CN104655757A - Bc-02的液相色谱检测方法 - Google Patents

Bc-02的液相色谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析化学检测领域，具体涉及一种BC-02的液相色谱检测方法。选用A相为甲醇-水、B相为乙腈-水-TFA-TEA作为流动相；通过恰当比例调节，既可满足BC-02与相邻杂质峰分离度的要求，也可使主要降解产物羟甲基5-Fu和5-Fu得到很好的分离度。在同一色谱条件下，不仅能够快速检测BC-02的含量，还可同时检测与BC-02结构相似的杂质及BC-02的异构体，确定了合适的样品溶液浓度，能够降低检测下限，在检测目标浓度较低时也能很好地进行定量分析，使该检测方法更具有实际应用价值，且方法简单、易操作，辅助试剂价廉易得，检测结果真实可靠，是一种快速、准确的定量检测方法。

Description

BC-02的液相色谱检测方法
技术领域
本发明属于分析化学检测领域，具体涉及一种BC-02的液相色谱检测方法。
背景技术
BC-02（Bestatin-5Fu衍生物）山东大学药学院自主研发的一种新型抗肿瘤新药。通过将抑制肿瘤干细胞的乌苯美司与细胞毒类抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶（5-Fu）骈合到一起，协同发挥疗效，实现多靶点型抗肿瘤作用，为抗肿瘤新药研究开辟了新的领域。
最近研究表明，在小鼠肝癌移植瘤实验中，比较单独使用乌苯美司、5-氟尿嘧啶和联合使用两种药物，结果发现，联合组表现出了极高的抑瘤活性。这一研究结果为乌苯美司与5-氟尿嘧啶及其他化疗药物的联合应用提供了很好的实验证据(J Clin Invest 2010,120,3326-3339)。也证实了BC-02在肿瘤化疗中同时抑制肿瘤干细胞的重要性。
                                                 
目前，尚无此类新型药物质量标准控制的分析方法及相关研究。为了进一步开发BC-02，使之成为CFDA正式批准的国家1.1类新药，有关其含量和杂质的测定分析方法成了研究的重点。系统研究BC-02杂质和含量的检测方法，是确保药物BC-02安全性、有效性和稳定性必要的技术手段和方法依据。BC-02在合成过程和储存过程中会产生多种杂质，这些杂质在结构、理化性质及药理毒理等方面均与主成分存在相关性，为做好工艺过程控制，有效分离相关杂质，提高BC-02产品质量，研究尝试用高效液相色谱分析法，检测BC-02杂质，同时检测其主成分的含量。
发明内容
本发明的目的是提供一种BC-02的液相色谱检测方法，能够精确测定BC-02的含量，以及检测BC-02中的杂质含量。
本发明提供的一种BC-02的液相色谱检测方法，包括以下步骤：
（1）取BC-02标准品采用水制备BC-02标准溶液，或取BC-02标准品和5-Fu标准品采用水制备混合标准溶液；
（2）取待测样品采用水制备待测样品溶液；
（3）系统适用性试验：取0.5mg/ml 5-Fu水溶液100μl和10mg BC-02用水稀释定容到10ml容量瓶中，配制成系统适用性溶液，取系统适用性溶液进样20μl，5-Fu与BC-02以及杂质与BC-02之间的分离度R＞1.5；
（4）取步骤（2）配制的待测样品溶液5～20μl注入液相色谱仪，流动相流速为0.5～1.5mL/min，检测波长为：200～300nm；检测器：PAD、柱温为30～40℃；
所述流动相包括A相和B相，A相为甲醇-水；B相为乙腈-水-TFA-TEA；A相与B相的体积比为10:90，所述的A相中甲醇与水体积比5:95，用磷酸调节pH值为3.5，B相中乙腈、水、TFA和TEA的体积比为25:75:0.15:0.1；
（5）采用步骤（4）检测条件测定步骤（1）配制的标准溶液或混合标准溶液，以外标法计算待测样品中BC-02或者BC-02中杂质的含量。
步骤(1) 所述BC-02标准品的纯度大于99％，为了保证标准品纯度，使用前可进行重结晶处理；所述5-Fu标准品的纯度大于99％。
步骤(1) 所述BC-02标准溶液质量浓度为0.05～1.5mg/mL；混合标准溶液质量浓度为0.002～0.015mg/mL，优选待测样品溶液浓度的0.1%。
步骤（1）混合标准溶液配制方法为，先分别配制0.5mg/ml的5-Fu标准品的水溶液和1mg/ml的BC-02标准品的水溶液，分别取以上两种溶液各100μl置同一10ml容量瓶中，用水稀释定容，得到5-Fu浓度5μg/ml、BC-02浓度10μg/ml的混合标准溶液。
步骤(2) 所述待测样品溶液的质量浓度为0.05～1.0mg/mL。
步骤(1) 和（2）所述标准溶液、混合标准溶液和待测样品溶液注入液相色谱仪之前通过孔径为0.2～0.5μm的过滤膜过滤。
本发明方法所用液相色谱仪的色谱柱为C18柱，柱长150～300mm，其中，色谱柱填料优选用于亲水性样品分离和在含高比例水的流动相条件下具有强的保留的填料。色谱柱优选型号phenomenex，柱长250mm，直径4.6mm，孔径5μm，填充剂为C18键合烷基硅胶、粒径100A。
本发明方法中，测定BC-02含量时采用BC-02标准溶液，等度洗脱方法；测定BC-02中的杂质含量时采用混合标准溶液，梯度洗脱方法。
所述的梯度洗脱方法为
本发明方法能够精确测定BC-02的含量，以及检测BC-02中的杂质含量；杂质包括已知杂质5-Fu和未知杂质，未知杂质即合成过程中产生的副产物、中间体和降解产物等。
本发明技术方案中流动相的比例可调节范围为±5%，液相色谱流动相的流速为0.5～1.5mL/min。用1.5mL/min以上的流速进行实验，羟甲基5-Fu与5-Fu以及BC-02与相邻杂质的分离度不符合要求，改用0.5mL/min 流速，分离度能达到要求，但一次分析的时间延长(梯度时间加倍），BC-02峰形展宽，不符合规定板数要求，以1.0mL/min 左右的流速检测，羟甲基5-Fu与5-Fu以及BC-02与相邻杂质既能良好分离，相对于0.5mL/min 流速也缩短了分析时间，改善了系统的理论板数。
本发明BC-02的液相色谱检测方法，具有如下优点：
1. 在同一色谱条件下，不仅能够快速检测BC-02的含量，还可同时检测与BC-02结构相似的杂质及BC-02的异构体，尤其适用于检测BC-02降解产物（如由BC-02降解产生的羟甲基5-Fu和5-Fu，以及与两种物质结构和极性极为相似的反应副产物），通过本发明检测方法可以定量、准确考察BC-02降解反应进程及相关的杂质情况。
2. 选用A相为甲醇-水、B相为乙腈-水-TFA-TEA作为流动相；通过恰当比例调节，既可满足BC-02与相邻杂质峰分离度的要求，也可使主要降解产物羟甲基5-Fu和5-Fu得到很好的分离度。
3. 确定了合适的样品溶液浓度，能够降低检测下限，在检测目标浓度较低时也能很好地进行定量分析，使该检测方法更具有实际应用价值。
4. 检测方法简单、易操作，辅助试剂价廉易得，检测结果真实可靠，是一种快速、准确的定量检测方法。
附图说明
图1 为BC-02标准溶液的高效液相色谱图；
图2 为混合标准溶液高效液相色谱图；
图3 实施例1 所述待检测的BC-02样品的高效液相色谱图；
图4 实施例2 所述待检测的BC-02样品的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 BC-02含量检测
一、试剂和溶液
1. BC-02标准品：纯度≥ 99.0％。
2. BC-02标准液：取BC-02标准品10.05mg，精密称量(精确至0.0001g)，置10mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，此溶液浓度为1mg/mL。
3. 系统适用性试验：取0.5mg/ml5-Fu水溶液100μl和10mg BC-02用水稀释定容到10ml容量瓶中，配制成系统适用性溶液。
二、仪器和设备
1. 分析天平：感量为0.0001g。
2. 微孔滤膜：孔径0.45μm。
3. 高效液相色谱仪( 配有紫外检测器)。
三、分析步骤
1. 液相色谱条件
色谱柱：phenomenex ( 或选择与之相当填料的C18 柱，即适用于亲水性样品分离和在含高比例水的流动相条件下具有强的保留)，长250mm，内径4.6mm，粒度5μm。
流动相：A相为甲醇-水（用磷酸调节pH值3.5）(5:95)；B相为乙腈-水-TFA-TEA（25:75:0.15:0.1），A:B=10:90作为流动相。
流速：1mL/min。
检测波长：262nm
进样量：10μL。
2. 待测样品溶液制备
称取BC-02样品10.10mg( 精确至0.0001g)，置于10mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，备用。
3. 液相色谱测定
取系统适用性溶液进样20μl，5-Fu与BC-02以及BC-02与相邻杂质之间的分离度R＞1.5。取待测样品溶液，过0.45μm 滤膜，精密量取续滤液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图3；另取BC-02标准液（浓度为0.1%），同法测定，见图1，按外标法以峰面积计算。
4. 计算公式
待测样品中BC-02含量X 以质量分数(％) 表示，按式(1) 计算：
式中：
C------ BC-02标准溶液的浓度，单位为mg/mL ；
A------- BC-02标准液中BC-02的峰面积;
Ax------ BC-02待测样品溶液中BC-02的峰面积；
Co------ BC-02待测样品溶液的浓度，单位为mg/mL 。
5. 测定结果
1.010(C)------ BC-02标准溶液的浓度，单位为mg/mL ；
7299795(Ax)------ BC-02待测样品溶液中BC-02的峰面积；
1.010(Co)------ BC-02待测样品溶液的浓度，单位为mg/mL ；
7251601(A)------- BC-02标准液中BC-02的峰面积。
待测样品中BC-02含量：
实施例2 BC-02中杂质检测
一、试剂和溶液
1. BC-02标准品：纯度≥99.0％。
2. 5-Fu标准品：纯度≥99.0％。
3. 混合标准溶液：称取5.12mg5-Fu用水稀释到10ml容量瓶中（0.5mg/ml），称取10.07mg BC-02到10ml容量瓶中，用水稀释定容。分别取以上两种溶液各100微升置同一10ml容量瓶中，用水稀释定容，得到5-Fu浓度5.12μg/ml，BC-02浓度10.07μg/ml的混合标准溶液。
4. 系统适用性试验：取0.5mg/ml5-Fu水溶液100μl和10mg BC-02用水稀释定容到10ml容量瓶中，配制成系统适用性溶液。
二、仪器和设备
1. 分析天平：感量为0.0001g。
2. 微孔滤膜：孔径0.45μm。
3. 高效液相色谱仪( 配有紫外检测器)。
三、分析步骤
1. 液相色谱条件
色谱柱：phenomenex ( 或选择与之相当填料的C18柱，即适用于亲水性样品分离和在含高比例水的流动相条件下具有强的保留)，长250mm，内径4.6mm，粒度5μm。
流动相：A相为甲醇-水（用磷酸调节pH值3.5）(5:95)；B相为乙腈-水-TFA-TEA（25:75:0.15:0.1），梯度洗脱。
流速：1mL/min。
检测波长：262nm。
进样量：10μL。
2. 待测样品溶液制备
称取BC-02待测样品10.10mg( 精确至0.0001g)，置于10mL 容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，备用。
3. 液相色谱测定
取系统适用性溶液进样20μl，5-Fu与BC-02以及BC-02与相邻杂质之间的分离度R＞1.5。取待测样品溶液，过0.45μm 滤膜，精密量取续滤液10μl 注入液相色谱仪，记录色谱图，见图4 ；另取混合标准溶液，同法测定，见图2，按外标法以峰面积计算BC-02中的已知杂质5-Fu及其他未知杂质的含量。
4. 计算公式
待测样品中5-Fu及其他未知杂质的含量X以质量分数(％) 表示，按式(2) 计算：
式中：
C------ 混合标准溶液中BC-02( 或5-Fu) 的浓度，单位为mg/mL ；
A-------混合标准溶液中BC-02( 或5-Fu) 的峰面积；
Ax------待测样品溶液中BC-02未知杂质( 或5-Fu) 的峰面积；
Co------待测样品溶液的浓度，单位为mg/mL。
5. 测定结果
0.01007(C)------ 混合标准溶液中BC-02的浓度，单位为mg/mL；
71951(A)------- 混合标准溶液中BC-02的峰面积；
0.00512(C)------ 混合标准溶液中5-Fu的浓度，单位为mg/mL；
103997 (Ax)------ 待测样品溶液中BC-02未知杂质的峰面积；
1.010(Co)------ 待测样品溶液的浓度，单位为mg/mL；
114314(Ax)------ 待测样品溶液中5-Fu的峰面积；
162028(A)------- 混合标准溶液中5-Fu的峰面积。
BC-02未知杂质含量：
   
5-Fu含量：
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详细的描述，但是本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种BC-02的液相色谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取BC-02标准品采用水制备BC-02标准溶液，或取BC-02标准品和5-Fu标准品采用水制备混合标准溶液；
（2）取待测样品采用水制备待测样品溶液；
（3）系统适用性试验：取0.5mg/ml 5-Fu水溶液100μl和10mg BC-02用水稀释定容到10ml容量瓶中，配制成系统适用性溶液，取系统适用性溶液进样20μl，5-Fu与BC-02以及杂质与BC-02之间的分离度R＞1.5；
（4）取步骤（2）配制的待测样品溶液5～20μl注入液相色谱仪，流动相流速为0.5～1.5mL/min，检测波长为：200～300nm；检测器：PAD、柱温为30～40℃；
所述流动相包括A相和B相，A相为甲醇-水；B相为乙腈-水-TFA-TEA；A相与B相的体积比为10:90，所述的A相中甲醇与水体积比5:95，用磷酸调节pH值为3.5，B相中乙腈、水、TFA和TEA的体积比为25:75:0.15:0.1；
（5）采用步骤（4）检测条件测定步骤（1）配制的标准溶液或混合标准溶液，以外标法计算待测样品中BC-02或者BC-02中杂质的含量。
2.根据权利要求1所述的BC-02的液相色谱检测方法，其特征在于：步骤（1）所述BC-02标准品的纯度大于99％，为了保证标准品纯度，使用前可进行重结晶处理；所述5-Fu标准品的纯度大于99％。
3.根据权利要求1所述的BC-02的液相色谱检测方法，其特征在于：步骤（1）所述BC-02标准溶液质量浓度为0.05～1.5mg/mL；混合标准溶液质量浓度为0.002～0.015mg/mL。
4.根据权利要求1所述的BC-02的液相色谱检测方法，其特征在于：步骤（1）混合标准溶液配制方法为，先分别配制0.5mg/ml的5-Fu标准品的水溶液和1mg/ml的BC-02标准品的水溶液，分别取以上两种溶液各100μl置同一10ml容量瓶中，用水稀释定容，得到5-Fu浓度5μg/ml、BC-02浓度10μg/ml的混合标准溶液。
5.根据权利要求1所述的BC-02的液相色谱检测方法，其特征在于：步骤（2）所述待测样品溶液的质量浓度为0.05～1.0mg/mL。
6.根据权利要求1所述的BC-02的液相色谱检测方法，其特征在于：步骤（1）和（2）所述标准溶液、混合标准溶液和待测样品溶液注入液相色谱仪之前通过孔径为0.2～0.5μm的过滤膜过滤。
7.根据权利要求1所述的BC-02的液相色谱检测方法，其特征在于：液相色谱仪的色谱柱为C18柱，柱长150～300mm；色谱柱填料为用于亲水性样品分离和在含高比例水的流动相条件下具有强的保留的填料。
8.根据权利要求7所述的BC-02的液相色谱检测方法，其特征在于：色谱柱型号phenomenex，柱长250mm，直径4.6mm，孔径5μm，填充剂为C18键合烷基硅胶、粒径100A。
9.根据权利要求1所述的BC-02的液相色谱检测方法，其特征在于：测定BC-02含量时采用BC-02标准溶液，等度洗脱方法；测定BC-02中的杂质含量时采用混合标准溶液，梯度洗脱方法，所述的梯度洗脱方法为
。
10.根据权利要求1所述的BC-02的液相色谱检测方法，其特征在于：本发明方法能够精确测定BC-02的含量，以及检测BC-02中的杂质含量；所述的杂质包括已知杂质5-Fu和未知杂质，未知杂质即合成过程中产生的副产物、中间体和降解产物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113009014A (zh) * 2021-02-24 2021-06-22 上海旭东海普药业有限公司 一种2-甲氧基-5-氟尿嘧啶杂质的高效液相检测方法
CN113109492A (zh) * 2020-06-22 2021-07-13 广东阿格蕾雅光电材料有限公司 一种检测双组分有机电致发光材料比例的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103588713A (zh) * 2013-06-07 2014-02-19 潍坊博创国际生物医药研究院 多靶点型乌苯美司前药衍生物及其制备方法和用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103588713A (zh) * 2013-06-07 2014-02-19 潍坊博创国际生物医药研究院 多靶点型乌苯美司前药衍生物及其制备方法和用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHANG, XIAOFAN; ZHONG, JULIA LI; LIU, WEI: "N(3)-o-toluyl-fluorouracil inhibits human hepatocellular carcinoma cell growth via sustained release of 5-FU", 《CANCER CHEMOTHERAPY AND PHARMACOLOGY》 *
荆凡波 等: "静脉注射乌苯美司/5-氟尿嘧啶在大鼠体内的药动学研究", 《中国药房》 *
马春华: "以氨肽酶N为靶点的抗肿瘤药物的设计、合成及初步活性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113109492A (zh) * 2020-06-22 2021-07-13 广东阿格蕾雅光电材料有限公司 一种检测双组分有机电致发光材料比例的方法
CN113109492B (zh) * 2020-06-22 2023-10-20 广东阿格蕾雅光电材料有限公司 一种检测双组分有机电致发光材料比例的方法
CN113009014A (zh) * 2021-02-24 2021-06-22 上海旭东海普药业有限公司 一种2-甲氧基-5-氟尿嘧啶杂质的高效液相检测方法

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