CN107693662A - 一种益生菌芦荟液及其用于制备烧伤创面药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种益生菌芦荟液及其用于制备烧伤创面药物用途，该技术方案先利用库拉索芦荟原汁、葡萄糖和水按照一定配比制备发酵备用液，添加益生菌进行共发酵。通过设定不同的温度梯度和pH梯度，经活菌计数后，确定其最佳发酵条件；并采用益生菌芦荟液进行抑菌实验确定其抗菌效果；同时通过对其抗氧化性指标的测定，确定该益生菌芦荟液的抗氧化能力，如DPPH自由基清除能力的测定、铁离子螯合能力的测定和总还原力的测定等；动物实验表明，芦荟发酵液结痂能力显著高于对照组和商品化烫伤膏组，且无任何耐药性现象发生。本产品主要应用于烧伤的治疗和恢复，结合芦荟抗菌抗炎的能力和益生菌的益生功效，评价了益生菌芦荟液对烧伤的治疗效果。

Description

一种益生菌芦荟液及其用于制备烧伤创面药物用途

技术领域

本发明涉及烧伤治疗技术领域，具体涉及一种益生菌芦荟液及其用于制备烧伤创面药物用途。

背景技术

烧伤是火灾中较常见的创伤之一，它不仅会使皮肤损伤，而且还可深达肌肉骨骼，严重者能引起一系列的全身变化，如休克、感染等。烧伤深度可分为Ⅰ度、Ⅱ度和Ⅲ度。其中Ⅰ度烧伤损伤最轻，烧伤皮肤发红、疼痛、明显触痛、有渗出或水肿；Ⅱ度烧伤损伤较深，皮肤水疱。水疱底部呈红色或白色，充满了清澈、粘稠的液体，触痛敏感，压迫时变白；Ⅲ度烧伤损伤最深，烧伤表面可以发白、变软或者呈黑色、炭化皮革状。一般烧伤发生后，需要注意对烧伤创面的保护，防止再次感染。另外创面一般不涂有颜色的药物(如红汞、紫药水等)，以免影响后续治疗中对烧伤创面深度的判断和清创。对浅度烧伤的水疱一般不予清除，大水疱仅作低位剪破引流，保留泡皮的完整性，起到保护创面的作用。

在烧伤的治疗中创面用药作用关键，一方面用于抑制微生物的定殖、保护创面，另一方面用于促进新生皮肤的发育。现有技术的烧伤创面用药主要是以广谱抗生素为主的各类抗菌剂，例如磺胺嘧啶银、磺胺咪隆等应用较为普遍；此外，天然药物在烧伤的治疗中也具有广泛的应用，主要为植物提取物所制成的膏剂或喷剂。现有技术的烧伤创面用药疗效仍有待提升，究其原因主要是在功效成分的选择及配伍方面未取得理想的效果。

芦荟属于天然的护肤品，含丰富的天然维生素A、B、C及E族维生素、矿物元素、氨基酸、芦荟多糖、酚类化合物等，这些基本营养素在保持机体活力和美容护肤的过程中起着重要的作用。其中，芦荟多糖能够调节机体的细胞免疫和体液免疫水平，激活皮肤基底层的朗罕细胞，增强其在皮肤局部的免疫功能和修复功能，促进其清除皮肤色素，降低抗氧化性损害(包括紫外线)，抗衰老和增加皮肤弹性等功效。尽管具有以上护肤性质，但有研究表明将芦荟提取物直接作用于烧伤创面时并未表现出理想的恢复效果，且存在一定的刺激性。

益生菌泛指一类对人和动物机体有益的菌，目前多应用于保健食品中。在现有技术的认知范围内，保证创面的清洁无菌是烧伤治疗的重要环节，因此应当尽可能杜绝创面与微生物的接触，在这种认知下，现有技术中用于烧伤创面治疗的生物制剂仅限于碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、蛋白酶等。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种益生菌芦荟液及其用于制备烧伤创面药物用途，以解决现有技术中用于烧伤创面治疗的外用药疗效不佳。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术中用于烧伤创面治疗的外用药可选类别有限。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种益生菌芦荟液，是由以下方法制备的：

1)取每片重量为300～400g的库拉索芦荟叶片，先用酒精擦拭叶片表面，而后去除表皮，用榨汁机榨取汁液，以6000rpm的转速离心10min，取上清，而后在55℃条件下水浴30min，得到芦荟原汁；

2)取植物乳酸杆菌、鼠李唐乳酸杆菌、德氏乳杆菌、婴儿双岐杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌菌株，活化后以活菌量为1:1:1:1:1:1的比例混合，得到复合益生菌悬液，以5％(g:g)的接种量将其加入至步骤1)所得的芦荟原汁中，得到发酵前液；

3)取若干份步骤2)所得的发酵前液，分别以温度25℃、30℃、37℃、42℃，pH值3、4、5、6、7、8、9的条件执行发酵，以发酵后发酵液中活菌浓度最大为依据选取对应的发酵条件，即得到最终发酵条件；

4)再取一份步骤2)所得的发酵前液，利用步骤3)所得的最终发酵条件进行发酵，所得发酵液即为所述益生菌芦荟液。

作为优选，步骤4)完成后，继续执行以下步骤5)：取活化的致病菌稀释至10⁸CFU/mL，取100μL菌液涂布于LB平板，菌液吹干后在平板中放入无菌的牛津杯，再向牛津杯中加入步骤4)所得的益生菌芦荟液上清，将所述LB平板于37℃培养，测量其抑菌圈直径。

作为优选，所述致病菌包括：鼠伤寒沙门氏菌，肠炎沙门氏菌，福氏志贺氏菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。

作为优选，步骤5)完成后，继续执行以下步骤6)：分别测定步骤4)所得益生菌芦荟液的DPPH自由基清除能力、铁离子螯合能力及总还原力。

作为优选，步骤6)完成后，继续执行以下步骤7)：取步骤4)所得的益生菌芦荟液，涂抹于烧伤创面上，观察其对皮肤的刺激性和恢复作用。

作为优选，步骤1)所得的芦荟原汁及步骤4)所得的益生菌芦荟液，在使用前均置于4℃条件下保存。

作为优选，步骤3)所得的最终发酵条件为：温度37℃，pH为7，发酵48h。

同时，本发明提供了上述益生菌芦荟液用于制备烧伤创面药物的应用。

本发明提供了一种益生菌芦荟液及其用于制备烧伤创面药物用途，该技术方案首先通过实验手段发现益生菌能利用皮肤汗腺排泄的无机盐、尿酸和尿素等物质作为生长因子和营养氮源，从而达到清洁皮肤的功效；在此基础上围绕烧伤创面保护效果对益生菌类别进行了甄选，尤其对不同益生菌的相互协同作用进行组合设计，最终确定了由植物乳酸杆菌、鼠李唐乳酸杆菌、德氏乳杆菌、婴儿双岐杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌菌株6种益生菌组成的复合益生菌液，该复合菌液代谢产生乳酸等有机酸可使皮肤的pH呈弱酸性，即皮肤正常的pH范围，从而达到平衡肌肤表面pH的功效；而且所产生的有机酸、双乙酰和小分子抗菌物质等能有效抑制皮肤表面有害菌的生长繁殖。

在此基础上，为了增进其皮肤修复效果，本发明将益生菌液与芦荟提取物进行了复配，并创新性的通过发酵方法提进行处理，一方面提升了菌体活力，另一方面对芦荟中大分子蛋白、多糖起到水解作用，小分子产物更有利于创伤皮肤的吸收，从而显著提升了烧伤皮肤创面的保护及恢复效果。本产品益生菌芦荟液基本无色，涂抹后清凉且无残留，安全方便，易于后续治疗。并且具有良好的抗菌抗氧化效果，同时结合了芦荟和益生菌护肤及修复皮肤的效果，对烧伤创面的治疗较单一成分具有更明显的效果。

具体来看，本发明先利用库拉索芦荟原汁、葡萄糖和水按照一定配比制备发酵备用液，添加益生菌进行共发酵。通过设定不同的温度梯度和pH梯度，经活菌计数后，确定其最佳发酵条件；并采用益生菌芦荟液进行抑菌实验确定其抗菌效果；同时通过对其抗氧化性指标的测定，确定该益生菌芦荟液的抗氧化能力，如DPPH自由基清除能力的测定、铁离子螯合能力的测定和总还原力的测定等。本产品主要应用于烧伤的治疗和恢复，结合芦荟抗菌抗炎的能力和益生菌的益生功效，评价了益生菌芦荟液对烧伤的治疗效果。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1(益生菌芦荟液发酵条件确定)

1、芦荟原汁制备：挑选新鲜、饱满、肉质肥厚的库拉索芦荟叶，剔除带有病斑、软腐的叶片，叶片均重约300～400g。用酒精擦拭叶片表面，去除表皮，采用榨汁机将叶肉榨成芦荟原汁，分装，6000rpm/min离心10min，取上清。采用巴氏消毒法将芦荟原汁灭菌，55℃水浴30min，待冷却于4℃冰箱保存，以备用。

2、发酵：选用二次活化后的6种益生菌按照1:1比例混合制备复合益生菌悬液，按5％接种量添加到芦荟原汁中，并辅以葡萄糖，进行共发酵。

3、发酵条件设定：分别以25℃、30℃、37℃、42℃设置温度梯度，并设置PH梯度为3、4、5、6、7、8、9；通过活菌计数法，确定复合益生菌的最佳发酵条件。

实施例1的结果表明，在37℃，PH＝7的条件下发酵48h，10000rpm/min 10离心后，发酵液澄清透亮。

实施例2(抑菌试验)

实验材料：益生菌、鼠伤寒、肠炎沙门、福氏志贺、大肠O157、单增ATCC、志贺301、金黄色葡萄球菌cowan1、库拉索芦荟、LB培养基、牛津杯。

实验步骤：

A活化益生菌、致病菌，过夜培养。

B将致病菌菌体浓度调至10⁸CFU/mL左右，分别取100μL菌液涂布于LB平板。

C待菌液吹干后，在平板中小心放入无菌的牛津杯；向牛津杯中加入益生菌芦荟液。

D 37℃培养6-8h，每隔2～3h观察。

E测量平板中的抑菌圈直径，并照相。

实验结果如表1所示。

表1益生菌芦荟液抑菌结果

以上结果表明，益生菌芦荟液对常见致病菌具有良好的抑制效果。

实施例3(抗氧化指标的测定及评价)

1、相关试剂：0.2mmol/L DPPH乙醇；150mmol/L pH 8.0Tris-Hcl；1.2mmol/L邻苯三酚；0.4％FeSO₄:FeSO₄·7H₂O；1％抗坏血酸；0.2mol/L氢氧化钠；10％三氯乙酸；0.1％邻二氮菲；pH为6.6磷酸缓冲液；0.1％三氯化铁。

2、确定最佳芦荟发酵液条件后以最佳条件进行发酵，发酵好后于4℃冰箱保存。

3、抗氧化指标的测定

A DPPH自由基清除能力的测定

取2ml益生菌芦荟液，加入0.2mol/LDPPH乙醇溶液2ml，黑暗下室温反应30min，然后用等体积的三氯甲烷抽提，取上清517nm测OD，对照为去离子水加DPPH溶液。

B羟基自由基清除能力的测定

取2mmol/L的硫酸亚铁溶液1mL,6mmol/L过氧化氢1mL，6mmol/L水杨酸1mL,并加入益生菌芦荟液1mL，静置30min，以蒸馏水为参比，在510nm处测定吸光度，计算羟自由基的清除率。

C 3.3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖

a标准曲线的制作：取8支15mm×180mm试管，分别编号为0至7，向其中依次加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.4、1.6、2.0mL的1mg/mL的葡萄糖标准溶液，然后用蒸馏水定容到2mL再依次加入1.5mL水杨酸，水浴5min，取出立即冷却到室温，加21.5mL蒸馏水，摇匀，在540nm处测定吸光度。

b样品中还原糖含量的测定：以标准曲线制作中0号为对照，向15mm×180mm试管中加入1mL样品溶液,1mL蒸馏水和1.5mL水杨酸，水浴5min，取出立即冷却到室温，加21.5mL蒸馏水，摇匀，在540nm处测定吸光度。

D对Fe²⁺的螯合能力的测定

取0.5mL益生菌芦荟液中加入0.4％的FeSO₄溶液0.1mL混合均匀后，再加入0.1mL1％的抗坏血酸溶液和0.2mol/L氢氧化钠溶液1mL，37℃下反应20min，然后用10％的三氯乙酸去除蛋白，取0.4mL上清并加入4mL 0.1％邻二氮菲，室温反应10min，测定536nm处吸光度。

E总还原力的测定

取1mL的样品，加入p H为6.6的磷酸缓冲液1mL和1％铁氰化钾溶液1mL，混匀,在50℃下保温20min,加入10％的三氯乙酸溶液1mL，振荡混匀后取1mL的混合液,加入4mL去离子水和0.1％的三氯化铁溶液0.4mL，静置10min，用去离子水为空白,在700nm下进行比色，吸光度的值越大，说明还原力越强。

表2益生菌芦荟液抗氧化参数测定

由以上实验结果可见，DPPH自由基清除能力实验中，清除率达到29.92％，说明益生菌芦荟液对自由基清除能力较弱；羟基自由基清除能力的测定实验，清除率为50.60％，说明益生菌芦荟液对羟基自由基清除能力较强；对Fe²⁺的螯合能力的测定中，螯合率为81.48％，说明益生菌芦荟液对铁离子的螯合能力较强；总还原力的测定实验，数值为0.164，说明芦荟益生菌发酵液具有一定还原力；在还原糖测定实验中，根据标准曲线计算得出还原糖含量为28.35mg/mL。

实施例4(芦荟发酵液对烧烫伤小鼠的治疗效果评价)

1大鼠深II度烧烫伤模型的制作

伤前禁食禁水12h；用消毒酒精将大鼠皮毛浸湿备用，10％水合氯醛(400ml)腹腔注射进行麻醉，背部剃毛，常规消毒；C水温升至100℃，将500g砝码置入沸水15min，取出后迅速将砝码底部紧贴大鼠背部皮肤，持续7S。每只大鼠造成1个烫伤创面后立即腹腔注射生理盐水抗休克处理；设置4个实验组：造模两小时后进行给药。

表3实验动物分组

A烧烫伤小鼠恢复观察

结果表明，芦荟发酵液组其伤口结痂能力明显高于模型组；芦荟发酵液组与烧伤膏于第七天即开始结痂，芦荟发酵液组正常结痂，烧伤膏组结痂后有轻度、中度感染发生；14天后芦荟发酵液组小鼠开始脱痂，暴露正常皮肤，其它组仍未开始恢复。

B伤口表面菌群数量计数

利用棉签于用药后一小时蘸取伤口表面，之后利用平板计数方法计数伤口表面细菌。结果表明芦荟发酵液组和烧伤膏组1-3天伤口表面皮肤菌群约为10³CFU/mL，模型组为10⁶CFU/mL，芦荟发酵液组和烧伤膏组可显著抑制有害菌在烫伤皮肤表面的繁殖；第4天起，模型组和烧伤膏组表面菌群计数结果为10⁶CFU/mL，芦荟发酵液组表面菌群计数结果为10³CFU/mL，表明烧伤膏组表面菌群对烧伤膏产生耐药性，而芦荟发酵液组不产生细菌耐药，可有效抑制皮肤菌群的变化。

C伤口表面耐药菌的观察

将5％烧伤膏加入细菌固体培养基，对正常对照组、模型组、芦荟发酵液组和烧伤膏组表面擦拭物进行活菌计数。结果显示正常对照组、模型组、芦荟发酵液组几乎为零，而烧伤膏组计数结果高达10⁵CFU/mL。表明长期使用烧伤膏会产生耐药菌，不利于伤口的恢复和治疗，而芦荟发酵液不会有上述问题发生。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种益生菌芦荟液，其特征在于是由以下方法制备的：

1)取每片重量为300～400g的库拉索芦荟叶片，先用酒精擦拭叶片表面，而后去除表皮，用榨汁机榨取汁液，以6000rpm的转速离心10min，取上清，而后在55℃条件下水浴30min，得到芦荟原汁；

2)取植物乳酸杆菌、鼠李唐乳酸杆菌、德氏乳杆菌、婴儿双岐杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌菌株，活化后以活菌量为1:1:1:1:1:1的比例混合，得到复合益生菌悬液，以5％(g:g)的接种量将其加入至步骤1)所得的芦荟原汁中，得到发酵前液；

3)取若干份步骤2)所得的发酵前液，分别以温度25℃、30℃、37℃、42℃，pH值3、4、5、6、7、8、9的条件执行发酵，以发酵后发酵液中活菌浓度最大为依据选取对应的发酵条件，即得到最终发酵条件；

4)再取一份步骤2)所得的发酵前液，利用步骤3)所得的最终发酵条件进行发酵，所得发酵液即为所述益生菌芦荟液。

2.根据权利要求1所述的益生菌芦荟液，其特征在于步骤4)完成后，继续执行以下步骤5)：取活化的致病菌稀释至10⁸CFU/mL，取100μL菌液涂布于LB平板，菌液吹干后在平板中放入无菌的牛津杯，再向牛津杯中加入步骤4)所得的益生菌芦荟液上清，将所述LB平板于37℃培养，测量其抑菌圈直径。

3.根据权利要求2所述的益生菌芦荟液，其特征在于所述致病菌包括：鼠伤寒沙门氏菌，肠炎沙门氏菌，福氏志贺氏菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。

4.根据权利要求2所述的益生菌芦荟液，其特征在于步骤5)完成后，继续执行以下步骤6)：分别测定步骤4)所得益生菌芦荟液的DPPH自由基清除能力、铁离子螯合能力及总还原力。

5.根据权利要求4所述的益生菌芦荟液，其特征在于步骤6)完成后，继续执行以下步骤7)：取步骤4)所得的益生菌芦荟液，涂抹于烧伤创面上，观察其对皮肤的刺激性和恢复作用。

6.根据权利要求5所述的益生菌芦荟液，其特征在于步骤7)完成后，继续执行以下步骤8)：取步骤4)所得的益生菌芦荟液，涂抹于烧伤小鼠烧伤创面上，观察其对皮肤结痂能力和恢复作用，观察其对烧烫伤表面细菌的清除能力及耐药菌的驯化效果。

7.根据权利要求1所述的益生菌芦荟液，其特征在于步骤1)所得的芦荟原汁及步骤4)所得的益生菌芦荟液，在使用前均置于4℃条件下保存。

8.根据权利要求1所述的益生菌芦荟液，其特征在于步骤3)所得的最终发酵条件为：温度37℃，pH为7，发酵48h，发酵终点pH为3-4。

9.权利要求1所述益生菌芦荟液用于制备烧伤创面药物的应用。