CN108430222B

CN108430222B - 农业上有利的微生物、微生物组合物以及聚生体

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Publication number: CN108430222B
Application number: CN201680009206.8A
Authority: CN
Inventors: 彼得·威格利; 苏珊·特纳; 卡罗琳·乔治; 托马斯·威廉斯; 凯利·罗伯茨; 格雷厄姆·希穆斯; 凯尔文·劳
Original assignee: Bioconsortia Inc
Current assignee: Bioconsortia Inc
Priority date: 2015-02-09
Filing date: 2016-02-09
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2036-02-09
Also published as: US20230047146A1; EP3261445A4; IL281528A; IL253690B; BR112017017003A2; AU2016219488A1; JP2018507708A; US20200229443A1; CA2976045A1; US20180020671A1; EP4147575A1; CN108430222A; US10602744B2; MX2017010294A; WO2016130586A3; WO2016130586A2; AU2020286338A1; AU2021203932A1; CN114698651A; JP2021090464A

Abstract

本发明涉及经分离的微生物、微生物聚生体以及包含其的农业组合物，所述经分离的微生物包括新型微生物品系。此外，本公开教示在用于赋予目标植物物种有利特性的方法中使用所描述的微生物、微生物聚生体以及包含其农业组合物的方法。在具体方面中，本公开提供用于增加在农艺学上重要的作物物种中的理想植物特性的方法。

Description

农业上有利的微生物、微生物组合物以及聚生体

相关申请案的交叉引用

本申请是PCT国际专利申请，其要求2015年2月09日提交的美国临时专利申请第62/113,792号和2015年5月22日提交的美国临时专利申请第62/165,620号以及2016年1月19日提交的美国临时专利申请第62/280,503号的优先权，其皆以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的。

技术领域

本发明涉及尤其在农业中具有应用的经分离的和生物学上纯的微生物。所公开的微生物可以其经分离的和生物学上纯的状态使用，也可以配制成农业上可接受的组合物。此外，本公开提供农业上有利的微生物聚生体，其含有所公开的微生物中的至少两个成员，以及在农业应用中使用所述聚生体的方法。

背景技术

根据联合国世界粮食计划署(United Nations World Food Program)，全世界有将近9亿营养不良人口。营养不良流行病在全世界发展中国家尤其显著，其中六名儿童中便有一名体重偏轻。缺乏可用的食物可归因于多种社会经济因素；然而，无论最终起因如何，事实仍然是可用于喂养正在增长的世界人口的食物不足，预期世界人口在2050年将达到90亿人。联合国估算到2050年，农业产量必须增加70-100％以喂养所计划的全球人口。

这些惊人的世界人口和营养不良数字突出了农业功效和生产力在维持正在增长的全世界人口方面的重要性。通过现代中耕作物农业实现的技术进步(其引起以前从未见过的作物产量)令人印象深刻。然而，尽管通过技术创新取得进步，如经遗传工程改造的作物和新型杀害虫和除草化合物，但仍需要经改良的作物性能，以满足以指数方式增加的全世界人口的需求。

科学家估算如果可以缩小全世界农业“产量差”(其为所观察到的最佳产量与在其它地方的结果之间的差)，那么全世界作物生产量将上升45-70％。也就是说，如果所有农民(与全世界位置无关)可以实现关于其各别区域所预期的最高的可达到的产量，那么可解决全世界食物生产量方面的大部分不足。然而，在不同的世界地貌中解决如何实现更高的产量的问题是困难的。

通常，产量差可通过水不足、不标准的耕种操作、肥料不足以及无法使用除草剂和农药来说明。然而，在全世界范围内极大地增加水、肥料、除草剂以及农药的使用不仅对于全世界大部分地区来说是经济上不可行的，而且将造成不良的环境后果。

因此，通过大部分发达国家所使用的简单地按比例增加当前高输入型农业系统来满足全球农业产量期望是完全不可行的。

因此，在所属领域中迫切需要经改良的用于提高作物性能和赋予所需植物物种有利的特性的方法。

发明内容

本发明解决如何改良作物性能的这一重要问题，由此缩小全世界产量差，并且提供赋予植物物种其它有利特性的方法。

由本发明提供的用于提高作物性能和增加产量的解决方案对地球资源无害，因为其不依赖于增加耗水量或增加系统中合成化学物质的输入。实际上，本发明利用微生物来赋予所需植物有利的特性，包括提高产率。

因此，本公开提供可使农民提高重要作物的产量的环境上可持续的解决方案，其不依赖于增加合成除草剂和农药的使用。

在实施例中，本公开提供有效并且广泛适用的农业平台，其利用可促进一种或多种所需植物特性的微生物和微生物聚生体。

在一些实施例中，利用单一微生物。在一些方面中，所述单一微生物经分离和纯化。在一些方面中，单一微生物是细菌的分类物种。在一些方面中，单一微生物是细菌的分类物种的可鉴别品系。在一些方面中，单一微生物是新型、最近发现的细菌的分类物种的品系。

在一些实施例中，利用来自表1的单一微生物。在其它实施例中，利用来自表2的单一微生物。在其它实施例中，利用来自表3的单一微生物。

在一些实施例中，使用来自芽生杆菌属(genus Bosea)的微生物。

在一些方面中，所述单一微生物(无论分类学上可鉴别的物种或品系)与不同物种或品系的一种或多种其它微生物组合。在某些方面中，两种或更多种微生物的组合形成聚生体或联合体。术语聚生体和联合体可互换地使用。

在某些方面中，本公开提供高功能性微生物聚生体的研究，所述微生物聚生体有助于促进所需表现型或基因型植物特性的研究和表现。在一些实施例中，本发明的聚生体具有当个别微生物单独存在时未在自然界中发现的功能属性。也就是说，在多种实施例中，将具体微生物物种组合成聚生体可产生具有功能属性的微生物组合，所述功能属性是在单独考虑时，所述聚生体中的任何一个个别成员都不具有的。

在一些实施例中，微生物聚生体所具有的这种功能属性是赋予植物物种一种或多种有利特性的能力，例如：增加生长、提高产量、提高氮利用效率、提高耐胁迫性、提高耐旱性、提高光合率、增强水使用效率、提高抗病原体性、未必影响植物产量，但实际上解决植物功能性的对植物架构的修改等。

在一些实施例中，个别微生物在其存在于自然界中时不具有可赋予植物这些有利特性的能力。实际上，在一些实施例中，通过人力将这些微生物组合成可产生功能组合物的聚生体，所述功能组合物具有自然界中不存在的属性和功能特性。

然而，在其它实施例中，本公开提供个别经分离和生物学上纯的微生物，其能够赋予所需植物物种有利特性而无需将所述微生物组合成聚生体。

在实施例中，微生物聚生体可以是来自表1的个别微生物的任何组合。在其它实施例中，微生物聚生体可以是来自表2的个别微生物的任何组合。在其它实施例中，微生物聚生体可以是来自表3的个别微生物的任何组合。在其它实施例中，微生物聚生体可以是来自表1到3中任一个的个别微生物的任何组合。在某些实施例中，微生物聚生体包含两种微生物，或三种微生物，或四种微生物，或五种微生物，或六种微生物，或七种微生物，或八种微生物，或九种微生物，或10种微生物，或超过10种微生物。

本公开的另一个目标涉及使用经分离的微生物和微生物聚生体作为植物生长促进剂。在其它方面中，经分离的微生物和微生物聚生体充当生长调节剂，其可例如抵抗正常老化从而引起生物质量增加。

本公开的另一目标涉及使用经分离的微生物和微生物聚生体作为土壤健康增强剂和植物健康增强剂。

本公开的另一目标是设计微生物联合体，其能够共同实现多维活性。在某些方面中，包含联合体的微生物以协同方式起作用。在各方面中，微生物联合体对某一植物特征的作用将大于所述联合体中任何一个个别微生物成员在单独使用时所观察到的作用。也就是说，在一些方面中，与联合体中的任何个别成员在单独使用时发现的作用相比，联合体对所需植物特征呈现大于累加作用的作用。

在一些方面中，聚生体引起产生其它植物-微生物相互作用，例如通过充当可设定未来微生物群落发育轨迹的主要定殖体或产生群体。

在实施例中，本公开涉及微生物分离物的协同组合(或混合物)。

在一些方面中，本文中教示的聚生体提供广泛范围的农业应用，包括：改良谷物、果实和花朵产量；改良植物部分的生长；改良抗病性；改良在极端气候中的存活率；以及改良其它所需植物表现型特征。显然，对植物的这些益处可在对环境无任何有害副作用的情况下获得。

在一些方面中，本公开的个别微生物或包含其的聚生体可组合成农业上可接受的组合物。

在一些实施例中，本公开的农业组合物包括(但不限于)：润湿剂、相容剂、消泡剂、清洗剂、螯合剂、防飘移剂、中和剂、缓冲剂、腐蚀抑制剂、染料、气味剂、扩展剂、渗透助剂、粘着剂、结合剂、分散剂、增稠剂、稳定剂、乳化剂、冷冻点抑制剂、抗菌剂、肥料、农药、除草剂、惰性载剂、聚合物等。

在本公开的一个实施例中，以种子涂料或其它种子施用物形式供应微生物(包括经分离的单一物种，或品系，或聚生体)。在实施例中，种子涂料可施用于裸的和未经处理的种子。在其它实施例中，种子涂料可用作经预先处理的种子的种子外涂层。

在一些实施例中，所施用的可变成内生性并且因此将存在于所处理的生长植物和其后代中。在其它实施例中，微生物可与种子处理同时以共同处理形式施用。

在本公开的一个实施例中，微生物以颗粒，或插入物，或施用于植物生长培养基的土壤浇灌物形式供应。在其它实施例中，微生物以叶面施用物形式供应，如叶面喷雾或液体组合物。叶面喷雾或液体施用物可施用于生长植物或生长培养基，例如土壤。

在实施例中，本公开的农业组合物可尤其配制成：(1)溶液；(2)可湿性粉末；(3)粉尘；(4)可溶性粉末；(5)乳液或悬浮液浓缩物；(6)拌种；(7)片剂；(8)水分散性颗粒；(9)水溶性颗粒(缓慢或快速释放)；(10)微囊封颗粒或悬浮液；以及(11)灌溉组分。在某些方面中，在常规喷雾施用之前，组合物可在水性介质中稀释。本公开的组合物可施用于土壤、植物、种子、根围、根鞘或其它可有利地施用微生物组合物的区域。

本公开的另一目标涉及农业组合物，其经配制以提供高集落形成单位(CFU)细菌群体或聚生体。在一些方面中，农业组合物具有可实现相关存放期的佐剂。在实施例中，所教示的农业组合物的CFU浓度高于在所公开的方法之外，所述微生物将天然存在的浓度。在另一实施例中，农业组合物以10³-10¹²CFU/克载剂或10⁵-10⁹CFU/克载剂的浓度含有微生物细胞。在一个方面中，微生物细胞以种子涂层形式，以10⁵-10⁹CFU的浓度直接施用于种子。在其它方面中，微生物细胞以另一种皮顶部上的种子外涂层形式，以10⁵-10⁹CFU的浓度施用。在其它方面中，微生物细胞与另一种种子处理剂一起以共同处理形式，以10⁵-10⁹CFU的浓度施用。

在各方面中，本公开涉及可促进植物生长的农业微生物配制物。在各方面中，本公开提供所教示的经分离的微生物，和包含其的聚生体，其待配制成农业生物接种体。所教示的生物接种体可施用于植物、种子或土壤。配制包含经分离的微生物的生物接种体的适合的实例可见于美国专利案第7,097,830号中，其以引用的方式并入本文中。

所公开的多微生物配制物可：降低对含氮肥料的需要、使矿物质溶解、保护植物抵抗病原体以及使植物可获得有价值的营养物，如磷酸盐，由此降低或消除对使用化学农药和化学肥料的需要。

在一些实施例中，在赋予所需植物物种一种或多种有利的性质或特性的方法中，可使用本公开的经分离和生物学上纯的微生物。

在一些实施例中，在赋予所需植物物种一种或多种有利的性质或特性的方法中，可使用含有本公开的经分离和生物学上纯的微生物的农业上可接受的组合物。

在一些实施例中，在赋予所需植物物种一种或多种有利的性质或特性的方法中，可使用本公开的聚生体。

在一些实施例中，在赋予所需植物物种一种或多种有利的性质或特性的方法中，可使用含有本公开的聚生体的农业上可接受的组合物。

在一些方面中，本公开的经分离和生物学上纯的微生物和/或本公开的聚生体是来源于加速微生物选择过程(“AMS”过程)。在本公开的一些方面中使用的AMS描述于例如以下文献中：(1)2012年9月20日公开为国际公开案第WO 2012125050 A1号的国际专利申请案第PCT/NZ2012/000041号，和(2)2014年3月27日公开为国际公开案第WO 2014046553 A1号的国际专利申请案第PCT/NZ2013/000171号，这些PCT申请案中的每一篇以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的。AMS过程描述于本公开中，例如图1到4中。

然而，在其它实施例中，本公开的微生物不来源于加速微生物选择过程。在一些方面中，本公开的实施例中使用的微生物是选自资料库中存在的微生物成员。在具体方面中，本公开的实施例中使用的微生物是基于所述微生物的具体特征而选自资料库中存在的微生物。

本公开假设可通过用经分离的微生物或微生物聚生体以通常无法在植物元件或植物部分上发现的量涂布所述植物元件或植物部分来使植物元件或植物部分有效扩增。

本文中所描述的一些实施例是用于制备农业种子组合物，或种子涂层的方法，其包含：使种子的表面与包含经纯化的微生物群体的配制物接触，所述经纯化的微生物群体包含至少一种对所述种子来说是异源的经分离的微生物。另外实施例需要制备农业植物组合物，其包含：使植物的表面与包含经纯化的微生物群体的配制物接触，所述经纯化的微生物群体包含至少一种对所述植物来说是异源的经分离的微生物。

在一些方面中，向种子或植物施用本公开的经分离的微生物、微生物聚生体和/或农业组合物可调节重要的农艺特性。重要的农艺特性可以是例如抗病性、抗旱性、耐热性、耐寒性、耐盐性、金属耐性、除草剂耐性、化学耐性、经改良的水使用效率、经改良的氮利用率、经改良的耐缺氮性、经改良的固氮作用、抗虫性、食草动物耐性、抗病原体性、增加的产量、在水受限条件下增加的产量、健康增强、活力改良、生长改良、光合作用能力改良、营养增强、改变蛋白质含量、改变含油量、增加生物质量、增加芽长度、增加根长度、改良根架构、增加种子重量、更快的种子出芽、改变种子碳水化合物组成、改变种子油组成、结荚的数目、延缓老化、常绿以及改变种子蛋白质组成。在一些方面中，调节至少2、3、4或更多种重要的农艺特性。在一些方面中，调节是对一种前述农艺特性的积极作用。

在一些方面中，本公开的经分离的微生物、聚生体和/或农业组合物可施用于植物，以调节或改变植物特征，如改变含油量、改变蛋白质含量、改变种子碳水化合物组成、改变种子油组成、改变种子蛋白质组成、化学耐性、耐寒性、延缓老化、抗病性、耐旱性、耳穗重量、生长改良、健康增强、耐热性、除草剂耐性、食草动物耐性、改良的固氮作用、改良的氮利用、改良的根架构、改良的水使用效率、增加生物质量、降低生物质量、增加根长度、降低根长度、增加种子重量、增加芽长度、降低芽长度、增加产量、在水受限条件下增加产量、果仁质量、果仁水分含量、金属耐性、耳穗数目、每个耳穗的果仁数目、结荚数目、营养增强、抗病原体性、抗虫性、光合作用能力改良、耐盐性、常绿、活力改良、增加成熟种子的干重、增加成熟种子的鲜重、增加每个植物的成熟种子的数目、增加叶绿素含量、增加每个植物的结荚数目、增加每个植物的结荚长度、降低每个植物的凋谢的叶子的数目、降低每个植物的严重凋谢的叶子的数目以及增加每个植物的未凋谢的叶子的数目、代谢物含量的可检测的调节、转录物含量的可检测的调节以及与参考植物有关的蛋白质组的可检测的调节。

在一些实施例中，本文中教示的农业配制物包含至少一个选自以下组成的组的成员：农业上相容的载剂、增粘剂、微生物稳定剂、杀真菌剂、抗菌剂、除草剂、杀线虫剂、杀昆虫剂、植物生长调节剂、灭鼠剂以及营养物。

本文所描述的方法可包括使种子或植物与至少100CFU或孢子、至少300CFU或孢子、至少1,000CFU或孢子、至少3,000CFU或孢子、至少10,000CFU或孢子、至少30,000CFU或孢子、至少100,000CFU或孢子、至少300,000CFU或孢子、至少1,000,000CFU或孢子或更多的本文中教示的微生物接触。

在本文所描述的方法的一些实施例中，本公开的经分离的微生物以在农业植物的目标组织内和/或目标组织上可被有效检测的量存在于配制物中。举例来说，在植物的目标组织中和/或目标组织上检测到至少100CFU或孢子、至少300CFU或孢子、至少1,000CFU或孢子、至少3,000CFU或孢子、至少10,000CFU或孢子、至少30,000CFU或孢子、至少100,000CFU或孢子、至少300,000CFU或孢子、至少1,000,000CFU或孢子或更多的量的微生物。或者或另外，本公开的微生物可按当与未被施用本公开的配制物的参考农业植物相比时，使被施用这类配制物的植物的生物质量和/或产量有效增加至少1％、至少2％、至少3％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或更多的量存在于配制物中。或者或另外，本公开的微生物可按当与未被施用本公开的配制物的参考农业植物相比时，使被施用这类配制物的植物的相关农艺特点有效地可检测地调节至少1％、至少2％、至少3％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或更多的量存在于配制物中。

在一些实施例中，本文中教示的农业组合物是耐贮存的。在一些方面中，本文中教示的微生物是冷冻干燥的。本文中还描述封闭于选自以下组成的组的物件内的多种经分离的微生物：瓶子、罐子、安瓿、包装袋、容器、包、盒子、储存箱、包膜、纸盒、容器、筒仓、船运集装箱、车箱以及箱子。

在一些方面中，组合所选择的植物物种与所公开的微生物(操作分类单元(OTU)、品系或包含前述各项中的任一种的组合物)可引起改良的作物产量和其产物生产。因此，在一个方面中，本公开提供第一植物的种子与涂布在所述第一植物的种子的表面上的微生物制剂的合成组合，使得与未经涂布的参考种子的表面相比，微生物以更高的含量存在于种子的表面上。在另一方面中，本公开提供第一植物的一部分与涂布在所述第一植物的所述部分的表面上的微生物制剂的合成组合，使得与未经涂布的参考植物部分相比，微生物以更高的含量存在于所述第一植物的所述部分的表面上。上述方法可单独使用，或与植物育种和转基因技术同时使用。

附图说明

图1展示所公开的用于加速微生物选择(AMS)(在本文中也称为定向微生物选择)的方法的示意性一般化过程。当在微生物联合体的情形下观察过程时，示意图是微生物联合体的定向进化过程的说明。所述过程是一种方法，其可用于获得本公开的有益微生物。

图2展示一个实施例的一般化过程流程图，其可用于获得本公开的有益微生物。

图3展示一个实施例的图形表示和相关流程图，其可用于获得本公开的有益微生物。

图4展示一个实施例的图形表示和相关流程图，其可用于获得本公开的有益微生物。

图5展示在用个别微生物品系(BCI)接种后第七天，小麦的平均总生物质量(鲜重克数)的图形表示。

图6展示在用个别微生物品系处理后第4天，玉米的平均芽长度(毫米)的图形表示。玉米种子用个别微生物品系(BDNZ编号)接种并且经历出芽测试。将种子接种，置放于湿纸巾上并且辊压。辊在密封塑料袋中在25℃下培育。将30个种子的每个个别品系各自一式两份地测试。在接种后第4天(DPI)测量芽长度。展示标准误差柱。结果表明尽管所测试的所有品系的出芽率都是良好的，但与活体内水对照物相比，在接种后第4天(DPI)，一些品系引起芽长度的相对增加。

图7展示在用个别微生物品系处理后第4天，玉米的平均根长度(毫米)的图形表示。玉米种子用个别微生物品系(BDNZ编号)接种并且经历出芽测试。将种子接种，置放于湿纸巾上并且辊压。辊在密封塑料袋中在25℃下培育。将30个种子的每个个别品系各自一式两份地测试。在接种后第4天(DPI)测量根长度。展示标准误差柱。结果表明尽管所测试的所有品系的出芽率都是良好的，但与活体内水对照物相比，在接种后第4天(DPI)，一些品系引起根长度的相对增加。

图8展示在用个别微生物品系处理后第4天，小麦的平均芽长度(毫米)的图形表示。小麦种子用个别微生物品系(BDNZ编号)接种并且经历出芽测试。将种子接种，置放于湿纸巾上并且辊压。辊在密封塑料袋中在25℃下培育。将30个种子的每个个别品系各自一式两份地测试。在处理后第4天测量芽长度。结果表明所测试的所有品系(>90％)的出芽率都是良好的，并且与活体外水对照物相比，在接种后第4天(DPI)，一些品系引起芽长度的相对增加。

图9展示在用个别微生物品系处理后第4天，小麦的平均根长度(毫米)的图形表示。小麦种子用个别微生物品系(BDNZ编号)接种并且经历出芽测试。将种子接种，置放于湿纸巾上并且辊压。辊在密封塑料袋中在25℃下培育。将30个种子的每个个别品系各自一式两份地测试。在处理后第4天测量根长度。结果表明所测试的所有品系(>90％)的出芽率都是良好的，并且与活体外水对照物相比，在接种后第4天(DPI)，一些品系引起根长度的相对增加。

图10展示在用个别微生物品系处理后第4天，番茄的平均芽长度(毫米)的图形表示。番茄种子用个别微生物品系(BDNZ编号)接种并且经历出芽测试。将种子接种，置放于湿纸巾上并且辊压。辊在密封塑料袋中在25℃下培育。将50个种子的每个个别品系各自一式两份地测试。在处理后第4天测量芽长度。水对照种子的芽的平均长度可见于标记为“H2O”的最右侧柱中。结果表明所测试的所有品系的出芽率都是良好的，并且与活体外水对照物相比，在接种后第4天(DPI)，一些品系引起芽长度的相对增加。

图11展示在用个别微生物品系处理后第4天，番茄的平均根长度(毫米)的图形表示。番茄种子用个别微生物品系(BDNZ编号)接种并且经历出芽测试。将种子接种，置放于湿纸巾上并且辊压。辊在密封塑料袋中在25℃下培育。将50个种子的每个个别品系各自一式两份地测试。在处理后第4天测量根长度。水对照种子的根的平均长度可见于标记为“H2O”的最右侧柱中。结果表明所测试的所有品系的出芽率都是良好的，并且与活体外水对照物相比，在接种后第4天(DPI)，一些品系引起根长度的相对增加。

国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(BUDAPEST TREATY ON THEINTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSE OFPATENT PROCEDURES)

在本申请案中描述的微生物保存在农业研究服务培养物收藏中心(AgriculturalResearch Service Culture Collection；NRRL)，其是位于1815North UniversityStreet,Peoria,IL 61604,USA的国际保存机构。

保存是在国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款下进行。

保存是根据37C.F.R.§§1.801-1.809和专利检查程序手册§§2402-2411.05中所阐述的准则进行并且符合所述准则。

NRRL寄存编号、保存日期以及关于前述布达佩斯条约保存物的说明提供于表1-3中。

表1

*表示已保存并且公众可获得的微生物物种，但所述物种不是确切的BCI或BDNZ品系的保存物。

表2

表3

具体实施方式

定义

尽管相信所属领域的一般技术人员将充分了解以下术语，但仍陈述以下定义以有助于说明本发明所公开的主题。

术语“一(a/an)”是指所述实体中的一个或多个，即可指多个指示物。因而，术语“一”、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可互换地使用。此外，通过不定冠词“一”提及“一个元件”并不排除存在超过一个元件的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅存在一个元件。

如本文所使用，术语“微生物体”或“微生物”应广泛考虑。这些术语可互换地使用并且包括(但不限于)两个原核结构域，细菌和古细菌，以及真核真菌和原生生物。在一些实施例中，本公开涉及表1-3中的“微生物”，或本公开中多种其它表格中的“微生物”。这种表征不仅可以指表格中所鉴别的分类细菌属，而且还可以指所鉴别的分类物种，以及所述表格中多种新型和新近鉴别的细菌品系。

术语“微生物聚生体”或“微生物联合体”是指个别微生物物种的微生物群体的子集，或物种的品系，其可描述为发挥共同功能，或可描述为参与或引起可识别的参数或植物表现型特性或与其相关联。所述群体可包含微生物的两种或更多种物种，或物种的品系。在一些情况下，微生物以共生方式在群体内共存。

术语“微生物群体”意指包含两种或更多种物种或品系的微生物群组。与微生物聚生体不同，微生物群体未必发挥共同功能，或未必参与或引起可识别的参数或植物表现型特性或与其相关联。

术语“加速微生物选择”或“AMS”可与术语“定向微生物选择”或“DMS”互换使用并且是指迭代选择方法，其在本公开的一些实施例中用于衍生所要求的微生物物种或所述物种的聚生体。

如本文中所使用，“分离物”、“经分离的”、“经分离的微生物”和类似术语意图指从至少一种在具体环境(例如土壤、水、植物组织)中与其相关联的材料分离的一种或多种微生物。

因此，“经分离的微生物”并不存在于其天然存在的环境中；实际上，通过本文中所描述的多种技术从其天然环境移出微生物并且处于非天然存在状态。因此，经分离的品系可以例如与农业载剂结合的生物学上纯的培养物或孢子形式(或品系的其它形式)存在。

在本公开的某些方面中，经分离的微生物以经分离和生物学上纯的培养物形式存在。所属领域的技术人员应了解，具体微生物的经分离和生物学上纯的培养物表示所述培养物基本上不含(在科学原因内)其它活的生物体并且仅含有所讨论的个别微生物。培养物可含有不同浓度的所述微生物。本公开注意到经分离和生物学上纯的微生物通常“必须不同于不太纯或不纯的材料”。参见例如In re Bergstrom,427F.2d 1394,(CCPA 1970)(讨论纯化的前列腺素)，还参见In re Bergy,596F.2d 952(CCPA 1979)(讨论纯化的微生物)，还参见Parke-Davis和Co.v.H.K.Mulford和Co.,189F.95(S.D.N.Y.1911)(Learned Hand，讨论纯化的肾上腺素)，aff'd in part,rev'd in part,196F.496(1912年第2期)，其中每一个以引用的方式并入本文中。此外，在一些方面中，本公开提供必须在经分离和生物学上纯的微生物培养物内发现的浓度或纯度界限的某些定量测量值。在某些实施例中，存在这些纯度值是可区分本发明所公开的微生物与以天然状态存在的微生物的另一种属性。参见例如Merck&Co.v.Olin Mathieson Chemical Corp.,253F.2d 156(1958年第4期)(讨论由微生物产生的维生素B12的纯度界限)，其以引用的方式并入本文中。

如本文中所使用，“个别分离物”应视为指在与一种或多种其它微生物分离之后，主要包含微生物的单一属、物种或品系的组合物或培养物。片语不应视为指示微生物的分离或纯化程度。然而，“个别分离物”可基本上仅包含微生物的一种属、物种或品系。

如本文中所使用，术语“生长培养基”是任何适合于支持植物生长的培养基。作为实例，培养基可以是天然或人造的，包括(但不限于)：土壤、盆栽混合土、树皮、蛭石、单独的并且施用于固体植物支持系统的水耕溶液以及组织培养凝胶。应了解，培养基可单独使用或与一种或多种其它培养基组合使用。其还可以在添加或不添加用于根和叶子的外源营养物和物理支持系统的情况下使用。

在一个实施例中，生长培养基是天然存在的培养基，如土壤、砂、泥浆、粘土、腐殖质、表土、岩石或水。在另一实施例中，生长培养基是人造的。这类人造的生长培养基可构筑成模拟天然存在的培养基的条件；然而，这并非必需的。人造的生长培养基可由任何数目的材料中的一种或多种和其组合制成，包括砂、矿物质、玻璃、岩石、水、金属、盐、营养物、水。在一个实施例中，生长培养基是无菌的。在另一实施例中，生长培养基不是无菌的。

培养基可被改善或富含其它化合物或组分，例如可有助于微生物与植物的特定群体以及彼此的相互相用和/或选择的组分。举例来说，可存在抗生素(如青霉素)或灭菌剂(例如季铵盐和氧化剂)和/或可改善生理条件(如盐度、植物营养物(例如有机和无机矿物质(如磷、氮盐、氨、钾和微量养分，如钴和镁)、pH值和/或温度)。

如本文中所使用，术语“植物”包括完整植物或其任何部分或衍生物，如植物细胞、植物原生质体、可使植物再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、胚芽、花粉、胚珠、果实、花朵、叶子、种子、根根端等。

如本文所使用，术语“栽培品种”是指已通过园艺或农艺技术产生并且通常不发现于野生型群体中的植物品种、品系或族类。

如本文中所使用，术语“双子叶植物(dicotyledon/dicot)”和“双子叶”是指具有胚芽的开花植物，所述胚芽含有两个子叶。如本文中所使用，术语“单子叶植物(monocotyledon/monocot)”和“单子叶”是指具有仅含有一个子叶的胚芽的开花植物。这些群组之间当然存在其它已知的差异，其将由所属领域的技术人员容易地识别。

如本文中所使用，“经改良”应广泛地用于涵盖与对照植物相比，或与所讨论的特征相关联的已知平均数量相比，植物的特征的改良。举例来说，与施用本公开的有益微生物或聚生体相关联的“经改良”植物生物质量可通过比较由本文中教示的微生物处理的植物的生物质量与未经处理的对照植物的生物质量来证明。或者，可以比较由本文中教示的微生物处理的植物的生物质量与既定植物通常达到的平均生物质量(如所属领域的技术人员已知的科学或农业出版物中表示)。在本公开中，“经改良”未必需要资料是统计显著的(即p<0.05)；实际上，任何表明一个值(例如平均处理值)与另一个值(例如平均对照值)的可定量差异可上升到“经改良”的程度。

如本文中所使用，“抑制和抑止”和类似术语不应解释为需要完全抑制或抑止，但在一些实施例中可能需要这种作用。

如本文中所使用，术语“基因型”是指个别细胞、细胞培养物、组织、生物体(例如植物)或生物体群组的基因组成。

如本文中所使用，术语“等位基因”意指基因的一种或多种替代形式中的任一种，其中所有等位基因涉及至少一种特性或特征。在二倍体细胞中，既定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的相应基因座。在实施例中，因为本公开涉及QTL，即可包含一种或多种基因或调节序列的基因组区域，在一些情况下，称为“单倍型”(即染色体区段的等位基因)比“等位基因”更准确，然而，在那些实例中，术语“等位基因”应理解为包含术语“单倍型”。等位基因在其表达类似表现型时被视为一致。序列中可能存在差异，但并不重要，只要其不影响表现型即可。

如本文中所使用，术语“基因座(locus)”(基因座(loci)的复数形式)意指可发现例如基因或基因标记物的染色体上的特定位置或位点。

如本文中所使用，术语“以基因方式连接”是指在育种期间，两种或更多种特性以高比率共同遗传，使得其难以通过杂交来分离。

如本文所使用，“重组”或“重组事件”是指染色体交叉或独立分类。术语“重组”是指具有作为重组事件的结果产生的新基因组成的植物。

如本文中所使用，术语“分子标记物”或“基因标记物”是指在用于观察核酸序列特征中的差异的方法中使用的指示物。这类指示物的实例是限制性片段长度多形现象(RFLP)标记物、经扩增的片段长度多形现象(AFLP)标记物、单核苷酸多态性(SNP)、插入突变、微卫星标记物(SSR)、经序列表征的扩增区域(SCAR)、经裂解的扩增多晶序列(CAPS)标记物或同工酶标记物或本文中所描述的标记物的组合(其定义特定基因和染色体位置)。等位基因附近分子标记物的定位是可由有分子生物技术经验的普通人执行的程序。

如本文中所使用，术语“特性”是指特征或表现型。举例来说，在本公开的一些实施例的情形下，作物产量涉及由植物产生的可销售生物质量(例如果实、纤维、谷物)的量。所需特性还可以包括其它植物特征，包括(但不限于)：水使用效率、营养物使用效率、生产率、机械收割能力、果实成熟期、存放期、抗虫性/抗病性、早期植物成熟期、耐胁迫性等。特性可以显性或隐性方式，或以部分或不完全显性方式遗传。特性可以是单基因性(即由单个基因座决定)或多基因性(即由超过一个基因座决定)或也可以由一种或多种基因与环境的相互相用产生。

显性特性引起在异型接合或同型接合状态下的完全表现型表现；隐性特性仅当在同型接合状态下存在时显示本身。

在本公开的情形下，特性也可以由一种或多种植物基因与一种或多种微生物基因的相互相用产生。

如本文中所使用，术语“同型接合”意指当两个一致的等位基因驻存在特定基因座，但个别地安置在二倍生物体的细胞中的相应同源染色体对上时存在的基因条件。相反，如本文中所使用，术语“异型接合”意指当两个不同等位基因驻存在特定基因座，但个别地安置在二倍生物体的细胞中的相应同源染色体对上时存在的基因条件。

如本文中所使用术语“表现型”是指个别细胞、细胞培养物、生物体(例如植物)或生物体群体的可观察的特征，其由个体的基因组成(即基因型)与环境之间的相互相用产生。

如本文中所使用，当描述核酸序列或蛋白质序列时，术语“嵌合”或“重组”是指将至少两个异源聚核苷酸或两个异源多肽连接成单个大分子，或使至少一个天然核酸或蛋白质序列的一个或多个元件重新排列的核酸或蛋白质序列。举例来说，术语“重组”可指序列中两个以其它方式分离的区段的人造组合，例如通过化学合成或通过遗传工程改造技术操作核酸中经分离的区段。

如本文中所使用，“合成核苷酸序列”或“合成多核苷酸序列”是已知在自然界中不存在或不是天然存在的核苷酸序列。通常，当与任何其它天然存在的核苷酸序列相比时，这类合成核苷酸序列将包含至少一种核苷酸差异。

如本文中所使用，术语“核酸”是指具有任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式，或其类似物。这一术语是指分子的初始结构，并且因此包括双股和单股DNA，以及双股和单股RNA。其还包括经修饰的核酸，如甲基化和/或封端核酸、含有经修饰的碱基、主链修饰的核酸等。术语“核酸”和“核苷酸序列”可互换地使用。

如本文中所使用，术语“基因”是指与生物功能相关联的任何DNA区段。因此，基因包括(但不限于)编码序列和/或其表达所需的调节序列。基因还可以包括未表达的DNA区段，其例如形成其它蛋白质的识别序列。基因可从多种来源获得，包括从相关来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，并且可包括设计成具有所需参数的序列。

如本文中所使用，术语“同源”或“同源物”或“直系同源物”是所属领域中已知的并且是指共有共同的祖先或家族成员并且基于序列一致性程度测定的相关序列。术语“同源性”、“同源”、“大体上类似”和“基本上对应”在本文中可互换地使用。其是指其中在一个或多个核苷酸碱基中的变化不影响核酸片段介导基因表达或产生某一表现型的能力的核酸片段。这些术语也指本发明的核酸片段的修饰，如一个或多个与初始、未经修饰的片段相比不显著改变所得核酸片段的功能特性的核苷酸的缺失或插入。因此，应理解，如所属领域的技术人员将了解，本公开涵盖超过特定例示性序列。这些术语描述在一种物种、亚种、变种、栽培品种或品系中发现的基因与另一种物种、亚种、变种、栽培品种或品系中的相应或等效基因之间的关系。在本公开中，比较同源序列。认为、相信或已知“同源序列”或“同源物”或“直系同源物”是功能相关的。功能关系可以多种方式中的任一种表示，包括(但不限于)：(a)序列一致性程度和/或(b)相同或类似的生物功能。优选的是，指示(a)和(b)。同源性可使用所属领域中容易获得的软件程序测定，如《最新分子生物学实验方法汇编(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编,1987)增刊30,章节7.718,表7.71中讨论的软件程序。一些比对程序是MacVector(Oxford Molecular Ltd，英国牛津布(Oxford,U.K.))、ALIGN Plus(Scientific and Educational Software，宾夕法尼亚州(Pennsylvania))以及AlignX(Vector NTI，Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))。另一种比对程序是Sequencher(Gene Codes，密歇根安娜堡(Ann Arbor,Michigan))，其使用默认参数。

如本文中所使用，术语“核苷酸变化”是指例如核苷酸取代、缺失和/或插入，如在所属领域中良好理解。举例来说，突变含有可产生沉默取代、添加或缺失，但不改变所编码的蛋白质的特性或活性或如何制得蛋白质的变化。

如本文中所使用，术语“蛋白质修饰”是指例如氨基酸取代、氨基酸修饰、缺失和/或插入，如在所属领域中良好理解。

如本文中所使用，术语核酸或多肽的“至少一部分”或“片段”意指具有这类序列的最小尺寸特征的部分，或全长分子任何更大的片段，最多是并且包括全长分子。本公开的聚核苷酸的片段可编码基因调节元件的生物活性部分。基因调节元件的生物活性部分可通过分离本公开的一种聚核苷酸中包含基因调节元件的部分并且如本文中所描述评估活性来制备。类似地，多肽的一部分可以是4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸等，最多是全长多肽。待使用的部分的长度将取决于具体应用。适用作杂交探针的核酸部分可短到12个核苷酸；在一些实施例中，其是20个核苷酸。适用作抗原决定基的多肽部分可短到4个氨基酸。多肽中发挥全长多肽功能的部分将通常长于4个氨基酸。

变异型聚核苷酸还涵盖来源于突变诱发和诱重组程序(如DNA改组)的序列。这类DNA改组的策略是所属领域中已知的。参见例如Stemmer(1994)《美国国家科学院院刊(PNAS)》91:10747-10751；Stemmer(1994)《自然(Nature)》370:389-391；Crameri等人(1997)《自然生物技术(Nature Biotech.)》15:436-438；Moore等人(1997)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》272:336-347；Zhang等人(1997)《美国国家科学院院刊》94:4504-4509；Crameri等人(1998)《自然》391:288-291；以及美国专利第5,605,793号和第5,837,458号。对于本文公开的聚核苷酸的PCR扩增，寡核苷酸引物可设计成用于PCR反应以由从任何相关植物提取的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法是所属领域中通常已知的并且公开于Sambrook等人(1989)《分子克隆实验指南(MolecularCloning:A Laboratory Manual)》(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约普莱恩维尤(Plainview,New York))。还参见Innis等人编(1990)《PCR方案：方法和应用指导(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications)》(Academic Press，纽约)；Innis和Gelfand编(1995)《PCR策略(PCR Strategies)》(Academic Press，纽约)；以及Innis和Gelfand编(1999)《PCR方法手册(PCR Methods Manual)》(Academic Press，纽约)。已知的PCR方法包括(但不限于)使用成对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分不匹配引物等的方法。

如本文所使用，术语“引物”是指能够粘接到允许DNA聚合酶连接的扩增目标的寡核苷酸，从而在处于诱导引物延伸产物合成的条件下(即在核苷酸和用于聚合的试剂(如DNA聚合酶)存在下和在适合的温度和pH值下)充当DNA合成的起始点。(扩增)引物优选是单股以获得扩增中的最大功效。优选的是，引物是寡脱氧核苷酸。引物必须足够长以在用于聚合的试剂存在下引发延伸产物的合成。引物的精确长度将取决于多种因素，包括引物的温度和组成(A/T对比G/C含量)。一对双向引子由一个正向和一个反向引物组成，如在DNA扩增(如PCR扩增)领域中通常使用。

术语“严格度”或“严格杂交条件”是指影响杂交物的稳定性的杂交条件，例如温度、盐浓度、pH值、甲酰胺浓度等。这些条件可凭经验最佳化以最大化特异性结合和最小化引物或探针与其目标核酸序列的非特异性结合。所使用的术语包括提及探针或引物将与其目标序列杂交的条件，达到与其它序列相比可检测地更大的程度(例如比背景大至少2倍)。严格条件具有序列依赖性并且将在不同情形下不同。更长序列在更高温度下特异性地杂交。通常，选择严格条件比既定离子强度和pH值下的特异性序列的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是使50％的互补目标序列与完全匹配的探针或引物杂交的温度(在既定离子强度和pH值下)。通常，严格条件将是其中在pH 7.0到8.3下盐浓度小于约1.0MNa+离子，通常是约0.01到1.0M Na+离子浓度(或其它盐)，并且温度是至少约30℃(对于短探针或引子(例如10到50个核苷酸))和至少约60℃(对于长探针或引子(例如大于50个核苷酸))的条件。严格条件也可以用添加去稳定化剂(如甲酰胺)来实现。例示性低严格度条件或“降低的严格度的条件”包括在37℃下与具有30％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液杂交并且在40℃下，在2×SSC中洗涤。例示性高严格度条件包括在37℃下，在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并且在60℃下，在0.1×SSC中洗涤。杂交程序是所属领域中是众所周知的并且由例如Ausubel等人,1998和Sambrook等人,2001描述。在一些实施例中，严格条件是在45℃下，在含有1mMNa2EDTA、0.5-20％十二烷基硫酸钠的0.25M Na2HPO4缓冲液(pH 7.2)杂交，如0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，接着在55℃到65℃下，在含有0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠的5×SSC中洗涤。

如本文中所使用，“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。启动子序列由接近和更靠近末端的上游元件组成，后一种元件通常称为强化子。因此，“强化子”是可以刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是启动子的固有元件或被插入以增强启动子的含量或组织特异性的异源元件。启动子可完全来源于原生基因，或由来源于在自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成DNA区段。所属领域的技术人员应理解，不同启动子可引导不同组织或细胞类型中基因的表达，或处于不同发育阶段，或响应不同的环境条件。还认识到，因为在大多数情况下，未完全界定调节序列的准确边界，一些变异形式的DNA片段可具有一致的启动子活性。

如本文中所使用，“植物启动子”是能够引发植物细胞中的转录的启动子，无论其来源是否是植物细胞，例如众所周知的是农杆菌属(Agrobacterium)启动子在植物细胞中具有功能性。因此，植物启动子包括从植物、植物病毒和细菌(如农杆菌属和短根瘤菌属(Bradyrhizobium)细菌)获得的启动子DNA。植物启动子可以是组成性启动子或非组成性启动子。

如本文中所使用，“组成性启动子”是在大部分条件下和/或在大部分发展阶段期间具有活性的启动子。在用于植物生物技术的表达载体中使用组成性启动子存在若干优势，如：用于选择转基因细胞或植物的蛋白质的高生产水准；报告蛋白质或评估标记物的高表达水准，使得易于检测和定量；作为调节转录系统的一部分的转录因子的高生产水准；生产在植物中需要普遍存在的活性的化合物；和生产在植物发育的所有阶段期间所需的化合物。非限制性例示性组成性启动子包括CaMV 35S启动子、冠瘿碱启动子、泛素启动子、醇脱氢酶启动子等。

如本文中所使用，“非组成性启动子”是在某些条件下、在某些类型的细胞中和/或在某些发育阶段期间具有活性的启动子。举例来说，组织特异性、组织优先、细胞类型特异性、细胞类型优先、诱导型启动子和在发育控制下为非组成性启动子的启动子。在发育控制下的启动子的实例包括优先起始在某些组织，如茎、叶子、根或种子中的转录的启动子。

如本文中所使用，“诱导型”或“阻抑型”启动子是在化学或环境因素控制下的启动子。可能影响通过诱导型启动子的转录的环境条件的实例包括厌氧条件或某些化学物质或存在光。

如本文中所使用，“组织特异性”启动子是仅仅在某些组织中起始转录的启动子。不同于基因的组成性表达，组织特异性表达是若干相互作用水准的基因调节的结果。因此，在所属领域中，有时优选的是使用来自同源或紧密相关植物物种的启动子以实现转基因在具体组织中的有效和可靠表达。这是大量从具体植物和组织分离的组织特异性启动子发现于科学和专利文献中的主要原因之一。

如本文中所使用，术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上核酸序列的偶联，使得一个核酸序列的功能由另一个调节。举例来说，启动子在其能够调节编码序列的表达时与所述编码序列可操作地连接(即，编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可以正义或反义定向可操作地连接于调节序列。在另一实例中，本公开的互补RNA区域可以使5'与目标mRNA可操作地连接(直接或间接)，或使3'与目标mRNA可操作地连接，或在目标mRNA内，或针对目标mRNA来说，第一互补区域是5'并且其补体是3'。

如本文中所使用，短语“重组型构筑体”、“表达构筑体”、“嵌合构筑体”、“构筑体”以及“重组型DNA构筑体”在本文中可互换地使用。重组型构筑体包含核酸片段(例如在自然界中未发现在一起的调节和编码序列)的人造组合。举例来说，嵌合构筑体可以包含来源于不同来源的调节序列和编码序列，或来源于同一来源的调节序列和编码序列，但其以与在自然界中发现的方式不同的方式排列。这类构筑体可单独使用或可与载体结合使用。如所属领域的技术人员众所周知，如果使用载体，那么载体的选择取决于用于使宿主细胞转型的方法。举例来说，可使用质体载体。所属领域的技术人员深知必须存在于载体上以便成功转型、选择和繁殖包含本公开的经分离的核酸片段中的任一种的宿主细胞的基因元件。所属领域的技术人员还将认识到不同的独立转型事件将引起不同的表达的量和模式(Jones等人,(1985)《欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)》4:2411-2418；De Almeida等人,(1989)《分子基因遗传学(Mol.Gen.Genetics)》218:78-86)，并且必须筛检多个事件以便获得显示所需表达量和模式的植株。这类筛检可尤其通过DNA的蛋白质分析、mRNA表达的北方印记分析(Northern analysis)、蛋白质表达的免疫印迹分析或表现型分析来实现。载体可以是质体、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等，其自发复制并且可整合入宿主细胞的染色体。载体还可以是非自发复制的裸RNA聚核苷酸、裸DNA聚核苷酸、由内相同股的DNA和RNA组成的聚核苷酸、聚赖氨酸结合的DNA或RNA、肽结合的DNA或RNA、脂质体结合的DNA等。如本文中所使用，术语“表达”是指功能性最终产物(例如mRNA或蛋白质(前驱体或成熟物))的产生。

在一些实施例中，细胞或生物体具有至少一种异源特性。如本文中所使用，术语“异源特性”是指由外源性DNA区段、异源聚核苷酸或异源核酸赋予经转型的宿主细胞或转基因生物体的表现型。本公开关注表现型的多种变化，包括(但不限于)修改植物中的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的病原体防御机制、提高具有经济重要特性的植物的产量(例如谷物产量、草料产量等)等。这些结果可使用本公开的方法和组合物通过提供异源产物的表达或增加的内源性产物的表达来获得。

“合成组合”可包括本公开的植物和微生物的组合。组合可例如通过用本公开的微生物涂布植物(如农业植物)的种子的表面或宿主植物组织(根、茎干、树叶等)来获得。此外，“合成组合”可包括多种品系或物种的微生物的组合。合成组合具有至少一个可区分所述组合与自然界中存在的任何组合的变量。变量尤其可以是不会天然存在的种子或植物组织上微生物的浓度，不会天然存在的和植物的组合，或不会天然共同存在的微生物或品系的组合。在这些实例中的每一个中，合成组合显示人为迹象并且具有当单独地考虑组合中的个别元素时不存在的结构和/或功能属性。

在一些实施例中，微生物可以对种子或植物来说是“内源性”。如本文中所使用，如果微生物是来源于作为其来源的植物样品，那么微生物对植物或种子视为“内源性”。也就是说，是否发现微生物在自然界中与所述植物相关联。在其中内源性微生物施用于植物的实施例中，那么内源性微生物以与在自然界中在植物上发现的含量不同的量施用。因此，如果微生物以在自然界中不存在的含量存在于既定植物上，那么对所述植物来说是内源性的微生物仍可与植物形成合成组合。

在一些实施例中，微生物可以对种子或植物来说是“外源性”(又称为“异源性”)。如本文中所使用，如果微生物不来源于作为其来源的植物样品，那么微生物对植物或种子视为“外源性”。也就是说，是否发现微生物在自然界中不与所述植物相关联。举例来说，通常与玉米植物的叶组织相关联的微生物视为对另一种在自然界中不含所述微生物的玉米植物的叶组织来说是外源性。在另一实例中，通常与玉米植物相关联的微生物视为对在自然界中不含所述微生物的小麦植物来说是外源性。

微生物还可以“以外源方式安置”在既定植物组织上。这意味着微生物置放于在自然界中未在上面发现其的植物组织上。举例来说，如果既定微生物仅在既定植物的根上天然存在，那么所述微生物可以外源方式施用于植物的地上组织并且将因此“以外源方式安置”在所述植物组织上。同样，当施用于不天然具有微生物或不天然具有所施用的数目的微生物的植物上时，所述微生物视为以外源方式安置。

本文中的组合物和方法可向宿主植物提供改良的“农艺特性”或“重要的农艺特性”，其可包括(但不限于)以下：与从不具有所述种子处理剂配制物的种子生长的等值植物相比，改变含油量、改变蛋白质含量、改变种子碳水化合物组成、改变种子油组成以及改变种子蛋白质组成、化学耐性、耐寒性、延缓老化、抗病性、耐旱性、耳穗重量、生长改良、健康增强、耐热性、除草剂耐性、食草动物耐性、改良氮固定、改良氮利用、改良根架构、改良水使用效率、增加生物质量、增加根长度、增加的种子重量、增加芽长度、增加的产量、在水有限条件下增加产量、果仁质量、果仁水分含量、金属耐性、耳穗数目、每个耳穗的果仁数目、结荚编号、营养增强、抗病原体性、抗虫性、光合作用能力改良、耐盐性、常绿、活力改良、增加成熟种子的干重、增加成熟种子的鲜重、增加每个植物的成熟种子的数目、增加叶绿素含量、增加每个植物的结荚数目、增加每个植物的结荚长度、降低每个植物的凋谢的叶子的数目、降低每个植物的严重凋谢的叶子的数目以及增加每个植物的未凋谢的叶子的数目、代谢物含量的可检测的调节、转录物含量的可检测的调节以及蛋白质组的可检测的调节。

由本公开的微生物和聚生体赋予既定植物物种有益特性的能力

本公开利用微生物赋予所需植物物种(如相关农艺物种)有益性质(或有益特性)。在本公开中，术语“有益性质”或“有益特性”可以互换地使用并且表示通过施用如本文中所描述的微生物或微生物聚生体来调节相关的所需植物表现型或基因性质。如前所述，在一些方面中，可能极佳的是由既定微生物产生的代谢物最终负责调节或赋予既定植物有益特性。

存在许多可通过施用本公开的微生物来调节的有益特性。举例来说，微生物可具有赋予植物物种一种或多种有益性质的能力，例如：增加生长、提高产量、提高氮利用效率、提高耐胁迫性、提高耐旱性、提高光合率、增强水使用效率、提高抗病原体性、未必影响植物产量，但实际上解决植物功能性，引起植物提高相关代谢物的产生的对植物架构的修改等。

在一些方面中，本文中教示的微生物提供广泛范围的农业应用，包括：改良谷物、果实和花朵产量；改良植物部分的生长；改良抗病性；改良在极端气候中的存活率；以及改良其它所需植物表现型特征。

在一些方面中，可向植物施用本公开的经分离的微生物、聚生体和/或农业组合物，以调节或改变植物特征，如改变含油量、改变蛋白质含量、改变种子碳水化合物组成、改变种子油组成、改变种子蛋白质组成、化学耐性、耐寒性、延缓老化、抗病性、耐旱性、耳穗重量、生长改良、健康增强、耐热性、除草剂耐性、食草动物耐性、改良的固氮作用、改良的氮利用、改良的根架构、改良的水使用效率、增加生物质量、增加根长度、增加种子重量、增加芽长度、增加产量、在水受限条件下增加产量、果仁质量、果仁水分含量、金属耐性、耳穗数目、每个耳穗的果仁数目、结荚数目、营养增强、抗病原体性、抗虫性、光合作用能力改良、耐盐性、常绿、活力改良、增加成熟种子的干重、增加成熟种子的鲜重、增加每个植物的成熟种子的数目、增加叶绿素含量、增加每个植物的结荚数目、增加每个植物的结荚长度、降低每个植物的凋谢的叶子的数目、降低每个植物的严重凋谢的叶子的数目以及增加每个植物的未凋谢的叶子的数目、代谢物含量的可检测的调节、转录物含量的可检测的调节以及与参考植物有关的蛋白质组的可检测的调节。

在一些方面中，可向植物施用本公开的经分离的微生物、聚生体和/或农业组合物，以按负性方式调节具体植物特征。举例来说，在一些方面中，本公开的微生物能够降低相关表现型特性，如可能在一些应用中需要这种功能性。举例来说，本公开的微生物可具有降低根生长或降低根长度的能力。或微生物可具有降低发芽生长或降低植物成长速度的能力，如在某些应用中需要植物特性的这些调节。

经分离的微生物-表1-3

在各方面中，本公开提供经分离的微生物，包括所鉴别的微生物物种的新品系，其呈现于表1-3中。

在其它方面中，本公开提供表1-3中鉴别的物种和品系的经分离的完整微生物培养物。这些培养物可包含多种浓度的微生物。

在各方面中，本公开提供在农业中利用选自表1-3的微生物。

在一些实施例中，本公开提供属于以下属的经分离的微生物物种：固氮菌属(Azotobacter)、固氮螺旋菌属(Azospirillum)、芽孢杆菌属(Bacillus)、芽生杆菌属(Bosea)、柄杆菌属(Caulobacter)、杜擀氏菌属(Duganella)、黄杆菌属(Flavobacterium)、草螺菌属(Herbaspirillum)、橙黄杆菌属(Luteibacter)、马赛菌属(Massilia)、粘液杆菌属(Mucilaginibacter)、泛菌属(Pantoeo)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、极单胞菌属(Polaromonas)、杜擀氏菌属(Pseudoduganella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拉恩氏菌属(Rahnella)、拉力菌属(Ramlibacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、赤球菌屬(Rhodococcus)、红育菌属(Rhodoferax)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobium)以及寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)。

在一些实施例中，在农业中利用来自芽生杆菌属的微生物以赋予植物物种一种或多种有益特性。

在一些实施例中，本公开提供经分离的微生物物种，其选自以下组成的组：褐球固氮菌、成团泛菌(最近重新分配成瓦氏泛菌)、荧光假单胞菌、稻皮假单胞菌、恶臭假单胞菌、水生拉恩菌、埃特里根瘤菌、红串赤球菌以及嗜麦芽窄食单胞菌。

在一些实施例中，本公开提供物种的新型经分离的微生物，其选自以下组成的组：褐球固氮菌、成团泛菌(最近重新分配成瓦氏泛菌)、荧光假单胞菌、稻皮假单胞菌、恶臭假单胞菌、水生拉恩菌、埃特里根瘤菌、红串赤球菌以及嗜麦芽窄食单胞菌。这些前述物种的具体新品系可见于表1-3中。

此外，本公开涉及具有与表1-3中鉴别的微生物的特征基本上类似的特征的微生物。

本公开中鉴别的经分离的微生物物种和所述物种的新品系能够赋予目标植物物种有益性质或特性。

举例来说，表1-3中描述的经分离的微生物或所述微生物的聚生体能够改良植物健康和活力。可定量测量改良的植物健康和活力，例如通过测量所述微生物应用对植物表现型或基因型特性的作用。

微生物聚生体-表1-3

在各方面中，本公开提供微生物聚生体，其包含选自表1中鉴别的微生物的至少任何两种微生物的组合。

在其它方面中，本公开提供微生物聚生体，其包含选自表2中鉴别的微生物的至少任何两种微生物的组合。

在其他方面中，本公开提供微生物聚生体，其包含选自表3中鉴别的微生物的至少任何两种微生物的组合。

并且，本公开提供微生物聚生体，其包含选自表1-3中鉴别的微生物的至少任何两种微生物的组合。

在某些实施例中，本公开的聚生体包含两种微生物，或三种微生物，或四种微生物，或五种微生物，或六种微生物，或七种微生物，或八种微生物，或九种微生物，或十种或更多种微生物。聚生体中的所述微生物是不同微生物物种，或微生物物种的不同品系。

在一些实施例中，本公开提供聚生体，其包含：至少两种属于以下属的经分离的微生物物种：固氮菌属、固氮螺旋菌属、芽孢杆菌属、芽生杆菌属、柄杆菌属、杜擀氏菌属、黄杆菌属、草螺菌属、橙黄杆菌属、马赛菌属、粘液杆菌属、泛菌属、类芽孢杆菌属、极单胞菌、杜擀氏菌属、假单胞菌属、拉恩氏菌属、拉力菌属、根瘤菌属、赤球菌屬、红育菌属、鞘氨醇杆菌属以及寡养单胞菌属。

在一些实施例中，本公开提供聚生体，其包含：至少两种选自以下组成的组的经分离的微生物物种：褐球固氮菌、成团泛菌(最近重新分配成瓦氏泛菌)、荧光假单胞菌、稻皮假单胞菌、恶臭假单胞菌、水生拉恩菌、埃特里根瘤菌、红串赤球菌以及嗜麦芽窄食单胞菌。

在一些实施例中，本公开提供聚生体，其包含：物种的至少两种新型经分离的微生物品系，其选自以下组成的组：褐球固氮菌、成团泛菌(最近重新分配成瓦氏泛菌)、荧光假单胞菌、稻皮假单胞菌、恶臭假单胞菌、水生拉恩菌、埃特里根瘤菌、红串赤球菌以及嗜麦芽窄食单胞菌。这些前述物种的具体新品系可见于表1-3中。

在具体方面中，本公开提供微生物聚生体，其包含如表4-10中分组的物种。关于表4-10，字母A到I表示本公开的微生物的非限制性选择，其定义为：

A＝表1中鉴别的褐球固氮菌和相关新品系；

B＝表1中鉴别的成团泛菌(最近重新分配成瓦氏泛菌)和相关新品系；

C＝表1中鉴别的荧光假单胞菌和相关新品系；

D＝表1中鉴别的稻皮假单胞菌和相关新品系；

E＝表1中鉴别的恶臭假单胞菌和相关新品系；

F＝表1中鉴别的水生拉恩菌和相关新品系；

G＝表1中鉴别的埃特里根瘤菌和相关新品系；

H＝表1中鉴别的红串赤球菌和相关新品系；以及

I＝表1中鉴别的嗜麦芽窄食单胞菌和相关新品系。

表4：八种和九种品系的聚生体

表5：七种品系的聚生体

表6：六种品系的聚生体

表7：五种品系的聚生体

表8：四种品系的聚生体

表9：三种品系的聚生体

表10：两种品系的聚生体

A、B

A、C

A、D

A、E

A、F

A、G

A、H

A、I

B、C

B、D

B、E

B、F

B、G

B、H

B、I

C、D

C、E

C、F

C、G

C、H

C、I

D、E

D、F

D、G

D、H

D、I

E、F

E、G

E、H

E、I

F、G

F、H

F、I

G、H

G、I

H、I

在一些实施例中，微生物聚生体可选自来自表4-10的任何成员组。

经分离的微生物-源材料

本公开的微生物是在新西兰和美国的多个地区以及其它地方获得。

经分离的微生物-微生物培养技术

利用标准微观技术鉴别表1-3中的微生物以表征微生物的表现型，其接着用于将微生物鉴别为以分类方式识别的物种。

本公开的微生物的分离、鉴别和培养可使用标准微生物技术实现。这类技术的实例可见于Gerhardt,P.(编),《一般和分子微生物学方法(Methods for General andMolecular Microbiology)》,美国微生物学会(American Society for Microbiology),Washington,D.C.(1994)和Lennette,E.H.(编),《临床微生物学手册(Manual of ClinicalMicrobiology)》,第三版,美国微生物学会,Washington,D.C.(1980)，其皆以引用的方式并入本文中。

分离可通过将样品以条纹形式置放于固体培养基(例如营养物琼脂板)上以获得单个群落(其特征在于上文描述的表现型特性(例如革兰氏阳性/阴性(Gram positive/negative)、能够以好氧/厌氧方式形成孢子、细胞形态、碳源代谢、酸/碱产生、酶分泌、代谢分泌物等)和降低用变得被污染的培养物进行操作的可能性来实现。

举例来说，对于本公开的经分离的细菌，生物学上纯的分离物可通过生物样品的重复继代培养获得，在每次继代培养之后以条纹方式置放于固体培养基上以获得个别群落。制备冻干细菌、使其解冻和生长的方法是众所周知的，例如Gherna,R.L.和C.A.Reddy.2007,《培养物保藏(Culture Preservation)》,第1019-1033页,C.A.Reddy,T.J.Beveridge,J.A.Breznak,G.A.Marzluf,T.M.Schmidt和L.R.Snyder编,美国微生物学协会,Washington,D.C.,1033页；其以引用的方式并入本文中。因此，涵盖在含有甘油的溶液中，在-70℃下冷冻长期储存的经干燥的液体配制物和培养物以用于提供本发明的配制物。

本公开的细菌可在好氧条件下，在液体培养基中繁殖。用于使本公开的细菌菌株生长的培养基包括碳源、氮源和无机盐，以及特殊需要的物质，如维生素、氨基酸、核酸等。可用于使细菌菌株生长的适合的碳源的实例包括(但不限于)淀粉、蛋白胨、酵母提取物、氨基酸、糖，如葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡糖胺、麦芽糖等；有机酸(如乙酸、反丁烯二酸、己二酸、丙酸、柠檬酸、葡糖酸、苹果酸、丙酮酸、丙二酸等)的盐；醇，如乙醇和甘油等；油或脂肪，如大豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油。所添加的碳源的量根据碳源种类而变化并且通常在每升培养基1到100克之间。优选的是，培养基中含有0.1-5％(W/V)的浓度的葡萄糖、淀粉和/或蛋白胨作为主要碳源。可用于使本发明的细菌菌株生长的适合的氮源的实例包括(但不限于)氨基酸、酵母提取物、胰蛋白胨、牛肉提取物、蛋白胨、硝酸钾、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、氨或其组合。氮源的量根据氮源的类型而变化，通常在每升培养基0.1到30克之间。无机盐、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、硫酸亚铁、氯化铁、氯化亚铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化锌、硫酸铜、氯化钙、氯化钠、碳酸钙、碳酸钠可单独或以组合形式使用。无机酸的量根据无机盐的种类而变化，通常在每升培养基0.001到10克之间。特殊需要的物质的实例包括(但不限于)维生素、核酸、酵母提取物、蛋白胨、肉类提取物、麦芽提取物、干燥酵母和其组合。培养可在实现细菌菌株生长的温度下实现，基本上在20℃与46℃之间。在一些方面中，温度范围是30℃-37℃。对于最佳生长，在一些实施例中，可将培养基调节到pH 7.0-7.4。应了解，还可以使用市售培养基培养细菌菌株，如可从密歇根州底特律(Detroit,MI)的Difco购得的Nutrient Broth或NutrientAgar。应了解，培养时间可视所使用的培养基类型和作为主要碳源的糖的浓度而不同。

在各方面中，培养持续24-96小时。使用所属领域中是众所周知的方法分离由此获得的细菌细胞。实例包括(但不限于)薄膜过滤和离心分离离心分离。可使用氢氧化钠等调节pH值并且可使用冷冻干燥器干燥培养物，直到水含量变成4％或更低。微生物共培养物可通过如上文所描述繁殖各品系来获得。应了解，当可使用相容的培养条件时，可共同培养微生物品系。

经分离的微生物-微生物品系

微生物可基于多相分类而区分入一个属，所述多相分类将所有可获得的表现型和基因型资料合并成共同分类(Vandamme等人,1996,《多相分类，细菌分类学的共同方法(Polyphasic taxonomy,a consensus approach to bacterial systematics)》,《微生物学综述(Microbiol Rev)》1996,60:407-438)。一种公认的用于定义物种的基因型方法是基于整体基因组相关性，使得在标准条件下，在5℃或更低的ΔT_m(同源与异源杂交物之间的熔融温度的差异)下使用DNA-DNA杂交时共有约70％或更高相关性的品系被视为相同物种的成员。因此，共有超过前述70％临界值的群组可被视为相同物种的变异体。

通常施用16S rRNA序列产生物种之间的区别，其中16S rRNA序列与参考序列共有小于指定序列一致性％，那么用于获得序列的两种生物体视为不同物种。

因此，如果遍及16S rRNA序列共有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列一致性，那么可将微生物视为相同物种。在各方面中，微生物仅在其共有至少95％一致性时才可被视为相同物种。

此外，可定义物种的微生物品系，如遍及16S rRNA序列共有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的品系。还可以针对参考序列与23S rRNA序列进行比较。在各方面中，微生物仅在其共有至少95％一致性时才可被视为相同品系。在实施例中，“大体上类似的基因特征”意指共有至少95％一致性的微生物。

在不存在表现型测定的情况下，无法培养的微生物通常无法指定为确切物种，微生物可被指定成一个属内的丝状菌名称，只要其16S rRNA序列与已知的物种符合一致性原理即可。

一种方法是观察序列空间中紧密相关物种的许多品系的分布和鉴别从其它丛集良好解析的品系的丛集。这种方法已通过使用多核(管家(house-keeping))基因的级联序列评估丛集模式来发展，并且已被称为多位点序列分析(MLSA)或多位点序列系统发生分析。已通过现有分类方法将MLSA成功地用于探索指定为极紧密相关物种的许多品系中的丛集模式，以观察一个属内或更广泛分类组内少数品系之间的关系，和解决特定分类问题。更一般来说，所述方法可用于探寻细菌物种是否存在，也就是说，观察一大群类似品系是否总是属于良好解析的丛集，或在一些情况下，是否存在其中未观察到明显分离成各丛集的基因连续性。

为了更准确进行各属的测定，进行表现型特性(如形态)、生物化学以及生理学特征的测定以用于与参考属原型进行比较。群落形态可包括颜色、形状、色素沉着、粘液产生等。关于形状、尺寸、革兰氏反应(Gram reaction)、细胞外物质、孢子内壁的存在、鞭毛存在和位置、活动性和包涵体来描述细胞的特征。生物化学和生理学特征描述生物体在不同范围的温度、pH值、盐度和大气压条件的生长，在不同的唯一碳和氮源存在下的生长。所属领域的一般技术人员将合理地知晓定义本公开的各属的表现型特性。举例来说，使用具体琼脂(例如YMA)上的群落颜色、形式以及纹理来鉴别根瘤菌属的物种。

在一个实施例中，本文中教示的微生物是利用16S rRNA基因序列鉴别。所属领域中已知16S rRNA含有高变区，其可提供适用于细菌鉴别的物种/品系特异性标记序列。在本公开中，通过部分(500-1200bp)16S rRNA序列标记来鉴别许多微生物。在各方面中，每个品系代表选自琼脂盘的纯的群落分离物。基于琼脂培养基上群落的任何既定形态特征来进行选择，以表示所存在的生物体的多样性。在实施例中，所使用的培养基是R2A、PDA、无氮型半固体培养基或MRS琼脂。在24小时生长之后进行每个‘经挑选’的分离物的群落说明并且接着输入到我们的资料库中。接着获得每个分离物的序列资料。

使用16S rRNA基因的系统发生的分析用于定义属于共同属的“大体上类似”物种以及定义既定分类物种的“大体上类似”品系。此外，我们记录分离物的生理学和/或生物化学特性，其可用于突出可引起植物的有利状态的品系之间的较小和显著差异。

农业组合物

在一些实施例中，本公开的微生物组合成农业组合物。在一些实施例中，本公开的农业组合物包括(但不限于)：湿润剂、相容剂(也称为“相容性试剂”)、消泡剂、清洗剂、螯合剂、防飘移剂、中和剂和缓冲剂、腐蚀抑制剂、染料、气味剂、扩展剂(也称为“散布剂”)、渗透助剂(也称为“渗透剂”)、粘着剂(也称为“粘合剂”或“结合剂”)、分散剂、增稠剂(也称为“稠化剂”)、稳定剂、乳化剂、冷冻点抑制剂、抗菌剂等。

在一些实施例中，本公开的农业组合物是固体。当使用固体组合物时，可能需要包括一种或多种载剂材料以及活性经分离的微生物或聚生体。在一些实施例中，本公开教示载剂的用途，包括(但不限于)：矿物质土，如二氧化硅、二氧化硅凝胶、硅酸盐、滑石、高岭土、美国活性白土(limestone)、石灰石、白垩、黄土、粘土、白云石、硅藻土、硫酸钙、硫酸镁、氧化镁、经研磨的合成材料、肥料(如硫酸铵)、磷酸铵、硝酸铵、硫脲和脲、植物来源产物(谷粉、树皮粉、木粉以及果壳粉)、纤维素粉末、绿坡缕石、蒙脱石、云母、蛭石、合成二氧化硅和合成硅酸钙，或这些物质的组合物。

在一些实施例中，本公开的农业组合物是液体。因此，在一些实施例中，本公开教示的是，本文中公开的农业组合物可包括化合物或盐，如单乙醇胺盐、硫酸钠、硫酸钾、氯化钠、氯化钾、乙酸钠、硫酸氢铵、氯化铵、乙酸铵、甲酸铵、草酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵、硫代硫酸铵、二磷酸氢铵、单磷酸二氢铵、磷酸氢钠铵、硫氰酸铵、氨基磺酸铵或氨基甲酸铵。

在一些实施例中，本公开教示的是，农业组合物可包括结合剂，如：聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、部分水解的聚乙酸乙烯酯、羧基甲基纤维素、淀粉、乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物以及聚乙酸乙烯酯，或这些物质的组合物；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸钠、滑石或聚乙二醇，或这些物质的组合物；消泡剂，如聚硅氧乳液、长链醇、磷酸酯、乙炔二醇、脂肪酸或有机氟化合物，以及络合剂，如：乙二胺四乙酸(EDTA)的盐、三次氮基三乙酸的盐或聚磷酸的盐，或这些物质的组合物。

在一些实施例中，农业组合物包含表面活性剂。在一些实施例中，向液体农业组合物中添加表面活性剂。在其它实施例中，向固体配制物，尤其被设计成在施用之前用载剂稀释的配制物中添加表面活性剂。因此，在一些实施例中，农业组合物包含表面活性剂。有时使用表面活性剂(单独或与其它添加剂一起，如矿物质或植物油)作为佐剂用于喷雾箱混合物以改良微生物对目标的生物性能。用于生物增强剂的表面活性剂的类型通常取决于微生物的性质和作用模式。表面活性剂的特征可以是阴离子性、阳离子性或非离子性，并且可用作乳化剂、湿润剂、悬浮剂或用于其它目的。在一些实施例中，表面活性剂是非离子物质，如：烷基乙氧基化物、乙氧基化直链脂肪醇以及乙氧基化脂肪族胺。配制物领域中常用并且还可以用于本发明的配制物中的表面活性剂描述于《麦克卡森的清洁剂和乳化剂年鉴(McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual)》,MC Publishing Corp.,新泽西州里齐伍(Ridgewood,N.J.),1998和《表面活性剂百科全书(Encyclopedia ofSurfactants)》,第I-III卷,Chemical Publishing Co.,纽约,1980-81。在一些实施例中，本公开教示表面活性剂的用途，包括芳香族磺酸(例如木素磺酸、酚磺酸、萘磺酸以及二丁基萘磺酸；芳基磺酸酯、烷基醚、十二烷基醚、脂肪醇硫酸盐以及脂肪醇二醇醚硫酸盐的脂肪酸)的碱金属、碱土金属或铵盐；磺化萘和其衍生物其衍生物与甲醛的缩合物；萘的缩合物或萘磺酸与酚和甲醛的缩合物；酚或酚磺酸与甲醛的缩合物；酚与甲醛和亚硫酸钠的缩合物；聚氧乙烯辛基苯基醚；乙氧基化异辛基酚、乙氧基化辛基酚或乙氧基化壬基酚；三丁基苯基聚二醇醚；烷基芳基聚醚醇；异十三基醇；乙氧基化蓖麻油；乙氧基化三芳基酚；乙氧基化磷酸化三芳基酚的盐；十二烷醇聚二醇醚乙酸盐；山梨糖醇酯；木质素-亚硫酸盐废液或甲基纤维素，或这些物质的组合物。

在一些实施例中，本公开教示其它适合的表面活性剂，包括烷基硫酸酯的盐，如十二烷基硫酸二乙醇铵；烷基芳基磺酸盐，如十二烷基苯磺酸钙；烷基苯酚-环氧烷加成产物，如壬基酚-C₁₈乙氧基化物；乙醇-环氧烷加成产物，如十三烷基醇-C₁₆乙氧基化物；皂类，如硬脂酸钠；烷基萘-磺酸盐，如二丁基萘磺酸钠；磺基丁二酸盐的二烷基酯，如二(2-乙基己基)磺基丁二酸钠；山梨糖醇酯，如山梨糖醇油酸酯；季胺，如氯化十二烷基三甲基铵；脂肪酸的聚乙二醇酯，如聚乙二醇硬脂酸酯；环氧乙烷与环氧丙烷的嵌段共聚物；单烷基和二烷基磷酸酯的盐；植物油，如大豆油、油菜籽/菜籽油、橄榄油、蓖麻油、葵花籽油、椰子油、玉米油、棉籽油、亚麻籽油、棕榈油、花生油、红花油、芝麻油、桐油等；以及以上植物油的酯，尤其甲酯。

在一些实施例中，农业组合物包含湿润剂。湿润剂是在添加到液体中时可通过降低液体与上面扩散液体的表面之间的界面张力来提高液体的扩散或渗透能力的物质。处于两种主要功能而在农业化学配制物中使用湿润剂：在处理和制造期间提高粉末在水中的湿润率以制备可溶性液体浓缩物或悬浮液浓缩物；和在喷雾箱或其它容器中混合产物与水期间缩短可湿性粉末的湿润时间和改良水进入水分散性颗粒的渗透。在一些实施例中，本公开的农业组合物(包括可湿性粉末、悬浮液浓缩物以及水分散性颗粒配制物)中使用的湿润剂的实例是：十二烷基硫酸钠；二辛基磺基丁二酸钠；乙氧基化烷基酚；以及乙氧基化脂肪醇。

在一些实施例中，本公开的农业组合物包含分散剂。分散剂是吸附在粒子表面上并且有助于保持粒子的分散状态和防止其重新聚集的物质。在一些实施例中，在制造期间向本公开的农业组合物中添加分散剂以促进分散和悬浮，以及确保粒子在喷雾箱中重新分散于水中。在一些实施例中，分散剂用于可湿性粉末、悬浮液浓缩物以及水分散性颗粒中。用作分散剂的表面活性剂具有强力吸附到粒子表面上并且提供针对粒子的重新聚集的带电或空间障壁的能力。在一些实施例中，最常用的表面活性剂是阴离子性、非离子性或两种类型的混合物。

在一些实施例中，对于可湿性粉末配制物，最常用的分散剂是木素磺酸钠。在一些实施例中，悬浮液浓缩物使用聚电解质(如萘磺酸钠甲醛缩合物)提供极良好的吸附和稳定作用。在一些实施例中，还使用乙氧基化三苯乙烯基苯酚磷酸酯。在一些实施例中，如烷基芳基乙烯氧化物缩合物和EO-PO嵌段共聚物有时与作为分散剂的阴离子表面活性剂组合以用于悬浮液浓缩物。

在一些实施例中，本公开的农业组合物包含聚合表面活性剂。在一些实施例中，聚合表面活性剂极长的疏水性‘骨架’和许多环氧乙烷链，其形成‘梳状’表面活性剂的‘齿’。在一些实施例中，这些高分子量聚合物可使悬浮液浓缩物具有极良好的长期稳定性，因为疏水性骨架在粒子表面上具有许多锚定点。在一些实施例中，本公开的农业组合物中使用的分散剂的实例是：木素磺酸钠；萘磺酸钠甲醛缩合物；乙氧基化三苯乙烯基苯酚磷酸酯；乙氧基化脂肪醇；烷基乙氧基化物；EO-PO嵌段共聚物；以及接枝共聚物。

在一些实施例中，本公开的农业组合物包含乳化剂。乳化剂是使一种液相的液滴的悬浮液在另一种液相中稳定的物质。当不存在乳化剂时，两种液体将分离成两种不可混溶的液相。在一些实施例中，最常用的乳化剂掺合物包括12个或更多的环氧乙烷单元的烷基苯酚或脂肪醇以及油溶性十二烷基苯磺酸的钙盐。在8到18范围内的亲水-亲油平衡(“HLB”)值通常将提供良好的稳定乳液。在一些实施例中，乳液稳定性有时可通过添加少量的EO-PO嵌段共聚物表面活性剂来改良。

在一些实施例中，本公开的农业组合物包含增溶剂。增溶剂是表面活性剂，其将在超过临界微胞浓度的浓度下在水中形成微胞。接着，微胞能够使微胞的疏水性部分内的不溶于水的材料分解或溶解。通常用于溶解的表面活性剂的类型是非离子性表面活性剂：脱水山梨糖醇单油酸酯；乙氧基化脱水山梨糖醇单油酸酯；以及油酸甲酯。

在一些实施例中，本公开的农业组合物包含有机溶剂。有机溶剂主要用于可乳化浓缩物的配制物、ULV配制物以及较小程度地用于颗粒状配制物中。有时，使用溶剂的混合物。在一些实施例中，本公开教示溶剂的用途，所述溶剂包括脂肪族链烷烃油，如煤油或精炼石蜡。在其它实施例中，本公开教示芳香族溶剂的用途，如二甲苯和具有C9和C10的较高分子量部分的芳香族溶剂。在一些实施例中，氯化烃适用作共溶剂以在配制物在水中乳化时防止农药结晶。有时使用醇作为共溶剂以提高溶剂功能。

在一些实施例中，农业组合物包含胶凝剂。增稠剂或胶凝剂主要用于悬浮液浓缩物、乳液和悬浮乳液的配制中，以改变液体的流变学或流动性以及防止分散的粒子或液滴的分离和沉降。增稠剂、胶凝剂以及防沉降剂通常属于两种类别，即不溶于水的颗粒和水溶性聚合物。有可能使用粘土和二氧化硅产生悬浮液浓缩物配制物。在一些实施例中，农业组合物包含一种或多种增稠剂，包括(但不限于)蒙脱石，例如膨润土、硅酸镁铝；以及绿坡缕石。在一些实施例中，本公开教示使用多糖作为增稠剂。最常用的多糖的类型是种子和海藻的天然提取物或纤维素的合成衍生物。一些实施例利用黄原胶并且一些实施例利用纤维素。在一些实施例中，本公开教示增稠剂的用途，包括(但不限于)：瓜尔豆胶；刺槐豆胶；角叉菜胶；海藻酸盐；甲基纤维素；羧甲基纤维素钠(SCMC)；羟基乙基纤维素(HEC)。在一些实施例中，本公开教示其它类型的防沉降剂的用途，如经改性的淀粉、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇以及聚氧化乙烯。另一种良好的防沉降剂是三仙胶。

在一些实施例中，存在表面活性剂(其降低界面张力)可引起基于水的配制物在通过喷雾箱进行的制备和施用中的混合操作期间起泡。因此，在一些实施例中，为了降低起泡趋势，通常在制备阶段期间或在填充到瓶子/喷雾槽中之前添加消泡剂。通常，存在两种类型的下消泡剂，即硅酮和非硅酮。硅酮通常是二甲基聚硅氧烷的水性乳液，而非聚硅氧消泡剂是不溶于水的油，如辛醇和壬醇，或二氧化硅。在两种情况下，消泡剂的功能是从空气-水界面转移表面活性剂。

在一些实施例中，农业组合物包含防腐剂。

此外，根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物群落可与农业领域中可用的已知活性剂组合，如：农药、除草剂、杀菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀病毒剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀疥虫剂、植物生长调节剂、灭鼠剂、抗藻剂、生物控制或有利的试剂。此外，根据所公开的方法研发的微生物、微生物聚生体或微生物群落可与已知的肥料组合。这类组合可呈现协同特性。此外，根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物群落可与惰性成分组合。而且，在一些方面中，所公开的微生物与生物活性剂组合。

由本公开的微生物和聚生体产生的代谢物

在一些情况下，本公开的微生物可产生一种或多种化合物和/或具有一种或多种活性，例如以下中的一种或多种：产生代谢物、产生植物激素(如生长素)、产生乙偶姻、产生抗微生物化合物、产生含铁细胞、产生纤维素酶、产生果胶酶、产生壳质酶、产生木聚糖酶、氮固定或矿物质磷酸盐溶解。

举例来说，本公开的微生物可产生选自以下组成的组的植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素、乙烯、油菜素内固醇以及脱落酸。

因此，“由本公开的微生物产生的代谢物”意图涵盖由微生物产生的任何分子(小分子、维生素、矿物质、蛋白质、核酸、脂质、脂肪、碳水化合物等)。通常，本公开的微生物赋予既定植物物种有益特性的精确作用机制是未知的。假设在一些情况下，微生物产生对植物有益的代谢物。因此，在一些方面中，微生物的无细胞或不活化制剂对植物有益，因为微生物并不必须是活的以赋予既定植物物种有益特性，只要所述制剂包括由所述微生物产生的代谢物并且其对植物有益即可。

在一个实施例中，本公开的微生物可产生生长素(例如吲哚-3-乙酸(IAA))。可分析生长素的产生。本文中所描述的许多微生物当在培养物中生长时能够产生植物激素生长素吲哚-3-乙酸(IAA)。生长素在更改植物的生理学(包括根生长程度)中起重要作用。

因此，在一个实施例中，本公开的微生物以安置于表面上或既定植物物种的组织内的群体形式存在。微生物可按当与未用本公开的微生物或无细胞或非活性制剂处理的参考植物相比时，可有效地引起在植物上或植物内发现的代谢物的量可检测增加的量产生代谢物。由所述微生物群体产生的代谢物可对植物物种有益。

植物生长调节剂和生物刺激剂

在一些实施例中，本公开的农业组合物包含与所教示的微生物组合使用的植物生长调节剂和/或生物刺激剂。

在一些实施例中，根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物群落可与农业领域中已知的植物生长调节剂组合，如：生长素、赤霉素、细胞分裂素、乙烯产生剂、生长抑制剂以及生长阻滞剂。

举例来说，在一些实施例中，本公开教示农业组合物，其包含以下活性成分中的一种或多种，所述活性成分尤其包括：环丙嘧啶醇、比达宁(butralin)、醇、矮壮素、细胞分裂素、亚拉生长素、丁酰肼、艾斯芬(ethepohon)、呋嘧醇、赤霉酸、赤霉素混合物、吲哚-3-丁酸(IBA)、马来酸酰肼、美孚得(mefludide)、氯化壮棉素、五硼酸壮棉素、萘-乙酸(NAA)、1-萘乙酰胺(NAD)、正癸醇、普拉布唑(placlobutrazol)、调环酸钙、抗倒酯、烯效唑、水杨酸、脱落酸、乙烯、油菜素内固醇、茉莉酮酸酯、多元胺、氧化氮、独脚金内酯或卡里金(karrikins)。

在一些实施例中，根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物群落可与农业领域中已知的种子接种体组合，尤其如：

在一些实施例中，短根瘤菌接种体与本文中所公开的任何单一微生物或微生物聚生体组合使用。在具体方面中，当组合一种前述接种体(例如

或短根瘤菌)与本文中教示的微生物或微生物聚生体时观察到协同作用。

在一些实施例中，本公开的农业组合物包含植物生长调节剂，其含有：活动素、赤霉酸和吲哚丁酸以及铜、锰和锌。

在一些方面中，包含本公开的微生物(例如表1-3中的任何微生物或其组合)和活动素、赤霉酸和吲哚丁酸以及铜、锰和锌的农业组合物呈现共同发挥协同作用的能力。

在一些实施例中，本公开教示农业组合物，其包含一种或多种市售植物生长调节剂，包括(但不限于)

Royaltac

Early

Boll

Cotton

Super

Early

Green

Sucker

DipN

Turf

Armor

和

在一些实施例中，本发明教示本发明所公开的微生物或微生物聚生体与植物生长调节剂和/或刺激剂(如植物激素或影响植物生长调节剂的产生或破坏的化学物质)的协同用途。

在一些实施例中，本发明教示植物激素可包括：生长素(例如吲哚乙酸IAA)、赤霉素、细胞分裂素(例如活动素)、脱落酸、乙烯(和其制剂，如由ACC合成酶调节和由ACC脱氨酶破坏)。

在一些实施例中，本发明教示其它可促进植物生长的化学物质，其可与本文中所公开的微生物和微生物聚生体发挥协同作用，如：黑腐酸、富里酸、氨基酸、多酚以及蛋白质水解产物。

在一些实施例中，本公开教示根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物群落(包括说明书的表1-3中所公开的任何单一微生物或微生物组合)可与

或其它类似的植物生长调节剂组合。

描述为包含0.090％细胞分裂素作为活动素、0.030％赤霉酸酸、0.045％吲哚丁酸以及99.835％其它成分。

因此，在一些实施例中，本公开提供将所教示的微生物与

的组合施用于任何作物。此外，本公开提供将所教示的微生物与

的组合施用于任何作物以及利用任何方法或施用量。

在一些实施例中，本公开教示具有生物刺激剂的农业组合物。

如本文中所使用，术语“生物刺激剂”是指任何用于刺激可存在于土壤或其它植物生长培养基中的微生物的生长的物质。

土壤或生长培养基中微生物的含量与植物健康直接相关。在可生物降解的碳源上提供微生物，并且因此植物健康也与土壤中有机物质的数量相关。尽管肥料提供营养物以供养和生长植物，但在一些实施例中，生物刺激剂提供可生物降解的碳(例如糖蜜、碳水化合物(例如糖))以供养和生长微生物。除非另有明确说明，否则生物刺激剂可包含单一成分，或若干种不同成分的组合，由于一种或多种所述成分的作用(单独或以组合方式起作用)，其能够增强微生物活性或植物生长和发育。

在一些实施例中，生物刺激剂是产生非营养性植物生长反应的化合物。在一些实施例中，生物刺激剂的许多重要优势是基于其影响激素活性的能力。植物中的激素(植物激素)是调节正常植物发育以及对环境的反应的化学信使。由植物激素调节根和芽的生长，以及其它生长反应。在一些实施例中，生物刺激剂中的化合物可改变植物的激素状况以及对其生长和健康产生重大影响。因此，在一些实施例中，本公开教示海带、黑腐酸、富里酸以及维生素B作为生物刺激剂的共同组分。在一些实施例中，本公开的生物刺激剂增强抗氧化剂活性，其增加植物的防御系统。在一些实施例中，维生素C、维生素E以及氨基酸(如甘氨酸)是生物刺激剂中所含的抗氧化剂。

在其它实施例中，生物刺激剂可用于刺激土壤或其它植物生长培养基中的微生物的生长。先前研究表明当某些包含特定有机种子提取物(例如大豆)的生物刺激剂与微生物接种体组合使用时，生物刺激剂能够刺激微生物接种体中所包括的微生物的生长。因此，在一些实施例中，本公开教示一种或多种生物刺激剂，其在与微生物接种体一起使用时能够强化原生微生物和接种体微生物的群体。关于生物刺激剂的一些流行用途的综述，请参见Calvo等人,2014,《Plant Soil(Plant Soil)》383:3-41。

在一些实施例中，本公开教示根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物群落(包括说明书的表1-3中所公开的任何单一微生物或微生物组合)可与任何植物生物刺激剂组合。

在一些实施例中，本公开教示农业组合物，其包含一种或多种市售生物刺激剂，尤其包括(但不限于)：

Diehard^TM

Diehard^TM

Fe、Diehard^TMSoluble Kelp、Diehard^TM Humate SP、

Foliar Plus^TM、Plant Plus^TM、Accomplish

Soil Builder^TM、Nutri Life、Soil Solution TM、Seed CoatTM PercPlus TM、Plant Power、

Thrust^TM、

以及

或其它类似的植物生长调节剂组合。

描述为包含4.0％赤霉酸和96.00％其它成分。

或其它类似的植物生长调节剂组合。

描述为包含10.0％赤霉酸和90.00％其它成分。

在一些实施例中，本公开教示根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物群落(包括说明书的表1-3中所公开的任何单一微生物或微生物组合)可与RyzUp

或其它类似的植物生长调节剂组合。RyzUp

描述为包含40.0％赤霉素A₃和60.00％其它成分。

在一些实施例中，本公开教示根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物群落(包括说明书的表1-3中所公开的任何单一微生物或微生物组合)可与X-CYTE^TM或其它类似的植物生长调节剂组合。X-CYTE^TM描述为包含0.04％细胞分裂素(作为活动素)和99.96％其它成分。

在一些实施例中，本公开教示根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物群落(包括说明书的表1-3中所公开的任何单一微生物或微生物组合)可与N-Large^TM或其它类似的植物生长调节剂组合。N-Large^TM描述为包含4.0％赤霉素A₃和96.00％其它成分。

在一些实施例中，当根据所教示的方法鉴别的微生物或微生物聚生体与活性化学试剂组合时，可发现对相关植物表现型特性的加成作用。在其它实施例中，当根据所教示的方法鉴别的微生物或微生物聚生体与活性化学试剂组合时，可发现对相关植物表现型特性的协同作用。

在一些实施例中，当根据所教示的方法鉴别的微生物或微生物聚生体与肥料组合时，可发现对相关植物表现型特性的加成作用。在其它实施例中，当根据所教示的方法鉴别的微生物或微生物聚生体与肥料组合时，可发现对相关植物表现型特性的协同作用。

在一些实施例中，当根据所教示的方法鉴别的微生物或微生物聚生体与植物生长调节剂时，可发现对相关植物表现型特性的加成作用。在一些实施例中，当根据所教示的方法鉴别的微生物或微生物聚生体与植物生长调节剂组合时，可发现协同作用。在一些方面中，本公开的微生物与

组合并且观察到一种或多种相关表现型特性的协同作用。

在一些实施例中，当根据所教示的方法鉴别的微生物或微生物聚生体与生物刺激剂组合时，可发现对相关植物表现型特性的加成作用。在一些实施例中，当根据所教示的方法鉴别的微生物或微生物聚生体与生物刺激剂组合时，可发现协同作用。

通过所教示的方法获得的协同作用可根据Colby的方程式(即(E)＝X+Y-(X×Y/100))来定量。参见Colby,R.S.,《计算除草剂组合的协同和拮抗性反应(CalculatingSynergistic and Antagonistic Responses of Herbicide Combinations)》,1967Weeds,第15卷,第20-22页，其以全文引用的方式并入本文中。因此，“协同”意指在其存在时可使所需作用增加超过累加量的分量。

本公开的经分离的微生物和聚生体可以协同方式提高农业活性化合物以及农业助剂化合物的效果。

在其它实施例中，当根据所教示的方法鉴别的微生物或微生物聚生体与肥料组合时，可发现协同作用。

此外，在某些实施例中，本公开利用协同相互作用以定义微生物聚生体。也就是说，在某些方面中本公开将某些发挥协同作用的微生物物种共同组合成聚生体，其赋予植物有益特性，或其与增加有益的植物特性相关。

根据本发明研发的农业组合物可与某些助剂一起配制，以改良已知的活性农业化合物的活性。这具有可降低配制物中活性成分的量，同时保持活性化合物的功效的优点，因此使成本保持尽可能低并且符合任何官方法规。在个别情况下，也有可能拓宽活性化合物的作用范围，因为植物(在未添加情况下用具体活性成分进行的处理不足够成功)可实际上通过添加某些助剂以及所公开的微生物分离物和聚生体来成功地处理。此外，当环境条件不利时，在个别情况下可通过适合的配制物增加活性的性能。

可用于农业组合物中的这类助剂可以是佐剂。通常，佐剂呈表面活性或盐类化合物形式。视其作用模式而定，其可大致分类为调节剂、活化剂、肥料、pH值缓冲剂等。调节剂影响配制物的湿润、粘着以及扩散特性。活化剂破坏植物的蜡质表层并且改良活性成分对质表层的渗透(短期(数分钟)和长期(数小时))。肥料(如硫酸铵、硝酸铵或尿素)可改良活性成分的吸收和可溶性并且可降低活性成分的拮抗性。pH值缓冲剂常规地用于使配制物具有最佳pH值。

关于本公开的农业组合物的其它实施例，参见《农业化学配制物的化学方法和技术(Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations)》,D.A.Knowles编,1998版,Kluwer Academic Publishers，其以引用的方式并入本文中。

种子处理

在一些实施例中，本公开还涉及探索在播种或种植之前用本公开的微生物或农业组合物中的一种或多种的组合来处理种子可增强所需植物特性，例如植物生长、植物健康和/或植物抗虫性。

因此，在一些实施例中，本公开教示使用微生物或微生物聚生体中的一种或多种作为种子处理剂。种子处理剂可以是直接施用于未经处理和“裸”种子的种子涂层。然而，种子处理剂可以是施用于已涂有一种或多种先前种子涂层或种子处理剂的种子的种子外涂层。先前种子处理剂可包括一种或多种活性化合物(化学或生物)和一种或多种惰性成分。

术语“种子处理剂”通常是指在土壤中种植之前或在土壤中种植期间将材料施用于种子。具有本公开的微生物和其它农业组合物的种子处理剂具有将处理剂传递到在种子出芽和幼苗出现之前不久种植种子的区域的优点。

在其它实施例中，本公开还教示使用种子处理剂可使成功处理植物所需的微生物或农业组合物的量最小化，并且与如在土壤上方或新出现的幼苗上方喷雾等施用技术相比，进一步限制工人与微生物和组合物的接触。

此外，在一些实施例中，本公开教示本文中所公开的微生物对于增强早期植物寿命(例如在幼苗出现之后的第一个三十天内)是重要的。因此，在一些实施例中，以种子处理剂形式传递本公开的微生物和/或组合物可在对于微生物活性来说重要的时间将其放置在作用区域。

在一些实施例中，本公开的微生物组合物配制成种子处理剂。在一些实施例中，预期通过使用特别设计和制造成精确、安全以及有效地向种子施用种子处理剂产品的处理剂施用设备，使用常规的混合、喷雾方法或其组合，可在种子上基本上均匀地涂布本文中所公开的微生物和/或农业组合物一个或多个层。这类设备使用不同类型的涂布技术，如旋转涂布器、滚筒涂布器、流体化床技术、喷泉床、旋转喷雾或其组合。液体种子处理剂(如本公开的液体种子处理剂)可通过自旋“雾化器”盘或喷射嘴施用，其在其以喷雾模式移动时将种子处理剂均匀地分布在种子上。在各方面中，接着再将种子混合或滚揉一段时间以实现额外的处理剂分布和干燥。

在用微生物组合物涂布之前，种子可经底涂或未经底涂以提高出芽和萌芽的均匀性。在替代性实施例中，可将干粉配制物以计量方式置放于移动种子上并且进行混合直到完全分布。

在一些实施例中，种子的至少一部分表面区域涂有根据本发明的微生物组合物。在一些实施例中，将包含微生物组合物的种子涂层直接施用于裸种子。在一些实施例中，将包含微生物组合物的种子外涂层施用于上面已施用种子涂层的种子。在一些方面中，种子可具有种子涂层，其包含例如可尼丁(clothianidin)和/或坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)-I-1582，在其顶部将以种子外涂层形式施用本发明的组合物。在一些方面中，所教示的微生物组合物以种子外涂层形式施用于已用PONCHO^TMVOTiVO^TM处理的种子。在一些方面中，种子可具有种子涂层，其包含例如灭达乐(灭达乐)和/或可尼丁和/或坚强芽孢杆菌-I-1582，在其顶部将以种子外涂层形式施用本发明的组合物。在一些方面中，所教示的微生物组合物以种子外涂层形式施用于已用ACCELERON^TM处理的种子。

在一些实施例中，经微生物处理的种子具有以下微生物孢子浓度或微生物细胞浓度：每个种子约10³到10¹²、10³到10¹¹、10³到10¹⁰、10³到10⁹、10³到10⁸、10³到10⁷、10³到10⁶、10³到10⁵或10³到10⁴。

在一些实施例中，经微生物处理的种子具有以下微生物孢子浓度或微生物细胞浓度：每个种子约10⁴到10¹²、10⁴到10¹¹、10⁴到10¹⁰、10⁴到10⁹、10⁴到10⁸、10⁴到10⁷、10⁴到10⁶或10⁴到10⁵。

在一些实施例中，经微生物处理的种子具有以下微生物孢子浓度或微生物细胞浓度：每个种子约10⁵到10¹²、10⁵到10¹¹、10⁵到10¹⁰、10⁵到10⁹、10⁵到10⁸、10⁵到10⁷或10⁵到10⁶。

在一些实施例中，经微生物处理的种子具有以下微生物孢子浓度或微生物细胞浓度：每个种子约10⁵到10⁹。

在一些实施例中，经微生物处理的种子具有每个种子至少约1×10³或1×10⁴或1×10⁵或1×10⁶或1×10⁷或1×10⁸或1×10⁹的微生物孢子浓度或微生物细胞浓度。

在一些实施例中，施用于种子的微生物和/或农业组合物中的一种或多种的量取决于最终配制物，以及所利用的植物或种子的尺寸或类型。在一些实施例中，微生物中的一种或多种以全部配制物的约2％w/w到约80％w/w存在。在一些实施例中，按重量计，组合物中使用的微生物中的一种或多种是全部配制物的约5％w/w到约65％w/w，或10％w/w到约60％w/w。

在一些实施例中，种子也可以具有更多的孢子或微生物细胞/种子，例如每个种子约10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵、10¹⁶或10¹⁷个孢子或细胞。

在一些实施例中，本公开的种子涂层的厚度可以是最多10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm、300μm、310μm、320μm、330μm、340μm、350μm、360μm、370μm、380μm、390μm、400μm、410μm、420μm、430μm、440μm、450μm、460μm、470μm、480μm、490μm、500μm、510μm、520μm、530μm、540μm、550μm、560μm、570μm、580μm、590μm、600μm、610μm、620μm、630μm、640μm、650μm、660μm、670μm、680μm、690μm、700μm、710μm、720μm、730μm、740μm、750μm、760μm、770μm、780μm、790μm、800μm、810μm、820μm、830μm、840μm、850μm、860μm、870μm、880μm、890μm、900μm、910μm、920μm、930μm、940μm、950μm、960μm、970μm、980μm、990μm、1000μm、1010μm、1020μm、1030μm、1040μm、1050μm、1060μm、1070μm、1080μm、1090μm、1100μm、1110μm、1120μm、1130μm、1140μm、1150μm、1160μm、1170μm、1180μm、1190μm、1200μm、1210μm、1220μm、1230μm、1240μm、1250μm、1260μm、1270μm、1280μm、1290μm、1300μm、1310μm、1320μm、1330μm、1340μm、1350μm、1360μm、1370μm、1380μm、1390μm、1400μm、1410μm、1420μm、1430μm、1440μm、1450μm、1460μm、1470μm、1480μm、1490μm、1500μm、1510μm、1520μm、1530μm、1540μm、1550μm、1560μm、1570μm、1580μm、1590μm、1600μm、1610μm、1620μm、1630μm、1640μm、1650μm、1660μm、1670μm、1680μm、1690μm、1700μm、1710μm、1720μm、1730μm、1740μm、1750μm、1760μm、1770μm、1780μm、1790μm、1800μm、1810μm、1820μm、1830μm、1840μm、1850μm、1860μm、1870μm、1880μm、1890μm、1900μm、1910μm、1920μm、1930μm、1940μm、1950μm、1960μm、1970μm、1980μm、1990μm、2000μm、2010μm、2020μm、2030μm、2040μm、2050μm、2060μm、2070μm、2080μm、2090μm、2100μm、2110μm、2120μm、2130μm、2140μm、2150μm、2160μm、2170μm、2180μm、2190μm、2200μm、2210μm、2220μm、2230μm、2240μm、2250μm、2260μm、2270μm、2280μm、2290μm、2300μm、2310μm、2320μm、2330μm、2340μm、2350μm、2360μm、2370μm、2380μm、2390μm、2400μm、2410μm、2420μm、2430μm、2440μm、2450μm、2460μm、2470μm、2480μm、2490μm、2500μm、2510μm、2520μm、2530μm、2540μm、2550μm、2560μm、2570μm、2580μm、2590μm、2600μm、2610μm、2620μm、2630μm、2640μm、2650μm、2660μm、2670μm、2680μm、2690μm、2700μm、2710μm、2720μm、2730μm、2740μm、2750μm、2760μm、2770μm、2780μm、2790μm、2800μm、2810μm、2820μm、2830μm、2840μm、2850μm、2860μm、2870μm、2880μm、2890μm、2900μm、2910μm、2920μm、2930μm、2940μm、2950μm、2960μm、2970μm、2980μm、2990μm或3000μm。

在一些实施例中，本公开的种子涂层的厚度可以是0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm。

在一些实施例中，本公开的种子涂层可以是未经涂布的种子重量的至少0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％、20％、20.5％、21％、21.5％、22％、22.5％、23％、23.5％、24％、24.5％、25％、25.5％、26％、26.5％、27％、27.5％、28％、28.5％、29％、29.5％、30％、30.5％、31％、31.5％、32％、32.5％、33％、33.5％、34％、34.5％、35％、35.5％、36％、36.5％、37％、37.5％、38％、38.5％、39％、39.5％、40％、40.5％、41％、41.5％、42％、42.5％、43％、43.5％、44％、44.5％、45％、45.5％、46％、46.5％、47％、47.5％、48％、48.5％、49％、49.5％或50％。

在一些实施例中，微生物孢子和/或细胞可自由地涂布到种子上或其可在涂布到种子上之前在液体或固体组合物中配制。举例来说，包含微生物的固体组合物可通过混合固体载剂与孢子的悬浮液直到固体载剂浸渍有孢子或细胞悬浮液来制备。接着可干燥这种混合物以获得所需粒子。

在一些其它实施例中，预期本公开的固体液体微生物组合物还含有功能性试剂，例如活性碳、营养物(肥料)，以及其它能够改良产物或其组合的出芽和质量的试剂。

所属领域中已知的种子涂布方法和组合物在其通过添加本发明的实施例之一而经修改时可尤其适用。这类涂布方法和其施用设备公开于例如：美国专利第5,916,029号；第5,918,413号；第5,554,445号；第5,389,399号；第4,759,945号；第4,465,017号，以及美国专利申请第13/260,310号，其中每一个以引用的方式并入本文中。

种子涂料组合物公开于例如：美国专利第5,939,356号；第5,876,739号、第5,849,320号；第5,791,084号、第5,661,103号；第5,580,544号、第5,328,942号；第4,735,015号；第4,634,587号；第4,372,080号、第4,339,456号；以及第4,245,432号，其中每一个以引用的方式并入本文中。

在一些实施例中，可向包含本发明的组合物的种子处理剂配制物中添加多种添加剂。可添加结合剂并且包括由对所涂布的种子无植物毒性作用的天然或合成粘合剂聚合物组成的结合剂。结合剂可选自聚乙酸乙烯酯；聚乙酸乙烯酯共聚物；乙烯乙酸乙烯酯(EVA)共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纤维素，包括乙基纤维素、甲基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基丙基纤维素以及羧基甲基纤维素；聚乙烯基氢吡咯酮；多糖，包括淀粉、变性淀粉、糊精、麦芽糊精、海藻酸酯以及壳聚糖；脂肪；油；蛋白质，包括明胶和玉米蛋白；阿拉伯胶(gum arabics)；虫胶；偏二氯乙烯和偏二氯乙烯共聚物；木质磺酸钙；丙烯酸共聚物；聚乙烯基丙烯酸酯；聚氧化乙烯；丙烯酰胺聚合物和共聚物；聚丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酰胺单体；以及聚氯丁二烯。

可使用多种着色剂中的任一种，包括有机发色团，其分类为亚硝基；硝基；偶氮基，包括单偶氮、双偶氮和多偶氮；吖啶、蒽醌、吖嗪、二苯基甲烷、吲达胺(indamine)、吲达酚(indophenol)、次甲基、噁嗪、酞菁、噻嗪、噻唑、三芳基甲烷、二苯并哌喃。可添加的其它添加剂包括微量营养物，如铁、锰、硼、铜、钴、钼以及锌的盐。

可施用聚合物或其它灰尘控制剂以使处理剂留存在种子表面上。

在一些具体实施例中，除微生物细胞或孢子以外，涂层可进一步包含粘着剂层。粘着剂应该是无毒性、可生物降解以及粘着性的。这类材料的实例包括(但不限于)聚乙酸乙烯酯；聚乙酸乙烯酯共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纤维素，如甲基纤维素、羟基甲基纤维素以及羟基甲基丙基纤维素；糊精；海藻酸酯；糖；糖蜜；聚乙烯吡咯烷酮；多糖；蛋白质；脂肪；油；阿拉伯胶；明胶；糖浆剂；以及淀粉。更多实例可见于例如美国专利第7,213,367号中，其以引用的方式并入本文中。

种子处理剂配制物中还可以包括各种添加剂，如粘着剂、分散剂、表面活性剂和营养物以及缓冲剂成分。其它常规种子处理剂添加剂包括(但不限于)：涂布剂、湿润剂、缓冲剂以及多糖。可向种子处理剂配制物中添加至少一种农业上可接受的载剂，如水、固体或干燥粉末。干燥粉末可来源于多种材料，如碳酸钙、石膏、蛭石、滑石、腐殖质、活性炭以及多种磷化合物。

在一些实施例中，种子涂料组合物可包含至少一种填充剂，其是有机或无机、天然或合成组分，其中活性组分组合以促进其在种子上的施用。在各方面中，填充剂是惰性固体，如粘土、天然或合成硅酸盐、二氧化硅、树脂、蜡、固体肥料(例如铵盐)、天然土壤矿物质(如高岭土、粘土、滑石、石灰、石英、绿坡缕石、蒙脱石、膨润土或硅藻土)或合成矿物质，替二氧化硅、氧化铝或硅酸盐，尤其是硅酸铝或硅酸镁。

在一些实施例中，种子处理剂配制物可进一步包括以下成分中的一种或多种：其它农药，包括仅在地面以下起作用的化合物；杀真菌剂，如盖普丹(captan)、福美双(thiram)、灭达乐(metalaxyl)、氟二恶尼(fludioxonil)、欧杀斯(oxadixyl)以及这些材料中的每一个的异构体等；除草剂，包括选自草甘膦、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、乙酰胺、三嗪、二硝基苯胺、甘油醚、哒嗪酮、尿嘧啶、含苯氧基的物质、尿素以及苯甲酸；除草安全剂，如苯并噁嗪、二苯甲基衍生物、N,N-二烯丙基二氯乙酰胺、各种二卤基乙酰基、噁唑啶基和噻唑烷基化合物、乙酮、萘二甲酸酐化合物以及肟衍生物；化学肥料；生物肥料；以及生物控制剂，如其它天然存在的或重组型细菌和来自根瘤菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、木霉属(Trichoderma)、脉络球属(Glomus)、胶霉属(Gliocladium)和菌根真菌的真菌。这些成分可作为种子上单独的层添加，或可作为本公开的种子涂料组合物的一部分添加。

在一些实施例中，在本公开中用于处理种子的配制物可呈悬浮液；乳液；水性介质(例如水)中粒子的浆料；可湿性粉末；可湿性颗粒(干燥可流动)；以及干燥颗粒形式。如果配制成悬浮液或浆料，那么配制物中活性成分的浓度可以是约0.5％到约99重量％(w/w)，或5-40％，或由所属领域的技术人员以其它方式配制。

如上文所提及，可将其它常规非活性或惰性成分并入配制物中。这类惰性成分包括(但不限于)：常规粘合剂；分散剂，如甲基纤维素，例如充当用于种子处理剂的组合分散剂/粘合剂；聚乙烯醇；卵磷脂、聚合分散剂(例如聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯)；增稠剂(例如用于改良粘度和减少粒子悬浮液的沉降的粘土增稠剂)；乳液稳定剂；表面活性剂；防冻剂化合物(例如尿素)、染料、着色剂等。本公开中适用的其它惰性成分可见于McCutcheon,第1卷,《乳化剂和清洁剂(Emulsifiers and Detergents)》,MC Publishing Company,美国新泽西州格伦罗克(Glen Rock,N.J.,U.S.A.),1996，其以引用的方式并入本文中。

本公开的种子涂层配制物可通过多种方法施用于种子，包括(但不限于)：在容器(例如瓶子或袋子)中混合、机械施用、翻滚、喷雾和浸没。多种活性或惰性材料可用于使种子与根据本发明的微生物组合物接触。

在一些实施例中，用于处理种子的微生物或农业组合物的量将视种子类型和活性成分类型而变化，但处理将包含使种子与农业上有效量的本发明组合物接触。

如上文所讨论，有效量意指足以实现有利或所需结果的本发明组合物的量。有效量可在一次或多次投药中投予。

在一些实施例中，除涂层以外，种子可用以下成分中的一种或多种处理：其它农药，包括杀真菌剂和除草剂；除草安全剂；肥料和/或生物控制剂。这些成分可作为单独的层添加，或可在涂层中添加。

在一些实施例中，本公开的种子涂层配制物可使用多种技术和机器施用于种子，如流体化床技术、辊磨机方法、旋转静态种子处理器以及圆筒涂布器。其它方法(如喷泉床)也可以是适用的。种子可在涂布之前预先设定大小。在涂布之后，通常干燥种子并且接着转移到设定大小的机器中以用于设定大小。这类程序是所属领域中已知的。

在一些实施例中，经微生物处理的种子还可以用薄膜外涂层包裹以保护涂层。这类外涂层是所属领域中已知的并且可使用流体化床和圆筒薄膜涂布技术施用。

在本公开的其它实施例中，可通过使用固体基质底涂物将根据本发明的组合物引入到种子上。举例来说，可将一定量的本发明组合物与固体基质材料混合，并且接着可置放种子使其与固体基质材料接触一段时间以实现将组合物引入种子中。接着，可任选地分离种子与固体基质材料并且储存或使用，或可储存或直接种植固体基质材料加上种子的混合物。适用于本公开的固体基质材料包括聚丙烯酰胺、淀粉、粘土、二氧化硅、氧化铝、土壤、砂、聚脲、聚丙烯酸酯或任何其它能够吸收或吸附本发明组合物一段时间并且将所述组合物释放到种子中或释放到种子上的材料。适用的是确保本发明组合物和固体基质材料彼此相容。举例来说，应选择固体基质材料使得其可按合理的速率(例如在数分钟、数小时或数天时间内)释放组合物。

微生物

如本文所使用，术语“微生物”应被广泛理解。其包括(但不限于)两个原核结构域(细菌和古细菌)以及真核真菌和原生生物。

作为实例，微生物可包括：变形菌门(Proteobacteria)(如假单胞菌、肠杆菌属、寡养单胞菌属、伯克霍尔德菌属、根瘤菌属、草螺菌属、泛菌属、沙雷氏菌属、拉恩氏菌属、固氮螺旋菌属、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、固氮菌属、杜擀氏菌属、代尔夫特菌属(Delftia)、短根瘤菌属(Bradyrhizobiun)、中华根瘤菌属和盐单胞菌属)、厚壁菌门(Firmicutes)(如芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、乳杆菌属、霉浆菌属以及醋杆菌属)、放线菌纲(如链霉菌属、赤球菌屬、微杆菌属以及短小杆菌属(Curtobacterium))以及真菌子囊菌门(Ascomycota)(如木霉属、白粉寄生孢、盾壳霉属、皮氏菌属(Paecoelomyces)、青霉属(Penicillium)、芽枝霉属(Cladosporium)、肉座菌属(Hypocrea)、白僵菌属(Beauveria)、绿僵菌属(Metarhizium)、轮枝孢属(Verticullium)、冬虫草属(Cordyceps)、匹氏菌属(Pichea)和假丝酵母属(Candida))、担子菌门(Basidiomycota)(如鬼伞属(Coprinus)、伏革菌属(Corticium)和伞菌属(Agaricus))和卵菌门(Oomycota)(如腐霉属(Pythium)、白霉菌属(Mucor)和被孢霉属(Mortierella))。

在具体实施例中，微生物是内寄生菌，或附生植物，或栖居于植物根围或根鞘的微生物。也就是说，可发现微生物存在于粘附于植物的根的土壤物质中或与植物的根紧邻的区域中。在一个实施例中，微生物是种传内寄生菌。

內寄生菌可通过防止病原性生物体对其进行定殖而对宿主植物有益。通过內寄生菌进行的植物组织的广泛定殖产生“障壁作用”，其中局部內寄生菌获胜并且阻止病原性生物体留存。內寄生菌也可以产生可抑制竞争物生长(包括病原性生物体)的化学物质。

在某些实施例中，微生物是不可培养的。这应视为意指尚不知道微生物是可培养的或难以使用所属领域的技术人员已知的方法培养。

本公开的微生物可从任何来源收集或获得，或包含于从任何来源收集的材料内和/或与其相关联。

在一个实施例中，微生物是从任何一般陆地环境获得，包括其土壤、植物、真菌、动物(包括无脊椎动物)以及其它生物区，包括湖泊和河流的沉积物、水以及生物区；来自海洋环境，其生物区和沉积物(例如海水、海泥、海洋植物、海洋无脊椎动物(例如海绵)、海洋脊椎动物(例如鱼))；陆地和海洋岩石圈(表土和岩石，例如受挤压的地下岩、砂和粘土)；低温层和其融化的水；大气(例如经过滤的空气粉尘、云和雨液滴)；城市、工业和其它人造环境(例如混凝土、路边沟槽、屋顶表面、道路表面上积聚的有机和矿物质)。

在另一实施例中，从可能有助于适合的微生物的选择的来源收集微生物。作为实例，所述来源可以是其中适于其它植物生长或被视为与风土相关联的具体环境。在另一实例中，来源可以是具有一种或多种理想特性的植物，例如在具体环境中或在某些相关条件下天然成长的植物。作为实例，某种植物可在沙土或高盐度砂中，或在极端温度下，或在具有极少的水的情况下天然生长，或其可抵抗环境中的某些害虫或疾病，并且可能需要经济作物在这类条件中生长，尤其在这是例如具体地理位置中仅有的条件时。作为另一实例，可从在这类环境中生长的市售作物，或更具体地说，从在任何特定环境中生长的作物中显示相关特性的最佳个别作物植物收集微生物，例如在盐受限土壤中生长的作物中生长最快的植物，或暴露于严重昆虫损害或疾病传染病的作物中受损度最低的植物，或具有所需量的某些代谢物和其它化合物(包括纤维含量、含油量等)的植物，或显示所需颜色、味道或气味的植物。可从相关植物或相关环境中的任何物质收集微生物，包括真菌和其它动物和植物生物区、土壤、水、沉积物以及环境的其它元素，如先前所提及。在某些实施例中，微生物是从不同环境分离的个别分离物。

在一个实施例中，用于本公开的方法中的微生物或微生物组合可基于对其对植物的可能或所预测的益处的一些知识而选自预先存在的个别微生物物种或品系的集合。举例来说，预测微生物可：改良氮固定；从土壤有机物质释放磷酸盐；从磷酸盐的无机形式释放磷酸盐(例如岩石磷酸盐)；根微球体中的“固定碳”；存活于植物的根围中，从而帮助植物从周围土壤吸收营养物并且接着将这些营养物更容易地提供给植物；增加植物根上节结的数目并且因此增加每个植物的共生氮固定细菌(例如根瘤菌属物种)的数目和由植物固定的氮的量；引发植物防御性反应，如ISR(诱导系统抗性)或SAR(后天系统抗性)，其植物抵抗病原性微生物的侵袭和传播；通过拮抗作用与对植物生长或健康有害的微生物竞争，或资源(如营养物或空间)的竞争性利用；改变植物的一个或多个部分的颜色，或改变植物的化学概况，其气味、味道或一种或多种其它质量。

在一个实施例中，微生物或微生物组合是选自预先存在的未提供其对植物的可能或所预测的益处的知识的个别微生物物种或品系的集合。举例来说，从植物组织分离而无任何关于其改良植物生长或健康的能力的知识的未鉴别的微生物的集合，或经收集以探索其用于产生可引起医药学药物发展的化合物的潜力的微生物的集合。

在一个实施例中，微生物是从其天然存在的来源材料(例如土壤、岩石、水、空气、灰尘、植物或其它生物体)获得。考虑到微生物在本公开的方法中的既定用途，其可以任何适合的形式提供。然而，仅作为实例，微生物可以水性悬浮液、凝胶、均质物、颗粒、粉末、浆料、活生物体或干燥材料形式提供。

本公开的微生物可在基本上纯的或混合培养物中分离。其可被浓缩、稀释或以其在发现其的来源材料中的天然浓度提供。举例来说，来自生理食盐水沉积物的微生物可通过使沉降物悬浮在淡水中并且使沉降物下降到底部来分离以用于本公开。可在适合的沉降期后通过倾析来移出含有微生物主体的水，并且直接施用于植物生长培养基，或通过过滤或离心来浓缩，稀释到适合的浓度并且与所移出的盐的主体一起施用于植物生长培养基。作为另一实例，可类似地处理来自矿化或有毒来源的微生物以回收微生物以用于植物生长材料，以便最小化损害植物的可能性。

在另一实施例中，微生物以粗物质形式使用，其中其未从其天然存在的来源材料分离。举例来说，微生物与其驻存的来源材料组合提供；例如土壤，或植物的根、种子或叶子。在这一实施例中，来源材料可包括微生物的一种或多种物种。

在一些实施例中，本公开的方法中使用微生物的混合群体。

在其中从来源材料(例如其中微生物天然驻存的材料)分离微生物的本公开的实施例中，可使用所属领域的技术人员易知的许多标准技术中的任一种或组合。然而，作为实例，这些通常使用可用于获得基本上纯形式的单一微生物的固体或液体培养物的方法，通常通过固体微生物生长培养基表面上的物理分离或通过在液体微生物生长培养基中的体积稀释分离。这些方法可包括从干燥材料、液体悬浮液、浆料或匀浆(其中材料在适合的固体凝胶生长培养基上的薄层中传播)分离，或在无菌培养基中进行的材料的连续稀释和接种到液体或固体培养基中。

尽管非必需，但在一个实施例中，可在分离过程之前预先处理含有微生物的材料以使材料中的所有微生物倍增，或通过用微生物营养物对材料进行富集(例如通过对样品进行巴氏杀菌以选择对热暴露具有抗性的微生物(例如杆菌)，或通过使样品暴露于低浓度的有机溶剂或灭菌剂(例如家用漂白剂)来选择某些部分的微生物群体，以增强孢子形成或溶剂耐性微生物的存活期)。如上文所述，接着可从经富集的材料或经处理以用于选择性存活的材料分离微生物。

在本发明的一个实施例中，从植物材料分离内生或附生植物型微生物。可使用所属领域中已知的多种标准技术并且可从植物中的任何适合的组织分离微生物，包括例如根、茎干和叶子，以及植物生殖组织。作为实例，用于从植物进行分离的常规方法通常包括相关植物材料(例如根或茎干长度、叶子)的无菌切除、用适合的溶液(例如2％次氯酸钠)进行的表面灭菌，随后将植物材料置放于营养物培养基上以用于微生物生长(参见例如Strobel G和Daisy B(2003)《微生物学和分子生物学综述(Microbiology and MolecularBiology Reviews)》67(4):491-502；Zinniel DK等人(2002),《应用和环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology)》68(5):2198-2208)。

在本公开的一个实施例中，从根组织分离微生物。用于从植物材料分离微生物的另一种方法详细描述于下文中。

在一个实施例中，使微生物群体暴露于(在方法之前或在方法中的任何阶段)选择压力。举例来说，使微生物在其添加到植物生长培养基(优选是无菌的)之前暴露于巴氏灭菌可能增强选择用于所需特性的植物将与可在不良条件下、在市售储存期中或在不良环境中以涂层形式施用于种子的更易于存活的孢子形成微生物相关联的机率。

在某些实施例中，如上文中所提及，微生物可以粗物质形式使用并且无需从植物或培养基分离。举例来说，可获得包括经鉴别对所选择的植物有益的微生物的植物材料或生长培养基并且用作粗微生物来源以用于下一轮方法，或在方法结束时用作粗微生物来源。举例来说，可获得完整的植物材料并且任选地处理，如覆盖或挤压。或者，可从植物分离所选择的植物的个别组织或部分(如叶子、茎干、根和种子)并且任选地处理，如覆盖或挤压。在某些实施例中，可从一种或多种所选择的植物移出与一种或多种微生物的第二集合相关联的植物的一个或多个部分，并且其中进行方法的任何连续重复，接枝到植物育种方法的任何步骤中使用的一种或多种植物上。

能够从施用所公开的微生物、聚生体以及包含其的组合物获益的植物

本公开的方法中可使用许多各种不同植物，包括藓类植物和地衣类植物和藻类植物。在实施例中，植物具有经济、社会或环境价值。举例来说，植物可包括用作粮食作物、纤维作物、油作物、用于林业、用于纸浆与造纸工业、用作生物燃料制剂的原料和用作观赏植物的植物。

在其它实施例中，植物可能在经济、社会或环保上不合乎需要，如野草。以下是本公开的方法可适用的植物类型的非限制性实例的列表：

粮食作物：

谷类，例如玉米、大米、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、黑麦、黑小麦以及荞麦；

叶菜，例如十字花科植物，如甘蓝、椰菜、小白菜、火箭；沙拉绿叶菜，如菠菜、水芹以及莴苣；

果实和开花蔬菜，例如鳄梨、甜玉米、洋蓟；瓜类，例如笋瓜、黄瓜、甜瓜、小胡瓜、南瓜；茄属蔬菜/果实，例如蕃茄、茄子以及辣椒；

荚果蔬菜，例如落花生、花生、豌豆、大豆、菜豆、小扁豆、鸡豆、秋葵；

球茎和茎菜类蔬菜，例如芦笋、芹菜、葱属作物(Allium crops)，例如大蒜、洋葱和韭菜；

根和块茎植物，例如胡萝卜、甜菜、竹子芽、木薯、山药、姜、洋姜、防风草、萝卜、马铃薯、甜马铃薯、芋头、芜菁以及山葵；

糖作物，包括糖用甜菜(甜菜(Beta vulgaris))、甘蔗(Saccharum officinarum)；

种植用于制备非酒精类饮品和刺激物的作物，例如咖啡、红茶、清凉茶和绿茶、可可、大麻以及烟草；

果实作物，如真正浆果果实(例如猕猴桃、葡萄、醋栗、鹅莓、番石榴、费约果(feijoa)、石榴)、柑橘果实(例如橙子、柠檬、酸橙、葡萄柚)、上位果实(例如香蕉、酸果蔓、蓝莓)、聚合果(黑莓、覆盆子、博伊森莓)、复果(例如菠萝、无花果)、核果类果实作物(例如杏、桃、樱桃、李子)、仁果(例如苹果、梨)等，如草莓、葵花籽；

烹调和医学草本植物，例如迷迭香、罗勒、月桂、芫荽、薄荷、莳萝、金丝桃(Hypericum)、毛地黄、芦荟、蛭石以及大麻；

产生香料的作物植物，例如黑胡椒、孜然肉桂、肉豆蔻、姜、丁香、番红花、小豆蔻、肉豆蔻衣、红辣椒、咖喱、大茴香；

种植用于产生坚果的作物，例如杏仁和胡桃、巴西果、腰果、椰子、栗子、澳洲坚果、开心果、花生、山核桃；

种植用于制备啤酒、葡萄酒和其它酒精类饮品的作物，例如葡萄和啤酒花；

油籽作物，例如大豆、花生、棉花、橄榄、葵花、芝麻、羽扇豆物种和栗子作物(例如芥花/油菜)；以及可食用真菌，例如白蘑菇、香菇以及蚝蘑；

用于田园农业的植物：

豆科植物(legumes)：车轴草属(Trifolium)物种、苜蓿属(Medicago)物种以及莲藕(Lotus)物种；白三叶草(白三叶(T.repens))；红三叶草(红三叶(T.pratense))；高加索三叶草(Caucasian clover)(高加索三叶(T.ambigum))；地下三叶草(地三叶(T.subterraneum))；苜蓿/紫花苜蓿(紫花豌豆(Medicago sativum))；一年生苜蓿(annualmedics)；蒺藜状苜蓿(barrel medic)；天蓝苜蓿(black medic)；红豆草(红豆草(Onobrychis viciifolia))；百脉根(Birdsfoot trefoil/Lotus corniculatus)；大百脉根(花梗莲藕(Lotus pedunculatus))；

种子豆科植物/波浪状植物，包括豌豆(Pisum sativum)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、蚕豆(Vicia faba)、绿豆(Vigna radiata)、豇豆(Vigna unguiculata)、鹰嘴豆(Cicer arietum)、羽扇豆(羽扇豆属物种(Lupinus species))；谷类，包括玉米(Zeamays)、高粱(高粱属(Sorghum spp.))、小米(糜子(Panicum miliaceum)、苏门答腊青霉(P.sumatrense))、大米(籼稻(Oryza sativa indica)、粳稻(Oryza sativa japonica))、小麦(小麦水稻(Triticum sativa))、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦(Secale cereale)、黑小麦(Triticum X Secale)、燕麦(Avena sativa)；

草料和疏林草：温带草，如黑麦草属(Lolium)物种；羊茅属(Festuca)物种；剪股颖属(Agrostis)物种、多年生的黑麦草(多年生黑麦草(Lolium perenne))；杂交黑麦草(多花黑麦草(Lolium hybridum))；一年生黑麦草(多花黑麦草(Lolium multiflorum))、高羊茅(Festuca arundinacea)；牛尾草(meadow fescue)(草甸羊茅(Festuca pratensis))；紫羊茅(Festuca rubra)；羊茅(Festuca ovina)；羊茅黑麦草(Festuloliums)(羊茅黑麦草杂交物(Lolium X Festuca crosses))；鸭茅(Dactylis glomerata)；肯塔基早熟禾(Kentuckybluegrass Poa pratensis)；泽地早熟禾(Poa palustris)；林地早熟禾(Poa nemoralis)；普通早熟禾(Poa trivialis)；孔氏早熟禾(Poa compresa)；雀麦属(Bromus)物种；虉草属(Phalaris)(梯牧草属(Phleum)物种)；丽蚌草(Arrhenatherum elatius)；冰草属(Agropyron)物种；糙伏毛燕麦(Avena strigosa)；谷子(Setaria italic)；

热带草(Tropical grasses)，如：虉草属(Phalaris)物种；臂形草属(Brachiaria)物种；画眉草属(Eragrostis)物种；黍属(Panicum)物种；巴哈草(Bahai grass)(百喜草(Paspalum notatum))；短柄草属(Brachypodium)物种；以及用于生物燃料制备的草，如柳枝稷(柳枝黍(Panicum virgatum)和芒草(Miscanthus)物种；

纤维作物：

棉花、木棉、黄麻、椰子、剑麻、亚麻(亚麻属(Linum)物种)、新西兰亚麻(NewZealand flax)(新西兰麻(Phormium)物种)；经收集用于纸张和经工程改造的木材纤维产物的种植和天然森林物种，如针叶和阔叶森林物种；

种植林业和生物燃料作物中使用的树和灌木物种：

松树(松属(Pinus)物种)；冷杉(黄杉属(Pseudotsuga)物种)；云杉(云杉属(Picea)物种)；柏树(柏木属(Cupressus)物种)；荆树(相思树(Acacia)物种)；桤木(赤杨(Alnus)物种)；橡树物种(栎属(Quercus)物种)；红木(巨杉属(Sequoiadendron)物种)；柳树(柳属(Salix)物种)；桦树(桦属(Betula)物种)；雪松(雪松属(Cedurus)物种)；白蜡木(梣属(Fraxinus)物种)；落叶松(落叶松属(Larix)物种)；桉树(Eucalyptus)物种；竹子(竹亚科(Bambuseae)物种)和白杨(白杨属(Populus)物种)。

种植用于通过提取、生物、物理或生物化学处理来转化成能量、生物燃料或工业产物的植物：

产油植物，如油棕、麻风树、大豆、棉花、亚麻籽；产乳胶植物，如帕拉橡胶树(ParaRubber tree)、橡胶树(Hevea brasiliensis)和巴拿马橡胶树(Panama Rubber Tree)弹性卡斯桑木(Castilla elastica)；用作用于制备生物燃料(即在生物燃料、工业溶剂或化学产品(例如乙醇或丁醇、丙二醛或其它燃料或工业材料)制备期间的化学、物理(例如热或催化)或生物化学(例如酶促预处理)或生物(例如微生物发酵)转型作用之后)的直接或间接进料的植物，包括糖作物(例如甜菜、甘蔗)、产淀粉作物(例如C3和C4谷类作物和结节作物)、纤维素作物(如林木)(例如松树、桉树)以及禾本和禾本科植物，如竹子、柳枝稷、芒草；通过将气体气化和/或微生物或催化转化成生物燃料或其它工业原料(如溶剂或塑料，产生或不产生生物炭)来进行的能量、生物燃料或工业化学生产中使用的作物(例如生质作物，如针叶、桉树、热带或阔叶林木、和禾本科作物，如竹子、柳枝稷、芒草、甘蔗或木棉或软木，如白杨、柳树；以及用于制备生物炭的生质作物；

产生适用于医药学、农业保健食品和药妆品工业的天然产物的作物：

产生医药学前驱体或化合物或保健食品和药妆品化合物和材料的作物，例如大茴香(莽草酸(shikimic acid))、尖头蓼(白藜芦醇)、猕猴桃(可溶纤维、蛋白水解酶)；

由于其美感或环境特性而种植的种花、观赏和礼仪性植物：

花朵，如玫瑰、郁金香、菊花；

观赏性灌木，如黄杨、赫柏、蔷薇、杜鹃花、常春藤

礼仪性植物，如悬铃木、墨西哥橘、鼠刺、大戟、苔属植物

藓类植物，如泥炭藓(sphagnum moss)

种植用于生物修复的植物：

向日葵、芸苔、柳、白杨、桉树

杂交和GM植物改良

在某些方面中，本公开的微生物施用于杂交植物以增加所述杂交物的有益特性。在其它方面中，本公开的微生物施用于经遗传修饰的植物以增加所述GM植物的有益特性。本文中教示的微生物能够适用于杂交物和GM植物，并且因此可最大化这些植物的优良遗传和特性技术。

应了解，植物可以种子、幼苗、修剪物、繁殖体或任何其它能够生长的植物材料或组织形式提供。在一个实施例中，种子可用如次氯酸钠或氯化汞等材料表面灭菌以去除表面受到污染的微生物。在一个实施例中，繁殖体在置放于植物生长培养基中之前在纯性培养物中生长，例如以组织培养物中的无菌苗形式。

施用方法

可使用所属领域中已知的任何适合的技术将微生物施用于植物、幼苗、修剪物、繁殖体等和/或含有所述植物的生长培养基。

然而，作为实例，经分离的微生物、聚生体或包含其的组合物可通过喷雾或撒粉来施用于植物、幼苗、修剪物、繁殖体等。

在另一实施例中，经分离的微生物、聚生体或包含其的组合物可在播种之前直接施用于植物种子。

在另一实施例中，经分离的微生物、聚生体或包含其的组合物可以种子涂层形式直接施用于植物种子。

在本公开的一个实施例中，经分离的微生物、聚生体或包含其的组合物以施用于植物生长培养基的颗粒或栓塞或土壤浸液形式供应。

在其它实施例中，经分离的微生物、聚生体或包含其的组合物以叶面施用物(如叶面喷雾或液体组合物)形式供应。叶面喷雾或液体施用物可施用于生长植物或生长培养基，例如土壤。

在另一实施例中，经分离的微生物、聚生体或包含其的组合物可配制成颗粒并且在种植期间沿着种子施用。或者，颗粒可在种植之后施用。或者，颗粒可在种植之前施用。

在一些实施例中，将经分离的微生物、聚生体或包含其的组合物以局部施用和/或浸液施用形式投予植物或生长培养基以改良作物生长、产量和质量。局部施用可通过利用干燥混合物或粉末或撒粉组合物或可以是液基配制物。

在实施例中，经分离的微生物、聚生体或包含其的组合物可尤其配制成：(1)溶液；(2)可湿性粉末；(3)撒粉粉末；(4)可溶性粉末；(5)乳液或悬浮液浓缩物；(6)种子敷料或涂层，(7)片剂；(8)水分散性颗粒；(9)水溶性颗粒(缓慢或快速释放)；(10)微囊封颗粒或悬浮液；以及(11)作为灌溉组分。在某些方面中，在常规喷雾施用之前，组合物可在水性介质中稀释。本公开的组合物可施用于土壤、植物、种子、根围、根鞘或其它可有利地施用微生物组合物的区域。此外，可利用冲击法作为用于引入内生微生物的手段。

在各方面中，将组合物施用于植物的叶子。可将组合物以乳液或悬浮液浓缩物、液体溶液或叶面喷雾形式施用于植物的叶子。组合物的施用可在实验室、生长箱、温室或田间进行。

在另一实施例中，可通过修剪根或茎干，并且通过喷雾、浸渍或以其它方式施用液体微生物悬浮液或凝胶或粉末使植物表面暴露于微生物来将微生物接种到植物中。

在另一实施例中，可将微生物直接注射到叶面或根组织中，或以其它方式直接接种到叶面或根修剪处中或接种到叶面或根修剪处上，或接种到离体胚芽或胚根或胚芽鞘中。这些经接种的植物接着可进一步暴露于含有其它微生物的生长培养基；然而，这并非必需的。

在其它实施例中，尤其在微生物是不可培养的情况下，可通过以下中的任一种或组合将微生物转移到植物：接枝、插入外植体、抽吸、电致孔、卷绕、根修剪、诱导气孔开口，或任何可提供使微生物进入植物细胞或胞间空间的机会的物理、化学或生物处理。所属领域的技术人员可容易地了解许多可使用的替代性技术。

在一个实施例中，微生物浸润植物的某些部分(如根、茎干、叶子和/或生殖植物部分(变成内生))，和/或在根、茎干、叶子和/或生殖植物部分的表面上生长(变成附生植物)和/或在植物根围中生长。在一个实施例中，微生物与植物形成共生关系。

实例

I.增加农业上重要的作物的产量

在本发明的某些实施例中，本发明的方法旨在增加既定作物的产量。

本文中呈现的方法(基于利用所公开的经分离的微生物、聚生体和包含其的组合物)具有增加重要的农业作物的产量的潜力。这些产量增加可在无需进一步添加肥料的情况下实现。

实例1：用经分离的微生物和微生物聚生体增加黑麦草生物质量

A.用经分离的微生物进行种子处理

在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以种子涂层形式施用于黑麦草(多年生黑麦草)的种子。在以种子涂层形式施用经分离的微生物时，将以标准方式种植和培育黑麦草。

也将绘制黑麦草种子(其未施用种子涂层形式的经分离的微生物)的对照曲线。

预期由用种子涂层处理的种子生长的黑麦草植物与对照性黑麦草植物相比将呈现更高定量的生物质量。

来自经处理的植物的生物质量可高约1-10％、高10-20％、高20-30％、高30-40％、高40-50％、高50-60％、高60-70％、高70-80％、高80-90％或更高。

来自经处理的植物的生物质量与对照物相比可等同每英亩增加约1蒲式耳，或每英亩增加2蒲式耳，或每英亩增加3蒲式耳，或每英亩增加4蒲式耳，或每英亩增加5蒲式耳或更多。

在一些方面中，生物质量增加是统计显著的。在其它方面中，生物质量增加不是统计显著，但仍是可定量的。

B.用微生物聚生体进行种子处理

在本实例中，将包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体以种子涂层形式施用于黑麦草(多年生黑麦草)的种子。在以种子涂层形式施用微生物联合体时，将以标准方式种植和培育黑麦草。

也将绘制黑麦草种子(其未施用种子涂层形式的微生物联合体)的对照曲线。

C.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理

在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以农业组合物形式施用，在播种时投予黑麦草种子。

举例来说，预期农民将在将黑麦草种子播种到田间的同时向所述种子施用农业组合物。这可例如通过向含有黑麦草种子并且配置成播种黑麦草种子的料斗或散播器施用农业组合物来实现。

也绘制未被投予农业组合物的黑麦草种子的对照曲线。

预期由用农业组合物处理的种子生长的黑麦草植物与对照性黑麦草植物相比将呈现更高定量的生物质量。

D.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理

在本实例中，包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体将以农业组合物形式施用，在播种时投予黑麦草种子。

也绘制未被投予农业组合物的黑麦草种子的对照曲线。

实例2：用经分离的微生物和微生物聚生体增加玉米生物质量

A.用经分离的微生物进行种子处理

在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以种子涂层形式施用于玉米(玉蜀黍)的种子。在以种子涂层形式施用经分离的微生物时，将以标准方式种植和培育玉米。

也将绘制玉米种子(其未施用种子涂层形式的经分离的微生物)的对照曲线。

预期由用种子涂层处理的种子生长的玉米植物与对照性玉米植物相比将呈现更高定量的生物质量。

B.用微生物聚生体进行种子处理

在本实例中，将包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体以种子涂层形式施用于玉米(玉蜀黍)的种子。在以种子涂层形式施用微生物联合体时，将以标准方式种植和培育玉米。

也将绘制玉米种子(其未施用种子涂层形式的微生物联合体)的对照曲线。

C.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理

在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以农业组合物形式施用，在播种时投予玉米种子。

举例来说，预期农民将在将玉米种子种植到田间的同时向所述种子施用农业组合物。这可例如通过在标准16行种植器上向含有玉米种子并且配置成将玉米种子种植到各行中的料斗/主体箱施用农业组合物来实现。或者，农业组合物可包含于种植器上单独的主体箱中并且在种植玉米种子时喷雾到各行中。

也绘制未被投予农业组合物的玉米种子的对照曲线。

预期由用农业组合物处理的种子生长的玉米植物与对照性玉米植物相比将呈现更高定量的生物质量。

D.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理

在本实例中，包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体将以农业组合物形式施用，在播种时投予玉米种子。

也绘制未被投予农业组合物的玉米种子的对照曲线。

实例3：用经分离的微生物和微生物聚生体增加大豆生物质量

A.用经分离的微生物进行种子处理

在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以种子涂层形式施用于大豆(Glycine max)的种子。在以种子涂层形式施用经分离的微生物时，将以标准方式种植和培育大豆。

也将绘制大豆种子(其未施用种子涂层形式的经分离的微生物)的对照曲线。

预期由用种子涂层处理的种子生长的大豆植物与对照性大豆植物相比将呈现更高定量的生物质量。

B.用微生物聚生体进行种子处理

在本实例中，将包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体以种子涂层形式施用于大豆的种子。在以种子涂层形式施用微生物联合体时，将以标准方式种植和培育大豆。

也将绘制大豆种子(其未施用种子涂层形式的微生物联合体)的对照曲线。

C.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理

在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以农业组合物形式施用，在播种时投予大豆种子。

举例来说，预期农民将在将大豆种子种植到田间的同时向所述种子施用农业组合物。这可例如通过在标准16行种植器上向含有玉米种子并且配置成将大豆种子种植到各行中的料斗/主体箱施用农业组合物来实现。或者，农业组合物可包含于种植器上单独的主体箱中并且在种植大豆种子时喷雾到各行中。

也绘制未被投予农业组合物的大豆种子的对照曲线。

预期由用农业组合物处理的种子生长的大豆植物与对照性大豆植物相比将呈现更高定量的生物质量。

D.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理

在本实例中，包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体将以农业组合物形式施用，在播种时投予大豆种子。

也绘制未被投予农业组合物的大豆种子的对照曲线。

实例4：用经分离的微生物改变小麦幼苗生物质量

A.用经分离的微生物进行种子处理

在本实例中，小麦种子用个别微生物品系(BCI)接种并且使其发芽(图5)。

将种子接种并且置放于湿纸巾上，并且辊压。接着辊在盖有湿巾的塑料仓中，在25℃下培育。一式三份地测试图5中呈现的各品系，其中每次重复测试使用20个种子。

在处理后第七天测量总生物质量。同时进行和测量未接种的‘水’对照处理。图5中与x轴平行并且二等分y轴顶部附近的柱的实线表示未接种的对照种子。与未经活体外处理的对照物相比，在接种后第七天(DPI)，一些经接种的品系显示生物质量的相对增加。

表11提供与仅用水处理对照物(H2O)和未经处理的(Unt)对照物相比，如上文所描述接种的小麦的生物质量增加的拐点。对于仅水处理对照物和未经处理的对照物，紧靠物种的右侧两个管柱反映与对照物相比的百分比增加(％IOC)。表11的资料中反映生物质的增加和减少。较小植物反映营养物和水的现场保留的潜力，其中这些来源可由干旱或局部条件限制，因此假设降低是产量相关的。

结果表明与活体外仅水和未经处理的对照物相比，在接种后第七天(DPI)，约19种品系引起小麦的整体生物质量的相对增加。与两种对照物相比，八种品系展示大于5％的增加，而与水对照物相比，19种品系展示大于5％的生物质量降低。

表11

实例5：用经分离的微生物增加玉米、小麦和番茄的根和芽长度

A.用经分离的微生物进行种子处理

在本实例中，用个别微生物品系(BDNZ品系)接种玉米、小麦和番茄的种子，并且使其发芽。

将种子接种并且置放于湿纸巾上，并且辊压。接着辊在密封塑料袋中，在25℃下培育。表12中呈现的每个品系在出芽测试中一式两份地测试，其中每次重复测试使用30个种子(小麦和玉米)和50个种子(番茄)。

在处理后第四天测量根长度和芽长度(RL和SL)。用水在不存在本公开的微生物接种体情况下进行种子的对照处理。与未经处理的对照物相比，一些经接种的品系在接种后第四天(DPI)显示根和/或芽长度的相对增加。

对于30个种子，各自一式两份地测试施用于玉米种子的每个品系。结果表明尽管所测试的所有品系的出芽率都是良好的，并且一些品系与活体外水对照物相比在接种后第4天(DPI)引起根和/或芽长度的相对增加(参见图6和7)。

对于30个种子，各自一式两份地测试施用于小麦种子的每个品系。在处理后第4天测量根和芽长度。结果表明尽管所测试的所有品系的出芽率都是良好的(>90％)，并且一些品系与活体外水对照物相比在接种后第4天(DPI)引起根和/或芽长度的相对增加(参见图8和9)。

对于50个种子，各自一式两份地测试施用于番茄种子的每个品系。在接种后第4天(DPI)测量根和芽长度。结果表明尽管所测试的所有品系的出芽率都是良好的，并且一些品系与活体外水对照物相比在接种后第4天(DPI)引起根和/或芽长度的相对增加(参见图10和11)。

表12提供与仅水处理对照物(H2O)相比，在如上文所描述接种之后，根和芽长度增加(mm)的拐点。对于仅水处理对照物，紧靠物种的右侧管柱反映与对照物相比的增加百分比(％IOC)。资料中反映增加和降低。较小植物反映营养物和水的现场保留的潜力，其中这些来源可由干旱或局部条件限制，因此假设降低是产量相关的。

结果表明与水对照物相比，在接种后第四天(DPI)，许多从优良植物分离的品系引起根和/或芽长度的显著增加(p<0.1，费雪LSD(Fisher's LSD))。与水对照物相比，二十个从优良植物分离的品系引起玉米根长度的显著增加，并且19个引起玉米芽长度的显著增加。与对照物相比，四个品系引起小麦的根和芽长度的显著增加。与对照物相比，四个品系引起番茄的根和芽长度的显著增加。

表12

在表12中，评定根和芽长度以评估微生物处理剂对早期植物发育的作用。已注意生物质量的增加和降低以反映假设降低是产量相关的可能性；举例来说，较小植物反映营养物和水的现场保留的潜力，其中营养物和水可由干旱或局部条件限制。结果表明与活体外水对照物相比，在所测试的所有品系中，某40个品系在接种后第4天(DPI)引起根长度的相对增加并且35个品系引起芽长度的相对增加。四个番茄品系、三个小麦品系和17个玉米品系引起芽长度和根长度的显著增加(p<0.1，费雪最小均方差)。

II.农业上重要的作物中增加的耐旱性和H₂O使用效率

在本发明的某些实施例中，本发明的方法旨在增加既定作物的耐旱性和水使用效率。

本文中呈现的方法(基于利用所公开的经分离的微生物、聚生体和包含其的组合物)具有增加重要的农业作物的耐旱性和水使用效率的潜力。这将实现更加可持续的农业系统并且增加适用于生长重要作物的世界区域。

实例1：用经分离的微生物和微生物聚生体增加黑麦草耐旱性和H₂O使用效率

A.用经分离的微生物进行种子处理

与对照性黑麦草植物相比，预期由用种子涂层处理的种子生长的黑麦草植物将呈现可定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。

耐旱性和/或水使用效率可基于所属领域中的任何次数的标准测试，例如叶子保水性、肿胀损失点、光合率、叶子颜色和其它指示干旱胁迫、产量性能以及多种根形态和生长模式的表现型。

B.用微生物聚生体进行种子处理

C.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理

也绘制未被投予农业组合物的黑麦草种子的对照曲线。

预期与对照性黑麦草植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的黑麦草植物将呈现可定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。

D.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理

也绘制未被投予农业组合物的黑麦草种子的对照曲线。

实例2：用经分离的微生物和微生物聚生体增加玉米耐旱性和H₂O使用效率

A.用经分离的微生物进行种子处理

与对照性玉米植物相比，预期由用种子涂层处理的种子生长的玉米植物将呈现可定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。

B.用微生物聚生体进行种子处理

C.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理

也绘制未被投予农业组合物的玉米种子的对照曲线。

预期与对照性玉米植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的玉米植物将呈现可定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。

D.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理

也绘制未被投予农业组合物的玉米种子的对照曲线。

实例3：用经分离的微生物和微生物聚生体增加大豆耐旱性和H₂O使用效率

A.用经分离的微生物进行种子处理

在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以种子涂层形式施用于大豆的种子。在以种子涂层形式施用经分离的微生物时，将以标准方式种植和培育大豆。

与对照性大豆植物相比，预期由用种子涂层处理的种子生长的大豆植物将呈现可定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。

B.用微生物聚生体进行种子处理

C.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理

也绘制未被投予农业组合物的大豆种子的对照曲线。

预期与对照性大豆植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的大豆植物将呈现可定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。

D.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理

也绘制未被投予农业组合物的大豆种子的对照曲线。

III.增加农业上重要的作物的氮使用效率

在本发明的某些实施例中，本发明的方法旨在降低必须沉积在既定农业系统中的氮的量，并且仍实现既定作物的相同或更好的产量。

本文中呈现的方法(基于利用所公开的经分离的微生物、聚生体和包含其的组合物)具有可降低由氮浸透到空气、土壤和水路中而引起的每年农民损失的氮肥料的量的潜力。这将实现更加可持续的农业系统，其仍能够产生符合当今农业期望的产量。

实例1：用经分离的微生物和微生物聚生体增加黑麦草NUE

A.用经分离的微生物进行种子处理

预期与对照性黑麦草植物相比，由用种子涂层处理的种子生长的黑麦草植物将呈现可定量和优良的利用氮的能力。

氮使用效率可通过记录同化路径中主要氮代谢池尺寸中的任一个的可测量的变化(例如以下中的一个或多个中的可测量的变化：硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、白氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、酪氨酸、植物部分的总蛋白含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量)来定量，或其中证实与对照植物相比，经处理的植物在较低氮施肥量下提供相同或升高的生物质量或可收获产量，或其中证实与对照植物相比，经处理的植物在相同氮施肥量下提供升高的生物质量或可收获产量。

B.用微生物聚生体进行种子处理

C.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理

也绘制未被投予农业组合物的黑麦草种子的对照曲线。

预期与对照性黑麦草植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的黑麦草植物将呈现可定量和优良的利用氮的能力。

D.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理

也绘制未被投予农业组合物的黑麦草种子的对照曲线。

实例2：用经分离的微生物和微生物聚生体增加玉米NUE

A.用经分离的微生物进行种子处理

预期与对照性玉米植物相比，由用种子涂层处理的种子生长的玉米植物将呈现可定量和优良的利用氮的能力。

B.用微生物聚生体进行种子处理

C.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理

也绘制未被投予农业组合物的玉米种子的对照曲线。

预期与对照性玉米植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的玉米植物将呈现可定量和优良的利用氮的能力。

D.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理

也绘制未被投予农业组合物的玉米种子的对照曲线。

实例3：用经分离的微生物和微生物聚生体增加大豆NUE

A.用经分离的微生物进行种子处理

预期与对照性大豆植物相比，由用种子涂层处理的种子生长的大豆植物将呈现可定量和优良的利用氮的能力。

B.用微生物聚生体进行种子处理

C.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理

也绘制未被投予农业组合物的大豆种子的对照曲线。

预期与对照性大豆植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的大豆植物将呈现可定量和优良的利用氮的能力。

D.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理

也绘制未被投予农业组合物的大豆种子的对照曲线。

IV.农业上重要的作物中增加的代谢物表达

在本发明的某些实施例中，本发明的方法旨在增加既定作物的相关代谢物的产生。

本文中呈现的方法(基于利用所公开的经分离的微生物、聚生体和包含其的组合物)具有增加既定作物的相关代谢物的产生的潜力。

实例1：用经分离的微生物和微生物聚生体增加罗勒中的糖含量

A.用经分离的微生物进行种子处理

在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以种子涂层形式施用于罗勒(灌木罗勒(Ocium basilicum))的种子。在以种子涂层形式施用经分离的微生物时，将以标准方式种植和培育罗勒。

也将绘制罗勒种子(其未施用种子涂层形式的经分离的微生物)的对照曲线。

预期与对照性罗勒植物相比，由用种子涂层处理的种子生长的罗勒植物将呈现水溶性碳水化合物含量的可定量增加。

B.用微生物聚生体进行种子处理

在本实例中，将包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体以种子涂层形式施用于罗勒(灌木罗勒)的种子。在以种子涂层形式施用微生物联合体时，将以标准方式种植和培育罗勒。

也将绘制罗勒种子(其未施用种子涂层形式的微生物联合体)的对照曲线。

V.可用微生物和

的组合实现的协同作用

A.用经分离的微生物与

的组合进行种子处理

在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将与

组合并且以种子涂层形式施用于植物的种子。在以种子涂层形式施用经分离的微生物/

组合时，将以标准方式种植和培育植物。

也将绘制不具有以种子涂层形式施用的经分离的微生物/

组合的植物种子的对照曲线。

预期与对照植物相比，由用种子涂层处理的种子生长的植物将呈现相关表现型特性的可定量增加。预期可观察到相关表现型特性的协同作用。

B.用微生物聚生体与

的组合进行种子处理

在本实例中，微生物联合体(包含至少两种来自表1-3的微生物)将与

组合，并且接着以种子涂层形式施用于植物的种子。在以种子涂层形式施用微生物联合体/

组合时，将以标准方式种植和培育植物。

也将绘制不具有以种子涂层形式施用的微生物联合体/

组合的植物种子的对照曲线。

VI.微生物聚生体

实例中利用的微生物聚生体以非限制性物质呈现于表13中，同时认识到微生物聚生体可包含表1-3中呈现的任一种或多种微生物。

表13：聚生体组合物

VII.微生物聚生体对植物表现型的作用

实例1：在美国试验中评估暴露于微生物聚生体的植物的表现型

表14中公开的植物在167ml根体积下在受控环境中，并且通常在土壤基质中生长。对于所有物种，所有实验的腔室光周期设定成16小时。由于植物高度在实验期间增加，光强度范围是180μmol PAR m^-2s^-1到约mol PAR m^-2s^-1。

对于玉蜀黍、大豆和双色高粱实验，空气温度在光周期期间通常是28℃，在夜间降低到23℃。对于小麦实验，空气温度在光周期期间通常是24℃，在夜间降低到20℃。

在早期无性繁殖生长期间，通常在V3发育期之前测量表现型。

使用可提供叶绿素含量指数的计量器，非相消地沿最嫩的完全扩增树叶在中间位置测量叶绿素含量(CCM-200，Opti Sciences，美国新罕布什尔州赫德森(Hudson,NH,US))。

在植物在设定成80℃的干燥箱中干燥到恒重之后测量完整植物、芽和根干重。对于在每次实验中测量的每个表现型，测量至少10个重复植物。

在各实验中进行未接种的种子的对照处理，以用于与由用微生物聚生体接种的种子生长的植物进行比较。

表14

表14中呈现的资料描述与相同实验中对照性操作相比，具体联合体改变相关表现型的时间百分比(功效)。所测量的表现型是完整植物干重(植物)、芽干重(芽)、根干重(根)、叶绿素含量(叶绿素)以及叶子温度(Tleaf)。

所呈现的资料是针对对照物测试的特定联合体的次数的平均值(评估值)。对于在不同编号的评估中测量不同表现型的聚生体，在资料点旁边置放星号以使表现型与评估编号匹配。已分解和显示特定作物物种(作物)的评估值。

所呈现的资料鉴别在超过60％的评估值中增加相关表现型(命中率>59)的聚生体，和在超过60％的评估值中降低相关表现型(命中率<41)的聚生体。记录相关表现型中的增加和降低以反映相关选择表现型的降低与产量相关性的可能性。通过降低的叶绿素进行的雨棚光合成改良和通过降低的芽生物质量进行的耐旱性改良组成两个实例。

实例2：在新西兰试验中评估暴露于微生物聚生体的植物的表现型

由以在25℃下培育48到72小时的R2A上的传播培养盘形式生长的分离物制备接种体。通过与无菌蒸馏水(SDW)掺合来收集群落，其接着转移到无菌容器中。将所收集的细胞的连续稀释物涂布并且在25℃下培育24小时，以评估各悬浮液中集落形成单位(CFU)的数目。使用个别分离物或分离物的掺合物(聚生体)制备稀释物以传递约1×10⁵cfu/微生物/种子，并且通过在液体悬浮液中渗吸或通过用5％植物胶和油过度处理来接种种子。

在农业土壤中，在24到48小时处理内种植对应于表15中的植物的种子，灌注培养基或惰性生长培养基。植物在小盆(28mL到200mL)中，在受控环境或温室中生长。对于所有物种，所有实验的腔室光周期设定成16小时。空气温度通常保持在22-24℃之间。

除非另有说明，否则所有植物用自来水每周浇水2到3次。生长条件根据相关特性变化并且包括如下施用肥料、灌溉制度和盐胁迫的操作：

●低N-在灌注培养基或惰性生长培养基的土壤中种植种子，其中不施用N肥料

●中等N-在补充有市售N肥料达到135kg/ha所施用的N的当量的土壤或生长培养基中种植种子

●不溶解的P-在灌注培养基或惰性生长基质中种植种子并且用含有三磷酸钙作为唯一磷酸盐肥料形式的四分之一强度皮氏液体培养基(Pikovskaya's liquid medium)浇灌。

●冷胁迫-在土壤、灌注培养基或惰性生长培养基中种植种子并且在10℃下培育一周，随后转移到植物生长室中。

●盐胁迫-在土壤、灌注培养基或惰性生长培养基中种植种子并且用含有100到200mg/L NaCl的溶液浇灌。

制备用于各实验的未经处理的(未施用微生物)对照物。在整个生长环境中，在塔盘上随机分配植物。对于各实验中的每次处理，制备10到30个重复植物。在早期无性繁殖生长期间，通常在V3发育期之前并且在播种之后的3到6周测量表现型。修剪叶子并且称重。洗涤根，以印迹方式干燥并且称重。结果表明针对未经处理的对照物的处理的性能。

表15

表15中呈现的资料描述与相同实验中的对照性操作相比，微生物物种或品系改变相关表现型的效率。对于植物生长，所测量的表现型是在不存在或存在胁迫情况下的芽鲜重和根鲜重(分析法)。对于各微生物物种，整体效率评分表明在独立评估中所述物种的品系使芽和根鲜重增加的时间百分比。对于各物种，提供各独立分析法的特殊性，提供品系ID(品系)和进行分析法的作物物种(作物)。对于各独立分析法，提供与对照物相比的芽和根鲜重的增加百分比。

实例3：在美国田间试验评估暴露于微生物聚生体的玉米的产量影响

表16中呈现的资料概述在美国中西部的八个地区测试的六种聚生体与对照物相比的最终产量变化。还呈现来自在美国加利福尼亚进行的两个干旱试验的最终产量资料。资料表示成试验百分比，其中观察具体量值的每英亩的产量影响(蒲式耳)。所有田间试验是根据标准农艺操作进行。

表16

实例4：在新西兰田间试验评估暴露于微生物聚生体的玉米的产量影响

表17中呈现的资料概述选择聚生体的新西兰田间试验的结果。所呈现的资料描述其中已相对于对照物测试具体聚生体的试验数，和其中聚生体处理相对于对照处理增加最终产量的试验数。所有田间试验是根据标准农艺操作进行。

表17

实例5：由ARS培养物收藏中心(NRRL)保藏的微生物

在一个实验实施例中，本发明人在本公开的应用中利用以下微生物物种。表18详细描述已由美国农业ARS培养物收藏部门(United States Department of AgricultureARS Culture Collection；NRRL)保藏的本公开的微生物物种。

表18

实例6：由ARS培养物保藏中心(NRRL)保藏的新型微生物物种

在一个实验实施例中，本发明人在本公开的应用中利用以下微生物物种。

表19

实例7：保藏的农业上新型微生物物种

在一个实验实施例中，本发明人在本公开的应用中利用以下微生物物种。表20说明已由NRRL、ATCC和/或DSMZ保藏中心以各别寄存编号保藏的本公开的微生物生物体。

表20

实例8：微生物聚生体实施例

在一个实验实施例中，本发明人在本公开的应用中利用以下微生物聚生体。表21说明本公开的微生物聚生体D1、A1、D6、D7、D12以及A15。每个聚生体名称下是鉴别每个聚生体中存在的微生物的特定品系数。

表21

实例9：微生物品系和微生物物种实施例

在一个实验实施例中，本发明人在本公开的应用中利用以下微生物物种和/或品系。表22说明实验研究中利用的特定微生物物种和品系，其在农业上是新型的并且在本公开的受控环境筛检实验中呈现正性结果。

表22

以引用的方式并入

本文中所引用的所有参考文献、论文、公开、专利、专利公开以及专利申请以全文引用的方式并入以用于所有目的。

然而，提及本文引用的任何参考文献、论文、公开案、专利、专利公开案以及专利申请案不是并且不应认为是承认或以任何形式暗示其构成有效现有技术或形成世界上任何国家的公共常识的部分。

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Claims

1.一种赋予植物物种至少一种有益特性的方法，其包含：

将库氏节杆菌物种(Arthrobacter cupressi sp.)施用于所述植物或具有植物的生长介质，其中，所述库氏节杆菌物种是库氏节杆菌，以NRRL寄存保藏号NRRL B-67184保藏。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述施用通过以下进行：用所述细菌涂布植物种子、用所述细菌涂布植物部分、将所述细菌喷雾到植物部分上、将所述细菌喷雾到将安置植物或种子的槽沟中、将所述细菌浸透到植物部分上或浸透到将安置植物的区域中、使所述细菌扩散到植物部分上或扩散到将安置植物的区域中、使所述细菌散播到植物部分上或散播到将安置植物的区域中、将所述细菌与肥料或其他农业组合物组合，及其组合。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述种子涂布包括以每个种子1×10⁵到1×10⁹个细菌细胞的浓度涂布至少一种经分离的细菌物种。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述经分离的细菌物种被形成为农业组合物，所述农业组合物具有下列各项中的一种或多种：农业上可接受的载剂、杀虫剂、植物生长调节剂、有利的试剂或生物活性剂。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述经分离的细菌物种以1×10³到1×10¹²个细菌细胞/克存在于所述农业组合物中。

6.一种农业组合物，包括：

a)

库氏节杆菌，以NRRL寄存保藏号NRRL B-67184保藏；以及

b)农业上可接受的载剂、杀虫剂、植物生长调节剂、有利的试剂和/或生物活性剂。

7.根据权利要求6所述的农业组合物，其中，所述农业组合物配制成种子涂层、肥料添加剂、喷雾剂、浸液及其组合。

8.一种微生物聚生体，包含：库氏节杆菌，以NRRL寄存保藏号NRRL B-67184保藏。

9.由根据权利要求8所述的微生物聚生体产生的代谢产物。

10.一种植物与权利要求6所述的农业组合物的合成组合。

11.根据权利要求10所述的合成组合，包括至少两种经分离的细菌物种，或相同物种的不同菌株。

12.根据权利要求11所述的合成组合，其中，将至少两种经分离的细菌物种，或相同物种的不同菌株涂布到植物的种子上，或者施用在植物部分表面上，或者施用在将种植植物的区域中，或者与肥料或其他农业组合物组合。