CN114014832A - 盘毛孢菌酮化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了盘毛孢菌酮化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用。本发明从Pestalotiopsis trachicarpicola SC‑J551菌株发酵物中分离纯化得到3个Pestalone型二苯甲酮新化合物盘毛孢菌酮A‑C(1–3)。体外抗菌活性测试和细胞毒试验结果表明，盘毛孢菌酮A‑C(1–3)对金黄色葡萄球菌(SA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、屎肠球菌(VSE)和耐万古霉素屎肠球菌(VRE)有良好的抗菌作用，对哺乳动物正常细胞株Vero无细胞毒。盘毛孢菌酮A‑C(1–3)的新颖结构、对包括MRSA和VRE在内的革兰氏阳性菌的较强活性、对非靶标细胞的良好安全性使其具有成为新型抗菌药物的研发潜力。

Description

盘毛孢菌酮化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一类来自植物内生菌Pestalotiopsistrachicarpicola SC-J551的Pestalone型二苯甲酮新衍生物盘毛孢菌酮(Pestalotinone)化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用。
背景技术：
抗菌素耐药是本世纪人类需要面对的全球性重大卫生挑战之一。WHO于2017年9月发布《临床开发中的抗菌剂：关于抗菌剂(包括抗结核药)的临床开发分析》的报告，强调全球抗菌素濒临枯竭，新抗菌素的开发严重不足，难以应对日益增长的抗菌素耐药菌的威胁。目前进入临床阶段的新抗菌药物大多是原有抗菌素的结构改造产物，这些抗菌素化学结构类型的范围窄、作用机制的局限性是耐药性加剧的原因之一。因此，寻找结构新颖、具有新作用机制的抗菌药物是解决抗菌素耐药问题的根本出路。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)是革兰氏阳性菌中最主要的两种致病菌，SA的耐药菌株-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)引起的感染死亡率比SA高65％。万古霉素曾是治疗MRSA感染的首选药，随着万古霉素的大量使用，主要引起医院内感染的屎肠球菌不断增多，其万古霉素耐药屎肠球菌(Vancomycin-resistant Enterococcus faecium,VRE)也出现剧增，由于高发病率、高致死率和多重耐药性，在2017年WHO发布的对人类健康威胁最大的12类细菌中MRSA和VRE被列为十分重要级别，急切需要研发针对它们的具有新作用机制和新结构的全新抗菌素。
Pestalone型二苯甲酮是一类主要由拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)真菌产生的具有异戊烯基和卤素取代的二苯甲酮衍生物。目前文献和专利报道的该类化合物不到20个(①Cueto M,et al.J Nat Prod.2001；64:1444–1446；②Li E,Jiang L,Guo L,Zhang H,Che Y.Bioorg Med Chem.2008；16:7894–7899；③Wei MY,Li D,Shao CL,Deng DS,WangCY.Mar Drug.2013；11:1050–1060；④Xing Q,et al.RSC Adv.2016；6:22653–22658；⑤Song RY,et al.Phyto Lett.2017；22:189–193；⑥Wang W,et al.J Nat Prod.2019,82:3357–3365；⑦Lei H,Niu H,Song C,Fu X,Luo Y,Chen S,ZhangD.Biochem.Syst.Ecol.2020,91:104072；⑧Wachi Y,Yamashita T,Komatsu K,YoshidaS.JP Patent JKXXAF JP 07061950 A2 19950307,1995.)。其中，Pestalone因在最初的试验中对SA、MRSA和VRE表现出了极强活性而被认为是一种有很高潜力的新型抗菌素先导物(Cueto M,et al.J Nat Prod.2001；64:1444–1446)；但后续研究证实该化合物的抗细菌活性并不突出(Augner D et al.J Nat Prod 2013,76:1519-1522)，而且其在细菌和哺乳动物细胞间无明显选择性，因此不具有成为新型抗菌素的潜力。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一类作用于革兰氏阳性菌而对哺乳动物细胞无毒性的pestalone型二苯甲酮新化合物--盘毛孢菌酮A、B和C(Pestalotinones A–C)。
本发明的Pestalotinones A–C(1–3)属于2-醛基(-CHO)还原为氧甲基(-CH2OR)的Pesatlone衍生物，其化学结构式分别如式(1)所示：
Figure BDA0003338340190000031
体外抗菌活性测试和细胞毒试验结果表明，Pestalotinones A–C(1–3)对金黄色葡萄球菌(SA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、屎肠球菌(VSE)和耐万古霉素屎肠球菌(VRE)表现出良好抗菌活性，而对哺乳动物正常细胞株Vero无细胞毒性(IC50>50μM)。因此Pestalotinones化合物在新型抗菌药物研发上有良好潜力。
本发明的第二个目的旨在提供式(1)所示的Pestalotinones化合物的制备方法，其特征在于所述的Pestalotinones化合物为从拟盘多毛孢属真菌Pestalotiopsistrachicarpicola SC-J551菌株的发酵培养物中提取、分离获得。
具体步骤如下：
将菌株P.trachicarpicola SC-J551活化后进行发酵，发酵培养物用乙酸乙酯提取，乙酸乙酯提取物通过正相硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯从体积比100:0、98:2、90:10、80:20、70:30作为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚-乙酸乙酯体积比70:30洗脱流份通过ODS柱层析，采用甲醇-水混合溶剂作为洗脱剂，从体积比40:60-100:0的梯度进行洗脱，收集甲醇-水体积比80:20的洗脱流份A，收集甲醇-水体积比90:10的洗脱流份B；
流份A再经正相硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯从体积比100:0、95:5、88:12、80:20、70:30、60:40作为洗脱剂进行洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比88:12的洗脱流份为流份1；收集石油醚-乙酸乙酯体积比70:30的洗脱流份为流份2；
流份B再经正相硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯从体积比100:0、95:5、90:10、85:15、80:20、70:30、60:40作为洗脱剂进行洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比85:15的洗脱流份即为流份3。
流份1经过分离纯化得到化合物Pestalone F和Pestalone，流份2经过分离纯化得到化合物3，流份3经过分离纯化得到化合物1和2。
所述的发酵，其发酵培养基是大米培养基，所述的大米培养基是每70mL水中加入大米70g。
本发明的第三个目的是提供P.trachicarpicola SC-J551菌株在制备上述Pestalotinones化合物中的应用。
本发明的第四个目的是提供上述Pestalotinones A–C(1–3)或其药用盐在制备抗菌药物中的应用。
所述的抗菌药物优选为抗金黄色葡萄球菌(SA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、屎肠球菌(VSE)或耐万古霉素屎肠球菌(VRE)的药物。
本发明的第五个目的是提供一种抗菌药物，其特征在于，含有上述任一Pestalotinones化合物或其药用盐作为活性成分。
所述的抗菌药物优选为抗金黄色葡萄球菌(SA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、屎肠球菌(VSE)或耐万古霉素屎肠球菌(VRE)的药物。
本发明的Pestalotiopsis trachicarpicola SC-J551菌株是分离自乌毛蕨科乌毛蕨茎(采自深圳沙头角林场)的植物内生真菌，在抗细菌活性筛选中发现其发酵产物有明确的抗SA和抗MRSA活性，因此对其抗菌活性代谢产物进行了研究。对该菌株用大米固体培养基进行发酵，用乙酸乙酯对发酵培养物进行提取，用正相硅胶柱层析、反相硅胶(ODS)柱层方法对提取物进行分离，最后用半制备HPLC进行纯化，获得了Pestalotinones A–C(1–3)3个新化合物及Pestalone和Pestalone F二个已知化合物。体外抑菌试验结果表明Pestalotinones A–C(1–3)对金黄色葡萄球菌(SA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、屎肠球菌(VSE)和耐万古霉素屎肠球菌(VRE)有良好抑菌活性。其中抗SA和MRSA的活性(MIC：1.25–2.5μg/mL)显著优于已知化合物Pestalone和Pestalone F(MIC：5.0–10.0μg/mL)。体外细胞毒试验显示Pestalotinones A–C(1–3)对哺乳动物正常细胞株Vero无细胞毒(IC50>50.0μM)，而Pestalone和Pestalone F对Vero细胞表现出了较强的毒性(IC50分别为1.7和3.2μM)。比较二个已知化合物与Pestalotinones A–C的结构表明将C-2位醛基还原为氧甲基不仅增强了化合物的抗菌活性，而且极大地降低了化合物对哺乳动物正常细胞的毒性。综上，本发明的Pestalotinones A–C(1–3)化合物结构新颖、对MRSA和VRE等病原菌有良好活性、对哺乳动物细胞无明显毒性，具备成为新型抗菌素的研发潜力。
Pestalotiopsis trachicarpicola SC-J551于2021年10月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510070，保藏编号为：GDMCC No：61978。
具体实施方式：
以下参照具体实施方式来进一步描述本发明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要指出的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述描述，可以进行很多改变和变化。其他任何未违背本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
实验中所用溶剂氯仿、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、正丁醇等均为分析纯，由广州试剂二厂和天津富宇试剂公司生产。薄层硅胶层析板为烟台黄务硅胶开发试验厂生产。柱层析硅胶为青岛海洋化工厂生产(200～300目)。旋转蒸发仪为EYELA N-1001，EYELA A-1000S型循环水真空泵，EYELA CA-1111型低温冷却液循环泵，Tokyo Rikakai Co.Ltd.生产。半制备HPLC：泵为Shimadzu LC-20AT pump、检测器Shimadzu SPD-20A UV/VISdetector、柱子为YMC-Pack ODS-A column(5μm，10×250mm)。高分辨质谱用Bruker maXisQ-TOF mass spectrometer测定。NMR谱用Bruker AVANCE III型超导核磁共振仪测定，以氘代溶剂作标定。各种氘代试剂为美国剑桥公司(CIL)生产。
实施例1
将P.trachicarpicola SC-J551菌株(保藏编号为：GDMCC No：61978)接种到PDA固体培养基上，28℃下培养2天进行活化。取适量上述活化的菌株菌块接种到YMG培养基中(所述的YMG培养基，其配制方法为：将4g葡萄糖、10g麦芽提取物、4g酵母提取物溶于1L水中，灭菌消毒备用)，26℃，150rpm，振荡培养72h得到种子液。然后将上述种子液接种在大米固体培养基(每70mL水中加入大米70g，混合均匀后灭菌所得)上、26℃静置培养24天，得到固体发酵培养物。
将菌株P.trachicarpicola SC-J551采用大米固体培养基发酵，发酵培养物用乙酸乙酯浸提，乙酸乙酯提取物通过正相硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(体积比100:0、98:2、90:10、80:20、70:30)和氯仿-甲醇(体积比100:0、98:2，95:5、90:10、80:20、70:30)混合剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚-乙酸乙酯体积比70:30洗脱流份通过ODS柱层析，采用甲醇-水混合溶剂作为洗脱剂，从体积比40:60-100:0的梯度进行洗脱，收集甲醇-水体积比80:20的洗脱流份A，收集甲醇-水体积比90:10的洗脱流份B。
流份A再经正相硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(体积比100:0、95:5、88:12、80:20、70:30、60:40)混合溶剂作为洗脱剂进行洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比88:12的洗脱流份为流份1；收集石油醚-乙酸乙酯体积比70:30的洗脱流份为流份2；
流份B再经正相硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(体积比100:0、95:5、90:10、85:15、80:20、70:30、60:40)混合溶剂作为洗脱剂进行洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比85:15的洗脱流份即为流份3。
流份1通过半制备高相液相色谱(流速2mL/min，色谱柱为YMC-Pack ODS-A column(5μm，10×250mm I.D.))，以体积分数为60％的乙腈水溶液为流动相分离纯化得到化合物Pestalone F(tR＝89.5min)和Pestalone(tR＝135min)。流份2通过半制备高相液相色谱(流速2mL/min，色谱柱为YMC-Pack ODS-A column(5μm，10×250mm))，以体积分数为65％的乙腈水溶液为流动相分离纯化得到化合物3(tR＝38min)。流份3通过半制备高相液相色谱(流速2mL/min，色谱柱为YMC-Pack ODS-A column(5μm，10×250mmI.D.))，以体积分数为65％的乙腈水溶液为流动相分离纯化得到化合物1(tR＝59min)和2(tR＝70.5min)。
盘毛孢菌酮A(Pestalotinone A,化合物1)：黄色无定形粉末；UV(MeOH)λmax(logε)302(3.75),322(3.65),350(3.70)nm；1H和13C NMR数据，见表1；HR-ESIMS m/z 453.0880[M-H]-(calcd for C22H23Cl2O6,453.0877)。
盘毛孢菌酮B(Pestalotinone B,化合物2)：黄色无定形粉末；UV(MeOH)λmax(logε)300(3.64),321(3.51),352(3.59)nm；；1H和13C NMR数据，见表1；HR-ESIMS m/z 423.0758[M+H]+(calcd for C21H21Cl2O5,423.0761)。
盘毛孢菌酮C(Pestalotinone C,化合物3)：黄色无定形粉末；UV(MeOH)λmax(logε)314(3.87),348(3.69),361(3.70)nm；1H和13C NMR数据，见表1；HR-ESIMS m/z 373.0855[M-H]-(calcd for C20H18ClO5,373.0848)。
表1化合物1-3的1H和13C NMR数据
Figure BDA0003338340190000081
Figure BDA0003338340190000091
aRecorded in CDCl3.bRecorded in DMSO-d6.
根据以上信息，鉴定盘毛孢菌酮A-C(Pestalotinones A-C,1-3)均为Pestalone型二苯甲酮新化合物，其化学结构式如式(1)所示：
Figure BDA0003338340190000092
实施例2：新化合物Pestalotinones A-C(1-3)和已知化合物Pestalone和Pestalone F的抗菌活性测定
用金黄色葡萄球菌(SA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、屎肠球菌(VSE)和耐万古霉素屎肠球菌(VRE)作为测试菌株，用25mL的LB培养基在37℃、150rpm的摇床上培养12h，用LB调整各菌悬液的浓度为1×105CFU/mL。以DMSO溶解各测试样品(化合物1–3，Pestalone和Pestalone F)并稀释为所需的浓度，各测试样品的终浓度为：10、5、2.5、1.25、0.625和0.3125μg/mL。设置相同浓度的DMSO代替测试样品作为阴性对照，用Alamar Blue不含菌悬液作为空白对照，卡拉霉素和万古霉素分别作为阳性对照。在96孔板中加入100μL的菌悬液其中包含Alamar Blue(8％，v/v)和稀释好的各测试样品(4％，v/v)，每个处理三个重复，在37℃黑暗条件下孵育。当阴性对照孔内颜色从蓝色变为红色时，读取各个化合物的MIC值。MIC定义为从蓝色变为粉红色的最低样品浓度，实验结果如表2所示。
表2化合物1–3的抑菌活性
Figure BDA0003338340190000101
NT:Not Tested.
实施例3：新化合物Pestalotinones A-C(1-3)和已知化合物Pestalone和Pestalone F的细胞毒性测定
取对数生长的人肺癌细胞A549、肝癌细胞HepG2、宫颈癌细胞HeLa、乳腺癌细胞MCF-7和非洲绿猴肾细胞Vero加入96孔板中，每孔100μL含有约2000个细胞。再分别加入100μL以上实施例1得到的新化合物1-3和已知化合物Pestalone和Pestalone F，各测试样品的终浓度为：50、10、2、0.4、0.08和0.016μM，以未加化合物的细胞组作为对照，每组设4个平行孔，置二氧化碳培养箱中37℃培养72小时，实验终止前4h加入20μL MTT(5mg/mL)溶液，再培养4h，弃去培养液加入0.15mL DMSO，待结晶溶解后在酶联检测仪上检测570nm波长下每孔的OD值。按下列公式求出生长抑制率，再由SPSS(17.0)软件求出半数抑制浓度(IC50值)。
Figure BDA0003338340190000111
结果见表3，其中IC50用Mean±SD表示。
表3化合物1-3对细胞体外生长抑制作用的IC50(μM)
Figure BDA0003338340190000112
IC50:mean±SD.

Claims (10)

1.如式(1)所示的任一盘毛孢菌酮化合物或其盐：
Figure FDA0003338340180000011
2.一种权利要求1所述的盘毛孢菌酮化合物的制备方法，其特征在于，所述的盘毛孢菌酮化合物是从拟盘多毛孢属真菌Pestalotiopsis trachicarpicola SC-J551菌株的发酵培养物中分离获得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：
将菌株P.trachicarpicola SC-J551活化后进行发酵，发酵培养物用乙酸乙酯提取，乙酸乙酯提取物通过正相硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯从体积比100:0、98:2、90:10、80:20、70:30作为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚-乙酸乙酯体积比70:30洗脱流份通过ODS柱层析，采用甲醇-水混合溶剂作为洗脱剂，从体积比40:60-100:0的梯度进行洗脱，收集甲醇-水体积比80:20的洗脱流份A，收集甲醇-水体积比90:10的洗脱流份B；
流份A再经正相硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯从体积比100:0、95:5、88:12、80:20、70:30、60:40作为洗脱剂进行洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比88:12的洗脱流份为流份1；收集石油醚-乙酸乙酯体积比70:30的洗脱流份为流份2；
流份B再经正相硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯从体积比100:0、95:5、90:10、85:15、80:20、70:30、60:40作为洗脱剂进行洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比85:15的洗脱流份即为流份3；流份1经过分离纯化得到化合物Pestalone F和Pestalone，流份2经过分离纯化得到化合物3，流份3经过分离纯化得到化合物1和2。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的发酵，其发酵培养基是大米培养基，所述的大米培养基是每70mL水中加入大米70g。
5.P.trachicarpicola SC-J551菌株在制备权利要求1所述的任一盘毛孢菌酮化合物中的应用。
6.权利要求1所述的任一盘毛孢菌酮化合物或其药用盐在制备抗菌药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、屎肠球菌或耐万古霉素屎肠球菌的药物。
8.一种抗菌药物，其特征在于，含有权利要求1所述的任一盘毛孢菌酮化合物或其药用盐作为活性成分。
9.根据权利要求8所述的抗菌药物，其特征在于，所述的抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、屎肠球菌或耐万古霉素屎肠球菌的药物。
10.Pestalotiopsis trachicarpicola SC-J551，保藏编号为：GDMCC No：61978 。
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