CN104382163A - 一种鼠李糖乳酸杆菌atcc 7469与芦荟共发酵饮料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469与芦荟共发酵饮料的制备方法，其特征是利用库拉索芦荟原汁与鼠李糖乳酸杆菌ATCC7469共发酵，通过设定不同的温度梯度和PH梯度，经活菌计数后，确定其最佳发酵条件。用芦荟发酵液对致病菌进行抑菌实验，确定其抗菌能力；并通过对其抗氧化性指标的测定，如DPPH自由基清除能力的测定、铁离子螯合能力的测定和总还原力的测定等，初步确定了该芦荟益生菌发酵液的抗氧化能力，并进行评价，以实现芦荟洗液和芦荟饮品的研制。
Description
技术领域
本发明主要涉及鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469与芦荟原汁共发酵条件的摸索，将发酵液进行抑菌试验，测定其并抑菌效果；并对发酵液的抗氧化能力进行了测定和评价，主要用于今后相关芦荟洗液和芦荟饮品的研制，具体涉及种鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469与芦荟共发酵饮料的制备方法。
背景技术
芦荟属百合科草本植物，芦荟凝胶中含有丰富的多糖、蛋白质、氨基酸、维生素、活性酶及对人体十分有益的微量元素。它具有多重功效，美白、保湿、控油、除痘等作用。并且芦荟提取液常添加在食品、药品、牙膏及化妆品中，不仅具有抗细菌、防止皮肤干裂或油脂分泌多、对治疗雀斑、青春痘和防止脱发、去头屑、消炎、愈合伤口、免疫、抗肿瘤都有极好的疗效。
益生菌是指一类对人和动物有益的细菌，指投入后通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，提高宿主健康水平和使宿主健康达到最佳状态的活菌制剂及其代谢产物，各种食品中更是添加多种益生菌，增强食品营养价值。
鼠李糖乳杆菌，从属于乳杆菌属，有调节微生态平衡、增强宿主肠道抵抗力、预防和治疗腹泻、消除过敏的功能，动物和人体试验表明该菌有一定的抑菌效果和加强免疫系统的功效，能维持健康的肠道菌群，可用于各种食品，保健食品和微生态制品或药品、腐乳、豆豉、豆酱等。
本发明采用鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469与芦荟原汁进行共发酵，研究了发酵液的抗氧化能力和发酵液的抑菌能力，并进行了评价。
发明内容
本发明主要用于芦荟洗液和芦荟饮品的研制，对研制前期的芦荟发酵液最佳条件进行探索，并进行抗氧化性的测定，评价芦荟发酵液产品研制过程中具有的优势，本发明提供一种鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469与芦荟共发酵饮料的制备方法。
本发明所述制备方法包括下列步骤：
1、芦荟的选择和制备：采选新鲜、饱满、肉质肥厚的芦荟叶片，剔除带有病斑、软腐的叶片，叶片均重300~400 g；叶片采用75% 酒精进行表面消毒，去除芦荟叶表面皮层，采用榨汁机榨汁，分装后，6000 rpm/min离心10 min，再次分装，制成芦荟原汁，所述芦荟为库拉索芦荟；
2、采用巴氏消毒法将芦荟原汁灭菌，55 ℃处理30 min，4 ℃保存备用；
3、鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469的活化
A.从-80 ℃冰箱取出鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469，按培养基体积5%接种于5 mL MRS培养基中，于37 ℃恒温培养箱中培养过夜。
B.取过夜培养的鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469，按按培养基体积5%接种5 mLMRS培养基中，二次活化。
4、最佳发酵条件的设定
A.设定温度梯度分别为25 ℃、30 ℃、37 ℃、42 ℃，在上述不同的发酵温度条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20 h，得到不同温度条件下的芦荟发酵液；
B.取上述各芦荟发酵液，加生理盐水按101～106比例稀释，取50 μＬ涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵温度；
C.在最佳温度的条件下，设定芦荟原汁PH梯度为3、4、5、6、7、8、9，在上述不同的PH条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20 h，采用PH计调节PH；
D. 取上述各芦荟发酵液，加生理盐水按101～106比例稀释，取50 μＬ涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵PH。
5、在最佳发酵温度和PH值条件下发酵培养：在步骤4确定最佳PH和温度后，取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，接种芦荟原汁5%的鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469，发酵48 h，10000 rpm/min离心10 min，重新分装，获得鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469芦荟发酵液，4 ℃保存备用。
6、芦荟发酵液抗氧化性指标的测定和后期评价
A.DPPH自由基清除能力的测定
取2 ml芦荟发酵液，加入0.2 mol/LDPPH乙醇溶液2ml，黑暗下室温反应30 min，然后用等体积的三氯甲烷抽提，取上清517nm测OD，对照为去离子水加DPPH溶液。
B.羟基自由基清除能力的测定
取2 mmol/L的硫酸亚铁溶液1 mL, 6 mmol/L过氧化氢1 mL, 6 mmol/L水杨酸1 mL, 并加入芦荟发酵液1 mL，静置 30 min，以蒸馏水为参比，在510 nm处测定吸光度，计算羟自由基的清除率。
C.3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖
a.标准曲线的制作：取8支15 mm×180 mm试管，分别编号为0至7，向其中依次加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.4、1.6、2.0 mL的1 mg/mL的葡萄糖标准溶液，然后用蒸馏水定容到2 mL 再依次加入1.5 mL水杨酸，水浴5 min，取出立即冷却到室温，加21.5 mL蒸馏水，摇匀，在540 nm处测定吸光度。
b.样品中还原糖含量的测定：以标准曲线制作中0号为对照，向15 mm×180 mm试管中加入1 mL样品溶液,1 mL蒸馏水和1.5 mL水杨酸，水浴5 min，取出立即冷却到室温，加21.5 mL蒸馏水，摇匀，在540 nm处测定吸光度。
D.对Fe2+的螯合能力的测定
取0.5 mL芦荟发酵液中加入0.4%的FeSO4溶液0.1 mL混合均匀后，再加入0.1 mL 1%的抗坏血酸溶液和0.2 mol/L氢氧化钠溶液1 mL，37℃下反应20 min，然后用10%的三氯乙酸去除蛋白，取0.4 mL上清并加入4 mL 0.1%邻二氮菲，室温反应10 min，测定536 nm处吸光度。
E.总还原力的测定
取1 mL的样品，加入 1 mL的磷酸缓冲液和1%铁氰化钾溶液1 mL，混匀, 在 50℃下保温 20 min, 加入 10 %的三氯乙酸溶液1 mL，振荡混匀后取1 mL的混合液, 加入4 mL去离子水和 0.1 %的三氯化铁溶液0.4 mL , 静置10 min，用去离子水为空白, 在700 nm下进行比色，吸光度的值越大，说明还原力越强。
7、抑菌试验
A．活化鼠伤寒、肠炎沙门、志贺301、福氏志贺、单增ATCC、金黄色葡萄球菌cowan1、大肠O157、痤疮丙酸杆菌，过夜培养。
B．将8株致病菌的菌体浓度调至108 CFU/mL左右，分别取100 μL菌液涂布于LB平板。
C．待菌液吹干后，在平板中小心放入无菌的牛津杯；将发酵液上清10000 rpm/min离心10 min，向牛津杯中加入发酵液上清。
D．37℃培养6-8 h，每隔2~3 h观察。
E．测量平板中的抑菌圈直径，并照相。
8、芦荟发酵液后期评价
针对步骤6中的抗氧化性指标测定结果，对该芦荟发酵液上清进行抗氧化能力的评价。
本发明的有益效果：本发明所制备的发酵饮料，安全无毒，将芦荟本身原有的保健功能和鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469的益生效果完美结合在一起，具有美容、调节肠道菌群平衡、促进肠道蠕动等功效，有益于人体健康。
附图说明
图1不同温度活菌计数
图2不同PH活菌计数；
图3鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469发酵液抗氧化参数测定；
图4还原糖标准曲线；
图5鼠李糖乳酸杆菌ATCC7469芦荟发酵液抑菌结果；
图6鼠李糖乳酸杆菌ATCC7469芦荟发酵液抑菌图片。
具体实施方式
实施例1：
一种鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469与芦荟共发酵饮料的制备方法：
1、芦荟的选择和制备：采选新鲜、饱满、肉质肥厚的芦荟叶片，剔除带有病斑、软腐的叶片，叶片均重300~400 g；叶片采用75% 酒精进行表面消毒，去除芦荟叶表面皮层，采用榨汁机榨汁，分装后，6000 rpm/min离心10 min，再次分装，制成芦荟原汁，所述芦荟为库拉索芦荟；
2、采用巴氏消毒法将芦荟原汁灭菌，55 ℃处理30 min，4 ℃保存备用；
3、鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469的活化
A.从-80 ℃冰箱取出鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469，按培养基体积5%接种于5 mL MRS培养基中，于37 ℃恒温培养箱中培养过夜。
B.取过夜培养的鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469，按按培养基体积5%接种5 mLMRS培养基中，二次活化。
4、最佳发酵条件的设定
A.设定温度梯度分别为25 ℃、30 ℃、37 ℃、42 ℃，在上述不同的发酵温度条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20 h，得到不同温度条件下的芦荟发酵液；
B.取上述各芦荟发酵液，加生理盐水按101～106比例稀释，取50 μＬ涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵温度；
C.在最佳温度的条件下，设定芦荟原汁PH梯度为3、4、5、6、7、8、9，在上述不同的PH条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20 h，采用PH计调节PH；
D. 取上述各芦荟发酵液，加生理盐水按101～106比例稀释，取50 μＬ涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵PH。
5、在最佳发酵温度和PH值条件下发酵培养：在步骤4确定最佳PH和温度后，取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，接种芦荟原汁5%的鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469，发酵48 h，10000 rpm/min离心10 min，重新分装，获得鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469芦荟发酵液，4 ℃保存备用。
实施例2：抗氧化指标的测定及评价
1、相关试剂：0.2 mmol/L DPPH 乙醇 溶液；150 mmol/L pH 8.0 Tris-Hcl；1.2 mmol/L 邻苯三酚；0.4% FeSO4: FeSO4·7H2O；1% 抗坏血酸；0.2 mol/L 氢氧化钠；10% 三氯乙酸；0.1% 邻二氮菲； p H为6.6磷酸缓冲液；0.1% 三氯化铁。
2、确定最佳PH和温度后，发酵48 h，10000 rpm/min离心10 min，重新分装，获的鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469芦荟发酵液，4 ℃保存备用。
3、抗氧化指标的测定
A.DPPH自由基清除能力的测定
取2ml芦荟发酵液，加入0.2mol/LDPPH乙醇溶液2ml，黑暗下室温反应30min，然后用等体积的三氯甲烷抽提，取上清517nm测OD，对照为去离子水加DPPH溶液。
B.羟基自由基清除能力的测定
取2 mmol/L的硫酸亚铁溶液1 mL, 6 mmol/L过氧化氢1 mL, 6 mmol/L水杨酸1 mL, 并加入芦荟发酵液1 mL，静置 30 min，以蒸馏水为参比，在510 nm处测定吸光度，计算羟自由基的清除率。
C. 3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖
a.标准曲线的制作：取8支15 mm×180 mm试管，分别编号为0至7，向其中依次加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.4、1.6、2.0 mL的1 mg/mL的葡萄糖标准溶液，然后用蒸馏水定容到2 mL 再依次加入1.5 mL水杨酸，水浴5 min，取出立即冷却到室温，加21.5 mL蒸馏水，摇匀，在540 nm处测定吸光度。
b.样品中还原糖含量的测定：以标准曲线制作中0号为对照，向15 mm×180 mm试管中加入1 mL样品溶液,1 mL蒸馏水和1.5 mL水杨酸，水浴5 min，取出立即冷却到室温，加21.5 mL蒸馏水，摇匀，在540 nm处测定吸光度。
D.对Fe2+的螯合能力的测定
取0.5 mL芦荟发酵液中加入0.4%的FeSO4溶液0.1 mL混合均匀后，再加入0.1 mL 1%的抗坏血酸溶液和0.2 mol/L氢氧化钠溶液1 mL，37℃下反应20 min，然后用10%的三氯乙酸去除蛋白6000 rpm，10 min，4℃，取0.4 mL上清并加入4 mL 0.1%邻二氮菲，室温反应10 min，测定536 nm处吸光度。
E.总还原力的测定
取1 mL的样品，加入 1 mL的p H为6.6磷酸缓冲液和1%铁氰化钾溶液1 mL，混匀, 在 50℃下保温 20 min, 加入 10 %的三氯乙酸溶液1 mL，振荡混匀后取1 mL的混合液, 加入4 mL去离子水和 0.1 %的三氯化铁溶液0.4 mL , 静置10 min，用去离子水为空白, 在700 nm下进行比色，吸光度的值越大，说明还原力越强。
实施例3：抑菌试验
实验材料：鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469、鼠伤寒、肠炎沙门、志贺301、福氏志贺、单增ATCC、金黄色葡萄球菌cowan1、大肠O157、痤疮丙酸杆菌、库拉索芦荟、MRS培养基、LB培养基、SLB培养基、牛津杯。
实验步骤
1．活化鼠伤寒、肠炎沙门、志贺301、福氏志贺、单增ATCC、金黄色葡萄球菌cowan1、大肠O157、痤疮丙酸杆菌，过夜培养。
2．将8株致病菌的菌体浓度调至108 CFU/mL左右，分别取100 μL菌液涂布于LB平板。
3．待菌液吹干后，在平板中小心放入无菌的牛津杯；将发酵液上清10000 rpm/min离心10 min，向牛津杯中加入发酵液上清。
4．37℃培养6-8 h，每隔2~3 h观察。
5．测量平板中的抑菌圈直径，并照相。
为评价鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469能否在芦荟原汁中大量生长及评价其最适发酵温度和pH，我们对不同温度和pH芦荟原液中的嗜热链球菌ATCC 14485进行了计数，
如图1,2结果表明，鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469芦荟发酵液在发酵20 h后，当温度为37 ℃，PH=7时，活菌计数结果细菌数量最多，基本达到108数量级。因此，我们将鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469芦荟发酵液发酵最佳条件设定为37 ℃，PH=7。
为确保我们制备的芦荟发酵液具有良好的抗氧化性，我们对常见的几个抗氧化性指标进行了评价。如图3、4结果表明，在37 ℃，PH=7的条件下发酵48 h，10000 rpm/min 10 离心后，发酵液澄清透亮。DPPH自由基清除能力实验中，清除率达到36.48%，说明鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469芦荟发酵液对自由基清除能力较弱；羟基自由基清除能力的测定实验，清除率为38.18%，说明鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469芦荟发酵液对羟基自由基清除能力较弱；对Fe2+的螯合能力的测定中，螯合率为90.04%，说明鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469芦荟发酵液对铁离子的螯合能力较强；总还原力的测定实验，数值为0.307，说明鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469芦荟发酵液具有较强还原力；在还原糖测定实验中，根据标准曲线计算得出还原糖含量为24.76 mg/mL。
同时，我评价芦荟发酵液对致病菌的拮抗能力，我们评价了芦荟发酵液对几种常见食源性致病菌的抑制效果。
如图5、6，结果表明，针对我们选用的八种致病菌：鼠伤寒、肠炎沙门、福氏志贺、大肠O157、单增ATCC、志贺301、金黄色葡萄球菌cowan1、痤疮丙酸杆菌，通过抑菌实验我们发现鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469芦荟发酵液对痤疮丙酸杆菌抑制效果最好；对鼠伤寒、肠炎沙门、福氏志贺、志贺301、金黄色葡萄球菌cowan1效果次之；对大肠O157、单增ATCC效果最差。
Claims (2)
1.一种鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469与芦荟共发酵饮料的制备方法，其特征是:
（1）芦荟的选择和制备：采选新鲜、饱满、肉质肥厚的芦荟叶片，剔除带有病斑、软腐的叶片，叶片均重300~400 g；叶片采用75% 酒精进行表面消毒，去除芦荟叶表面皮层，采用榨汁机榨汁，分装后，6000 rpm/min离心10 min，再次分装，制成芦荟原汁；
（2）采用巴氏消毒法将芦荟原汁灭菌，55 ℃处理30 min，4 ℃保存备用；
（3）鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469的活化
A.从-80 ℃冰箱取出鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469，按培养基体积5%接种于5 mL MRS培养基中，于37 ℃恒温培养箱中培养过夜；
B.取过夜培养的鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469，按按培养基体积5%接种5 mLMRS培养基中，二次活化；
（4）最佳发酵条件的设定
A.设定温度梯度分别为25 ℃、30 ℃、37 ℃、42 ℃，在上述不同的发酵温度条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20 h，得到不同温度条件下的芦荟发酵液；
B.取上述各芦荟发酵液，加生理盐水按101～106比例稀释，取50 μＬ涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵温度；
C.在最佳温度的条件下，设定芦荟原汁PH梯度为3、4、5、6、7、8、9，在上述不同的PH条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20 h，采用PH计调节PH；
D. 取上述各芦荟发酵液，加生理盐水按101～106比例稀释，取50 μＬ涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵PH；
（5）在最佳发酵温度和PH值条件下发酵培养：在步骤4确定最佳PH和温度后，取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，接种芦荟原汁5%的鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469，发酵48 h，10000 rpm/min离心10 min，重新分装，获得鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469芦荟发酵液，4 ℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种鼠李糖乳酸杆菌ATCC 7469与芦荟共发酵饮料的制备方法，其特征是:所述芦荟为库拉索芦荟。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150304 |