CN107595921A

CN107595921A - 一种复合益生菌发酵的仙人掌果制剂及其在治疗口腔溃疡中的应用

Info

Publication number: CN107595921A
Application number: CN201711001529.5A
Authority: CN
Inventors: 陈廷涛; 夏超飞
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2017-10-24
Filing date: 2017-10-24
Publication date: 2018-01-19

Abstract

本发明提供了一种复合益生菌发酵的仙人掌果制剂，其特征是所述的复合益生菌由鼠李糖乳酸杆菌、植物乳酸杆菌和保加利亚乳酸杆菌按照1：1：1的比例混合而成，并与仙人掌果原汁一起发酵。该产品具有良好的杀菌效果和抗氧化能力，且仙人掌果和益生菌复合后，取得了意想不到的效果，即可显著增强口腔溃疡和龋齿等疾病的恢复。

Description

一种复合益生菌发酵的仙人掌果制剂及其在治疗口腔溃疡中的应用

技术领域

本发明涉及一种发酵制剂，尤其涉及一种复合益生菌发酵的仙人掌果制剂及其在治疗口腔溃疡中的应用。

背景技术

仙人掌果(Opuntia ficus-indica)是仙人掌属(Opuntia)植物的果实，为椭圆形或长形的浆果，颜色有白、绿、黄、红、棕等色，重量在100-150克不等，果肉粘稠，皮厚、多籽；仙人掌果果肉含有丰富的微量元素、蛋白质、氨基酸、维生素、多糖类、黄酮类和果胶等。仙人掌果具有行气活血、祛湿退热、生肌等作用；印第安人和墨西哥人将其作为食物和药物使用也有几千年的历史。

其丰富的植物营养素与抗氧化剂，对身体内外都有绝佳的益处。在有关抗氧化剂对抑制自由基的实验中发现，仙人掌果实的抗氧化能力较维生素c高出7倍，并含有高量的维生素a、b1、b12、d3及核黄素，能促进肌肤细胞再生、增强肌肤的柔软度，富含花青素。

研究表明，仙人掌果实萃取物具有加速伤口愈合、使肌肤柔软细腻、防止皮肤干燥、减少皱纹等神奇的功效，因为仙人掌果实富含抗氧化剂、核黄素和硫胺(维生素B1)，是滋润保养肌肤极佳的营养成分。此外，仙人掌果实也能促进人体正常纤维细胞的扩散再生，促进溃疡愈合，不论对身体内部还是表皮创伤的愈合都十分有帮助。

益生菌是指一类对人和动物有益的细菌，通过益生菌发酵的仙人掌果治疗口腔溃疡，既可以增强仙人掌果治疗口腔溃疡的效果，还可以减少仙人掌果的用药量，同时兼具益生菌的辅助功效具有重要的经济价值和现实意义，利用现代生物技术使仙人掌果治疗溃疡的作用与有益菌完美结合，形成新兴的制剂，在抗生素耐药，超级细菌不断出现的形势下，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种复合益生菌发酵的仙人掌果制剂，既可以增强仙人掌果治疗口腔溃疡的效果，还可以减少仙人掌果的用药量，同时具有治疗龋齿等口腔疾病的作用。

本发明采用的技术方案如下：

一种复合益生菌发酵的仙人掌果制剂，制备方法包括下列步骤：

(1)仙人掌果原汁的制备：采选新鲜、饱满、肉质肥厚的仙人掌果，去掉大小刺及八角刺后，取出果肉，采用榨汁机榨汁，过滤，汁液分装后，6000rpm/min离心10min，再次分装，制成仙人掌果原汁；

(2)采用巴氏消毒法将仙人掌果原汁灭菌，55℃处理30min，4℃保存备用；

(3)益生菌的活化：

①、从-80℃冰箱取出所需益生菌鼠李糖乳酸杆菌、植物乳酸杆菌和保加利亚乳酸杆菌，每种细菌分别按培养基体积的5％接种于5mL MRS液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养过夜；

②、取过夜培养的益生菌，分别按培养基体积的5％接种于5mL MRS培养基中，二次活化；

(4)取5mL仙人掌果原汁，加入5％仙人掌果原汁重量的葡萄糖。将二次活化后的鼠李糖乳酸杆菌、植物乳酸杆菌和保加利亚乳酸杆菌按活菌数量比为1:1:1混合得到复合益生菌，之后将混合后的益生菌按仙人掌果原汁体积的5％进行接种，在37℃、pH为7的条件下发酵48h，10000rpm/min离心10min，重新分装，获得复合益生菌发酵的仙人掌果制剂，4℃保存备用。

所述二次活化后的鼠李糖乳酸杆菌、植物乳酸杆菌和保加利亚乳酸杆菌中活菌数量均为10⁶CFU/ml。

本发明所述复合益生菌由鼠李糖乳酸杆菌、植物乳酸杆菌和保加利亚乳酸杆菌组成，其活菌数量比为1:1:1。

本发明的有益效果：本发明所制备的复合益生菌发酵的仙人掌果制剂口感更好，安全无毒，将仙人掌果本身原有的治疗和保健功能和混合益生菌的益生效果完美结合在一起，具有治疗口腔溃疡和治疗龋齿的效果。

具体实施方式

实施例1：一种复合益生菌发酵的仙人掌果制剂，制备方法包括下列步骤：

(3)益生菌的活化：

①、从-80℃冰箱取出所需益生菌鼠李糖乳酸杆菌、植物乳酸杆菌和保加利亚乳酸杆菌液体，每种细菌分别按培养基体积的5％接种于5mL MRS液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养过夜；

(4)最佳发酵条件的确定

①、设定发酵温度梯度分别为25℃、30℃、37℃、42℃，在上述不同的发酵温度条件下取5mL仙人掌果原汁，加入5％仙人掌果原汁重量的葡萄糖，将二次活化的鼠李糖乳酸杆菌、植物乳酸杆菌和保加利亚乳酸杆菌按活菌数量比为1:1:1混合，之后将混合后的益生菌按仙人掌果原汁体积的5％进行接种，发酵48h，得到不同温度条件下的仙人掌果发酵液；

②、取不同发酵温度条件下得到的仙人掌果发酵液，加生理盐水按10¹～10⁶比例稀释，取50μL涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵温度；

③、在最佳发酵温度的条件下，设定仙人掌果原汁pH梯度为3、4、5、6、7、8、9，在上述不同的pH条件下取5mL仙人掌果原汁，加入5％仙人掌果原汁重量的葡萄糖，复合益生菌接种量为仙人掌果原汁体积的5％，发酵48h，采用pH计调节pH；

④、取不同pH条件下发酵得到的仙人掌果发酵液，加生理盐水按10¹～10⁶比例稀释，取50μL涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵pH；

(5)在最佳发酵温度和pH条件下发酵培养

在步骤(4)确定最佳pH和最佳温度后，取5mL仙人掌果原汁，加入仙人掌果原汁重量的5％葡萄糖，接种仙人掌果原汁体积5％的复合益生菌，发酵48h，10000rpm/min离心10min，重新分装，获得益生菌仙人掌果发酵液，4℃保存备用。

为评价混合益生菌能否在仙人掌果原汁中大量生长及评价其最适发酵温度和pH，我们对不同温度和pH仙人掌果原液中的益生菌进行了计数，结果表明，益生菌仙人掌果发酵液在发酵48h后，当温度为37℃，pH＝7时，活菌计数结果细菌数量最多，基本达到10⁸数量级。因此，我们将益生菌仙人掌果发酵液发酵最佳条件设定为37℃，pH＝7。

实施例2：抗氧化指标的测定及评价

1、相关试剂配制：

0.2mmol/L DPPH乙醇溶液：0.007886g DPPH溶于100mL乙醇，避光配制，现配现用；150mmol/L pH 8.0Tris-Hcl：2.364g Tris-HCl溶于100mL蒸馏水中；1.2mmol/L邻苯三酚：0.01513g邻苯三酚10mM HCl，加蒸馏水定容至100mL，避光保存；0.4％FeSO4:FeSO4·7H2O：0.7315g溶于100mL蒸馏水中，避光保存；1％抗坏血酸：抗坏血酸1g溶解于100mL蒸馏水中，避光保存；0.2mol/L氢氧化钠：NaOH 0.8g溶解于100mL蒸馏水中；10％三氯乙酸：三氯乙酸10g溶于100mL蒸馏水中；0.1％邻二氮菲：邻二氮菲0.1g溶解于100mL蒸馏水中；磷酸缓冲液p H＝6.6：1M磷酸盐缓冲液配制；0.1％三氯化铁：FeCl3 0.1g溶解于100mL蒸馏水中。

2、抗氧化指标的测定

(1)DPPH自由基清除能力的测定

取2ml仙人掌果发酵液，加入2ml DPPH乙醇溶液，黑暗下室温反应30min，然后用等体积的三氯甲烷抽提，取上清517nm测OD，对照为去离子水加DPPH溶液。

(2)羟基自由基清除能力的测定

取2mmol/L的硫酸亚铁溶液1mL,6mmol/L过氧化氢1mL,6mmol/L水杨酸1mL,并加入仙人掌果发酵液1mL，静置30min，以蒸馏水为参比，在510nm处测定吸光度，计算羟自由基的清除率。

(3)3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖

a标准曲线的制作：取8支15mm×180mm试管，分别编号为0至7，向其中依次加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.4、1.6、2.0mL的1mg/mL的葡萄糖标准溶液，然后用蒸馏水定容到2mL再依次加入1.5mL水杨酸，水浴5min，取出立即冷却到室温，加21.5mL蒸馏水，摇匀，在540nm处测定吸光度。

b样品中还原糖含量的测定：以标准曲线制作中0号为对照，先将样品稀释20倍，向15mm×180mm试管中加入1mL稀释后样品溶液,1mL蒸馏水和1.5mL水杨酸，水浴5min，取出立即冷却到室温，加21.5mL蒸馏水，摇匀，在540nm处测定吸光度。

(4)对Fe²⁺的螯合能力的测定

取0.5mL仙人掌果发酵液中加入0.4％的FeSO4溶液0.1mL混合均匀后，再加入0.1mL 1％的抗坏血酸溶液和0.2mol/L氢氧化钠溶液1mL，37℃下反应20min，然后用10％的三氯乙酸去除蛋白6000rpm，10min，4℃，取0.4mL上清并加入4mL 0.1％邻二氮菲，室温反应10min，测定536nm处吸光度。

(5)总还原力的测定

取1mL的样品，加入1mL的磷酸缓冲液pH＝6.6和1％铁氰化钾溶液1mL，混匀，在50℃下保温20min,加入10％的三氯乙酸溶液1mL，振荡混匀后取1mL的混合液,加入4mL去离子水和0.1％的三氯化铁溶液0.4mL,静置10min，用去离子水为空白,在700nm下进行比色，吸光度的值越大，说明还原力越强。

结果表明，在37℃，pH＝7的条件下发酵48h，10000rpm/min 10分钟离心后，发酵液澄清透亮。DPPH自由基清除能力实验中，清除率达到32.26％，说明益生菌仙人掌果发酵液对DPPH自由基清除能力较弱；羟基自由基清除能力的测定实验，清除率为59.28％，说明益生菌仙人掌果发酵液针对羟基自由基清除能力较强；对Fe²⁺的螯合能力的测定中，螯合率为81.74％，说明益生菌仙人掌果发酵液对亚铁离子的螯合能力较强；总还原力的测定实验，数值为0.255，说明益生菌仙人掌果发酵液具有较强还原力；在还原糖测定实验中，根据标准曲线计算得出还原糖含量为32.38mg/mL。

实施例3：仙人掌果发酵液口感评价

为评价益生菌添加后对仙人掌果口感的影响，申请者招募40名志愿者对仙人掌果原汁和本发明仙人掌果发酵液口感进行评价。所述仙人掌果原汁是经本发明步骤(1)制得的。采用实验采取双盲方式，受试者不知道自己喝的属于哪组产品。

表1口感评价标准

表2口感评价结果

分组	色泽(20)	口感(60)	香味(20)	总分
					仙人掌果原汁	18	46	11	75
仙人掌果发酵液	17	59	19	95

结果表明，本发明仙人掌果发酵液在口感和爽口度方面显著优于仙人掌果原汁，总分高达95分。

实施例4：仙人掌果发酵液对口腔溃疡治疗效果评价

选取80例口腔溃疡患者，分为四组，对照组(常规治疗组，服用维生素C)；常规治疗+益生菌组(鼠李糖乳酸杆菌、植物乳酸杆菌和保加利亚乳酸杆菌冻干粉，三种菌按活菌数量1:1:1混合，总数为10⁸CFU/g)、常规治疗+仙人掌果原汁组、常规治疗+仙人掌果发酵液组。患者每天口含上述产品半小时，一周后观察其治疗效果。治疗结果由三位医生根据临床指标共同判断。

表3仙人掌果发酵液对口腔溃疡治疗效果

分组	N	痊愈	好转	无效	总有效率(％)
						对照组	20	4	9	7	65％
常规+益生菌	20	5	9	6	70％
						常规+仙人掌果原汁	20	6	9	5	75％
常规+仙人掌发酵液	20	8	9	3	85％

结果表明，仙人掌果发酵液对口腔溃疡治疗有效率达85％，显著高于其他组别。

实施例5：仙人掌果发酵液对龋齿患者口腔菌群的益生效果

鉴于口腔变异链球菌是导致龋齿的罪魁祸首，因为我们评价了仙人掌发酵液对龋齿患者口腔变异链球菌的杀伤效果。选取80例口腔溃疡患者，分为四组，对照组(常规治疗组，服用维生素C)；常规治疗+益生菌组(鼠李糖乳酸杆菌、植物乳酸杆菌和保加利亚乳酸杆菌冻干粉，三种菌按活菌数量1:1:1混合，总数为10⁸CFU/g)、常规治疗+仙人掌果原汁组、常规治疗+仙人掌果发酵液组。连续治疗1周后取患者唾液，利用实时荧光定量技术监测患者口腔变异链球菌数量，其中以对照组口腔内异链球菌数量作为基数进行计算。

表4仙人掌果发酵液对龋齿患者口腔菌群的益生效果

分组	X/对照组(％)
		常规+益生菌	89％
常规+仙人掌果原汁	89％
		常规+仙人掌发酵液	36％

结果显示，仙人掌发酵液组变异链球菌数量仅为对照组的36％，仙人掌果发酵液可显著降低龋齿患者口腔变异链球菌数量，有助于龋齿的治疗和恢复。

Claims

1.一种复合益生菌发酵的仙人掌果制剂，其特征在于：制备方法包括下列步骤：

(3)益生菌的活化：

2.如权利要求1所述的一种复合益生菌发酵的仙人掌果制剂，其特征在于：二次活化后的鼠李糖乳酸杆菌、植物乳酸杆菌和保加利亚乳酸杆菌中活菌数量均为10⁶CFU/ml。