CN108126011A - 用于肿瘤放疗及化疗病人辅助调理的药物组合物及其制法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药或保健品领域，具体涉及用于肿瘤放疗及化疗病人辅助调理的组合物及其制法。本发明所解决的技术问题是提供一种全新的组合物用于补益机体正气，增强体质，尤其是用于肿瘤化疗及放疗病人辅助调理，以及对辐射危害有辅助保护的作用。本发明组合物是以冬虫夏草、破壁灵芝孢子粉、当归、黄芪、肉桂、甘草为原料药，重量配比如下：冬虫夏草1‑8份、破壁灵芝孢子粉5‑30份、当归3‑25份、黄芪10‑80份、肉桂3‑25份、甘草10‑60份。相较于市面上的同类产品，本发明具有效果明确，疗效稳定，可控的优点，为公众提供了一种全新的选择。

Description

用于肿瘤放疗及化疗病人辅助调理的药物组合物及其制法
技术领域
本发明属于医药或保健品领域，具体涉及用于肿瘤放疗及化疗病人辅助调理的组合物及其制法。
背景技术
肿瘤化疗是利用化学药物阻止癌细胞的增殖、浸润、转移，直至最终杀灭癌细胞的一种治疗方式，由于其选择性不强，在杀灭癌细胞的同时也会不可避免的损伤人体正常的西部，从而出现骨髓抑制(白细胞降低、血小板降低、红细胞减少)、消化道反应(恶心、呕吐、腹泻、便秘)、脏器毒性(药物性肝损伤、肾功能不全、肺纤维化、神经毒性反应、心力衰竭)等不良反应。
肿瘤放疗是利用放射线治疗肿瘤的一种局部治疗方法。放射治疗会引起全身功能紊乱与失调，局部皮肤、粘膜以及骨髓抑制的不良反应。
同时，如电视塔、电磁波发射塔等高强度电磁波，以及手机、计算微波炉等家用电器产生的电磁辐射也成为必须控制的主要污染物之一，人体如果长期暴露在超过安全的辐射剂量下，也会造成骨髓抑制、造血组织功能障碍，和外周血白细胞下降以及免疫功能降低。
目前我国批准的增强免疫力的保健食品有近两千种，对辐射危害有辅助保护功能的保健食品有不到200种，同时具有增强免疫力和辐射危害有辅助保护功能的保健食品仅有69种。药品方面，针对抗辐射损伤有氨琉基类辐射防护剂(作用时间较短且毒性较大)、细胞因子(价格昂贵，常温难保存，普遍有较严重的副作用)、激素类(有一定副作用)、中草药类、金属硫蛋白、海洋生物成分等。
中医药在多年的研究中，发现具有清热解、活血化瘀、补血益气、养阴升白的中药均有不同程度的抗辐射作用，例如人参、灵芝、白藜芦醇等，以及多种中药的多糖类如木耳多糖和南沙参多糖、生物碱类如苦豆子总碱和骆驼蓬碱、皂苷类如刺五加皂苷，还有一些中药复方药物如护生宝口服、四生汤等。
然而，目前市面上针对辐射损伤的保健品大多功效不明显，更鲜有用于肿瘤放疗及化疗病人辅助调理且效果确切的药品或保健品，因此，开发出效果更佳的替代产品具有重要意义。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种全新的组合物用于补益机体正气，增强体质，尤其是用于肿瘤化疗及放疗病人辅助调理，以及对辐射危害有辅助保护的作用。
本发明提供了用于肿瘤化疗及放疗病人辅助调理的药物组合物，原料药重量配比如下：
冬虫夏草1-8份、破壁灵芝孢子粉5-30份、当归3-25份、黄芪10-80份、肉桂3-25份、甘草10-60份。
进一步地，原料药重量配比如下：冬虫夏草2-7份、破壁灵芝孢子粉8-25份、当归5-20份、黄芪20-70份、肉桂5-20份、甘草20-50份。
优选地，原料药重量配比如下：冬虫夏草3-6份、破壁灵芝孢子粉10-20份、当归8-15份、黄芪30-60份、肉桂8-15份、甘草25-40份。
进一步优选地，原料药重量配比如下：冬虫夏草5份、破壁灵芝孢子粉15份、当归10份、黄芪50份、肉桂10份、甘草30份。
上述原料药的来源与中国药典2015版收载的内容一致。
上述原料药干品和鲜品均可使用，优选使用干品，干品的获得方法：除去杂质，洗净，晾干，即得。其中，所述重量份以干品计。
其中，所述破壁灵芝孢子粉是将灵芝孢子粉通过超微粉碎机粉碎得到的。孢子粉外壁坚硬，如不破壁则有效成分无法获得，破壁后更有利于吸收。灵芝孢子粉破壁率达到95％以上可发挥较好的疗效。
进一步地，所述的药物组合物是取各原料药，按照常规方法制成口服制剂；或加入药学上可接受的辅料制成常用口服制剂。
进一步地，所述常用口服制剂为散剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂或口服液。
进一步地，所述颗粒剂含有三氯蔗糖；优选地，三氯蔗糖含量为0.03％w/w。
进一步地，所述颗粒剂采用聚维酮K30的乙醇溶液作为润湿剂。
优选地，润湿剂采用0.5-1.5％的聚维酮K30的30-60％乙醇溶液。
进一步优选地，润湿剂采用0.75％的聚维酮K30的40％乙醇溶液。
本发明提供了所述药物组合物的制备方法，包括如下步骤：取各重量配比的原料药，打粉，或加入水或有机溶剂提取，再加入药学上或保健品中可接受的辅料或者辅助性成分，即得。
本发明提供了所述药物组合物的制备方法，包括：
方法一：将各原料药粉碎成细粉，混合即成散剂；
方法二：将各原料药粉碎成细粉，装胶囊即成胶囊剂；
方法三：将各原料药粉碎成细粉，压片即成片剂；
方法四：将各原料药采用常规方法用水煎煮提取后，浓缩提取液制成颗粒，即成颗粒剂；
方法五：将各原料药采用常规方法用水煎煮提取后，浓缩提取液制成颗粒，装胶囊即成胶囊剂；
方法六：将各原料药采用常规方法用水煎煮提取后，浓缩提取液制成颗粒，压片即成片剂；
方法七：将各原料药采用常规方法用水煎煮提取后，制成口服液。
本发明提供了所述药物组合物的制备方法，取各原料药制备为颗粒剂，包括如下步骤：
A、肉桂粗粉加水提取收集肉桂挥发油，并制成肉桂挥发油包合物，提取液过滤得肉桂母液及肉桂药渣备用；
B、取肉桂药渣与当归、黄芪、甘草加水提取，过滤得滤液与肉桂母液混合，浓缩，离心，去除杂质，留液体浸膏备用；
C、步骤B所得浸膏干燥，粉碎过筛，得干膏粉备用；
D、混合肉桂挥发油包合物，冬虫夏草粉、破壁灵芝孢子粉、干膏粉、辅料；
E、制粒、干燥、整粒即得。
进一步地，步骤A所述肉桂粗粉为粒径10-65目；优选粒径10目。
进一步地，步骤A肉桂粗粉加水提取条件为：8-12倍量水，提取挥发油2-8小时；优选加水提取条件为10倍量水，提取挥发油6小时。/
进一步地，步骤A收集所得肉桂挥发油采用β-环糊精包合，得肉桂挥发油包合物备用。
进一步地，步骤B提取条件为：6-12倍量水，提取1-3次，每次1-2小时；优选提取2次：第一次加10倍量水提取1.5h，第二次加8倍量水提取1.5h。
进一步地，步骤B过滤采用100-200目筛网过滤；优选采用200目筛网过滤。
进一步地，步骤B浓缩条件为于-0.06～-0.08Mpa，60-80℃减压浓缩，浓缩至60℃测定相对密度为1.05-1.10。
进一步地，步骤C粉碎过筛为粉碎过50-100目筛，优选粉碎过80目筛。
进一步地，步骤D所述辅料包括三氯蔗糖、魔芋粉、二氧化硅、β-环糊精、糊精，具体的混合方法为三氯蔗糖和肉桂油包合物等量递增，得混合粉A；混合粉A再与冬虫夏草粉、魔芋粉、二氧化硅混合得混合粉B；混合粉B再与破壁灵芝孢子粉、β-环糊精、糊精、干膏粉混合。
进一步地，步骤E制粒采用8-14目制粒，优选14目制粒。
进一步地，步骤E干燥温度为40-60℃，优选50℃。
进一步地，步骤E整粒为10-18目整粒，优选12目整粒。
进一步地，肉桂挥发油采用β-环糊精包合的方法如下：
1)按挥发油：β-环糊精：水＝(0.5-2ml)：(4-8g)：(40-80ml)的配比混合；优选地，挥发油：β-环糊精：水的配比为1ml：8g：60ml；
2)在40-60℃包结0.5-2小时得包合物；优选地，在40℃包结1小时；
3)粉碎包合物，备用；优选地，粉碎包合物至过50-100目筛；进一步优选地，粉碎包合物至过80目筛。
本发明提供了所述的药物组合物在制备用于肿瘤化疗及放疗病人辅助调理的药物或保健品中的应用。
本发明提供了所述的药物组合物在制备具有辐射保护作用的药物或保健品中的应用。
本发明提供了所述的药物组合物在制备增强免疫力的药物或保健品中的应用。
本发明提供了用于肿瘤化疗及放疗病人辅助调理的组合物。该组合物以当归补血汤为基础，加入甘草使药调和，肉桂助阳，灵芝孢子粉增免抗癌。功能健胃消食、温阳化浊、活血祛瘀、化浊降脂。诸品合用，共同起到补肾益肺，补血活血，补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，补火助阳，引火归元，温通经脉，共同发挥补益机体正气，增强体质之功。动物试验研究证明，本发明药物组合物可显著增强细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性，同时可显著降低辐射损伤后骨髓细胞微核率。临床试用结果进一步表明，在肿瘤放化疗患者辅助调理方面，本发明组合物能较好的提高食欲，减轻呕吐、腹泻、疲乏、脱发症状，提高睡眠质量；用于亚健康者，本发明组合物在改善睡眠、脱发情况，提高注意力，减轻疲乏方面效果十分显著。相较于市面上的同类产品，本发明具有效果明确，疗效稳定，可控的优点，为公众提供了一种全新的选择。
附图说明
图1为实施例1中颗粒剂的吸湿曲线图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。以下所述“虫草灵孢归芪颗粒”即本发明颗粒剂。
本发明提供了以冬虫夏草、破壁灵芝孢子粉、当归、黄芪、肉桂、甘草为原料药的组合物，不仅可用于对肿瘤化疗及放疗病人术后的辅助调理，又可辅助保护辐射对人体造成的危害，具有增强免疫力的作用。
本发明组合物来源于当归补血汤，重用黄芪补气而专固肌表，大补脾肺之气，以资化源，使气旺血生，当归养血合营；加肉桂补元阳，暖脾胃，除积冷，通血脉；冬虫夏草补肾壮阳、益精气；破壁灵芝孢子粉补肝气，安魂魄；甘草清热解毒，调和诸药。方中诸药共奏能健脾益肾，补气血，增强免疫系统的机能。《内经》云：“正气存内，邪不可干。”故本发明药物组合物可补益人体正气，增强机体免疫系统，对辐射危害有辅助保护功能。
临床试用结果表明，在肿瘤放化疗患者辅助调理方面，与服用相同剂量的当归补血汤相比，本发明组合物在增进食欲、减轻恶心、呕吐，减轻脱发，提高睡眠质量方面的效果更为显著；本发明组合物用于亚健康者，与当归补血汤配方相比，在改善睡眠、脱发情况，提高注意力，减轻疲乏方面效果也有显著提升。
发明人在应用时，在以下重量配比范围内调整原料药的用量，均可以实现补益机体正气，增强体质，用于肿瘤化疗及放疗病人辅助调理，以及对辐射危害有辅助保护作用的目的：冬虫夏草1-8份、破壁灵芝孢子粉5-30份、当归3-25份、黄芪10-80份、肉桂3-25份、甘草10-60份。
经过长期临床或实验应用总结，本发明药物组合物原料药优选重量配比如下：冬虫夏草2-7份、破壁灵芝孢子粉8-25份、当归5-20份、黄芪20-70份、肉桂5-20份、甘草20-50份。
最优选的重量配比如下：冬虫夏草5份、破壁灵芝孢子粉15份、当归10份、黄芪50份、肉桂10份、甘草30份；由上述用量配比关系组成的药物组合物疗效更稳定，可控。
进一步地，因应用的便利性和制剂的简便，本发明组合物优选制备成颗粒剂使用。
发明人经过考察发现，本发明组合物服用量较大，加之中药提取物易吸潮的特点，所以做成胶囊剂不如颗粒剂。对于片剂而言，中药片剂需加入赋形剂、崩解剂、润滑剂制粒压片，包衣时又需要加入明胶、滑石粉、色素等辅料，不仅辅料量大、流程长，而且片剂不易崩解溶出，储存期易产生花斑、裂片等情况。口服液虽服用较方便，然而特殊的包装材料--玻璃，易碎，给携带和运输都带来不便，且对澄清度和微生物有一定的要求，工艺较为复杂。颗粒剂溶解释放迅速，吸收利用良好，避免了中药片剂生产中出现的松片、裂片、粘冲、叠片、变色、花斑等问题。中药颗粒剂既保持了口服液吸收快、作用迅速的特点，又克服了口服液运输携带不便、工艺复杂等缺点，且制备工艺适于工业生产，服用、携带、储藏、运输均较方便，发展前景较好。
进一步地，本发明还提供了所述组合物的制备方法。
本发明组合物的主要原料为冬虫夏草粉、破壁灵芝孢子粉、当归、黄芪、肉桂和甘草，发明人考虑到原料直接入药，服用量大，澄清度差，吸收较慢，所以采用提取工艺，将部分原料中的有效成分提取出来，使有效成分更好更快的发挥作用。结合颗粒剂的常规工艺，本发明组合物制成颗粒剂根据实际生产条件确定的制备方法，包括提取、浓缩、干燥、混合、制粒、干燥、整粒等步骤，工艺路线操作简便，适合于实际大生产。
实施例1本发明颗粒剂的制备工艺
1.肉桂提取和包结的工艺研究
1.1肉桂挥发油提取工艺研究
将肉桂破碎至10目左右备用，称取肉桂粗粉300g为一份，共取3份，考察药材是否浸泡及提油时间(水蒸气蒸馏提取)。不同时间记录出油量，至油量基本上不再增加为止。结果见表1。
表1挥发油提取考察
由以上结果可知，浸泡对挥发油的提取效果影响不大，药材提取4小时挥发油已基本提取完全，至6小时仅有极少量的增加，8小时后油量已不再增加，故确定挥发油提取条件为：提油药材不浸泡，提取时间为6小时为宜。
为了考察加水量对挥发油提取量的影响，又进行了加水量的考察试验。称取肉桂粗粉300g为一份，共取3份，分别加入8倍、10倍、12倍水，不同时间记录出油量，至油量基本上不再增加为止。结果见表2。
表2提油加水倍数的考察
由以上结果可知，8倍量水提取挥发油效果不好，10倍量挥发油提取量与12倍量提取相差不大，考虑到大生产实际(节约时间、能源，降低成本)，确定加水10倍为宜。
综合上述试验结果，肉桂挥发油的提取工艺为：肉桂粉碎成粗粉，加10倍量水，水蒸气蒸馏6小时即可。
1.2挥发油包结工艺条件的优选
为了保证挥发油在制剂中的稳定性，采用β-环糊精包结，并且通过正交试验优选包结工艺。
1.2.1实验方案设计
1.2.1.1包结物制备工艺操作
称取一定量的β-环糊精，根据实验设计的挥发油-β-环糊精-水用量比例，加入计算量的蒸馏水，加入β-环糊精，加热使溶解，再降至规定温度，在恒温搅拌条件下，将挥发油-无水乙醇溶液(1:1)慢慢加入到β-环糊精水溶液中，搅拌至规定时间后，冷却至室温，置冰箱中，冷藏24小时，抽滤至干(为了得到准确的挥发油包结率，沉淀物用石油醚(30-60℃)洗涤(洗涤3次，目的是洗去未被包结的挥发油))，然后置40-45℃的烘箱中干燥至恒重，即得挥发油的包结物。
1.2.1.2空白回收率的测定
分别精确吸取3份肉桂挥发油，每份3ml，分别置于烧瓶中，各加入200ml水，水蒸气蒸馏法提取挥发油，按《中国药典》2010版一部附录XD挥发油测定法乙法进行测定，至挥发油量不再增加，停止加热，放置30分钟后，读取挥发油的量。计算空白回收率(空白回收率＝挥发油测的量/挥发油加入量×100％)，结果见表3。
表3挥发油空白回收率测定结果
结果，测定空白回收率均值为94.1％。
1.2.1.3挥发油包结率的测定
包结物中实际含油量测定：将干燥的挥发油β-环糊精包结物置于烧瓶中，加水200ml，连接挥发油提取器，按《中国药典》2010版一部附录XD挥发油测定法一法测定，至不再增加挥发油时，停止加热，放置30分钟后，读取挥发油含量。以下面公式计算包结率。
1.2.2正交试验及结果
根据相关文献报道，对影响包结物收率的3个因素：油-β-环糊精-水比例、包结温度、搅拌时间各取三个水平，按L9(3)4正交表安排试验。以挥发油的利用率为考察指标进行优选，因素水平见表4。
表4挥发油包结试验因素水平表
量取9份肉桂挥发油，每份3ml，按照按L9(3)4正交表安排试验，按照“1.2.1.1包结物制备工艺操作”结果见表5-6。
表5挥发油包结正交试验结果
表6包结率方差分析表
注：F0.05(2，2)＝19 F0.01(2，2)＝99
以因素D为误差项，进行统计分析，结果表明，影响肉桂包结率的因素由大到小为A＞B＞C，因素A(油：β-环糊精：水)对肉桂油的包结有显著性影响，有统计学意义，根据直观分析结果优选A3。因素B(包结温度)、因素C(包结时间)对结果无显著性影响，无统计学意义，综合分析确定包结条件为A3B1C2，即油:β-环糊精:水＝1:8:60，40℃包结，包结1小时。1.2.3包结工艺验证
取肉桂药材3000g，粗碎至约10目，加水10倍量，水蒸气蒸馏法6小时提取挥发油。量取3份肉桂油，每份10ml，用β-环糊精包结(油:β-环糊精:水＝1:8:60，40℃包结，搅拌1小时)，冷藏24h，抽滤，包结物干燥(40-45℃)，测定包结率，结果见表7。
表7挥发油包结工艺验证结果
根据上述试验结果可知，肉桂包结率平均值为87.11％，各数据间数据比较平行，工艺重现性较好，而且包结率均高于正交试验结果，验证所确定的包结工艺稳定可行。
1.3肉桂提取和包结工艺确定
由以上结果可知，肉桂挥发油提取与包结工艺为：肉桂粉碎成粗粉，加10倍量水，水蒸气蒸馏6小时；收集挥发油，采用挥发油:β-环糊精:水(1:8:60)，40℃包结1小时制成肉桂油的包结物。
2.当归、黄芪、甘草水提工艺确定依据
2.1提取条件的考察
以粗多糖为考察指标，设计正交试验，因素水平见表8。
表8正交试验因素水平表
肉桂粗碎至约10目，取90g加10倍量水提取挥发油6小时，过滤，母液备用，取相当于10g肉桂的药渣与方中的甘草30g、当归10g、黄芪50g采用正交试验水提，滤液测定粗多糖和总皂苷的总量。以粗多糖总量(以葡萄糖计)进行指标判定评分，结果见表9-10；以总皂苷的总量进行指标判定评分，结果见表11-12。
表9正交实验及粗多糖总量结果表L9(34)
表10方差分析表
误差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
A 0.54 2 0.27 2.13 P＞0.05 ——
B 1.62 2 0.81 6.36 P＞0.05 ——
C 7.34 2 3.67 28.84 P＜0.05 *
误差(D) 0.25 2 0.13 —— —— ——
F0.05(2,2)＝19.00 F0.01(2,2)＝99.00
由方差分析结果可知，提取次数对粗多糖的提取量有显著影响(P＜0.05)，提取时间和加水量对粗多糖的提取量影响不显著(P＞0.05)，正交试验结果得出最佳工艺条件为A3B3C3。
表11正交实验及总皂苷总量结果表L9(34)
表12方差分析表
误差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
A 1608.67 2 804.33 4.19 P＞0.05 ——
B 1984.67 2 992.33 5.17 P＞0.05 ——
C 5300.67 2 2650.33 13.80 P＞0.05 ——
误差(D) 384.00 2 192.00 —— —— ——
F0.05(2,2)＝19.00 F0.01(2,2)＝99.00
由方差分析结果可知，提取次数、提取时间和加水量对总皂苷的提取量影响不显著(P＞0.05)，正交试验结果得出最佳工艺条件为A3B3C3。
对两组正交试验的直观分析可以看出因素A加8/6/6倍量与加10/8/8倍量水提取结果相差不大；因素B提取时间1.5小时与2小时的结果比较接近；因素C提取2次和提取3次对结果影响不大；实际生产中考虑到节能减耗，将最佳提取工艺定为加水提取2次，每次1.5小时：即第一次加10倍量水提取1.5小时，第二次加8倍量水提取1.5小时。
2.2提取工艺验证
肉桂粗碎成粗粉，取300g加10倍量水提取挥发油6小时，过滤，母液备用，取相当于100g肉桂的药渣与方中的甘草300g、当归100g、黄芪500g合并加水煎煮，第一次加10倍量水，提取1.5小时，第二次加8倍量水，提取1.5小时，合并滤液，测定滤液中的粗多糖总量(以葡萄糖计)、总皂苷的含量。同法共制3份样品，分别将测定含量后的滤液减压浓缩(60～80℃，-0.08Mpa～-0.06Mpa)，相对密度1.05～1.10(60℃)的浸膏，5000rpm/min离心10分钟，取上清液继续减压浓缩至稠膏后干燥，粉碎，计算出膏率。测定结果见表13。
表13提取工艺验证结果
根据上述试验结果可知，三份提取出膏率均值为19.21％，粗多糖总量均值为59.89g，总皂苷量均值为2.21g，与正交试验基本吻合，工艺稳定可行。最终确定提取为：肉桂药渣和甘草、当归、黄芪合并后第一次加10倍量水，提取1.5小时，第二次加8倍量水，提取1.5小时。
3.浓缩与干燥工艺
按照生产浓缩和干燥的参数最终确定工艺为：提取滤液减压浓缩(60～80℃，-0.08Mpa～-0.06Mpa)，相对密度1.05～1.10(60℃)的浸膏，5000rpm/min离心10分钟，取上清液继续减压浓缩至稠膏后干燥，粉碎，过80目备用。
3.1浓缩干燥验证试验
取肉桂，粉碎成粗粉后取500g、另取当归500g、黄芪2500g、甘草1500g。肉桂粗粉加10倍量水提取挥发油6小时，过滤，母液备用，肉桂药渣备用；取肉桂药渣与当归、黄芪、甘草用水提取，第一次加10倍量水提取1.5h，第二次加8倍量水提取1.5h，200目过滤，合并2次滤液，减压浓缩(-0.06～-0.08Mpa，60-80℃)至相对密度1.05-1.10(60℃测)，5000rpm/min离心10分钟，取上清液继续减压浓缩至稠膏后干燥，粉碎，过80目备，得浸膏粉，测定总皂苷、粗多糖总量，同法制成三份，结果见表14。
表14提取浓缩干燥条件验证试验
验证试验结果表明：三次提取平均出膏量为1.027kg，平均出膏率为20.54％，粗多糖总量及总皂苷量与小试研究结果吻合，故提取工艺稳定，可行。
4.制剂成型工艺研究
4.1剂型选择
本品以肉桂、当归、黄芪、甘草经提取的提取物为主要原料，提取液减压干燥，加入冬虫夏草(粉)、破壁灵芝孢子粉、挥发油包合物，并辅以适宜的辅料制成颗粒剂，工艺简单，节约制备成本。另外，颗粒剂溶解释放迅速，有效成分吸收利用良好；制备工艺稳定，简单，适合工业生产；采用复合膜包装，便于储存、运输、携带，提高稳定性。
4.2辅料及用量选择的
考虑中药提取物口感苦、涩等因素，决定加入辅料以掩盖其不良气味，便于服用。取验证工艺4.1项下实验序号1中的浸膏粉5份，每份82g，每份分别加入灭菌处理过的冬虫夏草粉20g、破壁灵芝孢子粉60g、挥发油包合物2.4g(取包结验证实验项下的)，按下表辅料进行考察，每份制成400g。结果见表15。
表15辅料的考察
根据以上试验结果及常规用量三氯蔗糖食用后不被吸收，不产生热能，高度安全，又有甜度高，甜味纯正的特点，且试验4口感适中，分散性好，成本较低，故最终确定矫味剂选择三氯蔗糖作为调味剂，三氯蔗糖用量为0.03％(0.3g/1000g)，β-环糊精作为剂量调节剂调至总量。
4.3混合时间选择
按5.2项下实验4的配方比例称取浸膏粉1016g(4.1验证工艺的实验2号项下)、冬虫夏草粉250g、破壁灵芝孢子粉750g、挥发油包合物30g(包结验证实验项下的)、β-环糊精1477.5g、糊精1250g、魔芋粉150g、二氧化硅75g、三氯蔗糖1.5g，一共5000g。首先将三氯蔗糖及肉桂油包合物等量递增混合均匀，再与冬虫夏草、魔芋粉、二氧化硅、破壁灵芝孢子粉、β-环糊精、糊精、浸膏粉共同混合，分别在混合10、20、30分钟取样检验考察均匀性，结果见表16。
表16混合时间选择结果
试验号 混合时间(分钟) 混合情况
1 10 有白色斑点分布混合粉中，混合不均匀
2 20 有少量白色斑点分布混合粉中，混合不均匀
3 30 混合粉色泽均一，混合均匀
按照取样原则对混合粉上下左右中5个点分别取样，以粗多糖为考察指标，结果表明，总混物料混合30分钟后，可以混合均匀。具体数据见表17：
表17粗多糖含量检测结果
由结果看出，混合30分钟后其物料色泽、粗多糖含量均一，表明上述物料已经混合均匀，故确定混合时间为30分钟。
最终混合工艺确定为：将三氯蔗糖和肉桂油包合物等量递增得混合粉A，混合粉A再与冬虫夏草粉、魔芋粉、二氧化硅、破壁灵芝孢子粉、β-环糊精、糊精、浸膏粉混合30min，混合均匀得总混合粉。
4.4湿润剂选择
药材提取物具有一定的吸湿性，用水制粒，物料太粘，无法制粒，故选择不同浓度的乙醇作为湿润剂制粒，以制粒的难易程度筛选润湿剂。14目制粒，50℃干燥，12目整粒，考察结果见表18。
表18润湿剂的筛选
根据以上结果，编号3样品颗粒制备容易，粒度较好，故确定0.75％的聚维酮K30的40％乙醇溶液作为润湿剂。
4.5颗粒干燥时间选择
按GB 5009.3测定在颗粒50℃干燥条件下干燥不同时间颗粒的含水量及休止角，结果见表19。
表19干燥时间考察
结果表明，干燥时间1小时后即能符合规定要求，此时颗粒流动性也较好，故确定颗粒干燥时间为1小时，水分控制在5％以下。
4.6临界相对湿度考察
为了考察颗粒是否易吸潮，我们进行了临界相对湿度的测定，具体方法如下：称取上述的颗粒适量，干燥至恒重，在已恒重的扁形称量瓶底部放入厚约2mm的颗粒，精密称定后置于下表所列的不同RH％的8种不同盐的过饱和溶液的干燥器内，于25℃恒温培养箱中保持48小时后，称重，计算吸湿百分率，结果见表20。
表20不同过饱和盐溶液在25℃时的相对湿度
表中的吸湿百分率％为纵坐标，相对湿度RH％为横坐标作图，作图中曲线两端的切线，两切线交点对应的横坐标即为临界相对湿度见图1。
由图1可知，颗粒的临界相对湿度大于65％，即制粒、分装时，环境湿度建议控制在65％以下，以减少水分对药物性质及稳定性的影响。
5.制备工艺总结
5.1前处理：肉桂破碎成约10目左右备用；冬虫夏草粉、破壁灵芝孢子粉、β-环糊精、聚维酮K30、糊精、魔芋粉、二氧化硅、三氯蔗糖分别过80目筛，备用；
5.2配料称量：按配方比例称取当归、黄芪、肉桂、甘草；
5.3提取、浓缩：
(1)肉桂粗粉加10倍量水提取挥发油6小时，过滤，母液及肉桂药渣备用；另收集肉桂挥发油，采用挥发油:β-环糊精:水(1:8:60)，40℃包结1小时，包合物粉碎过80目筛，备用；
(2)取肉桂药渣与当归、黄芪、甘草用水提取，第一次加10倍量水提取1.5h，第二次加8倍量水提取1.5h，200目过滤，合并2次滤液及肉桂提取挥发油后备用母液，减压浓缩(-0.06～-0.08Mpa，60-80℃)至相对密度1.05-1.10(60℃测)时，离心，备用；
5.4干燥：干燥，过80目筛，浸膏粉备用。
5.5混合：称取配方量的三氯蔗糖和肉桂油包合物等量递增，得混合粉A，混合粉A再与破壁冬虫夏草粉、魔芋粉、二氧化硅、灵芝孢子粉、β-环糊精、糊精、浸膏粉混合30min，混合均匀得总混合粉。
5.6制粒、干燥、整粒：用0.75％聚维酮K30的40％乙醇溶液作为粘合剂，14目制粒，50℃干燥，12目整粒，即得干颗粒；
5.7内包装：口服固体药品包装用复合膜，每袋5g；
5.8外包装：贴标签，装盒，装箱，待检验合格后入库。
四、中试以上生产规模的工艺验证报告及样品自检报告
以本工艺通过3批次中试生产，分别考察了理论产量、实际得量及成品率等中试生产技术数据，结果表明产品工艺稳定，可行。中试数据见表21。
表21中试数据表
实施例2本发明颗粒剂的稳定性实验
本发明药物组合物的颗粒剂在密闭、避光、常温下不同时间检测粗多糖、腺苷、黄芪甲苷的含量，检测项目、依据即结果如下：
检验项目及依据：粗多糖——Q/QHCT004-2015(企业标准)
腺苷——保健食品检验与技术评价规范(2003)
黄芪甲苷——Q/QHCT004-2015(企业标准)
样品放置条件：恒温38℃，相对湿度75％。
第零个月结果
第一个月结果
第二个月结果
第三个月结果
实施例3本发明药物组合物日服剂量的验证
本发明药物组合物的日服用剂量及药典参考日服剂量如表22：
表22本发明日服用剂量及药典参考日服剂量
原料 本发明日用量 药材参考日用量
冬虫夏草 0.5g 3～9g
破壁灵芝孢子粉 1.5g 6～12g
当归 1g 6～12g
黄芪 5g 9～30g
肉桂 1g 1～5g
甘草 3g 2～10g
由上可见，采用上述配方的本发明药物组合物，冬虫夏草、破壁灵芝孢子粉、当归、黄芪均显著低于药典参考日服剂量。因此，为了避免质疑未达到推荐剂量，发明人特别就以下四组剂量做了小鼠迟发型变态反应(DTH)试验对比和小鼠骨髓细胞微核试验对比，日用量的比较见表23：
表23日用量
取以上四组相应用量的药材，肉桂破碎成10目粗粉加10倍水提取挥发油6小时，过滤，母液及肉桂药渣备用；另收集肉桂挥发油，采用挥发油:β-环糊精:水(1:8:60)，40℃包结1小时，包合物粉碎过80目筛，备用；
取肉桂药渣与当归、黄芪、甘草用水提取，第一次加10倍量水提取1.5h，第二次加8倍量水提取1.5h，200目过滤，合并2次滤液及肉桂提取挥发油后备用母液，减压浓缩(-0.06～-0.08Mpa，60-80℃)至相对密度1.05-1.10(60℃测)时，5000rpm/min离心10分钟，取上清液急需减压浓缩至稠膏，备用；干燥，粉碎，过80目筛，干膏粉备用。
称取配方量的肉桂油包合物等量递增，再与冬虫夏草粉、破壁灵芝孢子粉混合30min，混合均匀得试验药物(不加辅料)。临用前配制成动物试验可灌胃的合适浓度。
1、试验方法
小鼠迟发型变态反应(DTH)试验：经口给予小鼠上述各组溶液及空白对照组溶液31d后，取羊血，生理盐水洗涤3次，每只小鼠经腹腔注射2％(V/V，用生理盐水配制)SRBC悬液(2000r/min，10min)0.2mL，致敏后4d，测量足后足跎部厚度。然后在测量部位皮下注射20％(V/V，用生理盐水配制)SRBC悬液20μL，于注射后24h测量左后足跎部厚度。以上两次测量均为同一部位测量三次，取平均值。以攻击前后足跎厚度的差值来表示DTH的程度。
小鼠骨髓细胞微核试验：各组织照射前后经口连续给予各配方药液26d，各组与辐射模型对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次，照射剂量选择3Gy，于照射后第3天，颈椎脱臼杀死动物，取胸骨，用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀，常规涂片。涂片自然干燥后，放入甲醇中固定10min，放入Giemsa应用染液中，染色15min，立即用蒸馏水冲洗，晾干。镜检，每只动物计数1000个嗜多染红细胞中微核细胞数，微核率以千分率表示。如果低于辐射模型组微核率，差异有显著性，可判定实验结果阳性。
2、试验结果
试验结果见表24、表25：
表24小鼠迟发型变态反应的影响对比
与空白对照组比较：*P<0.05
表25对辐射小鼠骨髓细胞微核率的影响对比()
与空白对照组比较：*P<0.05
3、试验结论
表24可见，经口给予小鼠不同配方的本品31d后，与空白对照组比较，均能显著提高小鼠迟发型变态反应程度(P<0.05或P<0.01)；表25可见，经口给予小鼠不同配方的本品26d后，与空白对照组比较，辐照后第3天，各组骨髓细胞微核率显著降低(P<0.05)。即本发明配方能够增强免疫力，降低对辐射损伤的影响，其日服药剂量是合理的。
实施例4本发明药物组合物增强免疫力的动物实验
按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)功能学评价检验方法中的“增强免疫力功能检验方法”进行试验：
1材料和方法
1.1样品：由北京海德润制药有限公司生产，青海春天药用资源科技利用有限公司提供的虫草灵孢归芪颗粒，样品规格为59/袋×10袋/盒。样品性状为棕褐色至黑褐色颗粒。人体推荐剂量为：每日10g/60kgBW。批号：20150904。避光、密封，置干燥处保存，保质期24个月。受试物用无菌水配制，供实验用。
1.2实验动物：选用北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：SCXK(京)2014-0004]繁殖的18g～22g清洁级昆明种雌性小鼠192只，共分为四批进行实验，每批随机分为4组，每组12只。实验一批进行脏器/体重比值测定、迟发型变态反应实验、半数溶血值(HC50)的测定和抗体生成细胞数的测定；实验二批进行碳廓清实验；实验三批进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验：实验四批进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定。实验动物饲养于北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心SPF级动物室。实验动物使用许可证号：SYXK(京)2012-00310维持饲料由北京科澳协力饲料有限公司[许可证号：SCXK(京)2014-0010]生产。
1.3剂量：虫草灵孢归芪颗粒的推荐剂量为成人(按60kg体重计)每日lOg，相当于0.167g/kgBW/do实验设人体推荐量的5倍、10倍、30倍，即每日0.83g/kgBW、1.67g/kgBW、5.00/kgBW为低、中、高剂量组。受试物配制：称取15.00g样品加无菌水至60.0mL为高剂量受试物，称取5.00g样品加无菌水至60.0mL为中剂量受试物，称取2.50g样品加无菌水至60.0mL为低剂量受试物，受试物每日一次经口给予，连续灌胃31d后，测各项指标。小鼠灌胃体积为20mL/kgBW。同时设一空白对照组(0g/kgBW)，用无菌水代替受试物，每日灌胃体积与各受试物组相同。各剂量组均给予维持饲料。
1.4主要仪器与试剂：HZF-B3000电子天平(2013002).ES-2IOOA电子天平(2003015)、
BS223S电子天平(2008007)、BS2202S电子天平(2014007)、BP211D电子天平(2004013)、UV2600紫外可见分光光度计(2015003)、Elx808酶标仪(2008001)、二氧化碳培养箱(2008002)、低速离心机(2010001)、恒温水浴(2004009)、显微镜(2003002)、倒置显微镜(98006)、螺旋测微仪(96099)。
洁净工作台、无菌手术器械、微量注射器(25μL)、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板、96孔U型细胞培养板、玻璃平皿、纱布、试管、玻片架、200目筛网、计时器、血色素吸管、载玻片等。
绵羊红细胞(SRBC)、生理盐水、Hank's液(pH7.2-7.4)、RPMI1640培养液、小牛血清、青霉素钠、链霉素钠、刀豆蛋白A(ConA).Imol/L的HCI溶液、酸性异丙醇(96mL异丙醇加1mol/L的HCI溶液4mL)、MTT、PBS缓冲液(pH7.2-7.4)、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、琼脂糖、Hb稀释液试剂盒(20160121).YAC-I细胞、乳酸锂、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶Ⅰ、0.2mol/L的Tris-HCI缓冲液(pH8.2)、1％NP40、印度墨汁、0.1070Na2C03溶液、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液等。
1.5实验方法：
1.5.1脏器体重比值的测定
小鼠称重后颈椎脱臼处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脾脏/体重比值和胸腺/体重比值。
1.5.2迟发型变态反应(DTH)实验(足跖增厚法)
取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)SRBC悬液(2000r/min，10min)0.2mL，致敏后4d，测量左后足跖部厚度。然后在测量部位皮下注射20％(v/v，用生理盐水配制)SRBC悬液20μL，于注射后24h测量左后足跖部厚度。以上两次测量均为同一部位测量三次，取平均值。以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。
1.5.3ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，制成细胞悬液。用Hank's液洗2次，每次离心5min(1000r/min)o然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中，镜检计数，调整细胞浓度为3x106个/mL。再将脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1.0mL，在其中一孔加75μL ConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置二氧化碳培养箱中5％CO2，37℃培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50Μl/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1.0mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后将此液体移入比色杯中，在紫外分光光度计上比色测定，波长570nm。淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值差值表示。受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。
1.5.4抗体生成细胞数的测定(Jerne改良玻片法)
取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)SRBC悬液0.2mL。将SRBC免疫5d后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液。离心(1000r/min)5min，用Hank's液洗2遍，最后将细胞悬浮在8.0mLHank's液中。将琼脂糖加热溶解后，与等量双倍Hank's液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加10％(v/v，用SA液配制)SRBC悬液50μL、脾细胞悬浓8μL，迅速混匀后，倾倒于己刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中37℃温育1h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1：8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。可反映抗体生成细胞数用空斑数/全脾细胞来表示。受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。
1.5.5半数溶血值(HC50)的测定
取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)SRBC悬液0.2mL进行免疫0.5d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，3000r/min离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释为300倍，取1.0mL置试管内，依次加入10％(v/v，用SA缓冲液配制)SRBC悬液0.5mL，补体1.0mL(用SA缓冲液按1:8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置37℃恒温水浴中保温15min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取上清1.0mL，加Hb稀释液3.0mL。同时取10％(v/v，用SA缓冲液配制)的SRBC悬液0.25mL。加Hb稀释液至4.0mL于另一试管中，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按下式计算：
样品半数溶血值＝样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数
受试样品组的HCso显著高于对照组的HC50，可判定该项实验结果阳性。
1.5.6小鼠碳廓清实验
按体重从小鼠尾静脉注射稀释4倍的印度墨汁(0.05mL/10gBW)。待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并将其加到2.0mL 0.1％Na2C03溶液中。用紫外分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD)，以0.1％Na2C03溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏称重。以吞噬指数(a)表示小鼠碳廓清的能力按下式
计算a：
k＝(lgODi-lgOD2)/(t2-t1)a-体重÷(肝重+脾重)×k1/3
受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。
1.5.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
小鼠腹腔注射20％(v/v，用生理盐水配制)鸡红细胞(2000r/min，10min)悬液ImL，间隔30min，颈椎脱臼处死，将其仰位固定于鼠板上，经腹腔注入生理盐水2mL，轻轻按揉腹部20次。取胺腔巨噬细胞洗液1mL，分别滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以1：1丙酮甲醇溶液固定，Giemsa-磷酸缓冲液染色，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数，每片计数100个巨噬细胞，计算吞噬率和吞噬指数。得出的吞噬百分率再进行数据转换，所得数据为计量资料，受试样品组的吞噬百分率和吞噬指数均显著高于对照组的吞噬百分率和吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。
1.5.8NK细胞活性的测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)
实验前24h将靶细胞YAC-I进行传代培养，应用前以Hank's液洗3次，用含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4x105个/mL。受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank's液洗2次，每次离心lOmin(1000r/min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加人0.5mL双倍Hank's液及8.0mLHank's液，1000r/min,10min离心，用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，镜检计数，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2x107个/mL。使效靶比为50：1。取靶细胞和效应细胞各100μL，加入U形96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μL；上述各项均设三个平行孔。置二氧化碳培养箱中5％C02,37℃培养4h。将96孔板以1500r/min离心5min，吸取每孔上清100μL置平底96孔培养板中，加入LDH基质液100μL，反应3-10min，然后每孔加入1mol/L HCl溶液30μL终止反应，在酶标仪490nm处测光密度值(OD)。计算NK细胞活性：
NK细胞活性(％)＝(反应孔OD.自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100％
得出的NK细胞活性按下式进行数据转换。所得数据为计量资料，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，可判定该项实验结果阳性。1.6数据处理
用SPSS软件进行数据处理。采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<F0.05，结论：各组均数间差异无显著性：F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
1.7结果判定依据
《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)规定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。其中细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。单核-巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核-巨噬细胞功能结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。
2结果
2.1虫草灵孢归芪颗粒对小鼠体重的影响
结果可见，小鼠的初始体重在四批实验动物各剂量组与0g/kgBW组间比较，差异均无显著性(P>0.05)。即小鼠的初始体重在各组间较为均衡。经口给予小鼠不同剂量的虫草灵孢归芪颗粒31d后，小鼠的体重在四批各剂量组与0g/kgBW组间比较，以及各剂量组脾脏/体重比值与0g/kgBW组比较，差异均无显著性(P>0.05)。即虫草灵孢归芪颗粒对小鼠体重无不良影响，对小鼠的脾脏/体重比值无影响。
2.3虫草灵孢归芪颗粒对小鼠细胞免疫功能的影响
表26小鼠迟发型变态反应的影响
*：与0mL/kgBW组比较有显著性差异
可见，经口给予小鼠不同剂量的虫草灵孢归芪颗粒31d后，与0g/kgBW组比较，1.67g/kgBW组、5.00g/kgBW组小鼠足跖肿胀度提高，有显著性差异(P<0.05)。即虫草灵孢归芪颗粒在1.67g/kgBW组和5.00g/kgBW组能提高小鼠迟发型变态反应程度。
表27对小鼠淋巴细胞转化实验的影响
可见，经口给予小鼠不同剂量的虫草灵孢归芪颗粒31d后，各剂量组淋巴细胞增殖能力与0g/kgBW组比较，差异均无显著性(P>0.05)，即虫草灵孢归芪颗粒对小鼠淋巴细胞增殖能力无影响。
2.4虫草灵孢归芪颗粒对小鼠体液免疫的影响
表28对小鼠抗体生成细胞数的影响
*：与0mL/kgBW组比较有显著性差异
可见，经口给予小鼠不同剂量的虫草灵孢归芪颗粒31d后，与0g/kgBW组比较，5.00g/kgBW组小鼠溶血空斑数提高，有显著性差异(P<0.05)。即虫草灵孢归芪颗粒在5.00g/kgBW组能提高小鼠抗体生成细胞数。
表29对小鼠半数溶血值的影响
*：与0mL/kgBW组比较有显著性差异
可见，经口给予小鼠不同剂量的虫草灵孢归芪颗粒3ld后，与Og/kgBW组比较，5.00g/kgBW组小鼠半数溶血值提高，有显著性差异(P<0.05)。即虫草灵孢归芪颗粒在5.00g/kgBW组能提高小鼠半数溶血值。
2.5虫草灵孢归芪颗粒对小鼠单核.巨噬细胞吞噬功能的影响
表30对小鼠碳廓清能力的影响
可见，经口给予小鼠不同剂量的虫草灵孢归芪颗粒31d后，各剂量组小鼠吞噬指数与0g/kgBW组比较，差异均无显著性(P>0.05)。即虫草灵孢归芪颗粒对小鼠的碳廓清能力无影响。
表31对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率的影响
*：与0mL/kgBW组比较有显著性差异
可见，经口给予小鼠不同剂量的虫草灵孢归芪颗粒31d后，与0g/kgBW组比较，1.67g/kgBW组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率提高，有显著性差异(P<0.05)；5.00g/kgBW组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率提高，有显著性差异(P<0.01)。即虫草灵孢归芪颗粒在1.67g/kgBW组和5.00g/kgBW组能提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率。
表32对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数的影响
*：与0mL/kgBW组比较有显著性差异
可见，经口给予小鼠不同剂量的虫草灵孢归芪颗粒31d后，与0g/kgBW组比较，1.67g/kgBW组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数提高，有显著性差异(P<0.01)；5.00g/kgBW组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数提高，有显著性差异(P<0.001)。即虫草灵孢归芪颗粒在1.67g/kgBW组和5.00g/kgBW组能提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数。
2.6虫草灵孢归芪颗粒对小鼠NK细胞活性的影响
表33对小鼠NK细胞活性的影响
可见，经口给予小鼠不同剂量的虫草灵孢归芪颗粒3ld后，各剂量组NK细胞活性与0g/kgBW组比较，差异均无显著性(P>0.05)。即虫草灵孢归芪颗粒对小鼠NK细胞活性无影响。3总结
经口给予小鼠不同剂量的虫草灵孢归芪颗粒31d后，与0mL/kgBW组比较，该受试物在1.67g/kgBW组能提高小鼠足跖肿胀度(P<0.05)、提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数(P<0.05)和吞噬指数(P<0.05)；在5.00g/kgBW组能提高小鼠足跖肿胀度(P<0.05)、提高小鼠抗体生成细胞数(P<0.05)、提高小鼠半数溶血值(P<0.05)、提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率(P<0.01)和吞噬指数(P<0.001)。受试物对小鼠体重增长无不良影响。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)对增强免疫力保健食品的判定标准可知，虫草灵孢归芪颗粒具有增强免疫力的功能。
实施例5本发明药物组合物对辐射保护作用的动物实验
按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)功能学评价检验方法中的“对辐射危害有辅助保护功能检测方法”进行试验：
l材料和方法
1.1样品：由北京海德润制药有限公司生产，青海春天药用资源科技利用有限公司提供的虫草灵孢归芪颗粒，样品核准净含量为5g/袋×10袋/盒。样品为棕褐色至黑褐色颗粒。人体推荐剂量为：每日10g/60kg BW，批号：20150904。避光、密封，置干燥处保存，保存期24个月。
1.2实验动物：选用北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：SCXK(京)2014-0004]繁殖的16-20g昆明种健康清洁级雌性小鼠192只，共分为四批进行实验，每批随机分为4组，每组12只。实验一批进行血清溶血素含量实验，实验二批进行外周血白细胞计数实验，实验三批进行小鼠骨髓细胞微核实验，实验四批进行血中超氧化物歧化酶活性实验。实验动物饲养于北京联合大学应用文理学院保健食品检测中心SPF级动物室。实验动物使用许可证号：SYXK(京)2012-0031。维持饲料由北京科澳协力饲料有限公司[许可证号：SCXK(京)2014-0010]生产。
1.3剂量：虫草灵孢归芪颗粒的推荐剂量为成人(按60kg体重计)每日10g，相当于0.167g/日/kg体重。实验设人休推荐量的5倍、10倍、30倍，即每日0.83g/kgBW、1.67g/kgBW、5.00g/kgBW为低、中、高剂量组。高剂量：称取样品25.00g，加无菌水至100.0mL；中剂量：称取样品8.33g，加无菌水至100.0mL：低剂量：称取样品4.17g，加无菌水至100.0mL。每日一次经口给予，连续灌胃26天后辐照动物，辐照后仍然给予受试样品。小鼠灌胃体积为0.2mL/10g鼠重。同时设一辐射模型对照组(0g/kgBW)，用无菌水代替受试物，每日灌胃体积与各受试物组相同。
1.4仪器与试剂
1.4.1仪器：E400生物显微镜(2005011)、UV2600紫外可见分光光度计(2015003)、MEK-6318K血液分析仪(2004012)。
1.4.2试剂：Hank's液、Giemsa染液、小牛血清、l/15moL/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)、血液分析仪稀释液(上海东湖生物医学有限公司，型号：DH-640，批号：151112)，SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20160321)，氰化高铁血红蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20160323)，Hb贮备液(南京建戍生物工程研究所，批号：20160121)。
1.5实验方法：
1.5.1白细胞计数实验：剂量组于照射前后经口连续给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次，照射剂量选择3Gy。分别于照射前、照射后第3天、照射后第14天三次采末梢血20μL，加入2.0mL稀释液中，混匀后，于血液分析仪上进行白细胞计数。任一时间点、任一剂量组与辐射模型对照组比较，白细胞总数增多，差异有显著性，则可判定该实验阳性。
1.5.2小鼠骨髓细胞微核实验：剂量组于照射前后经口连续给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次，照射剂量选择3Gy。于照射后第3天，颈椎脱臼杀死动物，取胸骨，用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀，常规涂片。涂片自然干燥后，放入甲醇中固定10min，放入Giemsa应用染液中，染色15min，立即用蒸馏水冲洗，晾干。镜检，每只动物计数1000个嗜多染红细胞中微核细胞数，微核率以干分率表示。任一剂量组微核率低于辐射模型对照组微核率，差异有显著性，可判定实验结果阳性。
1.5.3血中超氧化物歧化酶活性实验：
1.5.3.1剂量组照射前后经口给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次，照射剂量选择7Gy。于照射后7天，进行实验。
1.5.3.2红细胞抽提液制备：10μL全血冲入0.5mL生理盐水，2000r/min离心3min，弃上清，加冰冷的双蒸水0.2mL混匀，加入95％乙醇0.1mL，振荡30s，加入三氯甲烷0.1mL，置快速混合器抽提1min,4000r/min离心3min，分层，上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积，待测。
1.5.3.3SOD活力测定：
表34SOD活力测定
定义：每克血红蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。
1.5.3.4Hb稀释液配制：取Hb贮备液临用时双蒸水1:99稀释，配成Hb稀释液，充分混匀。
1.5：3.5血红蛋白测定：
表35血红蛋白测定
1.5.3.6计算红细胞中SOD活力：
任一剂量组与辐射模型对照组比较，血中SOD活性增强，差异有显著性，则可判定实验阳性。
1.5.4血清溶血素(半数溶血值)实验：受试样品组照射前后经口给予受试样品，
剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量丫射线全身照射一次，照射剂量选择1Gy。于照射后7d，进行实验。每只小鼠腹腔注射0.2mL绵羊红细胞(SRBC)(2％v/v)进行免疫。4d后，摘除眼球取血。放置1h后，将凝固的血与管壁分离，使血清充分析出，2000r/min离心lOmin，收集血清。取血清用SA缓冲液稀释(300倍)。取稀释后的血清1.0mL，SRBC(10％v/v)0.5mL，补体1.0mL加入同一离心管中。另设不加血清的对照管(以SA液代替)。置37℃恒温水浴中保温15min后，冰水浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1.0mL,Hb稀释液3.0mL试管内，同时取SRBC(10％v/v)0.25mL加Hb稀释液至4.0mL作为半数溶血管。各试管充分混匀，放置10min后于540nm处以对照管作为空白，分别测定各管光密度值。计算半数溶血值。任一剂量组与辐射模型对照组比较，血清半数溶血值增多，差异有显著性，则可判定实验阳性。
1.6数据处理：用SPSS软件进行数据处理。计量资料采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<F0.05，结论：各组均数间差异无显著性：F值>F0.05,P<0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。计数资料采用卡方检验。
照射后第3天辐射模型对照组的白细胞数分别与照射前进行自身比较，采用配对样本的t检验进行统计。
1.7结果判定依据：在外周血中白细胞计数实验、小鼠骨髓细胞微核实验、血中超氧化物歧化酶活性实验、血清溶血素实验中，任何两项实验结果阳性，可判定该受试样品具有对辐射危害有辅助保护功能的作用。
2结果
2.1虫草灵孢归芪颗粒对小鼠体重的影响
结果可见，小鼠的初始体重在四批实验动物各剂量组与0g/kgBW组间比较，差异均无显著性(P>0.05)。即小鼠的初始体重在各组间较为均衡。经口给予小鼠不同剂量的虫草灵孢归芪颗粒后，小鼠体重在四批实验动物各剂量组与0g/kgBW组间比较，差异均无显著性(P>0.05)。即虫草灵孢归芪颗粒对小鼠的体重无不良影响。
2.2辐射损伤模型的建立
可见，3Gyγ射线全身一次性辐照后第3天，与照射前进行自身比较，辐射模型对照组的白细胞数降低，差异有显著性(P<0.01)。即辐射损伤模型建立成功。
2.3虫草灵孢归芪颗粒对辐射后小鼠白细胞计数的影响
表36虫草灵孢归芪颗粒对辐射后小鼠外周血白细胞计数的影响
可见，辐照前各剂量组小鼠外周血白细胞数与0g/kgBW组比较，差异均无显著性(P>0.05)。说明各组间外周血白细胞数较为均衡。辐射后第3天及第14天，各剂量组外周血白细胞数与0g/kgBW组比较，差异均无显著性(P>0.05)。即虫草灵孢归芪颗粒在各剂量组对辐射损伤模型小鼠外周血白细胞数无影响。
2.4虫草灵孢归芪颗粒对辐射小鼠骨髓细胞微核率的影响
表37虫草灵孢归芪颗粒对辐射小鼠骨髓细胞微核率的影响
*：与0mL/kgBW组比较有显著性差异
可见，辐照后第3天，1.67g/kgBW组与0g/kgBW组比较，小鼠骨髓细胞微核率降低，有显著性差异(P<0.01)：5.00g/kgBW组与0g/kgBW组比较，小鼠骨髓细胞微核率降低，有显著性差异(P<0.001)。即虫草灵孢归芪颗粒在1.67g/kgBW组、5.00g/kgBW组可降低辐射损伤模型小鼠骨髓细胞微核率。
2.5虫草灵孢归芪颗粒对辐射后小鼠血中超氧化物歧化酶活性影响
表38虫草灵孢归芪颗粒对辐射后小鼠血中超氧化物歧化酶活性的影响
可见，辐照后第7天，各剂量组辐射后小鼠血中超氧化物歧化酶活性与0g/kgBW组比较，差异均无显著性(P>0.05)。即虫草灵孢归芪颗粒对辐射损模型小鼠血中超氧化物歧化酶活性无影响。
2.6虫草灵孢归芪颗粒对辐射后小鼠血清溶血素的影响
表39虫草灵孢归芪颗粒对辐射后小鼠血清溶血素的影响
*：与0mL/kgBW组比较有显著性差异
可见，辐照后第7天，5.00g/kgBW组与0g/kgBW组比较，血清溶血素升高，有显著性差异(P<0.05)。即虫草灵孢归芪颗粒在5.00g/kgBW组可提高辐射损伤模型小鼠血清溶血素含量。
3.小结
经口给予小鼠不同剂量虫草灵孢归芪颗粒26天后，对各组小鼠以γ射线一次性照射。与0g/kgBW组比较，该受试物在1.67g/kgBW组能降低辐照后第3天辐射损伤模型小鼠骨髓细胞微核率(P<0.01)；在5.00g/kgBW组能降低辐照后第3天辐射损伤模型小鼠骨髓细胞微核率(P<0.001)，能提高辐照后第7天辐射损伤模型小鼠血清溶血素含量(P<0.05)。受试物对小鼠体重增长无不良影响。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)对辐射危害有辅助保护功能保健食品的判定标准可知，虫草灵孢归芪颗粒对辐射危害有辅助保护功能的动物实验结果阳性。
实施例6本发明药物组合物的安全性毒理学评价
本发明药物组合物的颗粒剂经过安全性毒理学评价，结果如下：
虫草灵孢归芪颗粒对两种性别的小鼠经口的最大耐受剂量(MTD)均大于15g/kgBW，按急性毒性分级属无毒级。经Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验，结果均为阴性，在受试剂量范围内未见致突变活性。大鼠30天喂养试验，大鼠体重、增重、摄食量、食物利用率、脏器检查、脏器重量、脏/体比值、血液学和血液生化学检查结果表明，各剂量组与溶剂对照组比较，各检验项目均无显著差异(P>0.05)。病理组织学检查结果表明，溶剂对照组和高剂量组雌、雄性大鼠肝、肾、胃、肠、脾、卵巢及睾丸均未发现明显损伤性病理变化。30天喂养试验未发现本样品有明显的毒性作用。
实施例7本发明药物组合物的临床疗效
肿瘤组：选择60例肿瘤患者，正在进行放化疗或完成放化疗后恢复期，包括肺癌、肝癌、乳腺癌、直肠癌、膀胱癌，年龄20-70岁，男女不限，有明显放化疗所致的精神不振、食欲下降、身体疲乏、恶心呕吐、皮肤瘙痒、湿疹溃疡、口腔溃疡、腹泻腹痛、脱发、白细胞减少、肝肾功能降低等体征。平均分为2组，分别给予虫草灵孢归芪颗粒、当归补血颗粒，每日2次，连续服用30天。
亚健康组：选择60例亚健康者，年龄18-60岁，男女不限，有免疫力低下等亚健康相关症状体征，如精神不振、食欲下降、身体、疲乏、过敏性等。平均分为2组，分别给予虫草灵孢归芪颗粒、当归补血颗粒，每日2次，连续服用30天。
根据制定的评价量表，对服用前后的各项指标进行评价，具体如下：
1、样品制备：按照下表的配方量，以及分别制备2组颗粒：
表40配方表
2、肿瘤组症状评价量表：
表41肿瘤组症状评分量表
3、亚健康组症状评价量表：(最近半年)
表42亚健康组症状评分量表
4、疗效评定：
统计数据进行症状及疗效分析。
对每个症状和体征均做单项评价。
总体疗效判定(因肿瘤属于重危疾病，本发明并不是抗肿瘤药物，故不做此项评定，仅对亚健康人群做总体疗效判定)：
痊愈：临床症状、体征消失或基本消失，积分减少≥95％
显效：临床症状、体征明显改善，积分减少≥70％
有效：临床症状、体征有好转，积分减少≥30％
显效：临床症状、体征无明显改善，积分减少≤30％
5、结果：
5.1肿瘤组结果统计：
表43肿瘤组结果统计
5.2亚健康组结果统计：
5.2.1总体疗效评定：
表44总体疗效评定表
项目 痊愈 显效 有效 无效 总有效率
配方A 3例(10％) 10例(33.3％) 11例(36.7％) 6例(20％) 24例(80％)
配方B 0例(0％) 10例(33.3％) 8例(26.7％) 12例(40％) 18例(60％)
5.2.2单项症状评定：
表45单项症状评定
以上试验结果可以看出：在肿瘤放化疗患者辅助调理方面，本发明组合物能较好的提高食欲，减轻呕吐、腹泻、疲乏、脱发症状，提高睡眠质量；与服用相同剂量的当归补血汤相比，在增进食欲、减轻恶心、呕吐，减轻脱发，提高睡眠质量方面的效果更为显著。
本发明组合物用于亚健康者，与当归补血汤配方相比，在改善睡眠、脱发情况，提高注意力，减轻疲乏方面的效果也有显著提升。
以上结果表明，本发明在传统经验方当归补血汤的基础上加味，提供了对肿瘤放化疗患者辅助调理、增强免疫效果更佳的组合物。

Claims (14)

1.用于肿瘤化疗及放疗病人辅助调理的药物组合物，其特征在于：原料药重量配比如下：
冬虫夏草1-8份、破壁灵芝孢子粉5-30份、当归3-25份、黄芪10-80份、肉桂3-25份、甘草10-60份。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：原料药重量配比如下：冬虫夏草2-7份、破壁灵芝孢子粉8-25份、当归5-20份、黄芪20-70份、肉桂5-20份、甘草20-50份；
优选地，原料药重量配比如下：冬虫夏草3-6份、破壁灵芝孢子粉10-20份、当归8-15份、黄芪30-60份、肉桂8-15份、甘草25-40份；
进一步优选地，原料药重量配比如下：冬虫夏草5份、破壁灵芝孢子粉15份、当归10份、黄芪50份、肉桂10份、甘草30份。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于：取各原料药，按照常规方法制成口服制剂；或加入药学上可接受的辅料制成常用口服制剂。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：所述常用口服制剂为散剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂或口服液。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于：所述颗粒剂含有三氯蔗糖；优选地，三氯蔗糖含量为0.03％w/w。
6.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于：所述颗粒剂采用聚维酮K30的乙醇溶液作为润湿剂；优选地，润湿剂采用0.5-1.5％的聚维酮K30的30-60％乙醇溶液；进一步优选地，润湿剂采用0.75％的聚维酮K30的40％乙醇溶液。
7.权利要求1-6任意一项所述药物组合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：取各重量配比的原料药，打粉，或加入水或有机溶剂提取，再加入药学上或保健品中可接受的辅料或者辅助性成分，即得。
8.权利要求1-6任一项所述药物组合物的制备方法，其特征在于：包括：
方法一：将各原料药粉碎成细粉，混合即成散剂；
方法二：将各原料药粉碎成细粉，装胶囊即成胶囊剂；
方法三：将各原料药粉碎成细粉，压片即成片剂；
方法四：将各原料药采用常规方法用水煎煮提取后，浓缩提取液制成颗粒，即成颗粒剂；
方法五：将各原料药采用常规方法用水煎煮提取后，浓缩提取液制成颗粒，装胶囊即成胶囊剂；
方法六：将各原料药采用常规方法用水煎煮提取后，浓缩提取液制成颗粒，压片即成片剂；
方法七：将各原料药采用常规方法用水煎煮提取后，制成口服液。
9.权利要求1-6任一项所述药物组合物的制备方法，其特征在于：取各原料药制备为颗粒剂，包括如下步骤：
A、肉桂粗粉加水提取收集肉桂挥发油，并制成肉桂挥发油包合物，提取液过滤得肉桂母液及肉桂药渣备用；
B、取肉桂药渣与当归、黄芪、甘草加水提取，过滤得滤液与肉桂母液混合，浓缩，离心，去除杂质，留液体浸膏备用；
C、步骤B所得浸膏干燥，粉碎过筛，得干膏粉备用；
D、混合肉桂挥发油包合物，冬虫夏草粉、破壁灵芝孢子粉、干膏粉、辅料；
E、制粒、干燥、整粒即得。
10.根据权利要求9所述药物组合物的制备方法，其特征在于：至少满足以下任一项：
步骤A所述肉桂粗粉为粒径10-65目；优选粒径10目；
步骤A肉桂粗粉加水提取条件为：8-12倍量水，提取挥发油2-8小时；优选加水提取条件为10倍量水，提取挥发油6小时；
步骤A收集所得肉桂挥发油采用β-环糊精包合，得肉桂挥发油包合物备用；
步骤B提取条件为：6-12倍量水，提取1-3次，每次1-2小时；优选提取2次：第一次加10倍量水提取1.5h，第二次加8倍量水提取1.5h；
步骤B过滤采用100-200目筛网过滤；优选采用200目筛网过滤；
步骤B浓缩条件为于-0.06～-0.08Mpa，60-80℃减压浓缩，浓缩至60℃测定相对密度为1.05-1.10；
步骤C粉碎过筛为粉碎过50-100目筛，优选粉碎过80目筛；
步骤D所述辅料包括三氯蔗糖、魔芋粉、二氧化硅、β-环糊精、糊精，具体的混合方法为三氯蔗糖和肉桂油包合物等量递增，得混合粉A；混合粉A再与冬虫夏草粉、魔芋粉、二氧化硅混合得混合粉B；混合粉B再与破壁灵芝孢子粉、β-环糊精、糊精、干膏粉混合；
步骤E制粒采用8-14目制粒，优选14目制粒；
步骤E干燥温度为40-60℃，优选50℃；
步骤E整粒为10-18目整粒，优选12目整粒。
11.根据权利要求10所述药物组合物的制备方法，其特征在于：肉桂挥发油采用β-环糊精包合的方法如下：
1)按挥发油：β-环糊精：水＝(0.5-2ml)：(4-8g)：(40-80ml)的配比混合；优选地，挥发油：β-环糊精：水的配比为1ml：8g：60ml；
2)在40-60℃包结0.5-2小时得包合物；优选地，在40℃包结1小时；
3)粉碎包合物，备用；优选地，粉碎包合物至过50-100目筛；进一步优选地，粉碎包合物至过80目筛。
12.权利要求1-6任意一项所述的药物组合物在制备用于肿瘤化疗及放疗病人辅助调理的药物或保健品中的应用。
13.权利要求1-6任意一项所述的药物组合物在制备具有辐射保护作用的药物或保健品中的应用。
14.权利要求1-6任意一项所述的药物组合物在制备增强免疫力的药物或保健品中的应用。
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