CN108096638B - 用于生物打印的生物砖及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物学，再生医学，生物打印(例如3D生物打印)，组织工程学等技术领域。特别地，本发明涉及一种可用于生物打印(例如3D生物打印)和组织工程的生物砖，包含所述生物砖的组合物(例如生物墨汁)，所述生物砖的制备方法以及其用途，以及包含所述生物砖或者使用所述生物砖/生物墨汁构建的构建体(例如三维构建体)。

Description

用于生物打印的生物砖及其用途
本申请是申请日为2016年4月7日、发明名称为“用于生物打印的生物砖及其用”、申请号为201610211593.5的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物学，再生医学，生物打印(例如3D生物打印)，组织工程学等技术领域。特别地，本发明涉及一种可用于生物打印(例如3D生物打印)和组织工程的生物砖，包含所述生物砖的组合物(例如生物墨汁)，所述生物砖的制备方法以及其用途，以及包含所述生物砖或者使用所述生物砖/生物墨汁构建的构建体(例如三维构建体)。
背景技术
在人体组织中，细胞按照一定的规则和顺序进行排列与分布。不同功能的组织，其细胞排布不同。例如，构成上皮组织的上皮细胞呈单层紧密排列以保证其保护功能；肌细胞成条索状排列以保证其收缩功能；神经细胞间平行排列或交织成网以增强其信息传递功能等。细胞排布的异常，表现为细胞形态、细胞间连接、细胞群整体功能的异常。各种组织器官的病理变化过程中均存在细胞排布异常，引起细胞功能异常并导致组织器官整体结构和功能的破坏。例如，肝脏肿瘤组织中肝细胞条索排布紊乱，无正常肝小叶结构；小肠上皮细胞排布紊乱引起细胞屏障作用受到破坏，肠道内毒素吸收增加并形成内毒素血症；血管平滑肌细胞排布紊乱，引起血管顺应性降低、弹性减弱、抗压力能力减弱等。因此，实现对细胞的精确排布是人工构建组织器官的关键。
3D生物打印技术是近几年来兴起的一项技术，其已被尝试用于构建复杂的组织和器官。目前已报道了数种3D生物打印技术，其中最受关注的是，CYFUSE BIOMEDICAL KK公司提出的3D生物打印技术(下文简称为Cyfuse技术，参见例如美国专利申请US 14/126,681，以及Organovo公司提出的3D生物打印技术(下文简称为Organovo技术，参见例如中国专利申请CN103946374A)。
Cyfuse技术主要涉及以下步骤：构建细胞球，形成微型组织块；通过“剑山”将不同的微型组织块以特定的空间排布形式堆叠在一起，并进一步通过细胞自发融合的特性，将堆叠的微型组织块连接在一起形成所需结构的组织。
Organovo技术的基本原理如下：首先制备生物打印所需的生物墨汁(即，细胞)和生物纸(通常是凝胶)；然后，根据准备打印的组织或器官的3D模型，通过下述步骤使用生物墨汁和生物纸进行3D打印：(1)打印一层生物墨，即，将一层细胞置于另一层细胞或凝胶之上；(2)打印一张生物纸，即，将一层凝胶置于细胞上；(3)不断重复步骤(1)和(2)，直至打印完成新组织或器官。
然而，这些已知的生物打印技术也存在着显著的缺陷。特别地，目前已经知晓的生物打印方法均无法实现对细胞的精确排布，从而也不能制造出具有精细结构的微组织团块。与此同时，在目前已经知晓的生物打印方法中，所使用的细胞均缺乏力学保护。因此，当将细胞用于3D生物打印时，细胞易于因外界压力或剪切力的伤害而受损或死亡。这大大限制了生物打印技术的应用。此外，一些已知的生物打印技术在构建微型组织块时，需要使用大量细胞，这进一步严重限制了生物打印技术的应用。
因此，目前已知的3D生物打印技术均无法实现以细胞数量可控、细胞精确排布的方式构建具有三维结构的复杂组织或器官，并且所制备三维构建体的细胞存活率较低，且尺寸受到了严重的限制。
发明概述
为了解决上述技术问题，本申请发明人开发了一种可用于打印组织或器官的基础单元，生物砖。本发明的生物砖所包裹的细胞类型和细胞数目是可控的，并且生物砖本身的结构和尺寸也是可控的，从而其可用于制备标准化、可控化的生物墨汁，并且由此所制备的生物墨汁可在生物打印过程中实现细胞的精确排布，实现组织或器官的精确生物打印。此外，本发明的生物砖(例如其壳层的硬度和弹性模量)还给细胞提供了有效的力学保护，从而确保了细胞在打印过程中存活率(达到90％以上)，避免了因细胞受损或死亡而导致的应用限制。本发明的生物砖可用作生物打印的基础单元，并且还可用作研究工具。
因此，在一个方面，本发明提供了一种生物砖，其包括：细胞，包裹细胞的核层，和，封装核层的壳层，其中所述核层和壳层各自独立地由生物可降解材料制成。在本发明的某些优选实施方案中，所述核层和壳层中的生物可降解材料能够减少或避免生物砖内的细胞在操作(例如生物打印)过程中遭受机械损伤，并且能够提供物质(例如营养物质，细胞外基质，细胞因子，药物活性成分等)的可控释放，以促进细胞活性和功能(增殖、分化、迁移、分泌或新陈代谢)。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物(例如生物墨汁)，其包含本发明的生物砖，并且任选地，还包含载体(所述载体优选包含生物粘合剂)。
在另一个方面，本发明提供了用于制备本发明的生物砖的方法，其包括下述步骤：
(1)提供一种或多种核层材料，所述核层材料各自独立地由生物可降解材料制成，并且各自独立地包裹相同或不同的细胞或细胞组合；
(2)提供一种或多种壳层材料，所述壳层材料各自独立地由生物可降解材料制成；
(3)从步骤(1)所述的一种或多种核层材料中选择一种核层材料，并将其颗粒化，从而获得第一核层；
(4)任选地，使用来自步骤(1)的一种核层材料或使用来自步骤(2)的一种壳层材料对前一步骤获得的产物进行包被；
(5)任选地，重复步骤(4)一次或数次；
(6)使用来自步骤(2)的一种壳层材料对前一步骤的产物进行包被，从而产生所述生物砖。
在另一个方面，本发明提供了用于制备本发明的生物砖的方法，其包括下述步骤：
(1)将细胞与用于形成核层的生物可降解材料混合，以提供包裹细胞的核层材料；和
(2)将核层材料颗粒化，并使用用于形成壳层的生物可降解材料进行包被，从而制备所述生物砖。
在另一个方面，本发明提供了用于制备本发明的组合物(其例如为生物墨汁)的方法，其包括下述步骤：将本发明的生物砖与载体(所述载体优选包含生物粘合剂)混合。
在另一个方面，本发明提供了一种构建体(例如三维构建体，组织前体，组织或器官)，其包含本发明的生物砖，或者使用本发明的生物砖或组合物(例如生物墨汁)制备。
在另一个方面，本发明提供了一种制备构建体，例如三维构建体，组织前体，组织或器官的方法，其包括，使用本发明的生物砖或组合物(例如生物墨汁)的步骤。
在另一个方面，还提供了本发明的生物砖的用途。例如，本发明的生物砖可用于生物打印(例如3D生物打印)；或用于形成构建体(例如三维构建体)，例如组织前体、组织或器官。本发明的构建体可用于各种应用，例如用于研究领域或医药领域的应用。例如，本发明的构建体可用于研究干细胞分化，用于药物发现，用于药物筛选，用于体内或体外测定，用于植入宿主体内，用于组织工程或用于组织再生。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明的生物砖，组合物(例如生物墨汁)，和/或构建体(例如三维构建体，组织前体，组织或器官)。
下面将结合附图和发明详述来对本发明的实施方案进行详细阐释。但是，本领域技术人员将理解，下列附图和发明详述仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和发明详述的详细公开内容，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1A-1E示意性描述了本发明的生物砖的示例性结构，其包括：细胞，其能够进行生长、增殖、分化或迁移；包裹细胞的核层，其由生物可降解材料制成，并且为细胞的生命活动提供微环境，例如营养物质；和，封装核层的壳层，由生物可降解材料制成，其为内部的核层和细胞提供力学保护，并维持生物砖的空间状态。此外，所述壳层是通透性的，具有用于生物砖内外物质交换的通道。在优选的实施方案中，细胞可均匀分散于核层中，或者可以聚集在一起，位于核层内部。
特别地，图1A示意性描述了本发明生物砖的一种结构，其包括一个核层和一个壳层，其中，所述核层包裹有细胞，并且所述壳层位于核层外侧，且封装核层。
图1B示意性描述了本发明生物砖的一种结构，其由内到外依次包含：包裹细胞的核层、封装所述核层的第一壳层、和围绕第一壳层的第二壳层。
图1C示意性描述了本发明生物砖的一种结构，其由内到外依次包含：包裹细胞的第一核层、位于第一核层外侧的包裹细胞的第二核层、和封装所述第一核层和第二核层的第一壳层。
图1D示意性描述了本发明生物砖的一种结构，其由内到外依次包含：包裹细胞的第一核层、位于第一核层外侧的包裹细胞的第二核层、封装所述第一核层和第二核层的第一壳层、和围绕第一壳层的第二壳层。
图1E示意性描述了本发明生物砖的一种结构，其由内到外依次包含：包裹细胞的第一核层、封装所述第一核层的第一壳层、包裹细胞的第二核层、和封装所述第二核层的第二壳层。
图2示意性描述了使用本发明生物砖构建的三维构建体的一个结构实例，其包括三层结构，即，内皮细胞层，平滑肌细胞层和成纤维细胞层。其中，内皮细胞层由包含内皮细胞的生物砖构建；平滑肌细胞层由包含平滑肌细胞的生物砖构建；成纤维细胞层由包含成纤维细胞的生物砖构建。内皮细胞层，平滑肌细胞层和成纤维细胞层各自可以由一层或多层细胞构成，根据所使用的生物砖中含有的细胞的具体数量而定。生物砖之间的间隙填充有生物粘合剂。在优选的实施方案中，生物粘合剂中可进一步包含维持、促进、改善、调控生物砖内的细胞的生命活动的试剂。例如，当生物砖中的细胞为内皮细胞时，生物粘合剂中可进一步包含促进内皮细胞生长和分化的细胞因子。在优选的实施方案中，本发明的三维构建体是使用本发明的生物砖，通过3D生物打印方法而构建的。然而，不受于理论限制，本发明的三维构建体也可以使用本发明的生物砖，通过任何其他已知的方法(例如手工放置的方法)来构建。
图3A-3C显示了使用造粒仪在不同仪器参数下制备的生物砖的相差显微照片，其中，图3A中的生物砖的直径为约120μm(标尺为100μm)；图3B中的生物砖的直径为约200μm(标尺为100μm)；图3C中的生物砖的直径为约450μm(标尺为200μm)。图3A-3C的生物砖中所使用的细胞为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。这些结果表明，可通过控制造粒仪的仪器参数(例如，同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径)来控制生物砖的尺寸。本发明的生物砖的尺寸是可控的，可根据需要进行选择。
图4显示了通过实施例1方法制备的生物砖A的显微照片，其中，高亮部分代表生物砖的壳层，且该壳层的厚度为约2μm(标尺为50μm)。图4的生物砖中所使用的细胞为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。结果表明，可通过控制造粒仪的同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径，壳层材料的泵出速度等参数来控制壳层的厚度。本发明的生物砖的壳层厚度是可控的，可根据需要进行选择。
图5A-5C显示了通过实施例1方法制备的生物砖的显微照片，其中，图5A中的生物砖包裹的细胞数为约50个(标尺为100μm)；图5B中的生物砖包裹的细胞数为约8个(标尺为100μm)；图5C中的生物砖包裹的细胞数为约2个(标尺为100μm)。图5A-5C的生物砖中所使用的细胞为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。这些结果表明，可通过控制细胞悬液的细胞浓度来控制生物砖包裹的细胞数。本发明生物砖包含的细胞的数量是可控的，可根据需要进行选择。
图6A-6D显示了使用造粒仪制备的生物砖B1-B4的显微照片，其中，图6A中的生物砖为生物砖B1，其直径为约600μm(标尺为500μm)；图6B中的生物砖为生物砖B2，其直径为约500μm(标尺为500μm)；图6C中的生物砖为生物砖B3，其直径为约500μm(标尺为500μm)；图6D中的生物砖为生物砖B4，其直径为约500μm(标尺为500μm)。这些结果表明，可使用各种合适的生物可降解材料来制备本发明的生物砖。
图6E显示了用包裹有tracker CM-Dil(红色荧光)标记的细胞的核层材料和带有FITC(绿色荧光)的壳层材料制备的生物砖B2的共聚焦显微图像，其中，绿色荧光代表壳层，红色荧光代表核层红色荧光代表。
图7A显示了使用本发明的生物砖制备的生物墨汁的显微照片。其中，生物砖包含人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并且其壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原，且包含甲基紫染料；生物粘合剂的主要成分是海藻酸钠+明胶。如图7A所示，紫色染色仅存在于生物砖内部，而不存在于生物墨汁的载体(生物粘合剂)中。这表明生物砖的壳层能够在生物墨汁中保持生物砖的完整性。
图7B显示了用本发明的生物墨汁打印得到的单细胞层的显微照片。其中，生物砖包含人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并且其壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原，且包含甲基紫染料；生物粘合剂的主要成分是海藻酸钠+明胶。如图7B所示，紫色染色仅存在于生物砖内部，而不存在于生物墨汁的载体(生物粘合剂)中。这表明生物砖的壳层能够在生物打印过程中保持生物砖的完整性。
图8显示了所使用的生物粘合剂(海藻酸钠+明胶)的粘度分析。结果显示，在25℃-40℃下，所使用的生物粘合剂的粘度为30-160Pas；并且，随着温度升高，生物粘合剂的粘度有所下降。
图9A-9D显示了使用共聚焦显微镜观察通过实施例1方法制备的生物砖中细胞活力的分析结果，其中，所述生物砖用钙黄绿素(绿色荧光)和碘化丙啶(红色荧光)进行了双重染色；所使用的细胞为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。
图9A显示了在生物砖制备之后立即进行的生物砖中细胞活力的分析结果。在图9A中，每个标记的白色圆圈代表一个生物砖，并且，高亮点为红色荧光(代表死细胞)，低亮点为绿色荧光(代表活细胞)。图9A的结果显示，在用实施例1的方法制备生物砖后，生物砖中98％以上的细胞存活。
图9B显示了将制备的生物砖在4℃下贮存3小时后，生物砖中细胞活力的分析结果。在图9B中，每个标记的白色圆圈代表一个生物砖，并且，高亮点为红色荧光(代表死细胞)，低亮点为绿色荧光(代表活细胞)。图9B的结果显示，所制备的生物砖在4℃下保存3小时后，生物砖中的细胞仍然保持高活力(存活率为90％)。
图9C显示了在将生物砖制备成生物墨汁并进行生物打印后，立即进行的生物砖中细胞活力的分析结果。在图9C中，高亮点为红色荧光(代表死细胞)，低亮点为绿色荧光(代表活细胞)。图9C的结果显示，将生物砖制备成生物墨汁并立即进行生物打印后，生物砖中的细胞仍然保持高活力(存活率为97％)。
图9D显示了所制备的生物砖在37℃下，在H-DMEM培养基中培养5天后，生物砖中细胞活力的分析结果。在图9D中，高亮点为红色荧光(代表死细胞)，低亮点为绿色荧光(代表活细胞)。图9D的结果显示，所制备的生物砖在37℃下培养5天后，生物砖中的细胞仍然保持高活力(存活率为95％)。
图10A-10B显示了使用共聚焦显微镜观察通过实施例1方法制备的生物砖中细胞的粘附和伸展的分析结果，其中，所述生物砖用钙黄绿素(绿色荧光)和碘化丙啶(红色荧光)进行了双重染色；所使用的细胞为HepG2细胞，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。
图10A显示了在培养生物砖第1天，使用共聚焦显微镜观察到的照片(放大倍数：40倍)，其中细胞呈圆形，未粘附伸展。图10B显示了培养所述生物砖5天后，使用共聚焦显微镜观察到的照片(放大倍数：200倍)，其中细胞粘附伸展。图10A-10B的结果表明，在培养5天后，生物砖内的细胞伸展并建立细胞间连接。
图11显示了使用共聚焦显微镜观察生物砖中的细胞增殖的分析结果(放大倍数：200倍)，其中，所述生物砖用DAPI(蓝色荧光)和EdU(红色荧光)进行了双重染色；所使用的细胞为HepG2细胞，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。图11的结果表明，在培养5天后，生物砖内的细胞处于增殖状态。
图12A-12B显示了通过传统方法制备的细胞微球在培养过程中的细胞增殖情况(标尺为500μm)。结果显示，与培养之前(图12A)相比，培养7天后(图12B)的细胞微球中的细胞增殖不明显，细胞呈圆形，散在分布。图12C-12D显示了使用实施例1方法制备的生物砖在培养过程中的细胞增殖情况(标尺为500μm)。结果显示，与培养之前(图12C)相比，培养7天后(图12D)的生物砖中的细胞增殖明显，细胞在生物砖中伸展、粘附，并相互连接在一起。图12E显示了使用实施例1方法制备的生物砖在培养7天后的显微照片(标尺为100μm)。结果显示，生物砖中的HepG2细胞之间相互连接，形成有机的整体。图12A-12E的结果表明，与传统方法制备的细胞微球相比，本发明的生物砖能够更好地促进细胞的增殖，促进细胞之间建立连接。
图13显示了使用共聚焦显微镜观察培养7天后的生物砖的结果(图中标尺为100μm)，其中，所使用的生物砖包含用绿色荧光标记的HepG2细胞和用红色荧光标记的HUVEC细胞，并且图中的黄色区域是由红色荧光和绿色荧光叠加所致，这表明HepG2细胞和HUVEC细胞之间建立了连接。结果显示，生物砖内部的HepG2细胞之间、HUVEC细胞之间以及HepG2细胞与HUVEC细胞之间均建立了细胞间连接。
图14A显示了使用共聚焦显微镜观察培养7天后的生物砖的结果(图中标尺为100μm)，其中，所使用的生物砖包含分别用cell trackerGreen CMFDA(绿色荧光)标记的HepG2细胞和HUVEC细胞。结果显示，两个生物砖的细胞之间建立了细胞连接，如方框中的桥状结构所显示的。
图14B显示了使用共聚焦显微镜观察培养7天后的生物砖的结果(图中标尺为500μm)，其中，使用了两种生物砖：一种生物砖包含用cell tracker Green CMFDA(绿色荧光)标记的HepG2细胞，且另一种生物砖包含用tracker CM-Dil(红色荧光)标记的HUVEC细胞；并且，图中的黄色区域是由红色荧光和绿色荧光叠加所致。结果显示，表达红色荧光的生物砖与表达绿色荧光的生物砖之间建立了细胞连接，如图中的黄色区域所显示的。
图14C显示了使用共聚焦显微镜观察培养7天后的生物砖的结果(图中标尺为500μm)，其中，所使用的生物砖包含用cell tracker GreenCMFDA(绿色荧光)标记的HepG2细胞和HUVEC细胞；并且，图中的各个白色圆环分别表示一个生物砖。结果显示，不同生物砖的细胞之间建立了细胞连接，并形成有机的整体。
图15显示了包含MSC细胞的生物砖的显微照片，其中，图15A显示了包含MSC细胞的单个生物砖(标尺为100μm)；图15B显示了培养7天后的包含MSC细胞的生物砖(标尺为500μm)；图15C显示了培养9天后的包含MSC细胞的生物砖(标尺为500μm)。结果显示，培养7天后，多个包含MSC细胞的生物砖相互融合(如图15B中的白色箭头所指示的)；并且，培养9天后，包含MSC细胞的生物砖完全融合，形成有机整体(如图15C所显示的)。
图16A显示了通过实施例10的方法制备的第一生物砖在37℃，5％CO2下培养1天后的显微照片。结果显示，MSC细胞正常生长，但未出现分化。
图16B显示了通过实施例10的方法制备的第一生物砖在37℃，5％CO2下培养10天后经茜素红染色的显微照片，其中，粗箭头所指处为一个完整的生物砖，细箭头所指处为钙结节。结果显示，生物砖内出现大量钙结节，如细箭头所指示的。这表明，第一生物砖中的MSC细胞向成骨细胞分化。
图17示意性地描述了使用本发明的生物砖/生物墨汁来生物打印血管的流程图。
图18显示了使用生物砖打印获得的人工肝脏组织的HE染色结果和针对白蛋白的免疫组化染色结果。图18的HE染色结果显示，在使用生物砖打印获得的人工肝脏组织中，细胞呈条索状排列，且该人工组织产生了类似肝小叶的结构，与正常肝脏组织相似。此外，图18的免疫组化染色结果显示，处于人工肝脏组织内部的肝脏细胞能够正常分泌肝脏特异性蛋白——白蛋白(Albumin)，而处于边缘的非肝脏细胞则不表达白蛋白。这些实验结果表明，本发明的生物砖可用于生物打印人工肝脏组织。
图19显示了使用CD31抗体对实施例15获得的人工组织体的切片进行染色的染色结果。结果显示，使用生物砖打印获得的人工组织体内出现了大量的微血管。这些实验结果表明，所制备的生物砖可用于生物打印包含微血管的构建体。
图20A-20G显示了以不同种类和比例的种子细胞进行打印而获得的微血管。
发明详述
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，下面提供本说明书中的相关术语的定义和解释。当本说明书中给出的定义与本领域技术人员所通常理解的含义相冲突时，以本说明书中的定义为准。
如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数的指示物，除非上下文另有明确规定。此外，本文中任何提及的“或”意在包括“和/或”，除非另有说明。
如本文中所使用的，术语“生物砖”用于指本发明人构建的一种基本单元，其可用于多个领域，例如生物打印(如3D生物打印)、组织工程、再生医学等领域。特别地，本发明的生物砖具有特定的结构和组成，即，其包括：细胞，包裹所述细胞的核层，和，封装所述细胞和核层的壳层，其中所述核层和壳层各自由生物可降解材料制成。本发明的生物砖的示意性结构可参见图1A-1E。在本发明中，生物砖不局限于特定的形状或大小，例如，其可以是球形的，或者任何期望的形状。
如本文中使用的，术语“生物打印”是指：利用生物材料(包括但不限于，生物分子例如蛋白质，脂质，核酸和代谢产物；细胞例如细胞溶液、含细胞的凝胶、细胞悬浮液、细胞浓缩物、多细胞聚集体和多细胞体；亚细胞结构例如细胞器和细胞膜；与生物分子相关的分子例如合成的生物分子或生物分子的类似物)的打印。如本文中使用的，术语“打印”是指，按照预定的模式沉积材料的过程。在本发明中，生物打印优选地通过与自动的或半自动的、计算机辅助的三维原型装置(例如生物打印机)相匹配的方法来实现。然而，在本发明中，“打印”(例如生物打印)可通过各种方法来进行，包括但不限于，使用打印机(例如3D打印机或生物打印机)进行打印；使用自动化或非自动化机械过程(而非打印机)进行打印；通过手工放置或手工沉积(例如使用移液器)进行打印。
如本文中使用的，术语“组织”是指由形态相同或类似、机能相同的细胞群构成的细胞集合体，并且通常还包含非细胞形态的物质(称为细胞间质，例如基质、纤维等)。组织可包括一种或多种细胞。如本文中使用的，术语“器官”是指由不同的细胞和组织构成的、用于实现某一或某些特定功能的结构。器官可包括一种或多种组织。“人工组织”是指，不是通过天然组织生成或发育过程在生物体内形成的组织。人工组织可以是人为制造的组织，例如通过生物打印方法获得的组织。在本发明中，术语“人工组织”和“组织构建体”可互换使用。如本文中使用的，术语“组织前体”是指细胞集合体，其在培养、诱导或操作步骤后，能够形成组织。在本发明中，组织前体可以是人为制造的组织前体(即，人工组织前体)。
特别地，在本发明中，组织的实例包括但不限于：结缔组织(例如，疏松结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、网状结缔组织和脂肪组织)、肌肉组织(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、神经组织和上皮组织(例如，单层上皮和复层上皮)、内胚层来源的组织、中胚层来源的组织和外胚层来源的组织。
如本文中使用的，术语“构建体”是指，使用本发明的生物砖构建的物体，其可以具有二维或三维的结构，并且可以是组织前体，组织或器官。
如本文中使用的，术语“组织工程”具有本领域技术人员通常理解的含义。特别地，组织工程是跨学科的领域，其应用并结合了工程学和生命科学的原理，并且通常是指，使用生物替代品(例如本发明的生物砖)来恢复、保持或改善组织功能。经典组织工程学的基本原理是：从机体获取少量的活体组织，用特殊的酶或其他方法将细胞(又称种子细胞)从组织中分离出来在体外进行培养扩增，然后将扩增的细胞与具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料(支架)按一定的比例混合，使细胞黏附在生物材料(支架)上形成细胞-材料复合物；将该复合物植入机体的组织或器官病损部位，随着生物材料在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成相应的组织或器官，从而达到修复创伤和重建功能的目的。本发明的生物砖具有下述显著的优点：生物砖所包裹的细胞类型和细胞数目是可控的；并且生物砖本身的尺寸也是可控的；并且，生物砖的核层和壳层各自由生物可降解材料制成；从而特别适合用于组织工程。
如本文中使用的，“生物相容性材料”是指这样的材料，其(以及其降解产物)对于细胞是无毒性的，并且在植入宿主(例如人体)后与宿主相容，不会造成显著的或者严重的副作用，例如，不会对宿主(例如人体组织)造成毒害作用，不会引起宿主的免疫排斥反应、过敏反应或炎症反应等等。
如本文中使用的，“生物可降解材料”是指这样的材料，其能够被细胞或生物体降解和吸收，并且其降解产物是生物相容性的。此类材料可以是天然来源的(例如来源于动植物)，也可以是人工合成的。
如本文中使用的，“海藻酸”是指一类由褐藻提取的多糖,其为β-1,4-D-甘露糖醛酸(M单元)和α-1,4-L-古洛糖醛酸(G单元)的无规嵌段共聚物。通常，海藻酸中的M和G单元以M-M，G-G或M-G的组合方式通过1,4糖苷键相连成为嵌段共聚物。海藻酸的实验式为(C6H8O6)n，其分子量通常为4kDa-1500kDa。如本文中使用的，“海藻酸盐”是指由海藻酸形成的盐，包括但不限于，海藻酸钠，海藻酸钙，海藻酸锶，海藻酸钡等。
如本文中使用的，“氧化的海藻酸盐”是指，对海藻酸盐(例如海藻酸钠)进行氧化反应后形成的产物。通常情况下，氧化反应将使得海藻酸盐(例如海藻酸钠)中的部分糖醛酸单元的羟基被氧化为醛基。
如本文中使用的，“G/M值”是指海藻酸、海藻酸盐或氧化的海藻酸盐中，α-1,4-L-古洛糖醛酸(G单元)和β-1,4-D-甘露糖醛酸(M单元)的摩尔比。
如本文中使用的，“氧化度”是指被氧化的糖醛酸单元占海藻酸或海藻酸盐的总糖醛酸单元的摩尔分数。
如本文中使用的，“粘度”是指流体粘滞性的一种量度，是流体流动力对其内部摩擦现象的一种表示。将两块面积为1㎡的板浸于液体中,两板距离为1米,若在某一块板上加1N的切应力,使两板之间的相对速率为1m/s,则此液体的粘度为1Pa·s。
如本文中使用的，“经过改性的可降解聚合物”是指，通过化学和/或物理方法，改变原始聚合物具有的化学性质和/或物理性质而得到的可降解聚合物。例如，可通过化学反应改变原始聚合物的主链或侧链上的原子或原子团的种类和/或结合方式，从而获得经过改性的可降解聚合物。例如，对海藻酸钠进行氧化反应，以得到改性的海藻酸钠(即，氧化海藻酸钠)。
如本文中所使用的，术语“力学保护”是指，生物砖或其壳层具有一定的硬度和弹性模量，从而能够减少或避免其内封装的细胞遭受外界的机械损伤/力学损伤(例如，3D生物打印过程中可能产生的剪切力，挤压力等引起的损伤)。
如本文中使用的，“生物墨汁”是指，包含一种或多种本发明的生物砖的液体，半固体(例如凝胶)或固体组合物。例如，本发明的生物墨汁可以是包含生物砖的溶液，悬浮液，凝胶，或浓缩物。在优选的实施方案中，本发明的生物墨汁包含生物砖以及生物粘合剂。在本发明中，生物墨汁能够被用于生物打印，以产生特定的平面和/或层状几何形状；并且优选地，所产生的平面和/或层状几何形状能够进一步堆叠，从而形成具有特定形状和结构的三维构建体。此外，在生物打印之前，期间和/或之后，生物墨汁中的生物砖内的细胞能够进行各种期望的生命活动。在优选的实施方案中，生物砖内的细胞在生物打印之前处于休眠状态，而在生物打印之后进行生长和增殖，从而形成稳固的三维构建体。在优选的实施方案中，生物墨汁是可挤出的组合物。如本文中所使用的，“可挤出的”是指，组合物能够通过被迫(例如在压力下)穿过喷嘴或孔口而成形。
如本文中使用的，“生物粘合剂”是指，起粘合作用的、与细胞和生物体相容的、生物可降解的材料。其具体实例可包括，但不限于胶原、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐、淀粉、透明质酸、层粘连蛋白、弹性蛋白、明胶、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、琼脂糖、葡聚糖、甲基纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，或其任何组合。
如本文中使用的，“凝聚”指将细胞、细胞聚集体、多细胞聚集体、多细胞体和/或它们的层结合起来的细胞-细胞粘附。该术语可以与“融合”互换使用。
如本文中使用的，“层状”是指多层的、生物打印的组织，其中两个或多个平面层组合起来以增加该组织在z平面(即，垂直平面)的总厚度。在一些实施方案中，每个平面层在结构和/或组成上可以是基本类似的。在其它实施方案中，每个平面层在结构和/或组成上可以是基本上独特的，即彼此不同。此外，在每个平面层的x-y平面(即：水平平面)内，多个生物砖(或者其中的细胞)和/或空隙空间相对于彼此空间布置成设定的图案。
如本文中使用的，“一层或多层”是指，由至少一个平面层/组织层组成，其中每个平面层/组织层是一个或多个细胞层的厚度。由于本发明的生物砖可以包含一个细胞，也可以包含多个细胞(例如100个或1000个)。因此，在一些实施方案中，平面层/组织层为一个细胞层的厚度。在其它实施方案中，平面层/组织层为多个细胞层的厚度。此外，在3D生物打印过程中，可以一次沉积一个层，也可以同时沉积多个层。任选地，每个平面层/组织层包含多种细胞类型。此外，在每个平面层/组织层中的多种细胞类型任选地在x-y平面(即：水平平面)上以空间限定的结构相对于彼此排列。此外，在某些情况下，在z-平面(即：垂直平面)上的组织层增加导致细胞在组织层内相对于彼此的受控空间定位，使得空间限定的结构在z-平面上继续。
如本文中使用的，“试剂”是指化学试剂，生化试剂或药物，包括但不限于，小分子化合物，激素，肽(例如寡肽或蛋白质)，核酸(寡核苷酸，DNA，RNA或化学修饰的核酸)等，其对细胞活性，功能和/或行为具有作用或影响。试剂可以是天然来源的，重组产生的，或化学合成的。“刺激”是指，化学因素(例如试剂，酸，碱，氧浓度等)或物理因素(例如温度，辐照，机械力等)，其对细胞活性，功能和/或行为具有作用或影响。
如本文中使用的，“受试者”是指动物，例如脊椎动物。优选地，受试者为哺乳动物，例如人，牛科动物，马科动物，猫科动物，犬科动物，啮齿类动物或灵长类动物。特别优选地，受试者为人。在本文中，该术语可以与“患者”、“受体”和“供体”互换使用。
如本文中使用的，“不同的细胞”是指不同来源和/或类型的细胞。例如，细菌细胞和动物细胞属于不同的细胞；来源于鼠的细胞与来源于人的细胞属于不同的细胞；鼠软骨细胞与人软骨细胞属于不同的细胞；人软骨细胞与人上皮细胞属于不同的细胞。
因此，在一个方面，本发明提供了一种生物砖，其包括：细胞，包裹细胞的核层，和，封装核层的壳层，其中所述核层和壳层各自独立地由生物可降解材料制成。在本发明的某些优选实施方案中，所述核层和壳层中的生物可降解材料能够减少或避免生物砖内的细胞在操作(例如生物打印)过程中遭受机械损伤，并且能够提供物质(例如营养物质，细胞外基质，细胞因子或药物活性成分等)的可控释放，以促进细胞活性和功能(增殖、分化、迁移、分泌或新陈代谢)。在某些优选实施方案中，所述生物砖是生物打印的基本单元。在某些优选实施方案中，所述生物砖用于生物打印。
生物砖的核层提供了适合细胞粘附和伸展的空间结构和微环境，从而细胞在该结构内能够正常进行增殖、分化、迁移、分泌或新陈代谢。所述微环境指细胞所生长的环境，其包含的要素包括物理因素，比如空间结构、力学强度、温度、湿度、渗透压等；化学因素，比如酸碱度、离子浓度等；生物因素，包括细胞、细胞因子等。这些要素共同构成细胞生命活动的环境，并对在这个环境中生长的细胞的增殖、分化、迁移、分泌和新陈代谢进行动态调控。在某些实施方案中，所述核层能够为细胞的生命活动提供微环境，例如空间结构、营养物质等。优选地，所述核层各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述生物可降解材料是生物相容性的。
在本发明中，使用生物可降解材料来制备生物砖的核层是特别优选的。特别地，对于生物砖的某些用途(例如，生物打印，制备构建体，组织工程等)而言，无法降解的材料的使用是不利的。这是因为，一方面，这些无法降解的材料将被保留在所获得的构建体或人工组织中，从而限制构建体或人工组织的应用；另一方面，这些无法降解的材料将阻碍不同生物砖的细胞之间建立细胞连接，不利于构建有机的整体(例如，人工组织)。因此，生物可降解材料在核层中的使用对于利用生物砖来制备构建体、人工组织、器官是特别有利的和优选的。
在本发明的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料可以是天然存在的(例如来源于动植物的天然存在的生物可降解材料，例如胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，琼脂糖，明胶，葡聚糖，以及其任意组合)，人工合成的，重组产生的，经过改性的，或者其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的所述生物可降解材料是天然存在的可降解聚合物。优选地，所述可降解聚合物选自胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐(例如海藻酸钠)，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，琼脂糖，明胶，葡聚糖，以及其任意组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的所述生物可降解材料是经过改性的可降解聚合物，例如经过改性的海藻酸盐，例如氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的所述生物可降解材料是合成的可降解聚合物。此类可降解聚合物包括但不限于，聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己内酯(PCL)，聚羟基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(例如聚赖氨酸)，可降解性聚氨酯，以及其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的所述生物可降解材料包含天然存在的可降解聚合物和合成的可降解聚合物。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的所述生物可降解材料能够被酶(例如细胞分泌的酶)所降解。不同的生物可降解材料的降解速率差异很大，其范围可以为一个月到数年。然而在本发明中，特别优选地，用于制备核层的生物可降解材料在不超过2个月的时间内降解，例如在不超过1个月的时间内降解，例如在不超过30天、不超过25天、不超过20天、不超过15天、不超过10天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天、或不超过1天的时间内降解。例如，用于制备核层的生物可降解材料可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，25-30天，或30-60天的时间内降解。降解速率与生物可降解材料的分子组成、分子量大小和分子排列(例如，直链或支链)密切相关。一般情况下，分子量越高、分子排列越紧密，降解时间越长。因此，核层的降解速率可通过对核层的组分和/或含量的配置来控制。例如，为了获得更快的降解速率，可使用低含量(例如低于0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％)的生物可降解材料、低分子量(例如低于500Da、1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、或10kDa)的生物可降解材料，和/或具有疏松分子排布的生物可降解材料。为了获得更慢的降解速率，可使用高含量(例如高于0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％)的生物可降解材料、高分子量(例如高于500Da、1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、或10kDa)的生物可降解材料，和/或具有紧密分子排布的生物可降解材料。另外，还可通过改变生物砖的结构(如：多层包裹、表面多孔、孔隙率大小、比表面积等)来调节生物可降解材料的降解速率。此外，生物可降解材料的降解速率还可以通过改变合成该材料的聚合方式和共聚物比例来进行调节；或者，可通过对该材料的交联来进行调节。
各种生物可降解材料是本领域技术人员已知的，并且其降解性能已被进行了广泛研究。参见例如，Alexander D.Augst,Hyun Joon Kong,David J.Mooney,AlginateHydrogels as Biomaterials,Macromol.Biosci.2006,6,623-633，其通过引用并入本文。
在某些优选的实施方案中，所述核层的降解能够提供维持或促进所述细胞的生命活动的微环境，例如营养物质。在某些优选的实施方案中，核层的降解产物为小分子化合物，例如有机酸、单糖(例如葡萄糖)、寡糖、氨基酸、脂质等。此类降解产物可参与到细胞的新陈代谢活动中，用于合成细胞外基质或转化为活动所需的能量。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料及其降解产物对于细胞是无毒的，和/或对于宿主是非免疫原性的。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料选自胶原蛋白(例如I型，II型，III型胶原蛋白)、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠)、氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)、淀粉、透明质酸，层粘连蛋白，弹性蛋白，明胶、葡聚糖、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、琼脂糖、可降解性聚氨酯，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料含有细胞外基质或其类似物(例如胶原蛋白)。细胞外基质或其类似物(例如胶原蛋白)的使用能够为生物砖内的细胞的生命活动(特别是细胞的生长、粘附、伸展，以及细胞间连接的建立)提供类似于体内的有利的微环境，从而是优选的。例如，I型胶原的空间结构与细胞外基质的空间结构类似，能够为细胞生存和增殖提供类似于细胞外基质骨架结构的微环境，为细胞生物学功能的实现提供支持。因此，在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为I型胶原或者含有I型胶原。
在某些优选的实施方案中，所述核层包含I型胶原蛋白和/或海藻酸盐，例如包含I型胶原蛋白和海藻酸钠。在某些优选的实施方案中，I型胶原蛋白和海藻酸钠在核层中的重量比为约1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、3:25、1:9、1:10、1:20、1:30、或1:50。在某些优选的实施方案中，I型胶原蛋白和海藻酸钠在核层中的重量比为1:1-1:2、1:2-1:4、1:4-1:6、1:6-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、1:10-1:20、1:20-1:30、1:30-1:50、1:1-1:5、1:5-1:10、1:7-1:10、或1:8-1:9。在某些优选的实施方案中，I型胶原蛋白在核层中的重量百分比为约0.01％、0.05％、0.1％、0.125％、0.15％、0.175％、0.2％、0.25％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％。在某些优选的实施方案中，I型胶原蛋白在核层中的重量百分比为0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.125％、0.125％-0.15％、0.15％-0.175％、0.175％-0.2％、0.2％-0.25％、0.25％-0.3％、0.3％-0.4％、0.4％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、0.01％-0.1％、0.1％-0.2％、0.125％-0.175％、0.2％-0.5％、0.1％-0.5％、0.1％-1％、或0.05％-5％。在某些优选的实施方案中，海藻酸钠在核层中的重量百分比为约0.1％、0.5％、1％、1.25％、1.5％、2％、3％、4％、5％、7.5％、或10％。在某些优选的实施方案中，海藻酸钠在核层中的重量百分比为0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-1.25％、1.25％-1.5％、1.5％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-7.5％、7.5％-10％、0.1％-1％、1％-1.5％、1％-2％、0.5-2.5％、1％-3％、5-10％、或0.5-5％。
在某些优选的实施方案中，所述核层包含海藻酸钠。在某些优选的实施方案中，所述核层包含I型胶原蛋白。在某些优选的实施方案中，所述核层包含淀粉。在某些优选的实施方案中，所述核层包含可降解性聚氨酯。在某些优选的实施方案中，所述核层包含层粘连蛋白。
在某些优选的实施方案中，所述核层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)在核层中的重量比为约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)在核层中的重量比为10:1-9:1、9:1-8:1、8:1-7:1、7:1-6:1、6:1-5:1、5:1-4:1、4:1-3:1、3:1-2:1、2:1-1:1、1:1-1:2、1:2-1:3、1:3-1:4、1:4-1:5、1:5-1:6、1:6-1:7、1:7-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、10:1-5:1、5:1-1:1、1:1-1:5、1:5-1:10、2:1-1:2、4:1-1:4、或10:1-1:10。
在某些优选的实施方案中，所述核层为凝胶状。
生物砖的壳层为包裹的细胞提供了力学保护。在某些优选的实施方案中，所述生物砖或生物砖的壳层具有一定的力学强度，从而能够实现立体堆积。在本发明中，特别优选地，生物砖及其壳层具有适当的力学保护性能(例如，具有合适的硬度和/或弹性模量)。一方面，生物砖内的细胞在操作过程中(例如，在3D打印过程中)易于因外界压力或剪切力的伤害而受损或死亡。因此，如果生物砖及其壳层的硬度和/或弹性模量太低，那么将导致生物砖内的细胞存活率在人工操作后显著下降，进而导致生物砖的应用受到限制，或者需要使用大量的细胞。另一方面，如果生物砖及其壳层的硬度和/或弹性模量太高，那么将导致生物砖内的细胞的伸展、迁移受到限制，并且阻碍不同生物砖的细胞之间建立细胞连接，不利于构建有机的整体(例如，人工组织)。因此，适当的力学保护性能不仅使得能够对本发明的生物砖进行各种操作(例如进行3D生物打印，进行生物砖的精确排布等)，而且有利于生物砖内的细胞伸展、迁移、建立细胞连接，并形成有机的构建体(例如人工组织)，因此，是特别优选的。
在某些优选的实施方案中，所述生物砖或生物砖的壳层各自独立地具有约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.3、或0.4GPa的硬度。在某些优选的实施方案中，所述生物砖或生物砖的壳层各自独立地具有0.01-0.02、0.02-0.03、0.03-0.04、0.04-0.05、0.05-0.06、0.06-0.07、0.07-0.08、0.08-0.09、0.09-0.1、0.1-0.15、0.15-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.01-0.4、0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.4、0.05-0.15、或0.06-0.1GPa的硬度。在某些优选的实施方案中，所述生物砖或生物砖的壳层具有约0.083GPa的硬度。在某些优选的实施方案中，所述生物砖或生物砖的壳层各自独立地具有约0.01、0.05、0.1、0.5、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.4、2.8、3.2、4、10、20、30、40、50、80、或100MPa的弹性模量。在某些优选的实施方案中，所述生物砖或生物砖的壳层各自独立地具有0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.5-0.8、0.8-1、1-1.2、1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2、2-2.4、2.4-2.8、2.8-3.2、3.2-4、4-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-80、80-100、0.5-4、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-3、0.8-1.6、1.4-2.4、0.8-3.2、0.01-100、1-100、10-100、或0.5-50MPa的弹性模量。在某些优选的实施方案中，所述生物砖或生物砖的壳层具有约1.683MPa的弹性模量。壳层的力学保护作用(例如，硬度和弹性模量)可通过对壳层的组分和/或含量的配置来控制。
在某些优选的实施方案中，所述壳层也能够为细胞的生命活动提供微环境，例如营养物质。优选地，所述壳层各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述生物可降解材料是生物相容性的。
在本发明中，使用生物可降解材料来制备生物砖的壳层是特别优选的。特别地，对于生物砖的某些用途(例如，生物打印，制备构建体，组织工程等)而言，无法降解的材料的使用是不利的。这是因为，一方面，这些无法降解的材料将被保留在所获得的构建体或人工组织中，从而限制构建体或人工组织的应用；另一方面，这些无法降解的材料将阻碍不同生物砖的细胞之间建立细胞连接，不利于构建有机的整体(例如，人工组织)。因此，生物可降解材料在壳层中的使用对于利用生物砖来制备构建体、人工组织、器官是特别有利的和优选的。
在本发明的实施方案中，用于制备壳层的生物可降解材料可以是天然存在的(例如来源于动植物的天然存在的生物可降解材料，例如胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，琼脂糖，明胶，葡聚糖，以及其任意组合)，人工合成的，重组产生的，经过改性的，或者其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的所述生物可降解材料是天然存在的可降解聚合物。优选地，所述可降解聚合物选自胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，琼脂糖，明胶，葡聚糖，以及其任意组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的所述生物可降解材料是经过改性的可降解聚合物，例如经过改性的海藻酸盐，例如氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的所述生物可降解材料是合成的可降解聚合物。此类可降解聚合物包括但不限于，聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己内酯(PCL)，聚羟基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(例如聚赖氨酸)，可降解性聚氨酯，以及其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的所述生物可降解材料包含天然存在的可降解聚合物和合成的可降解聚合物。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的所述生物可降解材料能够被酶(例如细胞分泌的酶)所降解。不同的生物可降解材料的降解速率差异很大，其范围可以为一个月到数年。然而在本发明中，特别优选地，用于制备壳层的生物可降解材料在不超过1个月的时间内降解，例如在不超过30天、不超过25天、不超过20天、不超过15天、不超过10天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天、或不超过1天的时间内降解。例如，用于制备壳层的生物可降解材料可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，或25-30天的时间内降解。特别优选地，用于制备壳层的生物可降解材料在不超过10天的时间内降解。降解速率与生物可降解材料的分子组成、分子量大小和分子排列(例如，直链或支链)密切相关。一般情况下，分子量越高、分子排列越紧密，降解时间越长。因此，壳层的降解速率可通过对壳层的组分和/或含量的配置来控制。例如，为了获得更快的降解速率，可使用低含量(例如低于0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％)的生物可降解材料、低分子量(例如低于500Da、1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、或10kDa)的生物可降解材料，和/或具有疏松分子排布的生物可降解材料。为了获得更慢的降解速率，可使用高含量(例如高于0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％)的生物可降解材料、高分子量(例如高于500Da、1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、或10kDa)的生物可降解材料，和/或具有紧密分子排布的生物可降解材料。另外，还可通过改变生物砖的结构(如：多层包裹、表面多孔、孔隙率大小、比表面积等)来调节生物可降解材料的降解速率。此外，生物可降解材料的降解速率还可以通过改变合成该材料的聚合方式和共聚物比例来进行调节；或者，可通过对该材料的交联来进行调节。此外，用于制备壳层的生物可降解材料的降解速率还可受细胞生命活动的影响。
在本发明中，特别优选的是，生物砖内的细胞能够生长、伸展、增殖、迁移，并与其他生物砖内的细胞建立细胞连接，形成有机的构建体(例如人工组织)。因此，在某些优选的实施方案中，所述生物砖的壳层在相对短的时间(例如不超过30天的时间内，例如不超过10天的时间内)降解，以促进不同生物砖之间的细胞连接的建立，避免因壳层的存在而阻碍或影响不同生物砖之间的细胞建立相互的细胞连接。在某些优选的实施方案中，所述生物砖的壳层在不超过30天、不超过25天、不超过20天、不超过15天、不超过10天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天、或不超过1天的时间内降解。例如，所述生物砖的壳层可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，或25-30天的时间内降解。
各种生物可降解材料是本领域技术人员已知的，并且其降解性能已被进行了广泛研究。参见例如，Alexander D.Augst,Hyun Joon Kong,David J.Mooney,AlginateHydrogels as Biomaterials,Macromol.Biosci.2006,6,623-633，其通过引用并入本文。
在某些优选的实施方案中，所述壳层的降解能够提供维持或促进所述细胞的生命活动的微环境，例如营养物质。在某些优选的实施方案中，壳层的降解产物为小分子化合物，例如有机酸、单糖(例如葡萄糖)、寡糖、氨基酸、脂质等。此类降解产物可参与到细胞的新陈代谢活动中，用于合成细胞外基质或转化为活动所需的能量。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的生物可降解材料及其降解产物对于细胞是无毒的，和/或对于宿主是非免疫原性的。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的生物可降解材料含有细胞外基质或其类似物(例如弹性蛋白)。细胞外基质或其类似物(例如弹性蛋白)的使用能够为生物砖内的细胞的生命活动(特别是细胞的生长、粘附、伸展，以及细胞间连接的建立)提供类似于体内的有利的微环境，从而是优选的。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的生物可降解材料选自胶原蛋白(例如I型，II型，III型胶原蛋白)、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)、氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)、淀粉、透明质酸，层粘连蛋白，弹性蛋白，明胶、葡聚糖、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、琼脂糖，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，所述壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)，例如包含海藻酸钙和明胶，任选地还包含弹性蛋白。
在某些优选的实施方案中，所述壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和明胶。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和明胶在壳层中的重量比为约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和明胶在壳层中的重量比为10:1-9:1、9:1-8:1、8:1-7:1、7:1-6:1、6:1-5:1、5:1-4:1、4:1-3:1、3:1-2:1、2:1-1:1、1:1-1:2、1:2-1:3、1:3-1:4、1:4-1:5、1:5-1:6、1:6-1:7、1:7-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、10:1-5:1、5:1-1:1、1:1-1:5、1:5-1:10、2:1-1:2、4:1-1:4、或10:1-1:10。在某些优选的实施方案中，所述壳层还包含弹性蛋白。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和弹性蛋白在壳层中的重量比为约1000:1、500:1、400:1、300:1、250:1、200:1、100:1、50:1或10:1。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和弹性蛋白在壳层中的重量比为10:1-50:1、50:1-100:1、100:1-200:1、200:1-250:1、250:1-300:1、300:1-400:1、400:1-500:1、500:1-1000:1、10:1-100:1、100:1-200:1、200:1-300:1、300:1-400:1、400:1-1000:1、或100:1-500:1。在某些优选的实施方案中，明胶和弹性蛋白在壳层中的重量比为约1000:1、500:1、400:1、300:1、250:1、200:1、100:1、50:1或10:1。在某些优选的实施方案中，明胶和弹性蛋白在壳层中的重量比为10:1-50:1、50:1-100:1、100:1-200:1、200:1-250:1、250:1-300:1、300:1-400:1、400:1-500:1、500:1-1000:1、10:1-100:1、100:1-200:1、200:1-300:1、300:1-400:1、400:1-1000:1、或100:1-500:1。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)、明胶和弹性蛋白在壳层中的重量比为约250:250:1。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)在壳层中的重量百分比为约0.1％、0.5％、1％、1.25％、1.5％、2％、3％、4％、5％、7.5％、或10％。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)在壳层中的重量百分比为0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-1.25％、1.25％-1.5％、1.5％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-7.5％、7.5％-10％、0.1％-1％、1％-1.5％、1％-2％、0.5-2.5％、1％-3％、5-10％、或0.5％-5％。在某些优选的实施方案中，明胶在壳层中的重量百分比为约0.1％、0.5％、1％、1.25％、1.5％、2％、3％、4％、5％、7.5％、或10％。在某些优选的实施方案中，明胶在壳层中的重量百分比为0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-1.25％、1.25％-1.5％、1.5％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-7.5％、7.5％-10％、0.1％-1％、1％-1.5％、1％-2％、0.5-2.5％、1％-3％、5-10％、或0.5％-5％。在某些优选的实施方案中，弹性蛋白在壳层中的重量百分比为约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.1％、0.15％、0.2％、或0.5％。在某些优选的实施方案中，弹性蛋白在壳层中的重量百分比为0.01％-0.02％、0.02％-0.03％、0.03％-0.04％、0.04％-0.05％、0.05％-0.06％、0.06％-0.07％、0.07％-0.08％、0.08％-0.1％、0.1％-0.15％、0.15％-0.2％、0.2％、0.2％-0.5％、0.01％-0.03％、0.03％-0.05％、0.05％-0.08％、0.08％-0.15％、0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.03％-0.07％、0.04％-0.06％、0.01％-0.1％、0.1％-0.5％、或0.01％-0.5％。
在某些优选的实施方案中，所述壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)，例如包含海藻酸钙和明胶，任选地还包含弹性蛋白。在某些优选的实施方案中，所述壳层包含氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)。在某些优选的实施方案中，所述壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和琼脂糖。
在某些优选的实施方案中，可使用氧化的海藻酸盐(例如氧化的海藻酸钠和氧化的海藻酸钙)来制备生物砖的壳层/外壳，并且可通过控制海藻酸盐的氧化度来调节其降解速度，从而使壳层/外壳的降解速度与包裹在其中的细胞生长速度相匹配。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的至少一个壳层包含氧化的海藻酸盐(例如氧化的海藻酸钠和/或氧化的海藻酸钙)，从而使得能够对生物砖(或其壳层)的降解速度进行控制(例如，通过控制海藻酸盐的氧化度)。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的至少一个壳层(例如所有壳层)包含氧化的海藻酸盐(例如氧化的海藻酸钠和/或氧化的海藻酸钙)。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的位于最外侧的壳层包含氧化的海藻酸盐(例如氧化的海藻酸钠和/或氧化的海藻酸钙)。在某些优选的实施方案中，在本发明的生物砖中，仅位于最外侧的壳层包含氧化的海藻酸盐(例如氧化的海藻酸钠和/或氧化的海藻酸钙)。
在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐包含氧化的海藻酸钠和/或氧化的海藻酸钙。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐包含氧化的海藻酸钠。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐包含氧化的海藻酸钙。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐包含氧化的海藻酸钠和氧化的海藻酸钙。
在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的分子量为4kDa-1500kDa。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的分子量为4-10kDa、10-20kDa、20-30kDa、30-40kDa、40-50kDa、50-60kDa、60-70kDa、70-80kDa、80-90kDa、90-100kDa、100-200kDa、200-300kDa、300-400kDa、400-500kDa、500-600kDa、700-800kDa、800-900kDa、900-1000kDa、1100-1200kDa、1200-1300kDa、1300-1400kDa、或1400-1500kDa。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的分子量为32k-250k Da。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐是可溶于水的。
在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的G/M值为0.2-5。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的G/M值为0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-1.0、1.0-1.5、1.5-2.0、2.0-2.5、2.5-3.0、3.0-3.5、3.5-4.0、4.0-4.5、或4.5-5.0。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的G/M值为0.2-2.5。
在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的氧化度为1-40％。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的氧化度为1-2％、2-3％、3-4％、4-5％、5-6％、6-7％、7-8％、8-9％、9-10％、11-12％、12-13％、13-14％、14-15％、15-16％、16-17％、17-18％、18-19％、19-20％、20-25％、25-30％、30-35％、或35-40％。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的氧化度为2.5-4.4％、4.4-8.8％、8.8-17.6％或17.6-22％。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的氧化的海藻酸盐的粘度为100-3000mPa·s。在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的氧化的海藻酸盐的粘度为100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2700、2700-2800、2800-2900、或2900-3000mPa·s。在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的氧化的海藻酸盐的粘度为200-2000mPa·s。
在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐是通过将从藻类(例如褐藻，例如海带和马尾藻)中提取到的海藻酸盐氧化而获得的。
在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的至少一个壳层包含1-25％(wt)的氧化的海藻酸盐。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的至少一个壳层包含1-2％、2-3％、3-4％、4-5％、5-6％、6-7％、7-8％、8-9％、9-10％、10-15％、15-20％、20-25％(wt)的氧化的海藻酸盐。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的至少一个壳层包含至少5％(wt)的氧化的海藻酸盐。
在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的至少一个壳层包含氧化的海藻酸盐(例如，上文所定义的氧化的海藻酸盐)，以及海藻酸盐(例如海藻酸钠和/或海藻酸钙)。
在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的分子量为4kDa-1500kDa。在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的分子量为4-10kDa、10-20kDa、20-30kDa、30-40kDa、40-50kDa、50-60kDa、60-70kDa、70-80kDa、80-90kDa、90-100kDa、100-200kDa、200-300kDa、300-400kDa、400-500kDa、500-600kDa、700-800kDa、800-900kDa、900-1000kDa、1100-1200kDa、1200-1300kDa、1300-1400kDa、或1400-1500kDa。在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的分子量为32k-250k Da。
在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的G/M值为0.2-5。在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的G/M值为0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-1.0、1.0-1.5、1.5-2.0、2.0-2.5、2.5-3.0、3.0-3.5、3.5-4.0、4.0-4.5、或4.5-5.0。在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的G/M值为0.2-2.5。
在某些优选的实施方案中，用于制备所述至少一个壳层的海藻酸盐的粘度为100-3000mPa·s。在某些优选的实施方案中，用于制备所述至少一个壳层的海藻酸盐的粘度为100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2700、2700-2800、2800-2900、或2900-3000mPa·s。在某些优选的实施方案中，用于制备所述至少一个壳层的海藻酸盐的粘度为200-2000mPa·s。
在某些优选的实施方案中，在所述至少一个壳层中，海藻酸盐与氧化的海藻酸盐的质量比为1:9至9:1。在某些优选的实施方案中，在所述至少一个壳层中，海藻酸盐与氧化的海藻酸盐的质量比为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1。
在某些优选的实施方案中，所述壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)在壳层中的重量比为约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)在壳层中的重量比为10:1-9:1、9:1-8:1、8:1-7:1、7:1-6:1、6:1-5:1、5:1-4:1、4:1-3:1、3:1-2:1、2:1-1:1、1:1-1:2、1:2-1:3、1:3-1:4、1:4-1:5、1:5-1:6、1:6-1:7、1:7-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、10:1-5:1、5:1-1:1、1:1-1:5、1:5-1:10、2:1-1:2、4:1-1:4、或10:1-1:10。
在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层在不超过28天的时间内完全降解。在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层在不超过21天、不超过14天、不超过12天、不超过10天、不超过9天、不超过8天、不超过7天、不超过6天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、或不超过2天的时间内完全降解。在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层在2-5天，2-6天，2-8天，2-10天，2-12天，或2-14天内完全降解。
在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层的粘度为100-3000mPa·s。在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层的粘度为100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2700、2700-2800、2800-2900、或2900-3000mPa·s。在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层的粘度为200-2000mPa·s。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层和壳层的生物可降解材料可以是相同的或不同的。然而，特别优选地，根据其预期的目的，核层和壳层具有不同的组成。不拘于理论限制，通常认为，壳层提供了主要的力学保护作用，而核层则提供了细胞生命活动所需的主要的营养成分和微环境。因此，在某些优选的实施方案中，与壳层相比，核层具有更多的营养物质。在某些优选的实施方案中，与核层相比，壳层具有较低的降解速率，但具有更高的硬度和/或弹性模量。在某些优选的实施方案中，壳层中不包含细胞。
因此，在某些优选的实施方案中，核层和壳层由不同的生物可降解材料制成。例如，在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为，海藻酸钠和任选的I型胶原；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为，海藻酸钠和任选的弹性蛋白。在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为淀粉；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为海藻酸钠。在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为I型胶原；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为聚赖氨酸。在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为I型胶原；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为海藻酸钠。在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为聚氨酯；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为海藻酸钠。在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为海藻酸钠；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为聚赖氨酸。
在某些优选的实施方案中，核层和壳层分别以不同的重量比包含相同的生物可降解材料。换言之，核层和壳层可以由相同的生物可降解材料制成，但以不同的重量比包含生物可降解材料。例如，在某些优选的实施方案中，核层和壳层均由海藻酸钠制成；但核层包含不超过2％(例如1.5％)的海藻酸钠，而壳层包含超过4％(例如5％)的海藻酸钠。不超过2％(例如1.5％)的海藻酸钠能够为细胞在核层中的生长、增殖、分化或迁移提供优良的条件(通常，细胞难以在超过2％的海藻酸钠的条件下生长和存活)；而超过4％(例如5％)的海藻酸钠则能够为壳层提供足够的硬度和弹性。
在某些优选的实施方案中，所述核层和壳层包含选自下述的组合：
Figure BDA0001552026420000321
Figure BDA0001552026420000331
在某些优选的实施方案中，所述壳层各自独立地是通透性的。例如，所述壳层对于水，氧气，和营养物质(糖类例如葡萄糖，脂肪，蛋白质，氨基酸，短肽，矿物质，维生素、细胞因子、核苷酸等)是通透性的。
一般认为，半通透的(即，选择通透的)壳层的使用可能是有利的，因为其能够使得水，氧气，葡萄糖，矿物质，和氨基酸等营养物质透过壳层，进入核层，并提供给细胞，并且能够阻止对细胞有害的物质(例如来自宿主免疫系统的抗体蛋白)进入核层。然而，在本发明的生物砖中，通透性壳层的使用是优选的和有利的。特别地，通透性的壳层使得各种营养物质(包括大分子和小分子营养物质，例如葡萄糖，脂肪，蛋白质，氨基酸，短肽，矿物质，维生素、细胞因子、核苷酸等)能够更加容易、顺畅地进行交换，避免局部区域的细胞无法获得充足的营养物质。例如，当使用本发明的生物砖构建大尺寸的人工组织时，通透性的壳层将能够促进各种营养物质的交换，促进人工组织内部/核心区域的生物砖内的细胞获得充足的营养物质。此外，通透性的壳层有利于不同生物砖之间的细胞进行信号传递和建立细胞连接。特别地，细胞在生长过程中会分泌多种物质(包括细胞外基质的某些组分和多种信号分子)，与邻近的、甚至远端的细胞进行信号传递和/或物质交流，并由此对细胞自身的生命活动以及邻近的、甚至远端的细胞的生命活动产生影响或进行调控。因此，如果使用选择通透性的壳层的话，那么细胞之间的信号传递和/或物质交流将有可能受到影响/阻碍，例如细胞分泌的某些大分子信号物质(例如细胞因子蛋白)可能无法透过壳层，从而可能阻碍不同生物砖之间的细胞信号的传递和细胞连接的建立，不利于构建有机的整体(例如，人工组织)。因此，通透性壳层的使用对于本发明的生物砖而言是优选的。在本发明中，表述“通透性壳层”意指，各种小分子和大分子物质(例如蛋白质)能够自由通过壳层。例如，在某些优选的实施方案中，所述壳层对于分子量在5000kDa以下的分子是通透的。例如，在某些实施方案中，所述壳层对于分子量在200kDa以下或分子量在200kDa-300kDa、300kDa-400kDa、400kDa-500kDa、500kDa-800kDa、800kDa-1000kDa、1000kDa-1500kDa、1500kDa-2000kDa、2000kDa-3000kDa、3000kDa-4000kDa或4000kDa-5000kDa范围内的分子是通透的。在某些实施方案中，所述壳层对于免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE)是通透的。
在某些优选的实施方案中，所述壳层各自独立地具有用于生物砖内外物质交换的通道或孔。在某些优选的实施方案中，营养物质(糖类例如葡萄糖，脂肪，蛋白质，氨基酸，短肽，矿物质，维生素、细胞因子、核苷酸等)通过所述通道或孔扩散进入所述生物砖内。在某些优选的实施方案中，所述通道的直径为至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、或500nm。在某些优选的实施方案中，所述通道的直径为例如1nm-5μm；10nm-2μm；100nm-1μm；200-800nm等。在某些优选的实施方案中，所述孔的直径为至少100、200、400、600、800、1000、1500、2000、4000、或5000nm。
本发明的生物砖的壳层的厚度可以根据实际需要进行选择，而不受特别限制。例如，本发明生物砖的壳层的厚度各自独立地可以为1-20μm，例如5-15μm，例如8-12μm。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖的壳层的厚度各自独立地可以为约0.1、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、或50μm。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖的壳层的厚度各自独立地可以为0.1-0.5、0.5-1、1-2、2-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、0.1-1、1-5、1-10、5-10、10-20、10-30、5-20、或1-20μm。
在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖的壳层不包含细胞。
在某些优选的实施方案中，所述核层和/或壳层各自独立地还包含额外的试剂，例如，营养物质、细胞外基质、细胞因子和/或药物活性成分。优选地，所述额外的试剂能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢。在某些优选的实施方案中，所述核层包含至少一种(例如1、2、3、4、5或更多种)能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的额外的试剂。在某些优选的实施方案中，所述核层能够以受控的方式释放所述额外的试剂。
在某些优选的实施方案中，所述营养物质包括但不限于，核苷酸，氨基酸，多肽，碳水化合物(例如单糖，寡糖，多糖)，脂质，维生素等。
在某些优选的实施方案中，细胞外基质选自多糖，例如糖胺聚糖、蛋白聚糖；结构蛋白，例如胶原和弹性蛋白；粘着蛋白，例如纤粘连蛋白和层粘连蛋白。
在某些优选的实施方案中，所述细胞因子可以是用于调控细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的细胞因子，包括但不限于：
-与细胞生长相关的细胞因子，例如胰岛素、类胰岛素生长因子(如IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、转化生长因子(如TGFα和TGFβ)、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤细胞生长因子、血小板来源生长因子、骨肉瘤来源生长因子、生长激素释放抑制因子、神经生长因子、白细胞介素(如IL-1、IL-11、IL-3)、红细胞生长素、集落刺激因子、皮质醇、甲状腺素，或其任何组合；
-与细胞分化相关的细胞因子，例如Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc，GATA4，TSP1，β-甘油磷酸钠，地塞米松，维生素C，胰岛素，IBMX，吲哚美锌，血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)，5-氮杂胞苷，或其任何组合；
-与细胞迁移相关的细胞因子，例如环磷酸腺苷，三磷酸磷脂酰肌醇，基质细胞衍生因子-1、N-钙粘蛋白，核因子κB，骨连接素，血栓素A2，Ras，或其任何组合；和/或
-与细胞新陈代谢相关的细胞因子，例如胰岛素生长因子1、TRIP-Br2、DKK-1、sRANKL、OPG、TRACP-5b、ALP、SIRT1(2-7)、PGC-1α，PGC-1β、OPG、IL-3、IL-4、IL-6、TGF-β、PGE2、G-CSF、TNF-α，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，所述药物活性成分为能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的试剂。在某些优选的实施方案中，所述药物活性成分选自rhIL-2、rhIL-11、rhEPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、rHuEPO、sTNF-R1、和rhTNF-α。
本发明生物砖的核层所包含的细胞的数量可以根据实际需要进行选择，而不受特别限制。例如，本发明生物砖的核层各自独立地可以包含1-106个细胞，例如10-900、20-800、30-700、40-600、50-500、60-400、70-300、80-200、10-100个、10-103个、10-104个、10-105个、10-106个细胞。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的核层各自独立地包含至少1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、或106个细胞。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的核层各自独立地可以包含1-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-104、104-2x104、2x104-3x104、3x104-4x104、4x104-5x104、5x104-105、105-2x105、2x105-3x105、3x105-4x105、4x105-5x105、5x105-106、1-10、2-10、2-5、5-10、10-20、20-30、30-50、2-25、25-50、2-50、50-100、100-200、50-250、250-500、500-2000、2-100、2-500、或2-2000个细胞。
不受理论限制，本发明的生物砖可以包含任何种类和类型的细胞。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或更多种类型的细胞。例如，所述细胞可以为细菌、酵母、植物细胞或动物细胞，例如哺乳动物细胞，优选人细胞。优选地，所述细胞为粘附细胞，例如分化的粘附细胞或未分化的粘附细胞。优选地，所述细胞为多能干细胞。在某些优选的实施方案中，所述粘附细胞来源于选自下述的组织：结缔组织(例如，疏松结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、网状结缔组织和脂肪组织)、肌肉组织(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、神经组织和上皮组织(例如，单层上皮和复层上皮)、内胚层来源的组织、中胚层来源的组织和外胚层来源的组织。
在某些优选的实施方案中，所述粘附细胞选自肌肉细胞(例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成肌细胞)、结缔组织细胞(例如，骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞以及分化为成骨细胞、软骨细胞或淋巴组织的细胞)、骨髓细胞、内皮细胞、皮肤细胞、上皮细胞、乳腺细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、神经细胞、许旺细胞、胃肠细胞、肝细胞、胰细胞、肺细胞、气管细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、肾细胞、脂肪细胞、实质细胞、周细胞、间皮细胞、基质细胞、未分化的细胞(如干细胞和祖细胞)、内胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、癌来源的细胞，细胞系、诱导的多能干细胞(iPS)、或其任何组合。
可根据实际需要来选择合适的细胞。例如，在某些优选的实施方案中，所述生物砖包含心肌细胞，并且其用于产生心脏组织。在某些优选的实施方案中，所述生物砖包含内皮细胞，平滑肌细胞和成纤维细胞，并且其用于产生血管。在某些优选的实施方案中，所述生物砖包含内皮细胞，并且其用于产生皮肤组织。
在某些优选的实施方案中，所述生物砖的核层包裹的细胞包括内皮细胞。在某些优选的实施方案中，所述核层包裹的内皮细胞获自动物，例如哺乳动物，例如人、猿、大猩猩、牛、猪、犬、绵羊和山羊。在某些实施方案中，所述内皮细胞为动物内皮细胞，优选人内皮细胞或大鼠内皮细胞。在某些优选的实施方案中，所述内皮细胞包括静脉内皮细胞和/或动脉内皮细胞，优选脐静脉内皮细胞。在某些优选的实施方案中，所述内皮细胞包括人脐静脉内皮细胞。在某些优选的实施方案中，所述内皮细胞包括大鼠血管内皮细胞。
在某些优选的实施方案中，除了如上描述的内皮细胞之外，所述核层包裹的细胞还包括未分化的细胞，例如干细胞、祖细胞或其组合。在某些优选的实施方案中，所述干细胞为多能干细胞，例如诱导的多能干细胞。在某些优选的实施方案中，所述干细胞包括间充质干细胞。在某些优选的实施方案中，所述间充质干细胞是骨髓、脂肪、脐带、脐带血、和/或胎盘来源的间充质干细胞。在某些优选的实施方案中，所述间充质干细胞是骨髓来源的间充质干细胞。在某些优选的实施方案中，所述间充质干细胞获自动物，例如哺乳动物，例如人、猿、大猩猩、牛、猪、犬、绵羊和山羊。
在某些优选的实施方案中，除了如上描述的内皮细胞之外，所述核层包裹的细胞还包括额外细胞。在某些优选的实施方案中，所述额外细胞来源于选自下述的组织：结缔组织(例如，疏松结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、网状结缔组织和脂肪组织)、肌肉组织(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、神经组织和上皮组织(例如，单层上皮和复层上皮)、内胚层来源的组织、中胚层来源的组织和外胚层来源的组织。在某些优选的实施方案中，所述额外细胞选自肌肉细胞(例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成肌细胞)、结缔组织细胞(例如，骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞以及分化为成骨细胞、软骨细胞或淋巴组织的细胞)、骨髓细胞、皮肤细胞、上皮细胞、乳腺细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、神经细胞、许旺细胞、胃肠细胞、肝细胞、胰细胞、肺细胞、气管细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、肾细胞、脂肪细胞、实质细胞、周细胞、间皮细胞、基质细胞、内胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、癌来源的细胞、细胞系、或其任何组合。在某些优选的实施方案中，所述额外细胞为肝细胞。
在某些优选的实施方案中，所述生物砖包含内皮细胞和未分化的细胞。在某些优选的实施方案中，所述内皮细胞和所述未分化的细胞包裹于同一核层或不同核层。例如，所述内皮细胞位于第一核层且所述未分化的细胞位于第二核层，或者相反。
在某些优选的实施方案中，所述生物砖包含内皮细胞、未分化的细胞和额外细胞。在某些优选的实施方案中，所述内皮细胞、所述未分化的细胞和所述额外细胞包裹于同一核层或不同核层，例如其中两种细胞位于同一核层(例如第一核层)而第三种位于另一核层(例如第二核层)。
在某些优选的实施方案中，所述核层包裹的内皮细胞、未分化的细胞和/或额外细胞的来源是相同的，例如，均来源于人，或均来源于大鼠。
在某些优选的实施方案中，所述生物砖包含内皮细胞和/或未分化的细胞。在某些优选的实施方案中，所述内皮细胞占细胞总数量的1％-100％，例如，2％-90％、3％-80％、4％-70％、5％-60％、5.5％-50％、6％-40％、6.5％-30％、7％-20％、7.5％-19％、8％-18％、8.5％-17％、9％-16％、9.1％-15％、9.2％-14％、9.3％-13％、9.4％-12％、9.5％-11.5％、9.6％-11％、9.7％-10.9％、9.8％-10.8％、9.9％-10.7％、9.9％-10.6％、9.9％-10.5％、9.9％-10.4％、9.9％-10.3％、9.9％-10.2％、9.9％-10.1％、或10.0％。在某些优选的实施方案中，所述未分化的细胞占细胞总数量的0％-99％，例如，1％-90％、5％-80％、10％-70％、15％-65％、20％-60％、25％-55％、30％-50％、35％-45％、36％-44％、37％-43％、38％-42％、39％-41％、39.1％、39.2％、39.3％、39.4％、39.5％、39.6％、39.7％、39.8％、39.9％、40.0％、40.1％、40.2％、40.3％、40.4％、40.5％、40.6％、40.7％、40.8％或40.9％。在某些优选的实施方案中，所述内皮细胞与未分化的细胞的比例为约1:20-约1:1,例如约1:19、约1:18、约1:17、约1:16、约1:15、约1:14、约1:13、约1:12、约1:11、约1:10、约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、或约1:1.5。在某些优选的实施方案中，所述内皮细胞与未分化的细胞的比例为约1:15、约1:14、约1:13、约1:12、约1:11.5、约1:11、约1:10.5、约1:10、约1:9.5、约1:9、约1:8.5、约1:8、约1:7、约1:6。在某些优选的实施方案中，所述内皮细胞与未分化的细胞的比例为约1:10。
在某些优选的实施方案中，所述核层包裹的细胞包括内皮细胞和未分化的细胞，且所述内皮细胞为人脐静脉内皮细胞，所述未分化的细胞为骨髓来源的间充质干细胞，所述人脐静脉内皮细胞与所述骨髓来源的间充质干细胞的比例为约1:10。任选地，所述生物砖还包括额外细胞，其中所述额外细胞的数量与内皮细胞的数量比例优选为约1:1。在某些优选的实施方案中，所述额外细胞为肝细胞。在某些优选的实施方案中，所述核层包裹的细胞包括，比例为约1:1:10的人脐静脉内皮细胞、肝细胞和骨髓来源的间充质干细胞。
在某些优选的实施方案中，所述生物砖包括：MSC细胞，包裹所述MSC细胞的核层，和，封装所述核层的壳层；优选地，所述核层和壳层各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述核层提供诱导MSC向成骨细胞或骨分化的微环境(例如，所述核层包含诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子)。在某些优选实施方案中，此类生物砖的壳层也提供诱导MSC向成骨细胞或骨分化的微环境(例如，所述壳层包含诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子)。在某些优选实施方案中，所述诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子包含地塞米松、抗坏血酸和甘油磷酸。
在某些优选的实施方案中，所述生物砖包括：MSC细胞，包裹所述MSC细胞的核层，和，封装所述核层的壳层；优选地，所述核层和壳层各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述核层提供诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的微环境(例如，所述核层包含诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子)。在某些优选实施方案中，此类生物砖的壳层也提供诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的微环境(例如，所述壳层包含诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子)。在某些优选实施方案中，所述诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子包含TGF-β3、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸、丙酮酸钠、脯氨酸和胰岛素-转铁蛋白-硒溶液。
本发明的生物砖的尺寸可以根据实际需要进行选择，而不受特别限制。球形生物砖的尺寸通常可以通过其直径来进行明确定义。在严格定义的情况下，术语“直径”不能用于描述非球形的结构。然而，在本发明中，也使用术语“直径”来描述非球形的生物砖的尺寸。在此情况下，术语“直径”表示，与非球形的生物砖具有相同体积的球形生物砖的直径。换言之，在本发明中，使用球形生物砖的直径来描述具有相同体积的非球形的生物砖的尺寸。因此，在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的尺寸(即，本文所定义的直径)可以为20-2000μm，例如30-1900μm，40-1800μm，50-1700μm，60-1600μm，70-1500μm，80-1400μm，90-1300μm，100-1200μm，200-1000μm，300-800μm，400-600μm，100-500μm。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的尺寸(即，本文所定义的直径)可以为20-30、30-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、20-50、20-100、100-200、200-400、500-600、600-800、800-1000、或1000-2000μm。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的尺寸(即，本文所定义的直径)为至少20、30、50、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、或2000μm。
本发明的生物砖的形状可以根据实际需要进行选择，而不受特别限制。例如，本发明生物砖可以是球形，或者任何期望的形状(例如立方体，矩形棱柱，六棱柱，圆柱，或不规则的形状)。例如，一些形状(例如球形，立方体，矩形棱柱，六棱柱)可用于实现生物砖在构建体中的紧密堆积。
在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖为固体或半固体。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖为凝胶态。例如，本发明的生物砖的核层和/或壳层可以为凝胶态。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包含水凝胶。在某些优选的实施方案中，所述水凝胶包含海藻酸盐，琼脂糖，明胶，壳聚糖，或其它水溶性或亲水性聚合物。
在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖以混合物的形式存在。在此类实施方案中，生物砖可以与混合物中的另一生物砖接触或融合。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖是分离的生物砖。例如，在某些实施方案中，生物砖不与其他的生物砖直接接触。在某些优选的实施方案中，本发明的分离的生物砖提供于容器中。
本发明的生物砖可使用各种方法来制备。例如，在某些优选的实施方案中，可使用用于制造微球体的方法来制备本发明的生物砖，例如使用造粒仪来进行制备。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖是在无菌条件下制备的。某些优选的实施方案中，本发明的生物砖是在GMP工作间中制备的。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖在即将使用前被制备。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖在制备后贮存于4℃，例如贮存3小时、6小时、12小时、1天、2天、或3天。
在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖能够减少细胞在生物打印过程中受到的机械损伤。例如，在某些优选的实施方案中，在使用相同生物打印机和相同打印条件的情况下，与将细胞直接用于生物打印相比，本发明的生物砖能够减少细胞受到的机械损伤至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、70％、80％、或90％。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖能够在生物打印过程中保留生物砖内的细胞的生物活性(例如，增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢)。在某些优选的实施方案中，生物砖内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印后存活至少24小时。在某些优选的实施方案中，生物砖内至少90％的细胞在生物打印后存活至少3小时、6小时、12小时、1天、2天、4天、或7天。在某些优选的实施方案中，生物砖内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印24小时后能够增殖和/或分化。在某些优选的实施方案中，生物砖内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印24小时后具有正常的新陈代谢。在某些优选的实施方案中，生物砖内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印24小时后能够迁移。在某些优选的实施方案中，生物砖内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印24小时后能够分泌。
本发明的生物砖的示意性结构示于图1A-1E中。如图1A-1E所示，本发明的生物砖包括：细胞，其能够进行生长、增殖、分化或迁移；包裹细胞的核层，其由生物可降解材料制成，并且为细胞的生命活动提供微环境，例如营养物质；和，封装核层的壳层，由生物可降解材料制成，并且为内部的核层和细胞提供力学保护。在某些优选的实施方案中，所述壳层是通透性的，具有用于生物砖内外物质交换的通道。在某些优选的实施方案中，细胞可均匀分散于核层中，或者可以聚集在一起，位于核层内部。
在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包括至少一个核层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包括至少二个核层。例如，本发明的生物砖可包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个核层。
在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的各个核层各自独立地由上文所定义的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成。换言之，在本发明的生物砖包含至少二个核层的情况下，各个核层可以独立地由相同或不同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成。例如，如果本发明的生物砖包含2个核层，那么这2个核层可以由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成，也可以由不同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成。如果本发明的生物砖包含3个核层，那么这3个核层可以由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成；或者可以由3种不同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成；或者其中的2个核层由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成，且第3个核层由另一种生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的各个核层具有不同的组成成分。
在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的各个核层各自独立地包裹细胞。换言之，在本发明的生物砖包含至少二个核层的情况下，各个核层可以独立地包裹相同或不同的细胞或细胞组合。例如，如果本发明的生物砖包含2个核层，那么这2个核层可以包裹相同的细胞或细胞组合，也可以包裹不同的细胞或细胞组合。如果本发明的生物砖包含3个核层，那么这3个核层可以包裹相同的细胞或细胞组合；或者可以包裹3种不同的细胞或细胞组合；或者其中的2个核层包裹相同的细胞或细胞组合，且第3个核层包裹另一种细胞或细胞组合。
此外，本发明生物砖的各个核层各自独立地包含一个或多个细胞，例如，本发明生物砖的各个核层各自独立地可以包含1-106个细胞，例如10-900、20-800、30-700、40-600、50-500、60-400、70-300、80-200、10-100个、10-103个、10-104个、10-105个、10-106个细胞。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的各个核层各自独立地包含至少1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、或106个细胞。
通常，用于制备核层的生物可降解材料的选择与核层包裹的细胞的选择是独立的。因此，本发明生物砖的不同核层可以：(1)由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成，且包裹相同的细胞或细胞组合；或者(2)由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成，且包裹不同的细胞或细胞组合；或者(3)由不同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成，且包裹相同的细胞或细胞组合；或者(4)由不同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成，且包裹不同的细胞或细胞组合。然而，特别优选地，根据所使用的细胞或细胞组合以及预期的目的，选择合适的生物可降解材料或生物可降解材料的组合来制备核层，以给细胞的生长、增殖、分化或迁移提供最佳的条件。
在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包括至少一个壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包括至少二个壳层。例如，本发明的生物砖可包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个壳层。
在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的各个壳层各自独立地由上文所定义的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成。换言之，在本发明的生物砖包含至少二个壳层的情况下，各个壳层可以独立地由相同或不同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成。例如，如果本发明的生物砖包含2个壳层，那么这2个壳层可以由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成，也可以由不同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成。如果本发明的生物砖包含3个壳层，那么这3个壳层可以由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成；或者可以由3种不同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成；或者其中的2个壳层由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成，且第3个壳层由另一种生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的各个壳层具有不同的组成成分。
在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的各个壳层各自任选地经过处理(例如使用壳层固定液进行处理，例如，以改善壳层的力学性能)。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的各个壳层均经过处理。在某些优选的实施方案中，位于本发明生物砖最外侧的壳层经过处理。
本发明生物砖中的核层和壳层的数量和排布方式不受特别的限制。然而，特别优选地，生物砖的最外侧包含至少一个壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包括一个核层和一个壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包括一个核层和2个或更多个壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包括2个或更多个核层和一个壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包括至少2个核层和至少2个壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖由内到外依次包括，核层、第一壳层、和第二壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖由内到外依次包括，第一核层、第二核层、和壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖由内到外依次包括，第一核层、第二核层、第一壳层、和第二壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖由内到外依次包括，第一核层、第一壳层、第二核层、和第二壳层。本说明书的图1A-1E示意性描述了本发明生物砖的多种结构。
在另一个方面，本发明提供了多种分离的生物砖。在某些优选的实施方案中，本发明提供了多种分离的生物砖，其中所述生物砖是彼此分离的。在某些优选的实施方案中，本发明提供了多种分离的生物砖，并且其中至少两种分离的生物砖是不同的。在某些优选的实施方案中，每种分离的生物砖各自包含不同的试剂或试剂组合，所述试剂或试剂组合促进细胞增殖、分化、迁移、新陈代谢、分泌或其任何组合。在某些优选的实施方案中，每种分离的生物砖各自包含至少一种干细胞。在某些优选的实施方案中，每种分离的生物砖各自包含不同类型的干细胞。在某些优选的实施方案中，多种分离的生物砖各自包含相同的干细胞。在某些优选的实施方案中，所述多种分离的生物砖各自包含在不同的容器中。在某些优选的实施方案中，所述多种分离的生物砖提供于单个容器中。合适的容器包括但不限于，皿(例如组织培养皿或细胞培养皿)，瓶，管(例如试管，离心管，微量离心管等)，多孔板的孔等。
在另一个方面，本发明提供了包含多种分离的生物砖的容器。在某些优选的实施方案中，所述容器还包含液体或半液体组合物。在某些优选的实施方案中，所述液体或半液体组合物包含无机盐，培养基，缓冲剂，或用于培养所述生物砖或使用所述生物砖来进行实验的其他组分。在某些优选的实施方案中，所述液体或半液体组合物包含能够促进细胞增殖、分化、迁移、新陈代谢、分泌或信号传导的试剂或试剂组合。在某些优选的实施方案中，所述液体或半液体组合物包含促进生物砖分离的化合物(例如表面活性剂)。在某些优选的实施方案中，所述液体或半液体组合物包含稳定剂或防腐剂。在某些优选的实施方案中，所述生物砖分散于所述液体或半液体组合物中。
在某些优选的实施方案中，所述容器包含至少两种不同的分离的生物砖。不同的生物砖可在下述的一个或多个方面存在差异：生物砖的尺寸；生物砖的形状；所包含的细胞数目；所包含的细胞的类型；核层的组成(包括组分的类型和含量)；壳层的组成(包括组分的类型和含量)；核层和/或壳层中包含的额外试剂(包括类型和含量)；和/或，上文论述的任何其他参数。在某些优选的实施方案中，每种分离的生物砖各自包含不同的试剂或试剂组合，所述试剂或试剂组合促进细胞增殖、分化、迁移、新陈代谢、分泌或其任何组合。在某些优选的实施方案中，每种分离的生物砖各自包含至少一种干细胞。在某些优选的实施方案中，每种分离的生物砖各自包含不同类型的干细胞。在某些优选的实施方案中，所述多种分离的生物砖各自包含相同的干细胞。在某些优选的实施方案中，所述多种分离的生物砖各自包含在不同的容器中。在某些优选的实施方案中，所述多种分离的生物砖提供于单个容器中。在某些优选的实施方案中，所述容器选自但不限于，皿(例如组织培养皿或细胞培养皿)，瓶，管(例如试管，离心管，微量离心管等)，多孔板的孔等。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的生物砖。在某些优选的实施方案中，本发明的组合物包含生物砖和载体(所述载体优选包含生物粘合剂)。特别优选地，此类组合物可用作生物墨汁，用于生物打印。因此，在某些优选的实施方案中，本发明提供了一种生物墨汁，其包含本发明的生物砖，以及任选的载体(所述载体优选包含生物粘合剂)。在某些优选的实施方案中，所述载体包含生物粘合剂，或者由生物粘合剂组成。在某些优选实施方案中，本发明的生物墨汁用于生物打印。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)及其降解产物对于细胞是无毒的，和/或对于宿主是非免疫原性的。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)包含生物可降解材料。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料是生物相容性的。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料的降解能够提供维持或促进生物砖内的细胞的生命活动的微环境，例如营养物质。在某些优选的实施方案中，降解产物为小分子化合物，例如有机酸、单糖(例如葡萄糖)、寡糖、氨基酸、脂质等。此类降解产物可参与到细胞的新陈代谢活动中(例如用于合成细胞外基质)，用于合成细胞外基质或转化为活动所需的能量。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料是天然存在的(例如来源于动植物的天然存在的生物可降解材料，例如胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，琼脂糖，明胶，葡聚糖，以及其任意组合)，人工合成的，重组产生的，经过改性的，或者其任何组合。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料是天然存在的可降解聚合物。优选地，所述可降解聚合物选自胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，明胶，葡聚糖，弹性蛋白，以及其任意组合。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料是经过改性的可降解聚合物，例如经过改性的海藻酸盐，例如氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料是合成的可降解聚合物。此类可降解聚合物包括但不限于，聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己内酯(PCL)，聚羟基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(例如聚赖氨酸)，可降解性聚氨酯，以及其任何组合。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料选自胶原、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)、氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)、淀粉、透明质酸、层粘连蛋白、弹性蛋白、明胶、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、琼脂糖、葡聚糖、甲基纤维素、氧化海藻酸盐、聚乙烯醇、聚丙烯酸及其衍生物(例如聚丙烯酸或其酯、聚甲基丙烯酸或其酯)、聚丙烯酰胺、聚N-取代丙烯酰胺或其任何组合。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)包含海藻酸钠。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)在载体中的重量比为约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)在载体中的重量比为10:1-9:1、9:1-8:1、8:1-7:1、7:1-6:1、6:1-5:1、5:1-4:1、4:1-3:1、3:1-2:1、2:1-1:1、1:1-1:2、1:2-1:3、1:3-1:4、1:4-1:5、1:5-1:6、1:6-1:7、1:7-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、10:1-5:1、5:1-1:1、1:1-1:5、1:5-1:10、2:1-1:2、4:1-1:4、或10:1-1:10。
在某些优选的实施方案中，与生物砖的核层或壳层相比，所述载体(例如生物粘合剂)以不同的浓度包含相同的生物可降解材料，或者以不同的重量比包含相同的生物可降解材料的组合。在某些优选的实施方案中，与生物砖的核层或壳层相比，所述载体(例如生物粘合剂)包含不同的生物可降解材料。
在某些优选的实施方案中，所述载体还包含水，无机盐，pH缓冲剂，稳定剂，防腐剂，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)促进生物砖在构建体(例如三维构建体，组织前体，或组织)上的安置，和/或将生物砖固定在构建体(例如三维构建体，组织前体，或组织)上。
在某些优选的实施方案中，载体(例如生物粘合剂)为液体或半液体(例如凝胶)。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)的粘度为1-1000Pas，例如30-160Pas。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)的粘度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、50、80、100、200、300、400、500、800、或1000Pas。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)的粘度为1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-12、12-14、14-16、16-18、18-20、20-25、25-30、30-50、50-80、80-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-800、或800-1000、1-3、3-8、8-16、3-10、10-20、20-50、50-160Pas、或30-160Pas。
在某些优选的实施方案中，所述组合物(例如生物墨汁)由或者基本上由本发明的生物砖组成。在某些优选的实施方案中，所述组合物(例如生物墨汁)包含至少约50％的生物砖(按重量计，w/w)。在某些优选的实施方案中，所述组合物(例如生物墨汁)包含至少约10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％的生物砖(w/w)。在某些优选的实施方案中，所述组合物(例如生物墨汁)包含10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-100％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-100％、50％-75％、75％-100％、或50％-100％的生物砖(w/w)。在某些优选的实施方案中，除了生物砖中包含的液体之外，所述组合物(例如生物墨汁)基本上不含液体，例如具有少于约1％、2.5％、5％、7.5％、或10％的液体。
在某些优选的实施方案中，所述组合物(例如生物墨汁)包含一种或多种生物砖。在某些优选的实施方案中，所述组合物(例如生物墨汁)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10种生物砖。不同类型的生物砖可在下述的一个或多个方面存在差异：生物砖的尺寸；生物砖的形状；所包含的细胞数目；所包含的细胞的类型；核层的组成(包括组分的类型和含量)；壳层的组成(包括组分的类型和含量)；核层和/或壳层中包含的额外试剂(包括类型和含量)；和/或，上文论述的任何其他参数。
在某些优选的实施方案中，所述组合物(例如生物墨汁)中的生物砖的平均尺寸(即，本文所定义的直径)为约20、30、50、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、或2000μm。在某些优选的实施方案中，所述组合物(例如生物墨汁)中的生物砖的平均尺寸为20-30、30-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、20-50、20-100、100-200、200-400、500-600、600-800、800-1000、1000-2000、20-100、100-500、500-1000、300-800、30-50、30-200、30-500、30-1000、30-2000、或20-2000μm。在某些优选的实施方案中，所述组合物(例如生物墨汁)中的生物砖的尺寸的变异程度小于生物砖的平均尺寸的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、或35％。在某些优选的实施方案中，所述组合物(例如生物墨汁)中的生物砖所包含的细胞的平均数目为至少1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、或106个细胞。在某些优选的实施方案中，所述组合物(例如生物墨汁)中的生物砖所包含的细胞的平均数目为1-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-104、104-2x104、2x104-3x104、3x104-4x104、4x104-5x104、5x104-105、105-2x105、2x105-3x105、3x105-4x105、4x105-5x105、5x105-106、1-10、2-10、2-5、5-10、10-20、20-30、30-50、2-25、25-50、2-50、50-100、100-200、50-250、250-500、500-2000、2-100、2-500、2-2000个细胞。在某些优选的实施方案中，在本发明的组合物(例如生物墨汁)中，相同类型的生物砖之间细胞数目的变异程度小于相同类型的生物砖的平均细胞数目的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、或35％。
在某些优选的实施方案中，通过将多种生物砖混合而制备本发明的组合物(例如生物墨汁)。在某些优选的实施方案中，通过将一种或多种生物砖与上文论述的载体(例如生物粘合剂)混合而制备本发明的组合物(例如生物墨汁)。在某些优选的实施方案中，本发明的组合物(例如生物墨汁)是在无菌条件下制备的。在某些优选的实施方案中，本发明的组合物(例如生物墨汁)是在GMP工作间中制备的。在某些优选的实施方案中，本发明的组合物(例如生物墨汁)在即将使用前被制备。在某些优选的实施方案中，本发明的组合物(例如生物墨汁)在制备后贮存于4℃，例如贮存3小时、6小时、12小时、1天、2天、或3天。在某些优选的实施方案中，本发明的组合物(例如生物墨汁)用于生物打印构建体(例如三维构建体，组织前体，组织)。在某些优选的实施方案中，本发明的组合物(例如生物墨汁)与其他生物相容性材料，墨汁或组合物一起用于生物打印。
如上文所描述的，本发明生物砖的壳层是通透性的。因此，在某些优选的实施方案中，载体(例如生物粘合剂)可包含额外的试剂，例如，营养物质、细胞外基质、细胞因子和/或药物活性成分。优选地，所述额外的试剂能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)包含至少一种(例如1、2、3、4、5或更多种)能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的额外的试剂。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)能够以受控的方式释放所述额外的试剂。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)可包括，维持或促进细胞的生命活动的营养物质(包括但不限于，核苷酸，氨基酸，多肽，碳水化合物(例如单糖，寡糖，多糖)，脂质，维生素，细胞培养基等等)。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)可包括，改善或调控细胞的生命活动的物质，例如细胞因子，细胞外基质，抗凋亡剂，抗氧化剂，药物活性成分，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，细胞外基质选自多糖，例如糖胺聚糖、蛋白聚糖；结构蛋白，例如胶原和弹性蛋白；粘着蛋白，例如纤粘连蛋白和层粘连蛋白。
在某些优选的实施方案中，所述细胞因子可以是用于调控细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的细胞因子，包括但不限于：
-与细胞生长相关的细胞因子，例如胰岛素、类胰岛素生长因子(如IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、转化生长因子(如TGFα和TGFβ)、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤细胞生长因子、血小板来源生长因子、骨肉瘤来源生长因子、生长激素释放抑制因子、神经生长因子、白细胞介素(如IL-1、IL-11、IL-3)、红细胞生长素、集落刺激因子、皮质醇、甲状腺素，或其任何组合；
-与细胞分化相关的细胞因子，例如Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc，GATA4，TSP1，β-甘油磷酸钠，地塞米松，维生素C，胰岛素，IBMX，吲哚美锌，血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)，5-氮杂胞苷，或其任何组合；
-与细胞迁移相关的细胞因子，例如环磷酸腺苷，三磷酸磷脂酰肌醇，基质细胞衍生因子-1、N-钙粘蛋白，核因子κB，骨连接素，血栓素A2，Ras，或其任何组合；和/或
-与细胞新陈代谢相关的细胞因子，例如胰岛素生长因子1、TRIP-Br2、DKK-1、sRANKL、OPG、TRACP-5b、ALP、SIRT1(2-7)、PGC-1α，PGC-1β、OPG、IL-3、IL-4、IL-6、TGF-β、PGE2、G-CSF、TNF-α，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，所述药物活性成分为能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的试剂。在某些优选的实施方案中，所述药物活性成分选自rhIL-2、rhIL-11、rhEPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、rHuEPO、sTNF-R1、和rhTNF-α。
在某些优选的实施方案中，本发明的组合物(例如生物墨汁)包含，上文所描述的含有内皮细胞的生物砖。
在某些优选的实施方案中，本发明的组合物(例如生物墨汁)包含，上文所描述的含有MSC细胞和诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子的生物砖。优选地，在此类组合物中，所述载体(例如生物粘合剂)也包含诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子。
在某些优选的实施方案中，本发明的组合物(例如生物墨汁)包含，上文所描述的含有MSC细胞和诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子的生物砖。优选地，在此类组合物中，所述载体(例如生物粘合剂)也包含诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子。
本发明的组合物(例如生物墨汁)可以包含一种类型的生物砖(其也被称为均质或单型墨汁)，或者可以包含超过一种类型的生物砖(其也被称为异质或多型墨汁)。在某些优选的实施方案中，本发明的生物墨汁包含至少约10％(w/w)、至少约20％(w/w)、至少约30％(w/w)、至少约40％(w/w)、至少约50％(w/w)、至少约60％(w/w)、至少约70％(w/w)、至少约80％(w/w)、至少约90％(w/w)的生物砖。在某些优选的实施方案中，本发明的生物墨汁包含10％-90％(w/w)，20％-80％(w/w)，30％-70％(w/w)，40％-60％(w/w)，例如约50％的生物砖。
在某些优选的实施方案中，本发明的组合物(例如生物墨汁)为液体，半固体(例如凝胶)或固体组合物，例如溶液，悬浮液，凝胶，或浓缩物。在某些优选的实施方案中，本发明的载体(例如生物粘合剂)和/或组合物(例如生物墨汁)的粘度为1-1000Pas，例如30-160Pas，例如40-120Pas，50-150Pas，80-100Pas。在某些优选的实施方案中，本发明的组合物(例如生物墨汁)是可挤出的组合物。由此，本发明的组合物(例如生物墨汁)能够被用于生物打印，以产生特定的平面和/或层状几何形状；并且优选地，所产生的平面和/或层状几何形状能够进一步堆叠，从而形成具有特定形状和结构的构建体(例如三维构建体)。因此，本发明的组合物(例如生物墨汁)可用于形成构建体(例如三维构建体，组织前体，组织或器官)。
本发明的生物砖可使用各种方法来制备。例如，在某些优选的实施方案中，可使用用于制造微球体的方法来制备本发明的生物砖，例如使用制备微球体的仪器，例如造粒仪来进行制备。
因此，在另一个方面，本发明提供了用于制备本发明的生物砖的方法，其包括下述步骤：
(1)提供一种或多种核层材料，所述核层材料各自独立地由生物可降解材料制成，并且各自独立地包裹相同或不同的细胞或细胞组合；
(2)提供一种或多种壳层材料，所述壳层材料各自独立地由生物可降解材料制成；
(3)从步骤(1)所述的一种或多种核层材料中选择一种核层材料，并将其颗粒化，从而获得第一核层；
(4)任选地，使用来自步骤(1)的一种核层材料或使用来自步骤(2)的一种壳层材料对前一步骤获得的产物进行包被；
(5)任选地，重复步骤(4)一次或数次；
(6)使用来自步骤(2)的一种壳层材料对前一步骤的产物进行包被，从而产生所述生物砖。
在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，将细胞、用于形成核层的生物可降解材料和任选的期望的额外试剂(例如，营养物质、细胞外基质、细胞因子和/或药物活性成分)均匀混合，从而获得核层材料。
在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，至少一种壳层材料包含氧化的海藻酸盐，并且，步骤(4)-(6)使用的壳层材料中的至少一种包含氧化的海藻酸盐。
在某些优选的实施方案中，步骤(2)所述的壳层材料不包含细胞。
在某些优选的实施方案中，在步骤(3)-(6)中，使用制备微球体的仪器，例如造粒仪来进行颗粒化和包被。
在某些优选的实施方案中，在每一次进行步骤(4)之后，如果所获得的产物的最外层包被为壳层材料，则任选地进行下述步骤：对最外层包被进行处理(例如使用壳层固定液进行处理，例如，以改善壳层的力学性能)。
在某些优选的实施方案中，在步骤(6)之后，对所获得的生物砖的最外侧壳层进行处理(例如使用壳层固定液进行处理，例如，以改善壳层的力学性能)。
在某些优选的实施方案中，在步骤(6)中，使用来自步骤(2)的包含氧化的海藻酸盐的壳层材料对前一步骤的产物进行包被。在某些优选的实施方案中，在步骤(4)-(6)中，仅步骤(6)使用的壳层材料包含氧化的海藻酸盐。
在某些优选的实施方案中，所述方法在无菌条件下进行。在某些优选的实施方案中，所述方法在GMP工作间里进行。在某些优选的实施方案中，在即将使用前，利用本发明方法制备生物砖。在某些优选的实施方案中，所述方法在步骤(6)之后，将获得的生物砖贮存于4℃，例如贮存3小时、6小时、12小时、1天、2天、或3天。
在某些优选的实施方案中，所述核层材料能够为细胞的生命活动提供微环境(例如，营养物质)。在某些优选的实施方案中，所述核层材料各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述生物可降解材料是生物相容性的。在某些优选的实施方案中，用于制备核层材料的生物可降解材料是天然存在的(例如来源于动植物的天然存在的生物可降解材料)，人工合成的，重组产生的，经过改性的，或者其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层材料的所述生物可降解材料包含：
天然存在的可降解聚合物，例如胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐(例如海藻酸钠)，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，琼脂糖，明胶，葡聚糖，以及其任意组合；和/或，
经过改性的可降解聚合物，例如经过改性的海藻酸盐，例如氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)；和/或，
合成的可降解聚合物，例如聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己内酯(PCL)，聚羟基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(例如聚赖氨酸)，可降解性聚氨酯，以及其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层材料的所述生物可降解材料能够被酶(例如细胞分泌的酶)所降解。在某些优选的实施方案中，用于制备核层材料的所述生物可降解材料在不超过2个月的时间内降解，例如在不超过1个月的时间内降解，例如在不超过30天、不超过25天、不超过20天、不超过15天、不超过10天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天、或不超过1天的时间内降解。例如，用于制备核层材料的所述生物可降解材料可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，25-30天，或30-60天的时间内降解。在某些优选的实施方案中，所述核层材料的降解能够提供维持或促进所述细胞的生命活动的营养物质。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层材料的所述生物可降解材料含有细胞外基质或其类似物(例如胶原蛋白)。细胞外基质或其类似物(例如胶原蛋白)的使用能够为生物砖内的细胞的生命活动(特别是细胞的生长、粘附、伸展，以及细胞间连接的建立)提供类似于体内的有利的微环境，从而是优选的。例如，在某些优选的实施方案中，用于制备核层材料的生物可降解材料为I型胶原或者含有I型胶原。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层材料的所述生物可降解材料选自胶原蛋白(例如I型，II型，III型胶原蛋白)、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠)、氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)、淀粉、透明质酸，层粘连蛋白，弹性蛋白，明胶、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、葡聚糖、琼脂糖、可降解性聚氨酯，或其任何组合。优选地，所述核层材料包含I型胶原蛋白和/或海藻酸盐，例如包含I型胶原蛋白和/或海藻酸钠；或者，包含层粘连蛋白；或者，包含淀粉；或者，包含可降解性聚氨酯；或者，包含海藻酸盐(例如海藻酸钠)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)。在某些优选的实施方案中，所述核层材料为凝胶状。
在某些优选的实施方案中，所述壳层材料能够为核层材料包裹的细胞提供力学保护。在某些优选的实施方案中，所述壳层材料各自独立地具有0.01-0.4GPa的硬度，例如0.01-0.02、0.02-0.03、0.03-0.04、0.04-0.05、0.05-0.06、0.06-0.07、0.07-0.08、0.08-0.09、0.09-0.1、0.1-0.15、0.15-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.01-0.4、0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.4、0.05-0.15、或0.06-0.1GPa的硬度；和/或，具有0.01-100MPa的弹性模量，例如0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.5-0.8、0.8-1、1-1.2、1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2、2-2.4、2.4-2.8、2.8-3.2、3.2-4、4-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-80、80-100、0.5-4、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-3、0.8-1.6、1.4-2.4、0.8-3.2、0.01-100、1-100、10-100、或0.5-50MPa的弹性模量。
在某些优选的实施方案中，所述壳层材料能够为细胞的生命活动提供微环境，例如营养物质。在某些优选的实施方案中，所述壳层材料各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述生物可降解材料是生物相容性的。在某些优选的实施方案中，不同的壳层材料的组成成分不同。在某些优选的实施方案中，用于制备壳层材料的生物可降解材料是天然存在的(例如来源于动植物的天然存在的生物可降解材料)，人工合成的，重组产生的，经过改性的，或者其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层材料的所述生物可降解材料包含：
天然存在的可降解聚合物，例如胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，琼脂糖，明胶，葡聚糖，以及其任意组合；和/或，
经过改性的可降解聚合物，例如经过改性的海藻酸盐，例如氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)；和/或，
合成的可降解聚合物，例如聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己内酯(PCL)，聚羟基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(例如聚赖氨酸)，可降解性聚氨酯，以及其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层材料的所述生物可降解材料能够被酶(例如细胞分泌的酶)所降解。在某些优选的实施方案中，用于制备壳层材料的所述生物可降解材料在不超过1个月的时间内降解，例如在不超过30天、不超过25天、不超过20天、不超过15天、不超过10天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天、或不超过1天的时间内降解。例如，用于制备壳层材料的所述生物可降解材料可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，或25-30天的时间内降解。特别优选地，用于制备壳层材料的所述生物可降解材料在不超过10天的时间内降解。在某些优选的实施方案中，所述壳层材料的降解能够提供维持或促进所述细胞的生命活动的营养物质。在某些优选的实施方案中，用于制备壳层材料的所述生物可降解材料含有细胞外基质或其类似物(例如弹性蛋白)。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层材料的所述生物可降解材料选自胶原蛋白(例如I型，II型，III型胶原蛋白)、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)、氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)、淀粉、透明质酸，层粘连蛋白，弹性蛋白，明胶、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、葡聚糖、琼脂糖，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，所述壳层材料包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)，例如包含海藻酸钙和明胶，任选地还包含弹性蛋白；或者，包含氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)；或者，包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)；或者，包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和琼脂糖。
在某些优选的实施方案中，所述壳层材料各自独立地为通透性的；例如，所述壳层材料对于水，氧气，和营养物质(糖类例如葡萄糖，脂肪，蛋白质，氨基酸，短肽，矿物质，维生素、细胞因子、核苷酸)是通透性的。在某些优选的实施方案中，所述壳层材料对于分子量在5000kDa以下的分子是通透的。例如，在某些实施方案中，所述壳层材料对于分子量在200kDa以下或分子量在200kDa-300kDa、300kDa-400kDa、400kDa-500kDa、500kDa-800kDa、800kDa-1000kDa、1000kDa-1500kDa、1500kDa-2000kDa、2000kDa-3000kDa、3000kDa-4000kDa或4000kDa-5000kDa范围内的分子是通透的。在某些实施方案中，所述壳层材料对于免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE)是通透的。
在某些优选的实施方案中，所获得的生物砖包括：细胞，包裹细胞的核层，和，封装核层的壳层。在某些优选的实施方案中，所获得的生物砖包括至少一个核层，例如1个、2个、3个、4个、5个或更多个核层。优选地，所获得的生物砖包括至少2个核层。在某些优选的实施方案中，所获得的生物砖包括至少一个壳层，例如1个、2个、3个、4个、5个或更多个壳层。优选地，所获得的生物砖包括至少2个壳层。
在某些优选的实施方案中，所获得的生物砖包括：一个核层和一个壳层；或者，一个核层和2个或更多个壳层；或者，2个或更多个核层和一个壳层；或者，至少2个核层和至少2个壳层。例如，在某些优选的实施方案中，所获得的生物砖由内到外依次包括：核层和壳层；或者，核层、第一壳层、和第二壳层；或者，第一核层、第二核层、和壳层；或者，第一核层、第二核层、第一壳层、和第二壳层；或者，第一核层、第一壳层、第二核层、和第二壳层。
在某些优选的实施方案中，所获得的生物砖具有一定的力学强度，从而能够实现立体堆积。在某些优选的实施方案中，所获得的生物砖具有0.01-0.4GPa的硬度，例如0.01-0.02、0.02-0.03、0.03-0.04、0.04-0.05、0.05-0.06、0.06-0.07、0.07-0.08、0.08-0.09、0.09-0.1、0.1-0.15、0.15-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.01-0.4、0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.4、0.05-0.15、或0.06-0.1GPa的硬度；和/或，具有0.01-100MPa的弹性模量，例如0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.5-0.8、0.8-1、1-1.2、1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2、2-2.4、2.4-2.8、2.8-3.2、3.2-4、4-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-80、80-100、0.5-4、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-3、0.8-1.6、1.4-2.4、0.8-3.2、0.01-100、1-100、10-100、或0.5-50MPa的弹性模量。
在某些优选的实施方案中，所获得的生物砖的壳层各自独立地具有用于生物砖内外物质交换的通道或孔。优选地，所述通道的直径为至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、或500nm。优选地，所述孔的直径为至少100、200、400、600、800、1000、1500、2000、4000、或5000nm。
在某些优选的实施方案中，所获得的生物砖的壳层的厚度各自独立地为0.1-50μm，例如0.1-0.5、0.5-1、1-2、2-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、0.1-1、1-5、1-10、5-10、10-20、10-30、5-20、或1-20μm。
在某些优选的实施方案中，所述核层材料和/或壳层材料各自独立地还包含额外的试剂，例如，营养物质、细胞外基质、细胞因子和/或药物活性成分。在某些优选的实施方案中，所述额外的试剂能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢。
在某些优选的实施方案中，所述营养物质包括但不限于，核苷酸，氨基酸，多肽，碳水化合物(例如单糖，寡糖，多糖)，脂质，维生素。
在某些优选的实施方案中，所述细胞外基质选自多糖，例如糖胺聚糖、蛋白聚糖；结构蛋白，例如胶原和弹性蛋白；粘着蛋白，例如纤粘连蛋白和层粘连蛋白。
在某些优选的实施方案中，所述细胞因子可以是用于调控细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的细胞因子，包括但不限于：
-与细胞生长相关的细胞因子，例如胰岛素、类胰岛素生长因子(如IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、转化生长因子(如TGFα和TGFβ)、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤细胞生长因子、血小板来源生长因子、骨肉瘤来源生长因子、生长激素释放抑制因子、神经生长因子、白细胞介素(如IL-1、IL-1、IL-3)、红细胞生长素、集落刺激因子、皮质醇、甲状腺素，或其任何组合；
-与细胞分化相关的细胞因子，例如Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc，GATA4，TSP1，β-甘油磷酸钠，地塞米松，维生素C，胰岛素，IBMX，吲哚美锌，血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)，5-氮杂胞苷，或其任何组合；
-与细胞迁移相关的细胞因子，例如环磷酸腺苷，三磷酸磷脂酰肌醇，基质细胞衍生因子-1、N-钙粘蛋白，核因子κB，骨连接素，血栓素A2，Ras，或其任何组合；和/或
-与细胞新陈代谢相关的细胞因子，例如胰岛素生长因子1、TRIP-Br2、DKK-1、sRANKL、OPG、TRACP-5b、ALP、SIRT1(2-7)、PGC-1α，PGC-1β、OPG、IL-3、IL-4、IL-6、TGF-β、PGE2、G-CSF、TNF-α，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，所述药物活性成分为能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的试剂。优选地，所述药物活性成分选自rhIL-2、rhIL-11、rhEPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、rHuEPO、sTNF-R1、和rhTNF-α。
在某些优选的实施方案中，所获得的生物砖的核层各自独立地包含一个或多个细胞，例如，1-106个细胞，例如10-900、20-800、30-700、40-600、50-500、60-400、70-300、80-200、10-100个、10-103个、10-104个、10-105个、10-106个细胞。在某些优选的实施方案中，所述细胞为细菌、酵母、植物细胞或动物细胞，例如哺乳动物细胞，优选人细胞；优选地，所述细胞为粘附细胞，例如分化的粘附细胞或未分化的粘附细胞；优选地，所述细胞为多能干细胞。在某些优选的实施方案中，所述细胞来源于选自下述的组织：结缔组织(例如，疏松结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、网状结缔组织和脂肪组织)、肌肉组织(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、神经组织和上皮组织(例如，单层上皮和复层上皮)、内胚层来源的组织、中胚层来源的组织和外胚层来源的组织。在某些优选的实施方案中，所述细胞选自肌肉细胞(例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成肌细胞)、结缔组织细胞(例如，骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞以及分化为成骨细胞、软骨细胞或淋巴组织的细胞)、骨髓细胞、内皮细胞、皮肤细胞、上皮细胞、乳腺细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、神经细胞、许旺细胞、胃肠细胞、肝细胞、胰细胞、肺细胞、气管细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、肾细胞、脂肪细胞、实质细胞、周细胞、间皮细胞、基质细胞、未分化的细胞(如干细胞和祖细胞)、内胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、癌来源的细胞，细胞系、诱导的多能干细胞(iPS)、或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，至少一种核层材料包括内皮细胞(例如脐静脉内皮细胞)；任选地，还包括未分化的细胞(例如干细胞、祖细胞或其组合；例如MSC细胞)，和/或，额外细胞(例如肝细胞)。
在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，至少一种核层材料包括MSC细胞，并且，所述核层材料包含诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子(例如，包含地塞米松、抗坏血酸和甘油磷酸)，或诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子(例如，包含TGF-β3、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸、丙酮酸钠、脯氨酸和胰岛素-转铁蛋白-硒溶液)。进一步优选地，在步骤(2)中，至少一种壳层材料还包含诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子(例如，包含地塞米松、抗坏血酸和甘油磷酸)，或诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子(例如，包含TGF-β3、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸、丙酮酸钠、脯氨酸和胰岛素-转铁蛋白-硒溶液)。
在某些优选的实施方案中，所获得的生物砖的尺寸为20-2000μm，例如30-1900μm，40-1800μm，50-1700μm，60-1600μm，70-1500μm，80-1400μm，90-1300μm，100-1200μm，200-1000μm，300-800μm，400-600μm，100-500μm。
在某些优选的实施方案中，所获得的生物砖为球形，或者任何期望的形状(例如立方体，矩形棱柱，六棱柱，圆柱，或不规则的形状)。在某些优选的实施方案中，所获得的生物砖为固体或半固体，例如凝胶态。在某些优选的实施方案中，所获得的生物砖以混合物的形式存在。在某些优选的实施方案中，所获得的所述生物砖是分离的生物砖。在某些优选的实施方案中，所获得的生物砖提供于容器中。
在某些优选的实施方案中，所获得的生物砖具有如上文所描述的本发明生物砖的任一个或多个技术特征。
在另一个方面，本发明提供了制备本发明生物砖的方法，其包括下述步骤：
(1)将细胞与用于形成核层的生物可降解材料混合，以提供包裹细胞的核层材料；和
(2)将核层材料颗粒化，并使用用于形成壳层的生物可降解材料进行包被，从而制备所述生物砖。
在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，将细胞、用于形成核层的生物可降解材料和任选的期望的额外试剂(例如，营养物质、细胞外基质、细胞因子和/或药物活性成分)均匀混合。
在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，所述用于形成壳层的生物可降解材料包含氧化的海藻酸盐。
在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，使用制备微球体或的仪器，例如造粒仪来进行颗粒化和包被。
在某些优选的实施方案中，所述方法在步骤(2)之后还包括下述步骤：处理生物砖的壳层(例如使用壳层固定液，例如，以改善壳层的力学保护性能)。
在某些优选的实施方案中，本发明的方法在无菌条件下进行。在某些优选的实施方案中，本发明的方法在GMP工作间里进行。在某些优选的实施方案中，在即将使用前，利用本发明方法制备生物砖。在某些优选的实施方案中，在步骤(2)之后，将获得的生物砖贮存于4℃，例如贮存3小时、6小时、12小时、1天、2天、或3天。
在另一个方面，本发明提供了通过上述方法获得的生物砖。
在另一个方面，本发明提供了制备本发明的组合物(例如生物墨汁)的方法，其包括下述步骤：将本发明的生物砖与载体(例如生物粘合剂)混合。在某些优选的实施方案中，所述组合物(例如生物墨汁)和/或载体(例如生物粘合剂)具有如上所定义的任何一项或多项技术特征。
在另一个方面，本发明提供了一种构建体，其包含本发明的生物砖或者使用本发明的生物砖或生物墨汁而制备。在某些优选的实施方案中，所述构建体是三维构建体，组织前体，组织或器官。在某些优选的实施方案中，所述构建体是活的构建体。
在某些优选的实施方案中，所述构建体是骨组织、软骨组织、关节组织、或包含骨和软骨的复合结构。对于此类构建体而言，其可包含，上文所描述的含有MSC细胞和诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子的生物砖，和/或，上文所描述的含有MSC细胞和诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子的生物砖。此类构建体可通过使用上文所描述的含有MSC细胞和诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子的生物砖，和/或，上文所描述的含有MSC细胞和诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子的生物砖而制备。
在某些优选的实施方案中，所述构建体是肝脏组织、或包含微血管的构建体。对于此类构建体而言，其可包含，上文所描述的含有内皮细胞的生物砖。类似地，此类构建体可通过使用上文所描述的含有内皮细胞的生物砖而制备。例如，可使用含有脐静脉内皮细胞、肝脏细胞和干细胞的生物砖来制备肝脏组织。或者，可使用含有脐静脉内皮细胞和间充质干细胞的生物砖来制备包含微血管的构建体。
在某些优选的实施方案中，所述构建体包含多个生物砖。在某些优选的实施方案中，所述生物砖以预定的模式排布。在某些优选的实施方案中，所述预定的模式基于天然组织或器官的结构和细胞分布模式。在某些优选的实施方案中，所述构建体包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10种生物砖。在某些优选的实施方案中，所述生物砖包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10种不同的细胞类型。在某些优选的实施方案中，所述构建体(例如三维构建体，组织前体，组织或器官)的尺寸为至少30μm、50μm、100μm、200μm、500μm、1mm、2mm、5mm、1cm、2cm、5cm、10cm、20cm、或50cm。在某些优选的实施方案中，所述构建体被进一步培养以产生器官(例如心，肝，肾)或其功能单位。
在某些优选的实施方案中，所述构建体是通过生物打印而制备的。在某些优选的实施方案中，所述构建体的至少一个部分是生物打印的。生物打印的构建体一般通过使用快速原型技术的方法得到。快速原型技术是基于通过三维递送装置(例如生物打印机)将细胞/生物砖/生物墨汁和任选的限制材料向生物相容性表面(例如由水凝胶和/或多孔膜组成的生物相容性表面)上进行三维、自动化、计算机辅助的沉积。如本文中使用的，在用于指代组织和/或器官时，术语“工程化的”是指：根据计算机脚本，通过计算机辅助的装置(例如生物打印机)，将细胞、细胞溶液、细胞悬浮液、包含细胞的凝胶或浆料、细胞浓缩物、多细胞聚集体、生物砖和它们的层放置以形成三维结构。在进一步的实施方案中，计算机脚本例如是一个或多个计算机程序、计算机应用或计算机模块。在更进一步的实施方案，通过细胞、多细胞体或生物砖的打印后融合来形成三维组织结构。
尽管有许多方法可以用来将细胞、多细胞聚集体、生物砖和/或它们的层布置在生物相容性表面上以产生三维结构(例如手动放置)，但通过自动化的、计算机辅助的机器(例如生物打印机)来放置是有利的。采用生物打印机来递送细胞、多细胞体、生物砖是有利的，其优点包括：快速、精确和可再现地放置细胞、多细胞体、生物砖以产生构建体，该构建体表现出具有各种组成的细胞、多细胞聚集体、生物砖和/或它们的层的计划的或预先确定的取向或图案。
在一些实施方案中，生物打印方法是连续的和/或基本连续的。连续生物打印方法的非限制性实例是：经由连接到生物墨汁储存器的分配末端(例如，注射器、毛细管等)从生物打印机分配生物墨汁(例如与生物粘合剂或挤出化合物组合的生物砖)。在进一步的非限制性实施方案中，连续生物打印方法是按功能单元的重复图案分配生物墨汁。在各个实施方案中，重复功能单元具有任何适宜的几何形状，包括例如：圆形、正方形、矩形、三角形、多边形和不规则的几何形状，从而产生具有通过独特生物墨汁和/或间隙空间的空间图案化而获得的平面几何形状的一个或多个组织层。在进一步的实施方案中，生物打印的功能单元的一个重复图案包括一个层，相邻地生物打印(例如堆叠)多个层以形成具有层状几何形状的工程化组织或器官。在各个实施方案中，相邻地生物打印(例如堆叠)了2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个层，以形成工程化组织或器官。在进一步的实施方案中，具有层状几何形状的组织的一个或多个层也具有平面几何形状。
除了喷墨生物打印技术之外，还可使用低温沉降成型技术或紫外光固化成型技术，利用本发明的生物砖来构建三维构建体。关于喷墨生物打印技术、低温沉降成型技术和紫外光固化成型技术的详细描述，可参见例如，25thAnniversaryArticle:EngineeringHydrogels forBiofabrication，其通过引用以其全文并入本文。
因此，在某些优选的实施方案中，所述构建体具有预先确定的结构。特别地，可以以预先确定的模式，将本发明的生物砖用于打印或者堆叠，从而形成具有预先确定的结构的构建体。
在某些优选的实施方案中，所述构建体具有一层或多层结构。进一步优选的，每一个层结构各自由一层或多层生物砖构建。不同的结构层所使用的生物砖可以是相同或者不同的。例如，所述构建体可具有类似于血管的三层结构，即，内皮细胞层，平滑肌细胞层和成纤维细胞层。例如，所述构建体可具有两层结构，即，包含含有MSC细胞和诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子的生物砖的成骨层，和包含含有MSC细胞和诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子的生物砖的成软骨层。
在某些优选的实施方案中，所述构建体由生物砖内的细胞凝聚而形成。特别地，在本发明的实施方案中，生物砖的核层和壳层，以及载体(例如生物粘合剂)各自由生物可降解材料制成。因此，在生物打印后，在生物砖内部/外部各种活性物质的刺激下，生物砖内的细胞开始进行生长、增殖、分化、分泌和/或迁移；生物砖的核层和壳层以及载体(例如生物粘合剂)开始不断降解；细胞之间逐步凝聚/融合，建立连接(包括生物砖内部的细胞连接，生物砖之间的细胞连接)；并且，细胞分泌的细胞外基质也相互融合形成一体；由此，打印后精确排布的所有细胞融合形成有机排列的、一体化的三维构建体(例如，具有生物学功能的组织或器官)。
在某些优选的实施方案中，所述构建体为微型组织块。例如，此类微型组织块的尺寸可以为微米至厘米级别，例如1μm-1cm，例如，10μm-5mm，50μm-1mm，100μm-800μm，300μm-600μm。在某些优选的实施方案中，微型组织块的尺寸可以为至少30μm、50μm、100μm、200μm、500μm、1mm、2mm、5mm、1cm、2cm、5cm、10cm、20cm、或50cm。
在某些优选的实施方案中，所述构建体可进行进一步的培养。在某些优选的实施方案中，构建体的生物砖中的细胞生长，增殖，分化、分泌和/或迁移；并且生物砖的核层和/或壳层的生物可降解材料被至少部分降解。在某些优选的实施方案中，生物砖内的细胞在培养后增殖至少2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、或100000倍。在某些优选的实施方案中，构建体的生物砖中包含干细胞。优选地，所述干细胞能够分化产生至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10种不同的细胞。在某些优选的实施方案中，生物砖的核层和/或壳层的生物可降解材料被降解至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。在某些优选的实施方案中，在培养后，构建体中的不同生物砖之间的细胞彼此连接，并且生物砖的核层和/或壳层的生物可降解材料被至少部分降解。在某些优选的实施方案中，不同生物砖之间，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％的细胞彼此连接。在某些优选的实施方案中，载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料被降解至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。在某些优选的实施方案中，核层和/或壳层和/或载体中的生物可降解材料的降解产物为细胞提供了营养物质或细胞外基质材料。在某些优选的实施方案中，所述构建体被培养至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、或30天，例如1-3、3-5、5-7、7-10、10-14、14-21、21-28、1-7、7-14、1-14、或14-28天，以获得微型组织块，组织前体、组织或器官。在某些优选的实施方案中，所述构建体在3D培养箱中进行培养。在某些优选的实施方案中，所述构建体在生物反应器中进行培养。在某些优选的实施方案中，在培养过程中对构建体施加物理刺激(例如压力，剪切力，光照，加热等)。在某些优选的实施方案中，在培养过程中对构建体施加化学刺激(例如激素，细胞因子，化学试剂等)。
使用本发明生物砖构建的三维构建体的一个实例的示意性结构示于图2中。如图2所示，该三维构建体包括三层结构，即，内皮细胞层，平滑肌细胞层和成纤维细胞层。其中，内皮细胞层由包含内皮细胞的生物砖构建；平滑肌细胞层由包含平滑肌细胞的生物砖构建；成纤维细胞层由包含成纤维细胞的生物砖构建。内皮细胞层，平滑肌细胞层和成纤维细胞层各自可以由一层或多层细胞构成，根据所使用的生物砖中含有的细胞的具体数量而定。生物砖之间的间隙填充有载体(其包含生物粘合剂)。在优选的实施方案中，载体可进一步包含维持、促进、改善、调控生物砖内的细胞的生命活动的试剂。例如，当生物砖中的细胞为内皮细胞时，载体中可进一步包含促进内皮细胞生长和分化的细胞因子。当生物砖中的细胞为平滑肌细胞时，载体中可进一步包含促进平滑肌细胞生长和分化的细胞因子。当生物砖中的细胞为成纤维细胞时，载体中可进一步包含促进成纤维细胞生长和分化的细胞因子。在某些优选的实施方案中，本发明的三维构建体是使用本发明的生物砖，通过3D生物打印方法而构建的。然而，不受于理论限制，本发明的三维构建体也可以使用本发明的生物砖，通过任何其他已知的方法(例如手工放置的方法)来构建。
在另一个方面，本发明提供了制备构建体，例如三维构建体，组织前体，组织或器官的方法，其包括，使用本发明的生物砖或本发明的包含生物砖的组合物(例如生物墨汁)的步骤。在某些优选的实施方案中，本发明的方法包括，使用本发明的生物砖或本发明的包含生物砖的组合物(例如生物墨汁)进行生物打印的步骤。在某些优选的实施方案中，本发明的方法产生了具有预定模式的构建体，例如三维构建体，人工组织或其前体。在某些优选的实施方案中，本发明的方法使用了一种组合物(例如生物墨汁)。在某些优选的实施方案中，本发明的方法使用了至少2种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、或10种)组合物(例如生物墨汁)。不同类型的组合物(例如生物墨汁)可在下述的一个或多个方面存在差异：所包含的生物砖的类型；所包含的载体的类型；生物砖与载体的含量比；和/或不同类型的生物砖之间的含量比。在某些优选的实施方案中，本发明方法中的生物打印步骤是连续的和/或基本连续的。在某些优选的实施方案中，本发明方法包括，连续地生物打印多个层，以获得具有预定模式的、包含多个层的三维构建体，其中每个层根据预定的模式用本发明的组合物(例如生物墨汁)进行生物打印。在某些优选的实施方案中，本发明方法包括，连续地生物打印多个区段，以获得具有预定模式的、包含多个区段的三维构建体，其中每个区段根据预定的模式用本发明的组合物(例如生物墨汁)进行生物打印。在某些优选的实施方案中，组合物(例如生物墨汁)中的载体包含生物粘合剂，其将层、区段和/或构建体中的生物砖粘结在一起。在某些优选的实施方案中，组合物(例如生物墨汁)中的载体包含生物粘合剂，其将生物砖固定在层、区段和/或构建体中。在某些优选的实施方案中，所述预定的模式通过支架来限定。在某些优选的实施方案中，本发明的组合物(例如生物墨汁)被打印至支架上。优选地，所述支架具有预定的模式。在某些优选的实施方案中，所述支架为包含生物可降解材料的人工结构，其能够支持组合物(例如生物墨汁)中的生物砖形成人工组织或组织前体。在某些优选的实施方案中，本发明的制备构建体的方法不使用支架。
在某些优选的实施方案中，使用上文所描述的含有MSC细胞和诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子的生物砖，和/或，上文所描述的含有MSC细胞和诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子的生物砖来制备构建体，例如骨组织、软骨组织、关节组织、或包含骨和软骨的复合结构。
在某些优选的实施方案中，使用上文所描述的含有内皮细胞的生物砖来制备构建体，例如肝脏组织、或包含微血管的构建体。例如，可使用含有脐静脉内皮细胞、肝脏细胞和干细胞的生物砖来制备肝脏组织。或者，可使用含有脐静脉内皮细胞和间充质干细胞的生物砖来制备包含微血管的构建体。
在某些优选的实施方案中，本发明的制备构建体的方法还包括，使用本发明的生物砖以及任选的载体(例如生物粘合剂)制备本发明的组合物(例如生物墨汁)的步骤。在某些优选的实施方案中，本发明的制备构建体的方法还包括，使用其他的生物相容性材料、墨汁或组合物进行生物打印。在某些优选的实施方案中，本发明的制备构建体的方法还包括，根据天然组织或器官的形状和/或细胞排布模式，建立构建体(例如三维构建体)的结构模型。
本发明的制备构建体的方法与本领域已知的其他生物打印方法是相容的。例如，本发明的方法可用于Cyfuse、Organovo和EnvisionTEC开发的生物打印机。目前已开发了三种主要的生物打印机，即，喷墨型生物打印机，挤出型生物打印机和激光辅助型生物打印机(参见Murph SV and Atala A.(2014)Nature Biotechnology,32(8):773-785)。备选地，本发明的制备构建体的方法可用于使用自动化或非自动化机械过程(而非打印机)的生物打印方法中，或者使用手工放置或手工沉积法(例如使用移液器)的生物打印方法中。在某些优选的实施方案中，通过喷墨方式来进行生物打印。在某些优选的实施方案中，通过挤出的方式来进行生物打印。在某些优选的实施方案中，通过手工放置或手工沉积来进行生物打印。
在某些优选的实施方案中，使用本发明的生物砖或组合物(例如生物墨汁)在体内进行生物打印。在某些优选的实施方案中，在受试者(例如人受试者)上直接进行生物打印。在某些优选的实施方案中，在受试者的组织(例如皮肤组织)的损伤位点直接进行生物打印。在某些优选的实施方案中，所述组织因创伤，感染，疾病，或老龄化而遭致损伤。在某些优选的实施方案中，根据组织或组织损伤位点的细胞分布信息，在受试者的组织(例如皮肤组织)的损伤位点直接进行生物打印。在某些优选的实施方案中，所述细胞分布信息选自，组织或组织损伤位点的各个细胞层的位置或类型，各个层的细胞的类型，各个层中不同细胞的比率，各个层中的细胞分布模式，或其任何组合。在某些优选的实施方案中，在进行生物打印之前，获得组织或组织损伤位点的细胞分布信息。在某些优选的实施方案中，所述方法还包括，获得组织或组织损伤位点的细胞分布信息，然后根据所述细胞分布信息进行生物打印。在某些优选的实施方案中，用于在受试者上进行生物打印的组合物(例如生物墨汁)中的细胞来源于所述受试者。在某些优选的实施方案中，用于在受试者上进行生物打印的组合物(例如生物墨汁)中的细胞来源于与所述受试者具有相似或相同特征(例如，物种，年龄，性别，遗传信息等)的其他受试者。在某些优选的实施方案中，用于在受试者上进行生物打印的组合物(例如生物墨汁)中的细胞来源于同种异体。在某些优选的实施方案中，用于在受试者上进行生物打印的组合物(例如生物墨汁)中的细胞来源于细胞系。在某些优选的实施方案中，使用本发明的生物砖或组合物(例如生物墨汁)在体外进行生物打印。
本发明的制备构建体的方法不会对组合物(例如生物墨汁)中或生物砖内的细胞造成机械损伤。在某些优选的实施方案中，组合物(例如生物墨汁)中或生物砖内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印后存活。在某些优选的实施方案中，组合物(例如生物墨汁)中或生物砖内至少90％的细胞在生物打印后存活至少3小时、6小时、12小时、1天、2天、4天、或7天。在某些优选的实施方案中，组合物(例如生物墨汁)中或生物砖内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印后能够增殖和/或分化。在某些优选的实施方案中，组合物(例如生物墨汁)中或生物砖内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印后具有正常的新陈代谢。在某些优选的实施方案中，组合物(例如生物墨汁)中或生物砖内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印后能够迁移。在某些优选的实施方案中，组合物(例如生物墨汁)中或生物砖内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印后能够分泌。
在某些优选的实施方案中，本发明的制备构建体的方法还包括，在允许生物砖内的细胞增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的条件下，培养所获得的构建体。培养条件取决于所使用的细胞类型，所使用的生物砖的类型，构建体的结构和形状等等。本领域技术人员能够选择合适的培养条件，例如培养基，pH，温度，CO2水平和持续时间。一般的组织和细胞培养条件可参见例如，Doyle,Alan,and J.BryanGriffiths,eds.Cell and tissueculture:laboratory procedures in biotechnology.New York:Wiley,1998。在某些优选的实施方案中，培养所获得的构建体至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、或30天，例如以获得人工组织或其前体。在某些优选的实施方案中，培养所获得的构建体1-3、3-5、5-7、7-10、10-14、14-21、21-28、1-7、7-14、1-14、或14-28天，例如以获得人工组织或其前体。在某些优选的实施方案中，在3D培养箱中培养所获得的构建体。在某些优选的实施方案中，在生物反应器中培养所获得的构建体。在某些优选的实施方案中，在37℃，5％CO2的条件下培养所获得的构建体。在某些优选的实施方案中，在培养过程中对构建体施加物理刺激(例如压力，剪切力，光照，加热等)。在某些优选的实施方案中，在培养过程中对构建体施加化学刺激(例如激素，细胞因子，化学试剂等)。在某些优选的实施方案中，生物砖的核层和/或壳层和/或载体中的生物可降解材料在培养过程中至少一部分被降解。优选地，此类生物可降解材料的降解产物为生物砖中的细胞提供了营养物质和/或细胞外基质。在某些优选的实施方案中，细胞在培养过程中的分泌物整合入构建体的细胞外基质中。在某些优选的实施方案中，生物砖内的细胞在培养过程中彼此连接。在某些优选的实施方案中，生物砖之间的细胞在培养过程中彼此连接。在某些优选的实施方案中，所述构建体在培养后具有高细胞密度(例如至少100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、或100000细胞/mm3)。在某些优选的实施方案中，生物砖内的细胞在培养后增殖至少2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、或100000倍。
本发明方法所制备的构建体可具有任何预定的模式，例如任何预定的形状。例如，所述构建体可以是片状结构(例如长方形，正方形，圆形，椭圆形，六角形或不规则形状的片状结构)，或中空管状结构，或中空三维结构(例如中空立方体，中空球体，中空的矩形棱柱体，中空圆柱体，或中空的不规则形状的三维结构)，或实心三维结构(例如实心立方体，实心球体，实心矩形棱柱体，实心圆柱体，或实心不规则形状的三维结构)，或其任何组合。在某些优选的实施方案中，所述构建体的形状模拟天然组织或器官的形状。在某些优选的实施方案中，所述构建体的尺寸为至少30μm、50μm、100μm、200μm、500μm、1mm、2mm、5mm、1cm、2cm、5cm、10cm、20cm、或50cm。
与现有技术方法不同，在刚刚完成生物打印步骤之时，构建体中的不同生物砖之间的细胞彼此不互相连接。对构建体进行进一步培养将导致细胞首先在生物砖壳层内生长、增殖、分化、分泌和/或迁移；随后在培养过程中，随着生物砖内生物可降解材料(例如核层和壳层中的生物可降解材料)的降解，细胞可突破生物砖的壳层。由此，可在基于生物砖的构建体中实现精确的细胞排布，这进而使得能够产生更加复杂的组织或器官。
在另一个方面，本发明提供了通过上述方法制备的构建体。在某些优选的实施方案中，所述构建体是三维构建体，组织前体，组织或器官；例如骨组织、软骨组织、关节组织、包含骨和软骨的复合结构、肝脏组织、或包含微血管的构建体。在某些优选的实施方案中，所述构建体是活的构建体。
在另一个方面，本发明提供了本发明的生物砖的用途，其例如用于生物打印(例如3D生物打印)；或用于形成构建体(例如三维构建体)，例如组织前体、组织或器官；例如骨组织、软骨组织、关节组织、包含骨和软骨的复合结构、肝脏组织、或包含微血管的构建体。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖用于通过生物打印而制备构建体(例如三维构建体)，例如组织前体、组织或器官；例如骨组织、软骨组织、关节组织、包含骨和软骨的复合结构、肝脏组织、或包含微血管的构建体。
在另一个方面，本发明提供了本发明的组合物(例如生物墨汁)的用途，其用于生物打印(例如3D生物打印)；或用于形成构建体(例如三维构建体)，例如组织前体、组织或器官；例如骨组织、软骨组织、关节组织、包含骨和软骨的复合结构、肝脏组织、或包含微血管的构建体。在某些优选的实施方案中，本发明的组合物(例如生物墨汁)用于通过生物打印而制备构建体(例如三维构建体)，例如组织前体、组织或器官；例如骨组织、软骨组织、关节组织、包含骨和软骨的复合结构、肝脏组织、或包含微血管的构建体。
在另一个方面，本发明提供了本发明的构建体(例如三维构建体，例如组织前体、组织或器官)的用途。本发明的构建体可用于各种应用，例如用于研究领域或医药领域的应用。例如，本发明的构建体可用于研究干细胞(例如MSC细胞)分化，用于药物发现，用于药物筛选，用于体内或体外测定，用于植入宿主体内，用于组织工程或用于组织再生。本发明的构建体还可用于制备试剂盒，所述试剂盒用于各种应用，例如用于研究领域或医药领域的应用。例如，本发明的构建体可用于研究干细胞(例如MSC细胞)分化，用于药物发现，用于药物筛选，用于体内或体外测定，用于植入宿主体内，用于组织工程或用于组织再生。
在某些优选的实施方案中，本发明的构建体可用于组织工程。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体可用于研究干细胞分化。
在某些优选的实施方案中，本发明的构建体可用于体外测定。在某些优选的实施方案中，所述体外测定是用于检测或测量物质(例如化学试剂，生化试剂，药物等)在生物学样品(例如细胞聚集体，组织，器官，生物体等)中的存在或活性的方法。在某些优选的实施方案中，所述体外测定是定性的。在某些优选的实施方案中，所述体外测定是定量的。示例性的体外测定包括但不限于，基于图像的测定，分泌的蛋白质的测定，标志物的表达和蛋白质的产生。在某些优选的实施方案中，体外测定用于检测或测量下述中的一个或多个：分子结合(包括放射性配体结合)，分子摄取，活性(例如，酶活性和受体活性等)，基因表达，蛋白质表达，受体激动作用，受体拮抗作用，细胞信号传导，细胞凋亡，化学敏感性，转染，细胞迁移，趋化性，细胞活力，细胞增殖，安全性，有效性，新陈代谢，毒性和滥用倾向。在某些优选的实施方案中，体外测定是免疫测定，例如竞争性免疫测定和非竞争性免疫测定。在某些优选的实施方案中，体外测定是酶联免疫吸附测定。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖或构建体提供了体外测定中测量或检测的分子，细胞，细胞群或组织。在某些优选的实施方案中，体外测定用于基础研究，以发现、开发或研究任何分子，细胞，或其结构或作用机制。体外测定的示例性应用包括但不限于，开发三维培养系统，研究信号传导通路，干细胞诱导和分化，细胞间相互作用等等。
在某些优选的实施方案中，本发明的构建体可用于药物筛选或药物发现。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体用于制备细胞的阵列，微阵列或芯片，多细胞聚集体或组织，从而用于药物筛选或药物发现。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体存在于多孔容器的孔中。优选地，所述容器与自动化药物筛选方法和/或装置兼容。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体用于药物筛选或药物发现，以研究或开发可用于治疗疾病的药物。优选地，所述疾病包括但不限于，感染性疾病，血液疾病，肿瘤疾病，儿科疾病，心血管疾病，中枢神经系统疾病，神经内科疾病，消化内科疾病，肝病科疾病，泌尿科疾病，不孕不育，眼科疾病，肾内科疾病，骨科疾病，疼痛，呼吸病，皮肤疾病，免疫疾病，精神疾病。
在某些优选的实施方案中，本发明的构建体用于体内测定。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体用作受试者(例如动物模型)中的异种移植物。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体用作移植物，用于植入受试者体内。
在某些优选的实施方案中，本发明的构建体用于分析细胞在体内响应刺激或试剂而产生的变化(例如形态变化或功能变化)。在此类实施方案中，将生物砖中的细胞暴露于所述刺激或试剂，和，评估生物砖中的细胞的变化(例如形态变化或功能变化)。在某些优选的实施方案中，所述生物砖位于受试者体内。
在某些优选的实施方案中，本发明的构建体用于研究干细胞分化。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体用于评估因子(例如，化学试剂，例如化合物；物理刺激，例如辐射或加热)对组织或组织中的细胞的作用。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体用于三维组织培养。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体用于修复受试者中损伤组织。
在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖用于直接在受试者中进行生物打印。在某些优选的实施方案中，根据组织的细胞分布信息来进行生物打印。在某些优选的实施方案中，所述生物砖被打印至受试者中的支架上。在某些优选的实施方案中，所述受试者是动物模型。
在某些优选的实施方案中，本发明的构建体用于组织再生。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体用于体内组织或器官移植。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体用于保护、修复或替换受试者(例如人)体内的受损的，患病的或衰竭的组织或器官。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体用于生产细胞(例如干细胞，祖细胞，前体细胞，免疫细胞等等)，以用于细胞疗法。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体用于生产生物活性分子(例如激素，生长因子，细胞因子，配体等等)。优选地，所述生物活性分子可用于诱导接受本发明的构建体或其产物(例如细胞或生物活性分子)的受试者(例如人)的组织再生。
在另一个方面，本发明提供了评估因子(例如，化学试剂，例如化合物；物理刺激，例如辐射或加热)对组织或组织中的细胞的作用的方法，其包括，将本发明的构建体(例如三维构建体，组织前体，组织或器官；例如骨组织、软骨组织、关节组织、包含骨和软骨的复合结构、肝脏组织、或包含微血管的构建体)暴露于所述因子，和，评估所述构建体中的细胞响应所述因子的变化(例如形态变化或功能变化)，从而确定所述因子对组织或组织中的细胞的作用。在某些优选的实施方案中，所述化合物是药物。在某些优选的实施方案中，所述方法用于测定所述药物的功效。在某些优选的实施方案中，所述方法用于筛选药物。在某些优选的实施方案中，所述生物砖中的细胞来源于需要所述药物的受试者。
在另一个方面，本发明提供了修复受试者中损伤组织的方法，其包括，使用本发明的生物砖或组合物(例如生物墨汁)在受试者中组织的损伤位点直接进行生物打印。在某些优选的实施方案中，在置于组织损伤位点的支架上进行生物打印。在某些优选的实施方案中，所述方法包括，获得组织或组织损伤位点的细胞分布信息，然后根据所述细胞分布信息进行生物打印。在某些优选的实施方案中，用于在受试者上进行生物打印的生物砖或组合物(例如生物墨汁)中的细胞来源于所述受试者。在某些优选的实施方案中，用于在受试者上进行生物打印的生物砖或组合物(例如生物墨汁)中的细胞来源于与所述受试者具有相似或相同特征(例如，物种，年龄，性别，遗传信息等)的其他受试者。在某些优选的实施方案中，用于在受试者上进行生物打印的生物砖或组合物(例如生物墨汁)中的细胞来源于同种异体。在某些优选的实施方案中，用于在受试者上进行生物打印的生物砖或组合物(例如生物墨汁)中的细胞来源于细胞系。在某些优选的实施方案中，所述生物砖或组合物中的生物砖包含干细胞。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明的生物砖，组合物(例如生物墨汁)，和/或构建体(例如三维构建体，组织前体，组织或器官；例如骨组织、软骨组织、关节组织、包含骨和软骨的复合结构、肝脏组织、或包含微血管的构建体)。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含本发明的生物砖，其例如用于生物打印构建体(例如三维构建体，组织前体，组织或器官)。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10种生物砖。不同类型的生物砖可在下述的一个或多个方面存在差异：生物砖的尺寸；生物砖的形状；所包含的细胞数目；所包含的细胞的类型；核层的组成(包括组分的类型和含量)；壳层的组成(包括组分的类型和含量)；核层和/或壳层中包含的额外试剂(包括类型和含量)；和/或，上文论述的任何其他参数。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含载体(例如生物粘合剂)，其可与生物砖混合用于生物打印。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含定义生物打印模式的模型。在某些优选的实施方案中，所述模型基于待打印的构建体的天然结构和细胞排布模式。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含本发明的组合物(例如生物墨汁)，其例如用于生物打印构建体(例如三维构建体，组织前体，组织或器官)。在某些优选的实施方案中，所述组合物(例如生物墨汁)包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10种生物砖。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10种组合物(例如生物墨汁)。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含载体(例如生物粘合剂)。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含定义生物打印模式的模型。在某些优选的实施方案中，所述模型基于待打印的构建体的天然结构和细胞排布模式。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含另外的组分，例如容器，培养基，缓冲剂，和/或生物打印所需的其他试剂。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含使用说明书，其描述了产生构建体(例如三维构建体，组织前体，组织或器官)的方法，包括例如生物打印的步骤和培养条件。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含本发明的构建体。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体是使用本发明的生物砖或组合物(例如生物墨汁)制备的(例如通过生物打印)。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含，培养基，缓冲剂，和/或用于培养构建体所需的其他试剂。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含使用说明书，其描述了培养所述构建体的方法。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒用于再生医学，例如体内移植或细胞疗法。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒用于体外测定或药物筛选。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含，体外测定、药物筛选或再生医学(例如体内移植或细胞疗法)所需的其他试剂，和/或使用说明书。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含支架，或者用于制备支架的材料。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒可用于分析细胞响应刺激或试剂而产生的变化(例如形态变化或功能变化)，用于药物筛选或药物发现，用于治疗有此需要的受试者，用于研究干细胞分化，用于评估因子(例如，化学试剂，例如化合物；物理刺激，例如辐射或加热)对组织或组织中的细胞的作用，用于三维组织培养，用于修复受试者中损伤组织。
本发明的试剂盒可置于任何合适的包装中。此类包装包括但不限于，瓶，罐，和软包装(如聚酯薄膜或塑料袋)。
在另一个方面，本发明提供了本发明的构建体(例如三维构建体，组织前体，组织或器官)用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒可用于上文所论述的各种应用。例如，所述试剂盒可用于分析细胞响应刺激或试剂而产生的变化(例如形态变化或功能变化)，用于药物筛选或药物发现，用于治疗有此需要的受试者，用于研究干细胞分化，用于评估因子(例如，化学试剂，例如化合物；物理刺激，例如辐射或加热)对组织或组织中的细胞的作用，用于三维组织培养，用于修复受试者中损伤组织。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明的生物砖所包裹的细胞类型和细胞数目是可控的，并且生物砖本身的结构和尺寸也是可控的，从而其可用于制备标准化、可控化的生物墨汁。特别地，本发明的生物砖可以包含1至106个细胞，例如1至数千个细胞，并且任选地，可以以预先确定的比例包含不同的细胞类型。
(2)在本发明的生物砖中，可以通过调整生物砖内的物质，如细胞因子和生物可降解材料，为不同种类的细胞提供特定的微环境，从而调控细胞的生长和功能；这进一步使得能够在复杂的构建体(例如组织和器官)内对不同区域的细胞，或同一区域的不同细胞进行调控。
(3)在本发明的生物砖中，生物砖为特定细胞的生命活动提供了适当的微环境(例如特定细胞生长、分化所需的生长因子或营养物质，适合细胞增殖、分化的空间结构，促进细胞正常发挥生物学功能的物理因素例如力学刺激等，协助或者调控干细胞分化的滋养层细胞等)，使得能够在相同的培养体系中培养不同的细胞类型，或者在相同的培养体系中将相同的干细胞分化培养为不同的细胞类型。
(4)本发明的生物砖具有壳核结构，给细胞提供了有效的力学保护，有效地减少或避免细胞遭受外界的机械损伤/力学损伤(例如，在生物打印过程中)，从而确保了细胞在打印过程中存活率(达到90％以上)。此外，本发明的生物砖的壳层还可用作细胞的生物可降解支架，这使得在生物打印过程中，可以不用再为细胞提供生物可降解表面(例如，Organovo技术中使用的水凝胶表面)。
(5)本发明的生物砖和生物墨汁可在生物打印过程中实现细胞的精确排布，实现组织或器官的精确生物打印。特别地，可根据需要，定制不同类型的生物砖，其可以具有不同的结构，使用不同类型的细胞，使用不同类型的细胞因子和/或使用不同类型的生物可降解材料。随后，可根据预定的模式，将各种类型的生物砖用于生物打印，从而获得由按照预定模式排布的生物砖(细胞)构成的构建体，并最终实现生物砖(细胞)的精确排布。此外，由于细胞首先在生物砖内增殖，因此本发明的生物砖还使得能够显著增加所获得的构建体内的细胞密度，而不破坏生物砖(细胞)的预期排布/精确排布。
(6)通过添加不同的细胞因子/药物活性成分，本发明能够对各种生物砖内的细胞的增殖、分化、迁移、新陈代谢进行调控。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
实施例中未指明其来源的试剂、试剂盒或仪器均为市场上商购可得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.生物砖的制备
本实施例提供了制备生物砖的示例性方法。生物砖的制备方法应当在无菌条件下进行。此外，如果意欲将生物砖应用于人体的话，那么其制备方法的生物安全等级应当达到GMP车间级别。
本方法所使用的仪器为造粒仪(BUCHI，Encapsulator，B-395Pro)，其配备的同心喷嘴的直径如下：内层喷嘴，200μm；外层喷嘴，300μm。
本方法所使用的材料如下：
(1)用于制备核层的材料
I型胶原：4mg/ml，使用无菌1M NaOH进行中和；
海藻酸钠：使用去离子水溶解稀释；
血管内皮生长因子VEGF；
将I型胶原与2％(w/v)(即，2g/100ml，下同)海藻酸钠溶液以1:1的比例(按重量计)混合，用于制备核层。
(2)用于制备壳层的材料
4％海藻酸钠；
弹性蛋白；
壳层固定液，即，0.1mol/L CaCl2溶液。
(3)所使用的细胞：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(购买自ATCC)。
制备生物砖的操作步骤如下(以下实验步骤均在冰上操作)：
将120μl NaOH溶液与750μl I型胶原混合，然后向其中加入130μl血管内皮细胞悬液(细胞浓度为1x 105个/ml，悬浮于PBS中)，从而获得1ml细胞包裹液。然后，将细胞包裹液与1ml 2％海藻酸钠(包含终浓度为20ng/ml的VEGF)混合，使细胞均匀分散，从而获得包裹细胞的核层材料。
向2ml 4％海藻酸钠溶液中加入100ng弹性蛋白(elastin，其终浓度为50ng/ml)，充分混匀，该混合物用作壳层材料，用于制备生物砖的壳层。此外，取300ml 0.1mol/LCaCl2溶液置于烧杯中，用于壳层材料的固定。
将如上制备的核层材料和壳层材料分别置于2支5ml注射器中。按照制造商的说明书，设置造粒仪的压力、离散力、泵的速度等参数，然后使用所述核层材料和壳层材料进行造粒和包被。造粒仪的内喷嘴的直径设置为200μm，外喷嘴的直径设置为300μm。将获得的生物砖微粒收集于装有300ml 0.1mol/L CaCl2溶液的烧杯中，固定5min，制备获得生物砖。所制备的生物砖可以在4℃下保存，或可直接用于3D生物打印。
实施例2.生物砖的表征
本实施例具体分析了通过实施例1方法制备的生物砖的性能，包括生物砖的尺寸，壳层的厚度和力学保护作用，所包含的细胞的数量等。
使用显微镜来观察通过实施例1方法制备的生物砖，结果示于图3A-3C中。图3A-3C显示了使用造粒仪在不同仪器参数(同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径)下制备的生物砖的显微照片，其中，图3A中的生物砖的直径为约120μm(标尺为100μm)；图3B中的生物砖的直径为约200μm(标尺为100μm)；图3C中的生物砖的直径为约450μm(标尺为200μm)。这些结果表明，可通过控制造粒仪的仪器参数(例如，同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径)来控制生物砖的尺寸。本发明的生物砖的尺寸是可控的，可根据需要进行选择。
还使用显微镜进一步观察了通过实施例1方法制备的生物砖的壳层厚度，结果示于图4中。图4显示了通过实施例1方法制备的生物砖的显微照片，其中，高亮部分代表生物砖的壳层，且该壳层的厚度为约2μm(标尺为50μm)。结果表明，可通过控制造粒仪的同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径，壳层材料的泵出速度等参数来控制壳层的厚度。本发明的生物砖的壳层厚度是可控的，可根据需要进行选择。
还使用显微镜进一步观察了通过实施例1方法制备的生物砖所包含的细胞的数量。结果示于图5A-5C中。图5A-5C显示了通过实施例1方法制备的生物砖的显微照片，其中，图5A中的生物砖包裹的细胞数为约50个(标尺为100μm)；图5B中的生物砖包裹的细胞数为约8个(标尺为100μm)；图5C中的生物砖包裹的细胞数为约2个(标尺为100μm)。这些结果表明，可通过控制细胞悬液的细胞浓度来控制生物砖包裹的细胞数。本发明生物砖包含的细胞的数量是可控的，可根据需要进行选择。
另外，还根据制造商的说明书，使用美国Hysitron(海思创)TI-950型纳米压痕仪，检测了通过实施例1方法制备的生物砖(尺寸为约400μm)的力学性能。检测结果显示，该批次的生物砖的硬度平均大约为0.083GPa，弹性模量平均大约为1.683MPa。
这些结果表明，本发明生物砖具有优良的力学保护性能，可有效避免生物砖内的细胞遭受外界的力学损伤/机械损伤。此外，还已发现，可通过控制生物砖的壳层厚度和壳层材料等参数来控制生物砖的力学保护性(数据未显示)。本发明生物砖的力学保护性能是可控的，可根据需要进行选择。
实施例3.其他类型的生物砖的制备
还使用与实施例1类似的方法，利用造粒仪，以下述原料制备了其他类型的生物砖(即，生物砖B1-B4)。
Figure BDA0001552026420000841
图6A-6D显示了使用造粒仪制备的生物砖B1-B4的显微照片，其中，图6A中的生物砖为生物砖B1，其直径为约600μm(标尺为500μm)；图6B中的生物砖为生物砖B2，其直径为约500μm(标尺为500μm)；图6C中的生物砖为生物砖B3，其直径为约500μm(标尺为500μm)；图6D中的生物砖为生物砖B4，其直径为约500μm(标尺为500μm)。这些结果表明，可使用各种合适的生物可降解材料来制备本发明的生物砖。
另外，为了更清楚地观察所制备的生物砖的结构，还使用trackerCM-Dil(红色荧光)对用于制备生物砖B2的核层材料所包裹的细胞进行标记；并且，使用带有FITC(绿色荧光)的聚赖氨酸作为制备生物砖B2的壳层材料。随后，使用共聚焦显微镜来观察用含有trackerCM-Dil标记的细胞的核层材料和带有FITC的壳层材料所制备的生物砖B2。结果示于图6E中。图6E显示了用经标记的核层材料和壳层材料制备的生物砖B2的共聚焦显微图像，其中，绿色荧光代表壳层，红色荧光代表核层所包裹的细胞。
实施例4.壳层含有氧化海藻酸盐的生物砖的制备
本实施例提供了壳层含有氧化海藻酸盐的生物砖的示例性制备方法。生物砖的制备方法应当在无菌条件下进行。此外，如果意欲将生物砖应用于人体的话，那么其制备方法的生物安全等级应当达到GMP车间级别。
本方法所使用的仪器为造粒仪(BUCHI，Encapsulator，B-395Pro)，其配备的同心喷嘴的直径如下：内层喷嘴，200μm；外层喷嘴，300μm。
本方法所使用的材料如下：
(1)用于制备核层的材料
I型胶原：4mg/ml，使用无菌1M NaOH进行中和；
(2)用于制备壳层的材料
指定浓度的氧化海藻酸钠溶液，或含有指定浓度的氧化海藻酸钠和其他壳层材料的混合溶液；
壳层固定液，即，0.1mol/L CaCl2溶液。
(3)所使用的细胞：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(购买自ATCC)、肝癌细胞(HepG2，购买自ATCC)、人成纤维细胞(购买自ATCC)、大鼠间充质干细胞(MSC，原代)。
制备生物砖的操作步骤如下(以下实验步骤均在冰上操作)：
(1)将120μl NaOH溶液与750μl I型胶原混合，然后向其中加入130μl细胞悬液(细胞浓度为1x 105个/ml，悬浮于PBS中)，从而获得1ml细胞包裹液，用作核层材料。
(2)配制50ml 5wt％氧化海藻酸钠溶液用作壳层材料。
(3)配制300ml 0.1M CaCl2溶液置于烧杯中，用于壳层材料的固定。
(4)将如上制备的核层材料置于2ml注射器中，并且将50ml壳层材料置于造粒仪的包裹液瓶中，随后，用所述核层材料和壳层材料进行造粒和包被。
(5)将步骤(4)的产物收集于装有300ml 0.1mol/L CaCl2溶液的烧杯中，固定5min，制备获得生物砖。所制备的生物砖可以在4℃下保存，或可直接用于3D生物打印。
实施例5.壳层含有氧化海藻酸盐的生物砖的表征
本实施例具体分析了通过实施例4方法制备的生物砖的性能，包括生物砖的尺寸，壳层的厚度和力学保护作用，所包含的细胞的数量等。
使用显微镜来观察通过实施例4方法制备的生物砖。在制备过程中，使用了不同的造粒仪的仪器参数(例如，同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径)，制备了不同尺寸的生物砖。结果显示，可通过控制造粒仪的仪器参数(例如，同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径)来控制生物砖的尺寸。本发明的生物砖的尺寸是可控的，可根据需要进行选择。
还使用显微镜进一步观察了通过实施例4方法制备的生物砖的壳层厚度。结果表明，可通过控制造粒仪的同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径，壳层材料的泵出速度等参数来控制壳层的厚度。本发明的生物砖的壳层厚度是可控的，可根据需要进行选择。
还使用显微镜进一步观察了通过实施例4方法制备的生物砖所包含的细胞的数量。结果表明，可通过控制细胞悬液的细胞浓度来控制生物砖包裹的细胞数。本发明生物砖包含的细胞的数量是可控的，可根据需要进行选择。
另外，还根据制造商的说明书，使用美国Hysitron(海思创)TI-950型纳米压痕仪，检测了通过实施例4方法制备的生物砖的力学性能。结果显示，本发明生物砖具有优良的力学保护性能，可有效避免生物砖内的细胞遭受外界的力学损伤/机械损伤。此外，还已发现，可通过控制生物砖的壳层厚度和壳层材料等参数来控制生物砖的力学保护性(数据未显示)。本发明生物砖的力学保护性能是可控的，可根据需要进行选择。
实施例6.生物砖壳层的降解速度的调控
在本实施例中，对生物砖的壳层降解速度进行了研究。本实施例所使用的生物砖基本上按照实施例4描述的方法来制备，其中根据实验设置，对所使用的造粒仪的仪器参数(例如，同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径)、细胞(类型和数量)，核层材料，和壳层材料进行了调整。并且，在本实施例中，通过下述方法来检测所制备的生物砖的壳层降解速度：将生物砖在37℃培养箱中进行培养，并在指定的时间点检测生物砖的质量，测定生物砖的失重率。另外，还可绘制失重率-时间曲线，作为生物砖壳层的降解曲线。
首先，我们检测了所使用的细胞的类型和数量，以及氧化海藻酸钠的氧化度对生物砖壳层的降解速度的影响。
按照实施例4描述的方法来制备生物砖，其中，所使用的细胞为HUVEC、HepG2和MSC；所使用的细胞密度为4×106/mL，6×106/mL，或12×106/mL；所使用的核层材料为包裹细胞的I型胶原；所使用的壳层材料为5wt％氧化海藻酸钠，并且氧化海藻酸钠的氧化度为2.5％、4.4％、8.8％、17.6％或22％。随后，按照上文描述的方法，测定所制备的生物砖的壳层降解速度。测定结果示于表1中。
表1.
Figure BDA0001552026420000881
上述结果表明，用于制备生物砖的细胞的类型和数量以及氧化海藻酸钠的氧化度均能够影响生物砖壳层的降解速度。具体而言，(1)细胞的生长和增殖速度越快，则生物砖壳层的降解速度也越快。例如，HUVEC/HepG2细胞的生长和增殖速度快于MSC，因此，在同等条件下，包含HUVEC/HepG2的生物砖的壳层降解速度快于包含MSC的生物砖，如生物砖4和9所显示的。(2)细胞的数量越多，则生物砖壳层的降解速度越快，例如，如生物砖5和7所显示的。(3)氧化海藻酸钠的氧化度越高，则生物砖壳层的降解速度越快，例如，如生物砖4-6，或生物砖9和11所显示的。
其次，我们检测了生物砖壳层中氧化海藻酸钠的浓度对生物砖壳层的降解速度的影响。
按照实施例4描述的方法来制备生物砖，其中，所使用的核层材料为包裹细胞的I型胶原；所使用的壳层材料为指定浓度(5％、6％、7％、8％、9％、或10％)的氧化海藻酸钠，并且氧化海藻酸钠的氧化度为8.8％。随后，按照上文描述的方法，测定所制备的生物砖的壳层降解速度。实验结果见表2。
表2
Figure BDA0001552026420000891
实验结果表明，生物砖壳层中氧化海藻酸钠的浓度能够影响生物砖壳层的降解速度。特别地，氧化海藻酸钠的浓度越高，则生物砖壳层的降解速度越慢。
另外，我们还研究了生物砖壳层中其他生物可降解材料(例如，海藻酸钠)的存在对生物砖壳层的降解速度的影响。特别地，我们使用不同比例的海藻酸钠和氧化海藻酸钠来制备生物砖的壳层，并研究了海藻酸钠和氧化海藻酸钠的比例对生物砖壳层的降解速度的影响。
按照实施例4描述的方法来制备生物砖，其中，所使用的核层材料为包裹细胞的I型胶原；所使用的壳层材料为指定比例的氧化海藻酸钠(OSA)和海藻酸钠(SA)，并且氧化海藻酸钠(OSA)和海藻酸钠(SA)的总浓度为5％。随后，按照上文描述的方法，测定所制备的生物砖的壳层降解速度。实验结果见表3。
表3
Figure BDA0001552026420000901
结果表明，生物砖壳层中氧化海藻酸钠含量的降低将导致生物砖壳层的降解速度下降。特别地，氧化海藻酸钠在壳层中所占的比例越高，则生物砖壳层的降解速度越快；反之，氧化海藻酸钠在壳层中所占的比例越低，则生物砖壳层的降解速度越慢。
此外，我们还检测了所使用的细胞的类型对生物砖壳层的降解速度的影响。
按照实施例4描述的方法来制备生物砖，其中，所使用的细胞为MSC、HUVEC、HepG2或成纤维细胞；并且，在制备生物砖过程中，使用相同的细胞密度(例如6×106/mL)，相同的核层材料(例如I型胶原)，相同的壳层材料(例如，5wt％氧化海藻酸钠，并且氧化海藻酸钠的氧化度为8.8％)，并且使用相同的造粒仪的仪器参数。随后，按照上文描述的方法，测定所制备的包含不同类型的细胞的生物砖的壳层降解速度。
结果显示，用于制备生物砖的细胞的类型能够影响生物砖壳层的降解速度。具体而言，细胞的生长和增殖速度越快，则生物砖壳层的降解速度也越快。例如，HUVEC/HepG2细胞的生长和增殖速度快于MSC，因此，在同等条件下，包含HUVEC/HepG2的生物砖的壳层降解速度快于包含MSC的生物砖。
另外，我们还检测了所使用的细胞的数量对生物砖壳层的降解速度的影响。
按照实施例4描述的方法来制备生物砖，其中，所使用的细胞密度为4×106/mL，6×106/mL，8×106/mL，12×106/mL，16×106/mL，或24×106/mL；并且，在制备生物砖过程中，使用相同的细胞(例如HepG2细胞)，相同的核层材料(例如I型胶原)，相同的壳层材料(例如，5wt％氧化海藻酸钠，并且氧化海藻酸钠的氧化度为8.8％)，并且使用相同的造粒仪的仪器参数。随后，按照上文描述的方法，测定所制备的包含不同数量的细胞的生物砖的壳层降解速度。
结果显示，用于制备生物砖的细胞的数量能够影响生物砖壳层的降解速度。具体而言，细胞的数量越多，则生物砖壳层的降解速度越快。反之，细胞的数量越少，则生物砖壳层的降解速度越慢。
此外，我们还检测了所制备的生物砖的壳层厚度对生物砖壳层的降解速度的影响。
按照实施例4描述的方法来制备生物砖，其中，在制备生物砖过程中，使用相同的细胞(例如HepG2细胞)，相同的细胞密度(例如6×106/mL)，相同的核层材料(例如I型胶原)，相同的壳层材料(例如，5wt％氧化海藻酸钠，并且氧化海藻酸钠的氧化度为8.8％)，但是通过调整造粒仪的仪器参数(例如，同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径)，制备具有不同壳层厚度的生物砖。随后，按照上文描述的方法，测定所制备的具有不同壳层厚度的生物砖的壳层降解速度。
结果显示，生物砖的壳层厚度能够影响生物砖壳层完全降解所需的时间。具体而言，生物砖的壳层越厚，则壳层完全降解所需的时间越长。
实施例7.生物墨汁的制备和表征
本实施例将根据实施例1中描述的方法制备的生物砖与生物粘合剂均匀混合，制备成用于生物打印的生物墨汁。所使用的生物粘合剂为海藻酸钠+明胶。
在制备所述生物墨汁后，立即使用相差显微镜来进行观察。为了便于观察，在制备生物砖时，在核层中添加了甲基紫染料。观察结果示于图7A中。
图7A显示了使用本发明的生物砖制备的生物墨汁的显微照片。其中，生物砖包含人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并且其壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原，且包含甲基紫染料；生物粘合剂的主要成分是海藻酸钠+明胶。另外，由于生物砖和生物粘合剂的部分成分是一致的，因此，为了便于观察，在生物砖中添加了甲基紫染料。从而，在图7A中，生物砖显示为紫色。如图7A所示，紫色染色仅存在于生物砖内部，而不存在于生物墨汁的载体(生物粘合剂)中。这表明生物砖的壳层能够在生物墨汁中保持生物砖的完整性。
进一步，将如上制备的生物墨汁打印为单细胞层(宽度约为250)μm，并使用显微镜来进行观察。观察结果示于图7B中。
图7B显示了用本发明的生物墨汁打印得到的单细胞层的显微照片。其中，生物砖包含人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并且其壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原，且包含甲基紫染料；生物粘合剂的主要成分是海藻酸钠+明胶。在图7B中，生物砖因甲基紫染料的存在，而显示为紫色。如图7B所示，紫色染色仅存在于生物砖内部，而不存在于生物墨汁的载体(生物粘合剂)中。这表明生物砖的壳层能够在生物打印过程中保持生物砖的完整性。
为了进一步表征生物墨汁，使用粘度测定仪，测量生物粘合剂的粘度随温度(25℃-40℃)的变化情况。结果示于图8中。
图8显示了所使用的生物粘合剂(海藻酸钠+明胶)的粘度分析。结果显示，在25℃-40℃下，所使用的生物粘合剂的粘度为30-160Pas；并且，随着温度升高，生物粘合剂的粘度有所下降。另外，还已发现，生物粘合剂与生物砖混合后(即，生物墨汁)的粘度未发生显著改变(数据未显示)。生物墨汁的粘度主要取决于载体(例如生物粘合剂)的粘度。
可通过控制生物粘合剂的组分的类型和含量来调整生物墨汁/生物粘合剂的粘度。通常，粘度在1-1000Pas范围内的生物墨汁可与生物打印机例如(EnvisionTEC 3D-
Figure BDA0001552026420000931
)相容。因此，本发明的生物墨汁在4-40℃的温度下可用于本领域已知的生物打印系统。
实施例8.生物砖/生物墨汁的细胞相关的性能分析
细胞的活力
在本实验中，通过染色法检测了生物砖内的细胞活性。所使用的试剂如下：
钙黄绿素CaAM(公司：Invitrogen，货号：C3100MP)，其用于活细胞染色，能够对细胞浆进行标记，显示绿色荧光。使用方法：用10ul DMSO溶解50ug钙黄绿素，然后添加10mlPBS并混匀。所获得的溶液中钙黄绿素的终浓度为5mmol/l。
碘化丙啶核酸染料(公司：Invitrogen，货号：P1304MP)，其用于死细胞染色，能够对细胞核进行标记，显示红色荧光。使用方法：用双蒸水将碘化丙啶核酸染料稀释至1mg/ml，用作储存液；然后用PBS将储存液以1:3000的比例稀释至终浓度500nM，用作工作液。
染色方法如下：
将通过实施例1方法制备的生物砖(包含HUVEC，100个细胞/生物砖)置于1ml CaAM中，于37℃孵育1h；然后加入1ml碘化丙啶核酸染料，染色15min。之后，使用激光共聚焦显微镜观察生物砖的染色结果。结果示于图9A-9D中。
图9A-9D显示了使用共聚焦显微镜观察通过实施例1方法制备的生物砖中细胞活力的分析结果，其中，所述生物砖用钙黄绿素(绿色荧光)和碘化丙啶(红色荧光)进行了双重染色；所使用的细胞为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。
图9A显示了在生物砖制备之后立即进行的生物砖中细胞活力的分析结果。在图9A中，每个标记的白色圆圈代表一个生物砖，并且，高亮点为红色荧光(代表死细胞)，低亮点为绿色荧光(代表活细胞)。使用image pro plus软件，对红色、绿色进行颜色聚类统计，并计算红光斑和绿光斑的数量、面积、平均光密度、直径、累计光密度，由此确定红、绿像素点的个数，并计算细胞生存率。细胞生存率＝活细胞数量/(活细胞数+死细胞数)。图9A的结果显示，在用实施例1的方法制备生物砖后，生物砖中98％以上的细胞存活。
图9B显示了将制备的生物砖在4℃下贮存3小时后，生物砖中细胞活力的分析结果。在图9B中，每个标记的白色圆圈代表一个生物砖，并且，高亮点为红色荧光(代表死细胞)，低亮点为绿色荧光(代表活细胞)。如图9A，使用image pro plus软件计算细胞生存率。图9B的结果显示，所制备的生物砖在4℃下保存3小时后，生物砖中的细胞仍然保持高活力(存活率为90％)。
图9C显示了在将生物砖制备成生物墨汁并进行生物打印后，立即进行的生物砖中细胞活力的分析结果。在图9C中，高亮点为红色荧光(代表死细胞)，低亮点为绿色荧光(代表活细胞)。如图9A，使用image pro plus软件计算细胞生存率。图9C的结果显示，将生物砖制备成生物墨汁并立即进行生物打印后，生物砖中的细胞仍然保持高活力(存活率为97％)。
图9D显示了所制备的生物砖在37℃下，在H-DMEM培养基中培养5天后，生物砖中细胞活力的分析结果。在图9D中，高亮点为红色荧光(代表死细胞)，低亮点为绿色荧光(代表活细胞)。如图9A，使用image pro plus软件计算细胞生存率。图9D的结果显示，所制备的生物砖在37℃下培养5天后，生物砖中的细胞仍然保持高活力(存活率为95％)。
细胞的粘附和伸展
将包含HepG2细胞的生物砖在37℃，5％CO2，含10％FBS(胎牛血清)的H-DMEM培养基中培养5天，以允许细胞伸展，增殖，并建立生物砖内的细胞之间的连接(即，粘附)。如上文所述的，使用钙黄绿素(绿色荧光)和碘化丙啶(红色荧光)对生物砖进行双重染色，并使用激光共聚焦显微镜进行观察。观察结果示于图10A-10B中。
图10A-10B显示了使用共聚焦显微镜观察通过实施例1方法制备的生物砖中细胞的粘附和伸展的分析结果，其中，所述生物砖用钙黄绿素(绿色荧光)和碘化丙啶(红色荧光)进行了双重染色；所使用的细胞为HepG2细胞，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。
图10A显示了在培养生物砖第1天，使用共聚焦显微镜观察到的照片(放大倍数：40倍)，其中细胞呈圆形，未粘附伸展。图10B显示了培养所述生物砖5天后，使用共聚焦显微镜观察到的照片(放大倍数：200倍)，其中细胞粘附伸展。图10A-10B的结果表明，在培养5天后，生物砖内的细胞伸展并建立细胞间连接。
细胞的增殖
将包含HepG2细胞的生物砖(100个细胞/生物砖)在37℃，5％CO2，含10％FBS(胎牛血清)的H-DMEM培养基中培养5天，以允许细胞增殖。随后，使用DAPI(蓝色荧光)和EdU(红色荧光)对细胞进行双重染色，并使用激光共聚焦显微镜进行观察。观察结果示于图11中。
图11显示了使用共聚焦显微镜观察生物砖中的细胞增殖的分析结果(放大倍数：200倍)，其中，所述生物砖用DAPI(蓝色荧光)和EdU(红色荧光)进行了双重染色；所使用的细胞为HepG2细胞，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。图11的结果表明，在培养5天后，生物砖内的细胞处于增殖状态。
生物砖与细胞微球的比较
在本实验中，将本发明生物砖中的细胞增殖/连接情况与通过传统方法制备的细胞微球中的细胞增殖/连接情况进行了比较。
通过下述传统方法来制备细胞微球：使用造粒仪，用海藻酸钠直接包裹细胞，以形成细胞液滴；随后，将细胞液滴置于CaCl2溶液中，以使海藻酸钠在钙离子的作用下形成海藻酸钙，从而将细胞液滴交联固化成细胞微球。
另外，通过实施例1的方法来制备生物砖，其中，所使用的细胞为HepG2细胞，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。
将如上制备的细胞微球和生物砖于37℃、5％CO2环境下培养7天。并且，在培养之前和培养7天后，用钙黄绿素(绿色荧光)对细胞微球和生物砖进行染色。染色结果示于图12A-12E中。
图12A-12B显示了通过传统方法制备的细胞微球在培养过程中的细胞增殖情况(标尺为500μm)。结果显示，与培养之前(图12A)相比，培养7天后(图12B)的细胞微球中的细胞增殖不明显，细胞呈圆形，散在分布，细胞之间未建立连接。
图12C-12D显示了使用实施例1方法制备的生物砖在培养过程中的细胞增殖情况(标尺为500μm)。结果显示，与培养之前(图12C)相比，培养7天后(图12D)的生物砖中的细胞增殖明显，细胞在生物砖中伸展、粘附，并相互连接在一起。
图12E显示了使用实施例1方法制备的生物砖在培养7天后的显微照片(标尺为100μm)。结果显示，生物砖中的HepG2细胞之间相互连接，形成有机的整体。
图12A-12E的结果表明，与传统方法制备的细胞微球相比，本发明的生物砖能够更好地促进细胞的增殖，促进细胞之间建立连接。这对于后续的组织形成具有重要意义。
细胞间连接的建立-1
在本实验中，使用共聚焦显微镜观察生物砖内部的细胞间连接的建立。
通过实施例1的方法来制备生物砖，其中，所使用的细胞为HepG2，其用celltracker Green CMFDA(绿色荧光)进行标记，以及人HUVEC细胞，其用tracker CM-Dil(红色荧光)进行标记；壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。将所制备的生物砖于37℃、5％CO2环境下培养7天，随后用共聚焦显微镜进行观察。观察结果示于图13中。
图13显示了使用共聚焦显微镜观察培养7天后的生物砖的结果(图中标尺为100μm)，其中，所使用的生物砖同时包含用绿色荧光标记的HepG2细胞和用红色荧光标记的HUVEC细胞，并且图中的黄色区域是由红色荧光和绿色荧光叠加所致，这表明HepG2细胞和HUVEC细胞之间建立了连接。结果显示，生物砖内部的HepG2细胞之间、HUVEC细胞之间以及HepG2细胞与HUVEC细胞之间均建立了细胞间连接。
细胞间连接的建立-2
本实验中，使用共聚焦显微镜观察生物砖之间的细胞连接的建立情况。
通过实施例1方法来制备生物砖，其中，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。生物砖于37℃、5％CO2环境下培养7天后，用共聚焦显微镜进行观察。结果如图14A-14C所示。
图14A显示了使用共聚焦显微镜观察培养7天后的生物砖的结果(图中标尺为100μm)，其中，所使用的生物砖包含分别用cell tracker Green CMFDA(绿色荧光)标记的HepG2细胞和HUVEC细胞。结果显示，两个生物砖的细胞之间建立了细胞连接，如方框中的桥状结构所显示的。
图14B显示了使用共聚焦显微镜观察培养7天后的生物砖的结果(图中标尺为500μm)，其中，使用了两种生物砖：一种生物砖包含用cell tracker Green CMFDA(绿色荧光)标记的HepG2细胞，且另一种生物砖包含用tracker CM-Dil(红色荧光)标记的HUVEC细胞；并且，图中的黄色区域是由红色荧光和绿色荧光叠加所致。结果显示，表达红色荧光的生物砖与表达绿色荧光的生物砖之间建立了细胞连接，如图中的黄色区域所显示的。
图14C显示了使用共聚焦显微镜观察培养7天后的生物砖的结果(图中标尺为500μm)，其中，所使用的生物砖包含用cell tracker Green CMFDA(绿色荧光)标记的HepG2细胞和HUVEC细胞；并且，图中的各个白色圆环分别表示一个生物砖。结果显示，不同生物砖的细胞之间建立了细胞连接，并形成有机的整体。
本实施例的结果显示，细胞在本发明的生物砖内具有高活力(存活率为98％以上)，并且能够在生物砖内正常生长，增殖，伸展和分化。此外，本实施例的结果还显示，生物砖内部的细胞之间以及不同生物砖的细胞之间能够建立细胞间连接。这表明，本发明的生物砖以及其制备方法能够有效保持细胞的活力，并且能够促进细胞在生物砖内增殖，促进细胞之间建立连接，从而可有利地用于下游的各种应用，例如生物打印。
实施例9.包含MSC细胞的生物砖的制备及应用
使用与实施例1类似的方法，利用造粒仪，制备了包裹MSC细胞的生物砖，其中，所使用的细胞为来自原代培养的大鼠的MSC细胞(其用cell tracker dil标记红色荧光)，核层材料为I型胶原，壳层材料为聚赖氨酸。
将包含MSC细胞的生物砖在37℃，5％CO2的环境下进行培养，以允许细胞伸展，增殖，并建立细胞之间的连接。使用显微镜来观察培养之前、培养7天后以及培养9天后的包含MSC细胞的生物砖，结果示于图15中。
图15显示了包含MSC细胞的生物砖的显微照片，其中，图15A显示了培养第2天的包含MSC细胞的单个生物砖(标尺为100μm)；图15B显示了培养7天后的包含MSC细胞的生物砖(标尺为500μm)；图15C显示了培养9天后的包含MSC细胞的生物砖(标尺为500μm)。结果显示，培养7天后，多个包含MSC细胞的生物砖相互融合(如图15B中的白色箭头所指示的)；并且，培养9天后，包含MSC细胞的生物砖完全融合，形成有机整体(如图15C所显示的)。
实施例10.包含MSC细胞和诱导因子的生物砖的制备
本实施例提供了制备包含MSC细胞和诱导因子的生物砖的示例性方法。生物砖的制备方法应当在无菌条件下进行。此外，如果意欲将生物砖应用于人体的话，那么其制备方法的生物安全等级应当达到GMP车间级别。
本方法所使用的仪器为造粒仪(BUCHI，Encapsulator，B-395Pro)，其配备的同心喷嘴的直径如下：内层喷嘴，200μm；外层喷嘴，300μm。
本方法所使用的材料如下：
(1)用于制备核层的材料
海藻酸钠：使用去离子水溶解稀释；
I型胶原：4mg/ml，使用无菌1M NaOH进行中和；
在I型胶原中添加下述因子：
(a)诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子：0.1μM地塞米松、0.05mM抗坏血酸、以及10mM甘油磷酸；用于制备第一生物砖。或者
(b)诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子：10ng/mlTGF-β3、100nM地塞米松、50μg/ml的2-磷酸抗坏血酸、100μg/ml丙酮酸钠、40μg/ml脯氨酸以及胰岛素-转铁蛋白-硒溶液(ITS+,Collaborative Biomedical,Bedford,MA,USA)；用于制备第二生物砖。
将I型胶原与2％(w/v)(即，2g/100ml)海藻酸钠以1:1的比例(按重量计)混合，用于制备核层。
(2)用于制备壳层的材料
4％海藻酸钠；
弹性蛋白；
壳层固定液，即，0.1mol/L CaCl2溶液。
(3)所使用的细胞：MSC细胞(购买自ATCC)。
制备生物砖的操作步骤如下(以下实验步骤均在冰上操作)：
将120μl NaOH溶液与750μl I型胶原混合，然后向其中加入130μlMSC细胞悬液(细胞浓度为1x 105个/ml，悬浮于PBS中)，从而获得1ml细胞包裹液。然后，将细胞包裹液与1ml2％海藻酸钠混合，使细胞均匀分散，从而获得包裹细胞的核层材料。
向2ml 4％海藻酸钠溶液中加入100ng弹性蛋白(elastin，其终浓度为50ng/ml)，充分混匀，该混合物用作壳层材料，用于制备生物砖的壳层。此外，取300ml 0.1mol/LCaCl2溶液置于烧杯中，用于壳层材料的固定。
将如上制备的核层材料和壳层材料分别置于2支5ml注射器中。按照制造商的说明书，设置造粒仪的压力、离散力、泵的速度等参数，然后使用所述核层材料和壳层材料进行造粒和包被。造粒仪的内喷嘴的直径设置为200μm，外喷嘴的直径设置为300μm。将获得的生物砖微粒收集于装有300ml 0.1mol/L CaCl2溶液的烧杯中，固定5min，制备获得第一生物砖和第二生物砖。所制备的生物砖可以在4℃下保存，或可直接用于3D生物打印。
实施例11.包含MSC细胞和诱导因子的生物砖的表征
使用显微镜来观察通过实施例10的方法制备的第一生物砖，结果示于图16A-16B中。图16A显示了通过实施例10的方法制备的第一生物砖在37℃，5％CO2下培养1天后的显微照片。结果显示，细胞正常生长，但未出现分化。图16B显示了通过实施例10的方法制备的第一生物砖在37℃，5％CO2下培养10天后经茜素红染色的显微照片，其中，粗箭头所指处为一个完整的生物砖，细箭头所指处为钙结节。结果显示，生物砖内出现大量钙结节，如细箭头所指示的。这表明，第一生物砖中的MSC细胞向成骨细胞分化。
实施例12.包含内皮细胞和间充质干细胞的生物砖的制备
本实施例的制备方法中所采用的材料与细胞：
核材料：4mg/ml的I型胶原，使用无菌1M NaOH进行中和；
壳材料：1wt％聚赖氨酸；
种子细胞：HUVEC与MSC按1：10进行共混，细胞总浓度为3.7x106/ml；
本实施例的制备生物砖的方法的步骤如下：
(1)制备U型底超疏水孔板：在超净室内将U型底孔板用酒精清洗干净后，将U型底孔板置入过氧化氢/浓硫酸溶液(30％(v/v)，H2O2:H2SO4＝1:3)中，80℃反应1小时，以进行羟基化处理。将羟基化的U型底孔板放入浓度为1％的1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基硅烷(Sigma)溶液中12h，再在100℃烘箱中加热4h，以进行硅化处理。最后，清洗U型底孔板并风干。
(2)制备含种子细胞的胶原溶液：将120μl NaOH溶液(1mol/L)与750μl I型胶原(4mg/mL)混合，然后向其中加入130μl以1:10进行混合的HUVEC与经Tracker CM-Dil标记的大鼠MSC细胞的混合悬液(细胞总浓度为3.7x106/ml，悬浮于PBS中)，获得混合了种子细胞的胶原溶液。
(3)制备聚赖氨酸-FITC溶液：将经FITC(绿色荧光)标记的聚赖氨酸(Sigma，数均分子量Mn为150,000-300,000)溶于pH7.2的DMEM高糖培养基，得到浓度为1wt％的聚赖氨酸溶液。
(4)胶原滴加(形成核层结构)：采用能够吸取和排出纳升级液体的电子式吸取装置(例如Eppendorf Xplorer 0.5-10uL或TransferpetteElectronic 0.5-10uL，借助他们的分液功能，每分液量最低可达到0.1μl；或者采用SGE自动进样器1μl或0.5μl，可分别实现10次和5次的0.1μl液体滴定，特殊地，可选用锥形特质针头进行滴定，提高精确度)精密吸取0.1μl步骤2制备的I型胶原溶液，滴入步骤1制备的U型底超疏水孔板中，形成液滴，在37℃恒温保持30min，使其成型。
(5)滴加聚赖氨酸-FITC溶液(壳层结构)：更换吸头后，精密吸取0.5μl步骤3制备的聚赖氨酸-FITC溶液，在超疏水孔板中央位置将其滴入步骤4中成型的核层表面，反应10min，以形成包含HUVEC和MSC的生物砖。
实施例13.三维构建体的生物打印
本实施例示例性地使用包含根据实施例1描述的方法制备的生物砖的生物墨汁，通过生物打印方法，构建了三维构建体(例如血管)。
图17示意性地描述了使用本发明的生物砖/生物墨汁来生物打印血管的流程图。具体而言，该方法包含下述步骤：
(1)用DIO(绿色)、Mitochacker(红色)和hoechst(蓝色)对血管的内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞进行染色，然后采集大鼠血管的生物学信息，并构建血管结构数字模型。根据该模型，血管分为三层结构，即，位于最内层的血管内皮细胞，位于中间层的血管平滑肌细胞，以及位于最外层的成纤维细胞。
(2)使用实施例1中描述的方法，构建包含血管内皮细胞的生物砖、包含血管平滑肌细胞的生物砖、以及包含成纤维细胞的生物砖。其中，所使用的血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和成纤维细胞分别为来源于大鼠的原代培养的细胞；所使用的核层材料和壳层材料如实施例1所述。另外，为了促进细胞增殖和分化，在包含血管内皮细胞的生物砖核层中添加血管内皮生长因子(VEGF)；在包含血管平滑肌细胞的生物砖核层中添加血小板源生长因子(PDGF)；在包含成纤维细胞的生物砖核层中添加成纤维细胞生长因子(FGF)。
所制备的包含血管内皮细胞的生物砖大小为约30μm，内含2-3个血管内皮细胞；包含血管平滑肌细胞的生物砖大小为约200μm，内含50个左右的血管平滑肌细胞；包含成纤维细胞的生物砖大小为约100μm，内含10个左右的成纤维细胞。
(3)将生物粘合剂分别与前一步骤获得的3种生物砖混合，制备获得三种生物墨汁。所使用的生物粘合剂为海藻酸钠+明胶；生物粘合剂与生物砖的用量比为1:4(按重量计)。
应当注意的是，步骤(1)可以在步骤(2)和(3)之前，与之同时，或之后进行。
(4)使用3D生物打印机，以旋转打印方式进行打印。打印过程中，以血管结构数字模型为模板，使用对应的生物墨汁进行生物打印，其中，如图2所示，血管的最内层结构使用包含含有血管内皮细胞的生物砖的生物墨汁进行打印，中间层结构使用包含含有血管平滑肌细胞的生物砖的生物墨汁进行打印，最外层结构使用包含含有成纤维细胞的生物砖的生物墨汁进行打印。生物砖通过生物粘合剂而固化，形成血管前体。
(5)将血管前体置于三维培养箱中，在37℃，5％CO2的条件下使用常规细胞培养基(H-DMEM培养基+10％胎牛血清)对血管前体进行培养。培养过程中，可对血管前体施加物理刺激，例如剪切力。连续培养7-10天，使血管前体形成血管。
实施例14.人工肝脏组织的生物打印
使用实施例12中描述的方法来制备生物砖，其中，使用以10:1的比例混合的脂肪来源的间充质干细胞(MSC)与原代培养的肝脏细胞(Hepatocyte)的混合物作为种子细胞；使用I型胶原作为核材料；并且，使用聚赖氨酸作为壳材料。使用3D生物打印机，将制备好的生物砖进行生物打印，并置于37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的H-DMEM环境下培养7天，以制备人工肝脏组织。随后，对获得的人工肝脏组织进行HE染色和针对白蛋白的免疫组化染色，结果示于图18。图18的HE染色结果显示，在使用生物砖打印获得的人工肝脏组织中，细胞呈条索状排列，且该人工组织产生了类似肝小叶的结构，与正常肝脏组织相似。此外，图18的免疫组化染色结果显示，处于人工肝脏组织内部的肝脏细胞能够正常分泌肝脏特异性蛋白——白蛋白(Albumin)，而处于边缘的非肝脏细胞则不表达白蛋白。这些实验结果表明，本发明的生物砖可用于生物打印人工肝脏组织。
实施例15.包含微血管的构建体的生物打印
使用3D生物打印机，将实施例12中制备好的生物砖以环样结构进行打印，并置于37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的H-DMEM环境下培养9天。将培养后的人工组织体进行切片，并使用CD31抗体(RD,US)对切片进行染色。染色结果示于图19。结果显示，使用生物砖打印获得的人工组织内出现了大量的微血管(图19)。这些实验结果表明，所制备的生物砖可用于生物打印包含微血管的构建体。
实施例16.不同种类和比例的种子细胞对微血管形成的影响
使用实施例12中描述的方法，采用下表描述的细胞组合制备生物砖。然后，使用实施例15描述的方法，将制备的生物砖打印、培养、切片染色，并观察所获得的人工组织内的微血管结构。结果分别示于图20A-20G。
表4
Figure BDA0001552026420001041
Figure BDA0001552026420001051
注：BMSC：骨髓来源的间充质干细胞；SMC:血管平滑肌细胞；HUMSC:人脐带间充质干细胞。
这些实验结果表明，当种子细胞为HUVEC和BMSC时，采用1:1.5至1:20之间不同比例的HUVEC和BMSC的组合均可以见到微血管形成，尤其是当HUVEC和BMSC的比例为1:10时，能够形成大量的微血管(图20A-20D)。另外，当种子细胞中除了HUVEC和BMSC，还存在大鼠肝脏细胞时，也可以见到微血管形成(数据未显示)。特别地，当HUVEC:肝脏细胞：BMSC＝1:1:10时，可以见到大量微血管(图20E)。此外，当种子细胞中除了HUVEC和BMSC，还存在SMC(血管平滑肌细胞)时，也可以观察到微血管形成(图20F)。此外，当种子细胞为HUVEC和HUMSC时，采用1:1.5至1:20之间不同比例的HUVEC和HUMSC的组合也可以见到微血管形成(数据未显示)。例如，当HUVEC和HUMSC的比例为1:3时，可以见到微血管形成(图20G)。
实施例17：生物砖的应用
组织再生
本实施例提供了示例性的组织再生方法，其用于修复皮肤中的大伤口，避免大伤口的天然恢复过程所可能导致的大的伤疤。
首先，使用医学成像方法来扫描伤口，以获得皮肤以及伤口部位的结构信息。
其次，基于医学成像数据，根据伤口的结构信息和皮肤组织的细胞分布信息，构建数字修复模型。进一步，基于数字修复模型，制备相应类型的生物砖，包括含有成纤维细胞的生物砖，含有内皮细胞的生物砖。随后，根据数字修复模型，将这些生物砖用于直接在伤口上进行生物打印。
在某些情况下，生物砖中的细胞来源于获自相同受试者的自体干细胞。在生物打印后，生物砖中的细胞在伤口部位的不同层和微环境中增殖和分化，形成了相应的组织层和结构，从而修复了皮肤的伤口。
实施例18：构建体的各种应用
使用构建体来体外研究组织发育
制备多种生物砖，其各自包含不同类型的干细胞。根据目的组织的细胞分布模式，使用所制备的生物砖进行生物打印，获得相应的构建体(即，组织前体)。在合适的条件下，体外培养所获得的组织前体，以使其发育为目的组织。将生物砖中的细胞暴露于可能影响组织发育的候选试剂或试剂组合。然后，观察整个发育过程中，生物砖中的细胞的变化以及组织发育过程的变化。
移植物免疫学的体内研究
制备包含来源于即将接受组织移植的受试者(实验动物)的细胞的生物砖。使用所制备的生物砖进行生物打印，以获得组织前体或人工组织。随后，将组织前体或人工组织植入受试者中，并观察受试者对组织前体或人工组织的免疫学应答，包括生物相容性和免疫排斥。
药物发现
制备合适的生物砖，并将其打印为与药物功能相关的人工组织。根据制备过程中所使用的条件，例如生物砖中的细胞的来源，生物砖的核层中包含的试剂或刺激，或培养条件，此类人工组织可以为健康组织或患病组织。将所获得的人工组织暴露于一组化合物，并任选地，将各种化合物对患病的人工组织的作用与相同化合物对相应健康的人工组织的作用进行比较，从而确定各种化合物对与该组织相关的疾病的治疗效果。还基于化合物对健康的人工组织的影响来确定各种化合物的毒性和副作用。随后，将具有最佳治疗效果和/或最低毒性和副作用的化合物，或者在治疗效果与副作用之间取得最佳平衡的化合物确定为前导化合物，用于进一步的药物研发。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (244)

1.一种生物砖，其是生物打印的基本单元，且包括：细胞，包裹细胞的核层，和，封装核层的壳层；所述核层和壳层各自独立地由生物相容性的生物可降解材料制成；所述生物砖具有一定的力学强度，从而能够实现立体堆积；所述生物砖具有0.01-0.4GPa的硬度，和，具有0.01-10MPa的弹性模量；所述生物砖包括3个、4个或5个壳层，并且各个壳层各自独立地由生物可降解材料制成；所述壳层的厚度各自独立地为2-50μm；用于制备核层的所述生物可降解材料选自：胶原蛋白、壳聚糖、透明质酸以及其任意组合；用于制备壳层的所述生物可降解材料选自：明胶、胶原蛋白、透明质酸、海藻酸钠、聚赖氨酸、纤维蛋白、壳聚糖以及其任意组合。
2.权利要求1的生物砖，其中，所述壳层不包含细胞。
3.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖包括至少一个核层。
4.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个核层。
5.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖包括至少2个核层，并且各个核层各自独立地由生物可降解材料制成，和/或，各个核层各自独立地包裹相同或不同的细胞或细胞组合。
6.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖的最外侧包含至少一个壳层。
7.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖具有0.01-0.02、0.02-0.03或0.03-0.04GPa的硬度；和/或，具有0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.5-0.8、0.8-1、1-1.2、1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2、2-2.4、2.4-2.8、2.8-3.2、3.2-4或4-10MPa的弹性模量。
8.权利要求1的生物砖，其中，所述核层能够为细胞的生命活动提供微环境。
9.权利要求1的生物砖，其中，所述核层为凝胶状。
10.权利要求1的生物砖，其中，所述壳层为包裹的细胞提供了力学保护。
11.权利要求1的生物砖，其中，所述壳层各自独立地具有0.01-0.02、0.02-0.03或0.03-0.04GPa的硬度；和/或，具有0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.5-0.8、0.8-1、1-1.2、1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2、2-2.4、2.4-2.8、2.8-3.2、3.2-4或4-10MPa的弹性模量。
12.权利要求1的生物砖，其中，所述壳层能够为细胞的生命活动提供微环境。
13.权利要求1的生物砖，其中，不同的壳层的组成成分不同。
14.权利要求1的生物砖，其中，所述壳层各自任选地经过处理。
15.权利要求14的生物砖，其中，使用壳层固定液进行处理。
16.权利要求1的生物砖，其中，位于生物砖最外侧的壳层经过处理。
17.权利要求16的生物砖，其中，使用壳层固定液进行处理。
18.权利要求1的生物砖，其中，所述壳层各自独立地为通透性的。
19.权利要求18的生物砖，其中，所述壳层对于水，氧气，和营养物质是通透性的。
20.权利要求19的生物砖，其中，所述营养物质选自糖类、脂肪、蛋白质、氨基酸、矿物质、维生素、核苷酸。
21.权利要求20的生物砖，其中，所述糖类为葡萄糖。
22.权利要求19的生物砖，其中，所述营养物质包含短肽。
23.权利要求19的生物砖，其中，所述营养物质包含细胞因子。
24.权利要求1的生物砖，其中，所述壳层各自独立地具有用于生物砖内外物质交换的通道或孔。
25.权利要求24的生物砖，其中，所述通道的直径为10-20nm、20-50nm、50-100nm、100-150nm、150-200nm、200-250nm、250-300nm、300-350nm、350-400nm、400-500nm或至少500nm。
26.权利要求24的生物砖，其中，所述孔的直径为100-200nm、200-400nm、400-600nm、600-800nm、800-1000nm、1000-1500nm、1500-2000nm、2000-4000nm、4000-5000nm或至少5000nm。
27.权利要求1的生物砖，其中，所述壳层的厚度各自独立地为2-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30或30-50μm。
28.权利要求1的生物砖，其中，所述核层和/或壳层各自独立地还包含额外的试剂。
29.权利要求28的生物砖，其中，所述额外的试剂包含营养物质。
30.权利要求28的生物砖，其中，所述额外的试剂包含细胞外基质。
31.权利要求28的生物砖，其中，所述额外的试剂包含细胞因子。
32.权利要求28的生物砖，其中，所述额外的试剂包含药物活性成分。
33.权利要求28的生物砖，其中，所述额外的试剂能够调控细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢。
34.权利要求28的生物砖，其中，所述额外的试剂能够促进细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢。
35.权利要求29的生物砖，其中，所述营养物质选自核苷酸，氨基酸，多肽，碳水化合物，脂质，维生素。
36.权利要求35的生物砖，其中，所述碳水化合物选自单糖、寡糖、多糖。
37.权利要求30的生物砖，其中，所述细胞外基质选自多糖；结构蛋白；粘着蛋白。
38.权利要求37的生物砖，其中，所述多糖选自糖胺聚糖、蛋白聚糖。
39.权利要求37的生物砖，其中，所述结构蛋白选自胶原和弹性蛋白。
40.权利要求37的生物砖，其中，所述粘着蛋白选自纤粘连蛋白和层粘连蛋白。
41.权利要求31的生物砖，其中，所述细胞因子是用于调控细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的细胞因子，选自：
-与细胞生长相关的细胞因子；
-与细胞分化相关的细胞因子；
-与细胞迁移相关的细胞因子；和/或
-与细胞新陈代谢相关的细胞因子。
42.权利要求41的生物砖，其中，所述与细胞生长相关的细胞因子选自胰岛素、类胰岛素生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤细胞生长因子、血小板来源生长因子、骨肉瘤来源生长因子、生长激素释放抑制因子、神经生长因子、白细胞介素、红细胞生长素、集落刺激因子、皮质醇、甲状腺素，或其任何组合。
43.权利要求42的生物砖，其中，所述类胰岛素生长因子选自IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ。
44.权利要求42的生物砖，其中，所述转化生长因子选自TGFα和TGFβ。
45.权利要求42的生物砖，其中，所述白细胞介素选自IL-1、IL-11、IL-3。
46.权利要求41的生物砖，其中，与细胞分化相关的细胞因子选自Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc，GATA4，TSP1，β-甘油磷酸钠，地塞米松，维生素C，胰岛素，IBMX，吲哚美锌，血小板衍生生长因子BB，5-氮杂胞苷，或其任何组合。
47.权利要求41的生物砖，其中，所述与细胞迁移相关的细胞因子选自环磷酸腺苷，三磷酸磷脂酰肌醇，基质细胞衍生因子-1、N-钙粘蛋白，核因子κB，骨连接素，血栓素A2，Ras，或其任何组合。
48.权利要求41的生物砖，其中，与细胞新陈代谢相关的细胞因子选自胰岛素生长因子1、TRIP-Br2、DKK-1、sRANKL、OPG、TRACP-5b、ALP、SIRT1(2-7)、PGC-1α，PGC-1β、OPG、IL-3、IL-4、IL-6、TGF-β、PGE2、G-CSF、TNF-α，或其任何组合。
49.权利要求32的生物砖，其中，所述药物活性成分为能够调控细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的试剂。
50.权利要求32的生物砖，其中，所述药物活性成分为能够促进细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的试剂。
51.权利要求32的生物砖，其中，所述药物活性成分选自rhIL-2、rhIL-11、rhEPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、rHuEPO、sTNF-R1、和rhTNF-α。
52.权利要求28的生物砖，其中，所述额外的试剂选自：转化生长因子以及成纤细胞生长因子。
53.权利要求52的生物砖，其中，所述转化生长因子为TGFβ。
54.权利要求28的生物砖，其中，所述额外的试剂选自：诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子。
55.权利要求54的生物砖，其中，所述诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子选自地塞米松、抗坏血酸和甘油磷酸。
56.权利要求28的生物砖，其中，所述额外的试剂选自：成纤维细胞生长因子即FGF、转化生长因子即TGF、血管内皮生长因子即VEGF、TNF-α、sTNF-R1和rhTNF-α。
57.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖的核层各自独立地包含1-106个细胞。
58.权利要求57的生物砖，其中，所述生物砖的核层各自独立地包含10-900个细胞。
59.权利要求57的生物砖，其中，所述生物砖的核层各自独立地包含20-800个细胞。
60.权利要求57的生物砖，其中，所述生物砖的核层各自独立地包含30-700个细胞。
61.权利要求57的生物砖，其中，所述生物砖的核层各自独立地包含40-600个细胞。
62.权利要求57的生物砖，其中，所述生物砖的核层各自独立地包含50-500个细胞。
63.权利要求57的生物砖，其中，所述生物砖的核层各自独立地包含60-400个细胞。
64.权利要求57的生物砖，其中，所述生物砖的核层各自独立地包含70-300个细胞。
65.权利要求57的生物砖，其中，所述生物砖的核层各自独立地包含80-200个细胞。
66.权利要求57的生物砖，其中，所述生物砖的核层各自独立地包含10-100个细胞。
67.权利要求57的生物砖，其中，所述生物砖的核层各自独立地包含10-103个细胞。
68.权利要求57的生物砖，其中，所述生物砖的核层各自独立地包含10-104个细胞。
69.权利要求57的生物砖，其中，所述生物砖的核层各自独立地包含10-105个细胞。
70.权利要求57的生物砖，其中，所述生物砖的核层各自独立地包含10-106个细胞。
71.权利要求1的生物砖，其中，所述细胞为干细胞。
72.权利要求71的生物砖，其中，所述干细胞为诱导的多能干细胞。
73.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖的尺寸为30-1900μm。
74.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖的尺寸为40-1800μm。
75.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖的尺寸为50-1700μm。
76.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖的尺寸为60-1600μm。
77.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖的尺寸为70-1500μm。
78.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖的尺寸为80-1400μm。
79.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖的尺寸为90-1300μm。
80.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖为球形，立方体，矩形棱柱，六棱柱，圆柱，或不规则的形状。
81.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖为固体或半固体。
82.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖为凝胶态。
83.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖以混合物的形式存在。
84.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖是分离的生物砖。
85.权利要求1的生物砖，其中，所述生物砖提供于容器中。
86.一种用于生物打印的生物墨汁，其包含权利要求1-85任一项的生物砖。
87.权利要求86的生物墨汁，其中，所述生物墨汁包含生物砖和载体。
88.权利要求87的生物墨汁，其中，所述载体包含生物粘合剂。
89.权利要求87的生物墨汁，其中，所述载体包含生物可降解材料。
90.权利要求89的生物墨汁，其中，所述载体中的生物可降解材料是生物相容性的。
91.权利要求89的生物墨汁，其中，所述载体中的生物可降解材料选自淀粉、透明质酸、层粘连蛋白及其任意组合。
92.权利要求87的生物墨汁，其中，所述载体还包含水，无机盐，或其任何组合。
93.权利要求87的生物墨汁，其中，所述载体还包含pH缓冲剂、稳定剂、防腐剂、或其任何组合。
94.权利要求87的生物墨汁，其中，所述载体为液体或半液体。
95.权利要求87的生物墨汁，其中，所述载体为凝胶。
96.权利要求87的生物墨汁，其中，所述载体的粘度为1-1000Pas。
97.权利要求96的生物墨汁，其中，所述载体的粘度为1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-12、12-14、14-16、16-18、18-20、20-25、25-30、30-50、50-80、80-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-800、或800-1000Pas。
98.权利要求96的生物墨汁，其中，所述载体的粘度为1-3、3-8、8-16、或30-160Pas。
99.权利要求96的生物墨汁，其中，所述载体的粘度为3-10、10-20、20-50、或50-160Pas。
100.权利要求87的生物墨汁，其中，所述载体包含额外的试剂。
101.权利要求100的生物墨汁，其中，所述载体包含的额外的试剂含有营养物质。
102.权利要求100的生物墨汁，其中，所述载体包含的额外的试剂含有细胞外基质。
103.权利要求100的生物墨汁，其中，所述载体包含的额外的试剂含有细胞因子。
104.权利要求100的生物墨汁，其中，所述载体包含的额外的试剂含有药物活性成分。
105.权利要求100的生物墨汁，其中，所述额外的试剂能够调控细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢。
106.权利要求100的生物墨汁，其中，所述额外的试剂能够促进细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢。
107.权利要求100的生物墨汁，其中，所述额外的试剂包括，维持或促进细胞的生命活动的营养物质；和/或，改善或调控细胞的生命活动的物质。
108.权利要求107的生物墨汁，其中，所述维持或促进细胞的生命活动的营养物质选自核苷酸，氨基酸，多肽，碳水化合物，脂质，维生素。
109.权利要求107的生物墨汁，其中，所述维持或促进细胞的生命活动的营养物质包括细胞培养基。
110.权利要求108的生物墨汁，其中，所述碳水化合物选自单糖，寡糖，多糖。
111.权利要求107的生物墨汁，其中，所述改善或调控细胞的生命活动的物质包含细胞因子。
112.权利要求107的生物墨汁，其中，所述改善或调控细胞的生命活动的物质包含细胞外基质。
113.权利要求107的生物墨汁，其中，所述改善或调控细胞的生命活动的物质包含抗凋亡剂。
114.权利要求107的生物墨汁，其中，所述改善或调控细胞的生命活动的物质包含抗氧化剂。
115.权利要求107的生物墨汁，其中，所述改善或调控细胞的生命活动的物质包含药物活性成分。
116.权利要求112的生物墨汁，其中，所述细胞外基质选自多糖；结构蛋白；粘着蛋白。
117.权利要求116的生物墨汁，其中，所述多糖选自糖胺聚糖、蛋白聚糖。
118.权利要求116的生物墨汁，其中，所述结构蛋白选自胶原和弹性蛋白。
119.权利要求116的生物墨汁，其中，所述粘着蛋白选自纤粘连蛋白和层粘连蛋白。
120.权利要求111的生物墨汁，其中，所述细胞因子是用于调控细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的细胞因子，选自：
-与细胞生长相关的细胞因子；
-与细胞分化相关的细胞因子；
-与细胞迁移相关的细胞因子；和/或
-与细胞新陈代谢相关的细胞因子。
121.权利要求120的生物墨汁，其中，所述与细胞生长相关的细胞因子选自胰岛素、类胰岛素生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤细胞生长因子、血小板来源生长因子、骨肉瘤来源生长因子、生长激素释放抑制因子、神经生长因子、白细胞介素、红细胞生长素、集落刺激因子、皮质醇、甲状腺素，或其任何组合。
122.权利要求121的生物墨汁，其中，所述类胰岛素生长因子选自IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ。
123.权利要求121的生物墨汁，其中，所述转化生长因子选自TGFα和TGFβ。
124.权利要求121的生物墨汁，其中，所述白细胞介素选自IL-1、IL-11、IL-3。
125.权利要求120的生物墨汁，其中，所述与细胞分化相关的细胞因子选自Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc，GATA4，TSP1，β-甘油磷酸钠，地塞米松，维生素C，胰岛素，IBMX，吲哚美锌，血小板衍生生长因子BB，5-氮杂胞苷，或其任何组合。
126.权利要求120的生物墨汁，其中，所述与细胞迁移相关的细胞因子选自环磷酸腺苷，三磷酸磷脂酰肌醇，基质细胞衍生因子-1、N-钙粘蛋白，核因子κB，骨连接素，血栓素A2，Ras，或其任何组合。
127.权利要求120的生物墨汁，其中，所述与细胞新陈代谢相关的细胞因子选自胰岛素生长因子1、TRIP-Br2、DKK-1、sRANKL、OPG、TRACP-5b、ALP、SIRT1(2-7)、PGC-1α，PGC-1β、OPG、IL-3、IL-4、IL-6、TGF-β、PGE2、G-CSF、TNF-α，或其任何组合。
128.权利要求115的生物墨汁，其中，所述药物活性成分为能够调控细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的试剂。
129.权利要求115的生物墨汁，其中，所述药物活性成分为能够促进细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的试剂。
130.权利要求115的生物墨汁，其中，所述药物活性成分选自rhIL-2、rhIL-11、rhEPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、rHuEPO、sTNF-R1、和rhTNF-α。
131.权利要求86的生物墨汁，其中，所述生物墨汁按重量比计包含10％-40％的生物砖。
132.权利要求86的生物墨汁，其中，所述生物墨汁为液体，半固体或固体组合物。
133.权利要求86的生物墨汁，其中，所述生物墨汁为凝胶。
134.权利要求86的生物墨汁，其中，所述生物墨汁为溶液、悬浮液、凝胶、或浓缩物。
135.权利要求86的生物墨汁，其中，所述生物墨汁是可挤出的生物墨汁。
136.权利要求89、90、91、94、95、96或100任一项所述的生物墨汁，其中，所述载体为生物粘合剂。
137.制备权利要求86的生物墨汁的方法，其包括下述步骤：将权利要求1-85任一项的生物砖与载体混合。
138.权利要求137的方法，其中，所述载体为生物粘合剂。
139.权利要求137的方法，其中，所述生物墨汁为权利要求87-135任一项所述的生物墨汁，和/或，所述载体如权利要求88-130任一项所限定。
140.权利要求139的方法，其中，所述载体为生物粘合剂。
141.一种构建体，其包含权利要求1-85任一项的生物砖或者使用权利要求1-85任一项的生物砖或权利要求86的生物墨汁而制备。
142.权利要求141的构建体，其中，所述构建体是三维构建体，组织前体，组织或器官。
143.权利要求141的构建体，其中，所述构建体是活的构建体。
144.权利要求141的构建体，其中，所述构建体包含多个生物砖。
145.权利要求144的构建体，其中，所述生物砖以预定的模式排布。
146.权利要求141的构建体，其中，所述构建体的尺寸为30-50μm、50-100μm、100-200μm、200-500μm、500μm-1mm、1-2mm、2-5mm、5mm-1cm、1-2cm、2-5cm、5-10cm、10-20cm、20-50cm、或至少50cm。
147.权利要求146的构建体，其中，所述构建体为三维构建体，组织前体，组织或器官。
148.权利要求141的构建体，其中，所述构建体的至少一个部分是通过生物打印而制备的。
149.权利要求141的构建体，其中，所述构建体具有预先确定的结构。
150.权利要求141的构建体，其中，所述构建体具有一层或多层结构。
151.权利要求150的构建体，其中，每一个层结构各自由一层或多层生物砖构建。
152.权利要求141的构建体，其中，所述构建体为微型组织块。
153.权利要求152的构建体，其中，所述微型组织块的尺寸为微米至厘米级别。
154.权利要求153的构建体，其中，所述微型组织块的尺寸为1μm-50cm。
155.权利要求153的构建体，其中，所述微型组织块的尺寸为10μm-10cm。
156.权利要求153的构建体，其中，所述微型组织块的尺寸为50μm-1cm。
157.权利要求153的构建体，其中，所述微型组织块的尺寸为100μm-800μm。
158.权利要求153的构建体，其中，所述微型组织块的尺寸为300μm-600μm。
159.权利要求141的构建体，其中，所述构建体被进行进一步的培养。
160.权利要求159的构建体，其中，所述构建体被培养0-1、1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、11-12、12-13、13-14、14-15、15-16、16-17、17-18、18-19、19-20、20-21、21-25、25-30、或至少30天。
161.权利要求141的构建体，其中，所述构建体的生物砖中的细胞能够生长，增殖，分化、分泌和/或迁移。
162.权利要求141的构建体，其中，所述构建体具有片状结构，或中空管状结构，或中空三维结构，或实心三维结构，或其任何组合。
163.权利要求162的构建体，其中，所述片状结构选自长方形，正方形，圆形，椭圆形，六角形或不规则形状的片状结构。
164.权利要求162的构建体，其中，所述中空三维结构选自中空立方体，中空球体，中空的矩形棱柱体，中空圆柱体，或中空的不规则形状的三维结构。
165.权利要求162的构建体，其中，所述实心三维结构选自实心立方体，实心球体，实心矩形棱柱体，实心圆柱体，或实心不规则形状的三维结构。
166.权利要求141的构建体，其中，所述构建体模拟天然组织或器官的形状。
167.权利要求141的构建体，其中，所述构建体包括三层结构，即，内皮细胞层，平滑肌细胞层和成纤维细胞层。
168.一种制备构建体的方法，其包括，使用权利要求1-85任一项的生物砖或权利要求86的生物墨汁进行生物打印的步骤。
169.权利要求168的方法，其中，所述构建体为三维构建体、组织前体、组织或器官。
170.权利要求168的方法，其中，所述方法产生了具有预定模式的构建体。
171.权利要求170的方法，其中，所述预定模式为任何预定形状。
172.权利要求170的方法，其中，所述构建体为三维构建体、人工组织或其前体。
173.权利要求170的方法，其中，所述构建体具有片状结构、或中空管状结构、或中空三维结构、或实心三维结构、或其任何组合。
174.权利要求173的方法，其中，所述片状结构为长方形、正方形、圆形、椭圆形、六角形或不规则形状的片状结构。
175.权利要求173的方法，其中，所述中空三维结构为中空立方体、中空球体、中空的矩形棱柱体、中空圆柱体或中空的不规则形状的三维结构。
176.权利要求173的方法，其中，所述实心三维结构为实心立方体、实心球体、实心矩形棱柱体、实心圆柱体或实心不规则形状的三维结构。
177.权利要求170的方法，其中，所述构建体模拟天然组织或器官的形状。
178.权利要求168的方法，其中，所述方法使用了至少1种生物墨汁。
179.权利要求178的方法，其中，所述方法使用了2、3、4、5、6、7、8、9、或10种生物墨汁。
180.权利要求168的方法，其中，所述方法中的生物打印步骤是连续的和/或基本连续的。
181.权利要求168的方法，其中，所述方法包括，连续地生物打印多个层，以获得具有预定模式的、包含多个层的三维构建体，其中每个层根据预定的模式用权利要求86的生物墨汁进行生物打印。
182.权利要求168的方法，其中，所述方法包括，连续地生物打印多个区段，以获得具有预定模式的、包含多个区段的三维构建体，其中每个区段根据预定的模式用权利要求86的生物墨汁进行生物打印。
183.权利要求168的方法，其中，所述方法还包括，使用权利要求1-85任一项所述的生物砖以及任选的载体制备生物墨汁的步骤。
184.权利要求183的方法，其中，所述载体为生物粘合剂。
185.权利要求168的方法，所述方法还包括，根据天然组织或器官的形状和/或细胞排布模式，建立构建体的结构模型的步骤。
186.权利要求185的方法，其中，所述构建体为三维构建体。
187.权利要求168的方法，所述方法不会对生物墨汁中或生物砖内的细胞造成机械损伤。
188.权利要求187的方法，其中，所述生物墨汁中或生物砖内80％-85％、85％-87.5％、87.5％-90％、90％-92.5％、92.5％-95％、95％-98％、或至少98％的细胞在生物打印后能够存活、增殖、分化、分泌、迁移和/或具有正常的新陈代谢。
189.权利要求168的方法，其中，所述方法还包括，在允许生物砖内的细胞增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的条件下，培养所获得的构建体。
190.权利要求189的方法，其中，培养所获得的构建体0-1、1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、11-12、12-13、13-14、14-15、15-16、16-17、17-18、18-19、19-20、20-21、21-25、25-30、或至少30天。
191.权利要求189的方法，其中，在3D培养箱或生物反应器中培养所获得的构建体。
192.权利要求189的方法，其中，在培养过程中对构建体施加物理刺激和/或化学刺激。
193.权利要求192的方法，其中，所述物理刺激选自压力、剪切力、光照、加热。
194.权利要求192的方法，其中，所述化学刺激包含激素。
195.权利要求192的方法，其中，所述化学刺激包含细胞因子。
196.权利要求192的方法，其中，所述化学刺激包含化学试剂。
197.权利要求189的方法，其中，生物砖的核层和/或壳层和/或载体中的生物可降解材料在培养过程中至少一部分被降解。
198.权利要求189的方法，其中，生物砖内的和/或生物砖之间的细胞在培养过程中彼此连接。
199.权利要求168的方法，其中，所述方法产生了尺寸为30-50μm、50-100μm、100-200μm、200-500μm、500μm-1mm、1-2mm、2-5mm、5mm-1cm、1-2cm、2-5cm、5-10cm、10-20cm、20-50cm、或至少50cm的构建体。
200.通过权利要求168-199任一项所述的方法制备的构建体。
201.权利要求200的构建体，其中，所述构建体是三维构建体、组织前体、组织或器官。
202.权利要求200的构建体，其中，所述构建体是活的构建体。
203.权利要求1-85任一项的生物砖的用途，所述生物砖用于生物打印。
204.权利要求203的用途，其中，所述生物砖用于3D生物打印。
205.权利要求1-85任一项的生物砖的用途，所述生物砖用于通过生物打印而制备构建体。
206.权利要求205的用途，其中，所述构建体为三维构建体。
207.权利要求205的用途，其中，所述构建体为组织前体、组织或器官。
208.权利要求86的生物墨汁的用途，其用于生物打印。
209.权利要求208的用途，其中，所述生物打印为3D生物打印。
210.权利要求86的生物墨汁的用途，其用于通过生物打印而制备构建体。
211.权利要求210的用途，其中，所述构建体为三维构建体。
212.权利要求210的用途，其中，所述构建体为组织前体、组织或器官。
213.权利要求141或200的构建体的用途，其用于研究干细胞分化，所述用途用于非诊断或治疗目的。
214.权利要求141或200的构建体的用途，其用于药物发现，所述用途用于非诊断或治疗目的。
215.权利要求141或200的构建体的用途，其用于药物筛选，所述用途用于非诊断或治疗目的。
216.权利要求141或200的构建体的用途，其用于体外测定，所述用途用于非诊断或治疗目的。
217.权利要求141或200的构建体的用途，其用于体外评估因子对组织或组织中的细胞的作用，所述用途用于非诊断或治疗目的。
218.权利要求141或200的构建体的用途，其用于体外三维组织培养，所述用途用于非诊断或治疗目的。
219.权利要求141或200的构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于研究干细胞分化。
220.权利要求141或200的构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于药物发现。
221.权利要求141或200的构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于药物筛选。
222.权利要求141或200的构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于体内或体外测定。
223.权利要求141或200的构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于植入宿主体内。
224.权利要求141或200的构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于组织工程。
225.权利要求141或200的构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于组织再生。
226.权利要求141或200的构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于分析细胞在体内响应刺激或试剂而产生的变化。
227.权利要求141或200的构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于研究体内微环境的影响。
228.权利要求141或200的构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于治疗有此需要的受试者。
229.权利要求141或200的构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于评估因子对组织或组织中的细胞的作用。
230.权利要求141或200的构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于三维组织培养。
231.权利要求141或200的构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于修复受试者中损伤组织。
232.权利要求226的用途，其中，所述变化为形态变化或功能变化。
233.权利要求217或229的用途，其中，所述因子选自化学试剂、物理刺激。
234.权利要求233的用途，其中，所述化学试剂为化合物。
235.权利要求233的用途，其中，所述物理刺激为辐射或加热。
236.一种试剂盒，其包含权利要求1-85任一项的生物砖，权利要求86的生物墨汁，和/或权利要求141或200的构建体。
237.权利要求236的试剂盒，其中，所述构建体为三维构建体、组织前体、组织或器官。
238.一种容器，其包含权利要求1-85任一项的生物砖。
239.一种体外评估因子对组织或组织中的细胞的作用的方法，其包括，将权利要求141或200的构建体暴露于所述因子，和，评估所述构建体中的细胞响应所述因子的变化，从而确定所述因子对组织或组织中的细胞的作用，所述方法用于非诊断或治疗目的。
240.权利要求239的方法，其中，所述因子选自化学试剂、物理刺激。
241.权利要求240的方法，其中，所述化学试剂为化合物。
242.权利要求240的方法，其中，所述物理刺激为辐射或加热。
243.权利要求239的方法，其中，所述构建体为三维构建体、组织前体、组织或器官。
244.权利要求239的方法，其中，所述变化为形态变化或功能变化。
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