CN115876927A - 一种化合物lfhp-1c的含量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物分析技术的技术领域，尤其涉及是一种化合物LFHP‑1C的含量检测方法。检测方法包括以下步骤：称取LFHP‑1C待测样品，溶解获得供试品溶液；称取LFHP‑1C对照品溶解并稀释获得对照品溶液；取LFHP‑1C制备过程中的部分原料和中间体化合物、LFHP‑1C对照品配置系统适应性溶液；采用高效液相色谱法进行检测所述系统适应性溶液、对照品溶液和供试品溶液，获得供试品和对照品峰面积；根据所述供试品和对照品峰面积、对照品含量以及供试品的含水量按照外标法计算供试品含量。验证色谱条件的合理性，保证样品中各物质的分离度，提高含量测定的准确性；为LFHP‑1C的质量控制提供科学的参考价值。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术的技术领域，尤其涉及是一种化合物LFHP-1C的含量检测方法。
背景技术
缺血性脑卒中是一类常见的脑血管疾病，针对脑梗死发病机制中急性缺血及再灌注损伤的神经保护药物理论上能够改善脑部神经细胞的能量代谢过程，提高对缺血缺氧病理状态的耐受性。但目前临床上该类药物的疗效与安全性尚需更多临床试验证据进一步证实。同时大部分该类药物都存在作用机制不明确，无法为临床用药提供更明确的指导。本申请人以3-丁基-1(3H)-异苯并呋喃酮和4′-[4-甲基-6-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-2-丙基-1H-苯并咪唑-1-基甲基]联苯基-2-羧酸为起始原料，经系列化合反应获得LFHP-1C，其结构如下式所示，作为治疗剂型缺血性脑卒中的创新性药物，其药理实验数据显示具有明显由于对照组药物的效果，详见专利CN201410033418。
化合物LFHP-1C尚未商业化生产，也没有相应的标准物质，因此，急需开发一种LFHP-1C含量检测方法，为LFHP-1C的质量控制提供科学的参考价值。
发明内容
基于此，本发明提供了一种化合物LFHP-1C的含量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
称取待测样品，溶解获得待测样品溶液；称取LFHP-1C对照品，溶解获得对照品溶液；
取LFHP-1C制备过程中的部分原料和中间体化合物、LFHP-1C对照品配制系统适应性溶液；
采用高效液相色谱法对所述待测样品溶液和对照品溶液进行测定，根据所得色谱图计算所述待测样品中LFHP-1C的含量；
所述LFHP-1C的结构式为：
在一个实施例中，所述LFHP-1C制备过程中的部分原料和中间体化合物包括：替米沙坦和中间体C2、C3、C4，所述中间体C2如式Ⅰ、C3如式Ⅱ、C4如式Ⅲ所示：
在一个实施例中，所述系统适应性溶液包括替米沙坦、C2、C3和LFHP-1C对照品混合溶液和C4溶液，所述系统适应性溶液中各化合物的含量为0.010～0.015mg/mL。
在一个实施例中，所述高相液相色谱法中流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为乙腈，所述流动相B为0.8-1.5g/L的磷酸二氢钾溶液，采用梯度流动相洗脱。
在一个实施例中，所述梯度流动相洗脱过程包括：以流动相体积为100％计，流动相的梯度设置如下：
0～25min，流动相A的体积含量由40％到85％；
25～40min，保持流动相A的体积含量为85％；
40～41min，流动相A的体积含量由85％到40％；
41～50min，保持流动相A的体积含量为40％。
在一个实施例中，所述高效液相色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
在一个实施例中，所述高效液相色谱法中检测波长为290～305nm，柱温为25～35℃，所述流动相的洗脱流速为0.8mL/min～1.2mL/min。
在一个实施例中，所述高效液相色谱法中进样量为8-15μl。
在一个实施例中，所述待测样品溶液、对照品溶液和系统适应性溶液的溶剂为乙腈。
在一个实施例中，根据所得色谱图计算所述待测样品中LFHP-1C的含量过程中的计算公式为：
式中：M对为对照品的称样量，mg；P对为对照品的含量；A对为对照品主峰面积；A样为供试品主峰面积；M样为供试品称样量，mg；ω为供试品水分含量。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
本发明首次提出了化合物LFHP-1C的含量检测方法，其采用高效液相色谱法进行检测，以其制备原料和多个中间体作为系统适应性溶液，验证色谱条件的合理性，保证样品中各物质的分离度，提高含量测定的准确性；为LFHP-1C的质量控制提供科学的参考价值。
附图说明
图1是实施例1提供的系统适应性溶液的HPLC色谱图；a)为替米沙坦、C2、C3和LFHP-1C对照品混合溶液；b)为C4溶液；
图2为实施例1提供的LFHP-1C对照品和供试品的HPLC色谱图，a)为LFHP-1C对照品；b)为LFHP-1C供试品；
图3是实施例2提供的系统适应性溶液的HPLC色谱图；a)为替米沙坦、C2、C3和LFHP-1C对照品混合溶液；b)为C4溶液；
图4为实施例2提供的LFHP-1C对照品和供试品的HPLC色谱图，a)为LFHP-1C对照品；b)为LFHP-1C供试品；
图5是实施例3提供的系统适应性溶液的HPLC色谱图；a)为替米沙坦、C2、C3和LFHP-1C对照品混合溶液；b)为C4溶液；
图6为实施例3提供的LFHP-1C对照品和供试品的HPLC色谱图，a)为LFHP-1C对照品；b)为LFHP-1C供试品。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本发明的描述中，“若干”的含义是至少一个，例如一个，两个等，除非另有明确具体的限定。
本发明中的词语“优选地”、“更优选地”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
除非另外指明，所有百分比、分数和比率都是按本发明组合物的总质量计算的。除非另外指明，有关所列成分的所有质量均给予活性物质的含量，因此它们不包括在可商购获得的材料中可能包含的溶剂或副产物。本文术语“质量百分比含量”可用符号“％”表示。除非另外指明，在本文中所有的分子量都是以道尔顿为单位表示的重均分子量。除非另外指明，在本文中所有配制和测试发生在25℃的环境。本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。本发明的组合物和方法/工艺包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组份、步骤或限制项组成。本文中术语“效能”、“性能”、“效果”、“功效”之间不作区分。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明实施例本发明提供了一种化合物LFHP-1C的含量检测方法，包括以下步骤：
称取LFHP-1C待测样品，溶解获得供试品溶液；称取LFHP-1C对照品溶解并稀释获得对照品溶液；
取LFHP-1C制备过程中的原料、中间体化合物和LFHP-1C对照品配置系统适应性溶液；
采用高效液相色谱法进行检测所述系统适应性溶液、对照品溶液和供试品溶液，获得供试品和对照品峰面积；
根据所述供试品和对照品峰面积、对照品含量以及供试品的含水量按照外标法计算供试品含量；
所述LFHP-1C的结构式为：
在具体示例中，所述LFHP-1C对照品溶解并稀释过程中稀释倍数至少100倍。
在具体示例中，根据合成路线中相关残留杂质的分析，将残留可能性较大的原料和中间体作为已知杂质进行控制，在本发明的含量检测过程中，将该杂质与LFHP-1C配置成混合溶液，以确保杂质与目标分析化合物LFHP-1C的分离程度，减少杂质对化合物LFHP-1C的含量测定的影响。所述LFHP-1C制备过程中的部分原料和中间体化合物包括：替米沙坦和中间体C2、C3、C4，所述中间体C2、C3、C4如式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所示：
在具体示例中，所述系统适应性溶液包括替米沙坦、C2、C3和LFHP-1C对照品混合溶液和C4溶液，所述系统适应性溶液中各化合物的含量为0.010～0.015mg/mL。在本发明实施例中，由于C4化合物能与其他化合物进行反应，因此将其配置成单独的溶液并单独进样。
在具体示例中，所述高相液相色谱法中流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为乙腈，所述流动相B为0.8-1.5g/L的磷酸二氢钾溶液，采用梯度流动相洗脱，以流动相体积为100％计，流动相的梯度设置如下：
| 梯度 | 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 第一梯度 | 0 | 40 | 60 |
| 第二梯度 | 25 | 85 | 15 |
| 第三梯度 | 40 | 85 | 15 |
| 第四梯度 | 41 | 40 | 60 |
| 第五梯度 | 50 | 40 | 60 |
在具体示例中，所述高效液相色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，具体尺寸为：4.6×250mm，3.5μm。
在具体示例中，所述高效液相色谱法中检测波长为290～305nm，柱温为25～35℃，所述流动相的洗脱流速为0.8mL/min～1.2mL/min。
在具体示例中，所述高效液相色谱法中进样量为8-15μl，优选10μl。
在具体示例中，所述样品溶解溶剂为乙腈。
在具体示例中，根据所得色谱图计算所述待测样品中LFHP-1C的含量过程中的计算公式为：
式中：M对为对照品的称样量，mg；P对为对照品的含量；A对为对照品主峰面积；A样为供试品主峰面积；M样为供试品称样量，mg；ω为供试品水分含量。
在本发明实施例中，LFHP-1C对照品的标定方法如下：将LFHP-1C对照品配置成溶液，采用两台高效液相仪器上进行测定，6样6针，并采用面积归一化法，计算LFHP-1C峰面积百分比，以二者平均值计算纯度，获得LFHP-1C对照品的含量。其中高效液相检测条件为：流动相由流动相A和流动相B组成，其中流动相A为乙腈，流动相B为1.0g/L的磷酸二氢钾溶液(称取磷酸二氢钾1.00g加超纯水溶解并稀释至1000mL，使用0.2μm孔径滤膜过滤)，采用梯度流动相洗脱，以流动相体积为100％计，流动相的梯度设置如下：
| 梯度 | 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 第一梯度 | 0 | 40 | 60 |
| 第二梯度 | 25 | 85 | 15 |
| 第三梯度 | 40 | 85 | 15 |
| 第四梯度 | 41 | 40 | 60 |
| 第五梯度 | 50 | 40 | 60 |
其中高效液相色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，具体尺寸为：4.6×250mm，3.5μm；检测波长为210nm，柱温为30℃；所述流动相的洗脱流速为1.0mL/min；进样量为10μl。
实施例1
分别称取替米沙坦、C2、C3、LFHP-1C对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中各约含0.012mg的混合对照溶液，另称取C4对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含0.012mg的C4对照品溶液，作为系统适应性溶液。
精密称取20210107批次的LFHP-1C样品两份约25mg置于100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取LFHP-1C对照品两份适量，精密称定，加乙腈适量使溶解并稀释制成每1ml中约含0.25mg的溶液，作为对照品溶液，具体称量数据详见表3、4。
采用高效液相色谱法进行测定，条件如下：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以1g/L磷酸二氢钾溶液为流动相B(称取磷酸二氢钾1.00g加超纯水溶解并稀释至1000mL，使用0.2μm孔径滤膜过滤)，按下表进行梯度洗脱；检测波长为298nm，柱温30℃，流速每分钟1.0ml。分别取对照品溶液、供试品溶液10μl注入液相色谱仪。其中对照品和供试品进样量至少2次。
表1梯度洗脱参数
| 梯度 | 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 第一梯度 | 0 | 40 | 60 |
| 第二梯度 | 25 | 85 | 15 |
| 第三梯度 | 40 | 85 | 15 |
| 第四梯度 | 41 | 40 | 60 |
| 第五梯度 | 50 | 40 | 60 |
经检测获得的系统适应溶液、LFHP-1C对照品和LFHP-1C供试品的色谱图如图1、2所示。获得峰面积后，按照下述公式进行计算含量，系统适应性溶液、对照品和供试品含量检测结果如表2、3和4所示。
式中：M对为对照品的称样量，mg；P对为对照品的含量；A对为对照品主峰面积；A样为供试品主峰面积；M样为供试品称样量，mg；ω为供试品水分含量。
表2系统适应性溶液峰结果
表3对照品检测结果及含量
表4供试品检测结果及含量
由图1和表2可知，LFHP-1C的原料药、中间体和样品LFHP-1C在本发明的色谱条件下具有良好的分离度，系统适应性溶液中LFHP-1C峰与相邻色谱峰之间的分离度应大于2.0，C4对照品溶液的主峰不干扰LFHP-1C峰的测定。
实施例2
分别称取替米沙坦、C2、C3、LFHP-1C对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中各约含0.012mg的混合对照溶液，另称取C4对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含0.012mg的C4对照品溶液，作为系统适应性溶液。
精密称取20210301R1批次的LFHP-1C样品两份约25mg置于100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取LFHP-1C对照品两份适量，精密称定，加乙腈适量使溶解并稀释制成每1ml中约含0.25mg的溶液，作为对照品溶液，具体称量数据详见表7、8。
采用高效液相色谱法进行测定，条件如下：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以1g/L磷酸二氢钾溶液为流动相B，按下表5进行梯度洗脱；检测波长为298nm，柱温30℃，流速每分钟1.0ml。分别取对照品溶液、供试品溶液10μl注入液相色谱仪。其中对照品和供试品进样量至少2次。
表5梯度洗脱参数
| 梯度 | 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 第一梯度 | 0 | 40 | 60 |
| 第二梯度 | 25 | 85 | 15 |
| 第三梯度 | 40 | 85 | 15 |
| 第四梯度 | 41 | 40 | 60 |
| 第五梯度 | 50 | 40 | 60 |
经检测获得的系统适应溶液、LFHP-1C对照品和LFHP-1C供试品的色谱图
经检测获得的系统适应溶液、LFHP-1C对照品和LFHP-1C供试品的色谱图如图3、4所示。获得峰面积后，计算含量，系统适应性溶液、对照品和供试品含量检测结果如表6、7和8所示。
表6系统适应性溶液峰结果
表7对照品检测结果及含量
表8供试品检测结果及含量
实施例3
分别称取替米沙坦、C2、C3、LFHP-1C对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中各约含0.012mg的混合对照溶液，另称取C4对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含0.012mg的C4对照品溶液，作为系统适应性溶液。
精密称取20210301R1批次的LFHP-1C样品两个约25mg置于100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取LFHP-1C对照品两个适量，精密称定，加乙腈适量使溶解并稀释制成每1ml中约含0.25mg的溶液，作为对照品溶液，具体称量数据详见表11、12。
采用高效液相色谱法进行测定，条件如下：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以1g/L磷酸二氢钾溶液为流动相B，按下表9进行梯度洗脱；检测波长为298nm，柱温30℃，流速每分钟1.0ml。分别取对照品溶液、供试品溶液10μl注入液相色谱仪。其中对照品和供试品进样量至少2次。
表9梯度洗脱参数
| 梯度 | 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 第一梯度 | 0 | 40 | 60 |
| 第二梯度 | 25 | 85 | 15 |
| 第三梯度 | 40 | 85 | 15 |
| 第四梯度 | 41 | 40 | 60 |
| 第五梯度 | 50 | 40 | 60 |
经检测获得的系统适应溶液、LFHP-1C对照品和LFHP-1C供试品的色谱图如图5、6所示。获得峰面积后，计算含量，系统适应性溶液、对照品和供试品含量检测结果如表10、11和12所示。
表10系统适应性溶液峰结果
表11对照品检测结果及含量
表12供试品检测结果及含量
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种化合物LFHP-1C的含量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
称取待测样品，溶解获得待测样品溶液；称取LFHP-1C对照品，溶解获得对照品溶液；
取LFHP-1C制备过程中的部分原料和中间体化合物、LFHP-1C对照品配制系统适应性溶液；
采用高效液相色谱法对所述待测样品溶液和对照品溶液进行测定，根据所得色谱图计算所述待测样品中LFHP-1C的含量；
所述LFHP-1C的结构式为：
2.根据权利要求1所述的化合物LFHP-1C的含量检测方法，其特征在于，所述LFHP-1C制备过程中的部分原料和中间体化合物包括：替米沙坦和中间体C2、C3、C4，所述中间体C2如式Ⅰ、C3如式Ⅱ、C4如式Ⅲ所示：
3.根据权利要求2所述的化合物LFHP-1C的含量检测方法，其特征在于，所述系统适应性溶液包括替米沙坦、C2、C3和LFHP-1C对照品混合溶液和C4溶液，所述系统适应性溶液中各化合物的含量为0.010～0.015mg/mL。
4.根据权利要求1所述的化合物LFHP-1C的含量检测方法，其特征在于，所述高相液相色谱法中流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为乙腈，所述流动相B为0.8-1.5g/L的磷酸二氢钾溶液，采用梯度流动相洗脱。
5.根据权利要求4所述的化合物LFHP-1C的含量检测方法，其特征在于，所述梯度流动相洗脱过程包括：以流动相体积为100％计，流动相的梯度设置如下：
0～25min，流动相A的体积含量由40％到85％；
25～40min，保持流动相A的体积含量为85％；
40～41min，流动相A的体积含量由85％到40％；
41～50min，保持流动相A的体积含量为40％。
6.根据权利要求4所述的化合物LFHP-1C的含量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
7.根据权利要求4所述的化合物LFHP-1C的含量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中检测波长为290～305nm，柱温为25～35℃，所述流动相的洗脱流速为0.8mL/min～1.2mL/min。
8.根据权利要求4所述的化合物LFHP-1C的含量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中进样量为8-15μl。
9.根据权利要求1所述的化合物LFHP-1C的含量检测方法，其特征在于，所述待测样品溶液、对照品溶液和系统适应性溶液的溶剂为乙腈。
10.根据权利要求1所述的化合物LFHP-1C的含量检测方法，其特征在于，根据所得色谱图计算所述待测样品中LFHP-1C的含量过程中的计算公式为：
式中：M对为对照品的称样量，mg；P对为对照品的含量；A对为对照品主峰面积；A样为供试品主峰面积；M样为供试品称样量，mg；ω为供试品水分含量。
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