),室温搅拌5h，过滤，减压浓缩，经柱层析[二氯甲烷:甲醇(v:v)＝30:1]得白色固体1.48g，收率 46％。mp:113℃.MS(ESI):m/z641.4[M+H]+.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.799(t,3H, CH3,J＝6.8Hz),0.943-1.058(m,8H,4×CH2),1.506(m,4H,2×CH2),1.728-1.798(m,2H,CH2), 2.374(s,3H,CH3),2.731(t,2H,NH2CH2,J＝7.2Hz),2.839(t,2H,CH2,J＝7.7Hz),3.137(t,2H, NHCH2,J＝6.1Hz),3.728(s,3H,NCH3),5.398(s,2H,NCH2),7.015(s,1H,ArH),7.041(s,1H, ArH),7.204(m,4H,ArH),7.251-7.312(m,6H,ArH),7.405(m,1H,NH),7.468-7.491(m,1H, ArH),7.670-7.698(m,1H,ArH).13C NMR(75MHz,CDCl3):169.59,159.58,154.56,143.08,142.47,140.04,138.58,136.45,136.05,135.33,135.08,130.12,129.99,129.44,129.31,128.42,127.69,126.40,123.69,122.71,122.52,119.29,109.63,109.02,56.14,43.98,39.66, 35.15,31.90,31.81,29.70,29.33,26.41,26.36,22.66,16.94,14.08。
实施例6
2-O-{2-[(1-乙酰氧基)正戊基]苯甲酰基}乙二醇替米沙坦酯(I1)的合成。
将上述中间体V1(1.47g,5.0mmol)溶于无水二氯甲烷(30mL)中，加入EDAC(1.15g,6.0mmol)和催化量DMAP，室温搅拌0.5h，再加入替米沙坦(2.57g,5.0mmol)，室温搅拌8h，过滤，减压浓缩，经柱层析[二氯甲烷:甲醇(v:v)＝50:1]得白色固体1.69g，收率43％。mp:82-83℃.MS(ESI):m/z 791.4[M+H]+,813.4[M+Na]+.1H NMR(300MHz, CDCl3):δ0.772(m,3H,CH3),0.989(m,3H,CH3),1.181(m,4H,2×CH2),1.712(m,2H, CH2),1.808(m,2H,CH2),1.973(s,3H,ArCH3),2.691(s,3H,COCH3),2.871(m,2H, NCNCH2),3.716(s,3H,NCH3),3.973-4.310(m,4H,2×OCH2),5.369(s,2H,NCH2),6.478 (m,1H,OCH),6.948(s,1H,ArH),7.023(s,1H,ArH),7.120-7.302(m,7H,ArH), 7.323-7.423(m,5H,ArH),7.722-7.796(m,3H,ArH).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ169.19, 167.27,165.83,156.09,154.24,143.63,142.67,142.37,141.70,140.76,136.14,134.49, 132.12,131.09,130.26,130.01,129.73,129.58,128.97,128.49,126.94,126.65,125.60, 125.32,123.44,121.97,121.80,119.02,109.04,108.53,72.35,62.25,61.78,46.50,36.10, 31.29,29.29,27.57,21.98,21.45,20.68,16.41,13.59,13.50。
实施例7
4-O-{2-[(1-乙酰氧基)正戊基]苯甲酰基}丁二醇替米沙坦酯(I2)的合成
参照实施例5的方法，将中间体(1.61g,5.0mmol)和替米沙坦(2.57g,5.0mmol)反应，经柱层析得到白色固体1.84g，收率45％。mp:83℃.MS(ESI):m/z 819.5[M+H]+，841.4[M+Na]+.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.779(t,2H,CH3,J＝6.9Hz),0.855(t,1H,CH3, J＝7.1Hz),0.963(t,3H,CH3,J＝7.3Hz),1.160-1.304(m,4H,2×CH2),1.495(m,2H,CH2),1.725-1.826(m,4H,2×CH2),1.952(s,3H,ArCH3),2.676(s,3H,COCH3),2.847(t,2H,NCNCH2,J＝7.8Hz),3.671(s,3H,NCH3),3.926-4.078(m,4H,2×OCH2),5.339(s,2H, NCH2),6.438(q,1H,OCH,J＝4.9Hz),7.011(m,2H,ArH),7.149-7.413(m,14H,ArH), 7.695-7.741(m,3H,ArH).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ156.49,143.71,141.73,141.29, 136.64,134.99,134.87,132.30,131.36,131.25,130.76,130.63,130.13,129.93,129.85, 129.46,129.07,127.41,127.11,126.15,126.02,125.83,123.90,122.51,122.33,119.49,109.55,108.98,72.86,64.44,64.38,47.04,36.60,31.80,29.81,28.08,25.19,25.08,22.49, 21.87,21.18,16.91,14.10,14.01。
实施例8
8-N-{2-[(1-乙酰氧基)正戊基]苯甲酰基}辛二胺替米沙坦酰胺(I3)的合成
参照实施例5的方法，将中间体(1.88g,5.0mmol)和替米沙坦(2.57g,5.0mmol)反应，经柱层析得到白色固体1.78g，收率41％。mp:94-95℃.MS(ESI):m/z 873.6[M+H]+，895.6[M+Na]+.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.723(t,3H,CH3,J＝7.2Hz),0.917(t,3H, CH3,J＝7.3Hz),1.130(m,8H,4×CH2),1.157(m,4H,2×CH2),1.212(m,2H,CH2), 1.414-1.459(m,2H,CH2),1.670-1.775(m,4H,2×CH2),1.912(s,3H,ArCH3),2.636(s,3H, COCH3),2.786(t,2H,NCNCH2,J＝7.8Hz),2.956(q,2H,NHCH2,J＝6.6Hz),3.266(q, 2H,NHCH2,J＝6.8Hz),3.666(s,3H,NCH3),5.302(s,2H,NCH2),5.710(q,1H,OCH,J＝ 5.7Hz),6.954(s,1H,ArH),6.981(s,1H,ArH),7.134-7.157(m,5H,ArH),7.210-7.263(m, 9H,ArH),7.289(m,1H,NH),7.340(m,1H,NH),7.433-7.458(m,1H,ArH),7.603-7.632(m, 1H,ArH).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ171.16,169.02,168.61,155.93,154.05,142.60, 142.16,139.55,138.00,137.87,136.06,135.62,135.58,134.72,134.53,129.56,129.49, 128.93,128.82,127.97,127.40,127.20,127.16,125.85,125.25,123.33,122.10,121.89, 118.88,109.09,108.48,73.78,46.49,39.40,39.26,36.26,31.42,31.33,30.93,29.68,29.29,29.19,28.86,28.59,28.51,27.17,26.39,26.12,21.82,21.33,20.72,16.44,13.60,13.38。
实施例9
5-O-{2-[(1-乙酰氧基)正戊基]苯甲酰基}戊二醇替米沙坦酯(I4)的合成
参照实施例5的方法，将中间体(1.68g,5.0mmol)和替米沙坦(2.57g,5.0mmol)反应，经柱层析得到白色固体1.98g，收率48％。mp:78-79℃.MS(ESI):m/z 833.5[M+H]+,855.5[M+Na]+.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.786(t,3H,CH3,J＝6.9Hz),0.964(t,3H, CH3,J＝7.4Hz),1.223-1.256(m,6H,3×CH2),1.345-1.393(m,2H,CH2),1.571(t,2H,CH2, J＝7.4Hz),1.707-1.802(m,4H,2×CH2),1.955(s,3H,ArCH),32.681(s,3H,COCH3), 2.849(t,2H,NCNCH2,J＝7.8Hz),3.686(s,3H,NCH3),3.958(t,2H,OCH2,J＝6.5Hz), 4.132(t,2H,OCH2,J＝6.6Hz),5.356(s,2H,NCH2),6.448(q,1H,OCH,J＝4.7Hz),6.995 (s,1H,ArH),7.022(s,1H,ArH),7.140-7.205(m,6H,ArH),7.240-7.314(m,2H,ArH), 7.349-7.416(m,5H,ArH),7.696-7.754(m,3H,ArH).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ169.82, 167.74,166.41,155.98,154.16,143.15,142.63,142.31,141.25,140.78,136.13,134.50, 134.28,131.74,130.82,130.27,129.65,129.40,128.95,128.57,126.90,126.59,125.64,125.47,125.33,123.37,123.33,122.03,121.85,119.00,109.05,108.49,72.38,64.34,64.21, 46.56,36.12,31.32,29.32,27.68,27.58,27.48,22.00,21.93,21.37,20.69,16.42,13.61, 13.52。
实施例10
6-O-{2-[(1-乙酰氧基)正戊基]苯甲酰基}己二醇替米沙坦酯(I5)的合成
参照实施例5的方法，将中间体(1.75g,5.0mmol)和替米沙坦(2.57g,5.0mmol)反应，经柱层析得到白色固体1.82g，收率43％。mp:82-83℃.MS(ESI):m/z 847.5[M+H]+，869.5[M+Na]+.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.796(m,3H,CH3),0.973(t,3H,CH3,J＝ 7.2Hz),1.176-1.256(m,10H,5×CH2),1.600(m,2H,CH2),1.757-1.806(m,4H,2×CH2), 1.966(s,3H,ArCH3),2.687(s,3H,COCH3),2.849(t,2H,NCNCH2,J＝7.7Hz),3.702(s, 3H,NCH3),3.939-3.961(m,2H,OCH2),4.169(m,2H,OCH2),5.349(s,2H,NCH2),6.443 (q,1H,OCH),7.001-7.026(m,2H,ArH),7.154-7.203(m,8H,ArH),7.302-7.405(m,5H, ArH),7.720-7.775(m,3H,ArH).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ169.81,167.77,166.47, 155.97,154.15,143.08,142.64,142.30,141.25,140.80,136.13,134.52,134.22,131.68, 130.79,130.35,130.25,129.66,129.38,128.96,128.58,126.90,126.59,125.61,125.42,123.35,122.04,121.86,119.01,109.04,108.49,72.42,64.55,64.37,46.56,36.14,31.34, 29.24,28.03,27.73,27.59,25.12,25.05,22.01,21.37,20.69,16.42,13.61,13.52。
实施例11
8-O-{2-[(1-乙酰氧基)正戊基]苯甲酰基}辛二醇替米沙坦酯(I6)的合成
参照实施例5的方法，将中间体(1.89g,5.0mmol)和替米沙坦(2.57g,5.0mmol)反应，经柱层析得到白色固体1.96g，收率45％。mp:83-84℃.MS(ESI):m/z 875.6[M+H]+,897.5[M+Na]+.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.806(t,3H,CH3,J＝6.8Hz),0.981(t,3H, CH3,J＝7.3Hz),1.179-1.237(m,8H,4×CH2),1.452-1.474(m,6H,3×CH2),1.627-1.695(m, 2H,CH2),1.722-1.843(m,4H,2×CH2),1.980(s,3H,ArCH3),2.692(s,3H,COCH3),2.861 (t,2H,NCNCH2,J＝7.8Hz),3.712(s,3H,NCH3),3.931(t,2H,OCH2,J＝6.4Hz),4.204(t, 2H,OCH2,J＝6.6Hz),5.364(s,2H,NCH2),6.455(q,1H,OCH,J＝4.6Hz),7.001-7.027(m, 2H,ArH),7.158-7.286(m,8H,ArH),7.337-7.418(m,5H,ArH),7.703-7.797(m,3H,ArH). 13C NMR(75MHz,CDCl3):δ169.81,167.79,166.55,155.97,154.15,143.12,142.60, 141.24,140.81,136.11,134.51,134.16,131.63,130.77,130.40,130.24,129.69,129.37,128.95,128.59,126.89,126.58,125.59,125.38,123.39,122.04,121.86,119.02,109.02,108.50,72.47,64.75,64.54,62.40,46.59,36.15,32.24,31.33,29.33,28.85,28.63,28.55, 25.45,25.17,22.02,21.37,20.70,16.42,13.61,13.52。
实施例12
6-N-{2-[(1-乙酰氧基)正戊基]苯甲酰基}己二胺替米沙坦酰胺(I7)的合成
参照实施例5的方法，将中间体(1.74g,5.0mmol)和替米沙坦(2.57g,5.0mmol)反应，经柱层析得到白色固体1.69g，收率40％。mp:96-98℃.MS(ESI):m/z 845.6[M+H]+，867.5[M+Na]+.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.768(m,3H,CH3),0.970(t,3H,CH3,J＝ 7.2Hz),1.181(m,10H,5×CH2),1.417(m,2H,CH2),1.776-1.801(m,4H,2×CH2),1.936(s, 3H,ArCH3),2.645(s,3H,COCH3),2.843(t,2H,NCNCH2,J＝7.6Hz),3.013-3.032(m,2H, NHCH2),3.259-3.279(m,2H,NHCH2),3.751(s,3H,NCH3),5.365(s,2H,NCH2),5.749(m, 1H,OCH),7.022-7.046(m,2H,ArH),7.195-7.218(m,6H,ArH),7.299-7.328(m,9H,ArH), 7.423(m,1H,NH),7.501-7.524(m,1H,NH),7.4674(m,1H,ArH).13C NMR(75MHz, CDCl3):δ171.17,169.04,168.62,155.97,154.09,142.63,142.17,139.57,137.94,136.08, 135.64,135.52,134.78,134.58,129.62,129.51,128.95,128.84,127.98,127.39,127.23,127.12,125.89,125.29,123.29,122.11,121.92,118.92,109.09,108.50,73.75,46.50,39.17, 39.04,36.28,31.37,29.19,28.79,28.43,27.17,25.87,25.68,21.83,21.33,20.69,16.44, 13.60,13.38。
实施例13
4-N-{2-[(1-乙酰氧基)正戊基]苯甲酰基}丁二胺替米沙坦酰胺(I8)的合成
参照实施例5的方法，将中间体(1.60g,5.0mmol)和替米沙坦(2.57g,5.0mmol)反应，经柱层析得到白色固体1.88g，收率46％。mp:97-99℃.MS(ESI):m/z 817.5[M+H]+,839.5[M+Na]+.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.743-0.766(m,3H,CH3),0.974(t,3H,CH3, J＝7.3Hz),1.834-1.260(m,12H,6×CH2),1.835(s,3H,ArCH3),2.696(s,3H,COCH3), 2.856(t,2H,NCNCH2,J＝7.7Hz),3.097(m,4H,2×NHCH2),3.748(s,3H,NCH3),5.382(s, 2H,NCH2),5.903(m,1H,OCH),6.998-7.024(m,2H,ArH),7.191-7.215(m,6H,ArH), 7.280(m,9H,ArH),7.474(m,2H,2×NH),7.638(m,1H,ArH).13C NMR(75MHz,CDCl3): δ170.96,169.22,168.62,156.16,153.91,142.70,139.66,138.30,138.08,135.84,135.30, 134.74,129.57,129.33,129.03,128.89,127.87,127.25,127.10,126.84,125.78,125.46, 123.27,122.29,121.15,118.69,109.14,108.70,73.52,46.47,38.76,38.52,36.16,31.35,29.16,27.14,26.21,25.69,21.78,21.27,20.52,16.38,13.54,13.31。
实施例14
发酵4升，获1.5克活性发酵产物，进一步分离得化合物1(11mg)和化合物2(8.5mg)，化合物1和化合物2的MIC值分别为12.5和3.13μg/mL。
(1)菌株规模化发酵
250mL锥形瓶中装入100ml的PDB液体培养基，120℃高温灭菌，接种适量菌落，摇床28℃，120r/min振荡培养3d，获得种子液。1000mL锥形瓶中装入400ml的PDB 液体培养基，高温灭菌，按照1:40的接种量加入种子液，接种10瓶，28℃，静置培养 40d，获得发酵液约4升。
(2)抗菌活性测试(滤纸片法)
将灭菌后的LB固体培养基倒入培养皿中，将过夜液体培养后的副溶血性弧菌均匀涂布到固体培养基上，用甲醇将样品配制成浓度为50mg/mL的溶液，吸取3μL(即150 μg/片)滴加到直径为6mm滤纸片上，挥干溶剂，将加药面贴服于培养基上，每个样品做两组平行，将贴好滤纸片的培养皿封口后置于28℃恒温培养箱中倒置培养18-24h，测量抑菌圈直径达14.5mm。
(3)分离和结构鉴定
培养液4L，过滤，滤液用含有5％丙酮的乙酸乙酯液萃取2次，收集乙酸乙酯，减压浓缩得总浸膏1.5g。浸膏经硅胶减压柱色谱，以氯仿/甲醇系统梯度洗脱，其中二氯甲烷洗脱下来的Fr.A(160mg)经硅胶常压柱色谱，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，其中石油醚：乙酸乙酯＝30:1洗脱下来的Fr.A-1(50mg)和石油醚：乙酸乙酯＝3:1洗脱下来的 Fr.A-5(25mg)为目标组分。Fr.A-1经半制备HPLC纯化，流动相甲醇：水＝90:10得化合物1(TA-4,11mg)，Fr.A-5经半制备HPLC纯化，甲醇：水＝80:20得化合物2(TA-7,8.5 mg)，鉴定结果同前。
(4)化合物1和化合物2抗菌活性测试(微量稀释法)
将备好的细菌种子培养液稀释为原来浓度的1:800。取96孔微量稀释板，在板的第一排加198μL菌液后加2μL样品，其他孔加100μL菌液，吸100μL第一排中混匀的样品及菌液，依次往下加，作二倍递减浓度稀释，最后每个孔补齐200μL，每个浓度设三个平行。设氨苄青霉素钠阳性对照，培养基空白对照组以及DMSO阴性对照，置28℃培养18-24h，用酶标仪600nm测吸光度，获最小抑菌浓度。体外抗菌实验发现化合物 1和化合物2对副溶血性弧菌的抑制活性显著，MIC值分别为12.5和3.13μg/mL。化合物2对枯草芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和屎肠球菌的MIC值分别为3.13,12.5 和12.5μg/mL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一株海洋真菌WH4-2，其特征在于，该菌株2018年1月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏号为CGMCC NO.15280。
2.根据权利要求1所述的海洋真菌WH4-2，其特征在于，制备方法为：从采自山东威海附近海域的近海底泥中分离海洋真菌，采用滤纸片法对分离到的菌株发酵产物进行副溶血性弧菌抑制活性筛选，发现具有显著抑制副溶血性弧菌活性的菌株WH4-2，滤纸片法初筛显示菌株WH4-2发酵液粗提物在150μg/片时对测试菌有显著地抑制作用。
3.二苯并氧杂环庚酮类化合物，其特征在于，为通式I所示的化合物或其对映异构体或位置异构的同分异构体的混合物；化合物结构式如式I所示；
其中：R1为OH或OCH3；R2为异戊烯基，异戊烯基的取代位为C-7位或C-9位；C-5位为S构型或R构型。
4.根据权利要求3所述的二苯并氧杂环庚酮类化合物，其特征在于，制备方法为：将菌株WH4-2利用发酵培养基进行规模化发酵，提取物经硅胶减压柱色谱，二氯甲烷洗脱下来的Fr.A在150μg/片时对副溶血性弧菌有显著地抑制作用；
Fr.A经硅胶常压柱色谱，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，其中石油醚：乙酸乙酯＝30:1洗脱下来的Fr.A-1和石油醚：乙酸乙酯＝3:1洗脱下来的Fr.A-5为抗副溶血性弧菌活性组分；
Fr.A-1经半制备HPLC纯化，流动相甲醇：水＝90:10得到化合物1；
Fr.A-5经半制备HPLC纯化，甲醇：水＝80:20得化合物2。
5.根据权利要求3所述的二苯并氧杂环庚酮类化合物，其特征在于：化合物1是5R-Arugosin K和5S-Arugosin K对映异构体的混合物；
6.根据权利要求3所述的二苯并氧杂环庚酮类化合物，其特征在于：化合物2是Arugosin N和其异构体CAS:160585-91-1的混合物；
7.根据权利要求3所述的二苯并氧杂环庚酮类化合物，其特征在于：化合物1和化合物2均具有抑制副溶血性弧菌活性；化合物1的最小抑制浓度MIC值为12.5μg/mL；化合物2的最小抑制浓度MIC值为3.13μg/mL。
8.一种药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求3所述的通式I化合物或其旋光异构体、对映体、非对映体、外消旋体或外消旋混合物，或其药学上可接受的盐及可药用的载体、佐剂或媒剂。
9.权利要求1-3任一项所述的化合物在制备治疗抗副溶血性弧菌及抗枯草芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和屎肠球菌活性有关的疾病的药物中的应用。
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