CN107604039A - 检测和分离细胞的微流体分选器 - Google Patents
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Abstract
一种检测血样中的一个或多个病变血细胞的方法，该方法包括：将所述血样导入微流体装置的至少一个入口，该微流体装置包括一个或多个线性通道，其中每个线性通道具有一定长度，以及限定纵横比的高度和宽度的截面，适于根据病变血细胞与非病变血细胞相比而减弱的变形性沿着通道截面的至少一部分而分离病变血细胞，其中病变血细胞沿着所述通道的第一部分流到第一出口，而非病变血细胞沿着所述通道的第二部分流到第二出口。所述一个或多个通道能够适于根据细胞尺寸沿着部分通道截面而分离细胞。在某些实施方式中，所述一个或多个通道可为螺旋通道。
Description
相关申请
本申请是中国专利申请No.201180022034.5的分案申请，原申请的申请日为2011年03月04日，申请号为201180022034.5，发明创造名称为“检测和分离细胞的微流体分选器”。原申请要求2010年3月4日提交的编号为61/310,387的美国临时申请以及2010年9月17日提交的编号为61/383,881的美国临时申请的优先权。上述申请的全部教导通过引用合并于此。
背景技术
用于分离细胞的常规宏观方法包括采用基于膜的过滤器的物理过滤法以及利用细胞的大小、变形性和密度之间的差异以过滤出目标细胞的密度梯度离心法。这些技术均为劳动密集型，并且需要进行多步骤的样本制备，从而可能引入人工痕迹或导致所需细胞的损失。膜过滤方法也容易受到堵塞的影响，需要频繁地清理。此外，目前已对经过滤技术和离心技术处理的目标细胞的原始表型中机械应力诱导变化的证据作了报告。
因此存在明确的需求：开发更简单更有效的技术来处理血样，从而最小化细胞的损失并维持原始目标细胞表型，以便后续分析。
发明内容
微流体特别适合于初步处理血样，因为它的长度尺寸很小，可以更好地控制血液分离过程中的细胞微环境。现已针对不同的应用(例如RBC变形性的研究、血小板和血浆的分离、白细胞分离以及诸如CTC或胎儿细胞的罕见细胞从血液中分离)对片上血液分析进行了多组论证。然而，这些微流体系统的主要限制为样本稀释或流速缓慢造成的低处理量，使得它们不适于处理容量以毫升计的临床血样。此处描述了能克服这些问题的微流体装置。
因此，本发明大体旨在提供一种检测样本中的(一种或多种)细胞的方法。在一个特定方面，本发明旨在提供一种检测血样(例如全血)中的一种或多种病变血细胞的方法。该方法包括：将血样导入微流体装置的至少一个入口，该微流体装置包括一个或多个线性(linear)通道，其中每个通道具有长度，以及限定纵横比的高度和宽度的截面，适于根据病变血细胞与非病变血细胞相比而减弱的变形性沿着所述通道截面的至少一部分而分离病变血细胞，其中病变血细胞(如果存在的话)沿着所述通道的第一部分流到第一出口，而非病变血细胞沿着所述通道的第二部分流到第二出口，从而检测样本中的一种或多种病变血细胞。
在另一方面，本发明旨在提供一种检测人体样本中的一种或多种循环肿瘤细胞(CTC)的方法，该方法包括：将所述样本导入微流体装置的至少一个入口，该微流体装置包括一个或多个螺旋通道，其中每个通道具有长度，以及具有限定纵横比的高度和宽度的截面，适于根据细胞尺寸沿着所述通道截面的多个部分而分离循环肿瘤细胞，其中所述循环肿瘤细胞(如果存在的话)沿着所述通道的径向最内部分流到第一出口，样本中的其余细胞沿着所述通道的另一部分流到第二出口，从而检测人体样本中的一种或多种循环肿瘤细胞。
在又一方面，本发明旨在提供一种从异步(asynchronous)细胞混合物(例如悬浮液)中分离一种或多种同步(synchronized)细胞的方法。该方法包括：将异步细胞混合物导入微流体装置的至少一个入口，该微流体装置包括一个或多个螺旋通道，其中每个通道具有长度，以及具有限定纵横比的高度和宽度的截面，适于根据细胞尺寸沿着所述通道截面的多个部分而分离同步细胞，其中其中较大的同步细胞沿着所述通道的径向最内侧部分流到第一出口，而较小的同步细胞沿着所述通道的其余部分流到至少一个其它出口，从而从异步细胞混合物中分离一种或多种同步细胞。
在再一方面，本发明旨在提供一种检测人体样本中的一种或多种循环肿瘤细胞(CTC)的方法。该方法包括：将所述样本导入微流体装置的至少一个入口，该微流体装置包括一个或多个线性通道，其中每个通道具有长度，以及具有限定纵横比的高度和宽度的截面，适于根据细胞尺寸沿着通道截面的至少一部分而分离循环肿瘤细胞，其中所述循环肿瘤细胞(如果存在的话)沿着所述通道的第一部分流到第一出口，而样本中的其余细胞沿着所述通道的第二部分流到第二出口，从而检测人体样本中的一种或多种CTC。
本发明具有许多优点，包括以相对高的流速连续工作，能够更快地处理临床样本，不必对样本进行化学改性，这减少了处理时间和成本，以及使得能够采集活细胞以进行后续的生物检测。
附图说明
通过附图所示的本发明的示例性实施方式的以下更加具体的描述，上述内容将更加清楚，如在附图中图示的，在不同的图中，相同的附图标记表示相同的部件。附图不一定按照比例绘制，为了图示本发明的实施方式，代替的，可突出重点。
图1A-1B是本发明的微通道设计以及分离原理的示意图。图1A是示出装置尺寸的微流体设计的示例图。在该装置中，微通道在输入处具有100μm的宽度部分，其收缩至15μm。在出口处，微通道以100μm的宽度截面开口，以通过分割比例为1：2：1的三出口分叉来增强可视效果。微通道高度被固定为10μm。图1B是示出分离原理的微通道的截面图和俯视图。随着流体到达出口，在微通道入口处随机分布的被感染的红细胞(iRBC)迁移至通道的侧壁，并且由三出口系统过滤。
图2A-2C为直方图，其示出了改变2(A)1％红细胞比容(hematocrit)样本、2(B)10％红细胞比容样本以及2C 40％红细胞比容样本中的流速的微通道出口处的标准化3μm珠分布。
图3A和3B是这样的图：图3A是以5uL/min流速改变样本红细胞比容的侧出口处的3μm珠的过滤效率图；图3B是改变40％红细胞比容样本中流速的侧出口处的3μm珠的过滤效率图。此外图中示出了表示出口处通道截面的珠分布的荧光图像(白色虚线表示近似的通道壁边界)。
图4A-4B为直方图，其示出了改变4A 10％红细胞比容样本和4(B)40％红细胞比容样本中的流速的微通道出口处的标准化iRBC分布。与采用3μm珠的结果相反，在10％红细胞比容时观测不到iRBC边缘。在40％红细胞比容时，对于各种流动条件，～80％的iRBC迁移至侧壁边缘。
图5是改变40％红细胞比容样本中流速的侧出口处的晚期的营养体/裂殖体iRBC的过滤效率图。同理图中示出了表示出口处通道截面的被DARI染色的iRBC分布的荧光图像(白色虚线表示近似的通道壁边界)。
图6A-6B是表示在三个出口处采集的iRBC和常规RBC的浓度的流式细胞术(FACS)的数据图。图中示出了表示6A营养体/裂殖体晚期和6B环形阶段iRBC样本沿着三个出口的iRBC分布的计数(counting)结果。该结果表明，对晚期的营养体/裂殖体阶段的iRBC，过滤效率>90％，而对于早期环形阶段的iRBC，过滤效率为～75％。
图7A-7B是由PDMS制成的具有单个入口和八个等分出口(标记为1-8)并且用于CTC分离的组合螺旋微通道的照片(微通道充满染料以便可视化)。图7A也示出了示出螺旋微通道的出口截面的微观图像。
图8是用于CTC分离的螺旋分选器的示意图。在入口处，血细胞(RBC、白细胞、CTC)微通道截面的随机分布。在惯性升力和迪恩(Dean)涡的影响下，这些细胞基于它们的尺寸在截面内的区别(distinct)位置上保持平衡，其中较大的CTC在距离微通道内壁最近处保持平衡。然后，采用八个等距出口提取单个的细胞流，从而实现分离。
图9A-9B均为示意图，其中图9A是为细胞周期同步而开发的螺旋微流体设计的示意图。在惯性升力和迪恩拖曳力的影响下，异步的细胞群按尺寸分级，以在G0/G1、S和G2/M阶段获得较为纯粹的细胞群。由于尺寸较大，G2/M阶段的细胞在最接近微通道内壁处保持平衡，而S和G0/G1阶段的细胞次之；插图是PDMS制成的具有一个入口和八个出口的螺旋微通道的照片；图9B是使用荧光标记的聚苯乙烯颗粒的设计原理的校验示意图。重叠的图像示出了入口处直径为10μm、15μm、25μm的颗粒的分布和位置、出口前面500μm宽的通道截面，以及流速为2.5ml/min高度为140μm的微通道的分为两部分的出口。入口处随机分布的颗粒形成有序的聚流，然后在出口1、2、3处被分别采集。
图10A-10C是显示具有永久细胞系的细胞周期分析结果的图形(10A＝HeLa,10B＝KKU-100,10C＝CHO-CD36)。直方图表示同步之后的G0/G1、S和G2/M阶段中分选的单细胞的DNA内容的分布。G2/M阶段的细胞的DNA数量是G0/G1阶段细胞的两倍，因此荧光强度也是其两倍。在出口1采集的更大的细胞表示G2/M细胞群比例提高，而在出口4采集的较小的细胞表示G0/G1阶段的极大提高。图中也示出了同步细胞的尺寸分布。
图11A-11C为从出口1、2、3和4采集的尺寸已分选的hMSC细胞的光学显微照片。图11A示出了在出口1采集的平均细胞直径为～24μm，相对照的，在出口4采集的平均细胞直径为～15μm(p<0.001)。图11B示出了表示分选后hMSC的存活性的采集的细胞被台盼蓝染色的显微照片(箭头表示不能存活的细胞)。结果表明，细胞在这些微通道中承受的高剪切并不影响其存活性，可以实现大于90％的细胞回收。图11C是补种的细胞的光学显微照片，其表示从出口采集的具有高存活性和无菌的细胞的增殖速度之间没有太大的差别；Bar＝50μm。
图12示出了表示同步之后的G0/G1、S、G2/M阶段中分选的hMSC的DNA内容分布的直方图。同步细胞的尺寸分布也在图中示出(p<0.05)。
图13示出了表示在不同的增长时间间隔内从出口4采集的分选的hMSC的DNA内容分布的直方图。随着所有出口4的hMSC(24h时为82.3％)在1天(79.7％)经过S和G2/M阶段，hMSC展示了同步细胞分裂。由于接触抑制，G0/G1阶段的细胞百分比从2天向上增长。由于内分裂(interdivision)时间内的随机变异，同步随着时间的推移而衰退。
图14是开发的超高生产量(throughput)的CTC分离片的示意图，其示出了工作原理。全血通过装置的内部入口泵送，而鞘液流经外部入口。在迪恩拖曳力的影响下，由于通道的曲线几何形状，较小的血液细胞(RBC和WBC)随着两个相反的旋转涡流(截面图)朝着通道外壁迁移。CTC则由于其尺寸较大而承受较强的惯性升力，使之沿微通道内壁达到平衡，从而实现分离。
图15A和15B为平均合成图像15A和线扫描15B，表示RBC、白细胞和CTC在螺旋微通道的出口处的水平位置。这些图像示出了血液细胞(RBC和白细胞)在迪恩拖曳力的影响下被调换到通道的外半部分，而较大的CTC在惯性升力的影响下集中靠近通道内壁。
图16是用于将罕见细胞(rare-cell)与血液分离的微流体装置的示意图。
微通道的设计由具有伸-缩阵列构图的高纵横比的矩形微通道构成。在细胞聚集区中，在剪切力调节的惯性升力的影响下所有细胞沿着通道侧壁有效地保持平衡。在流经罕见细胞收聚(pinch)区的过程中，较大细胞的质心沿着通道中心对齐，较小的血液细胞沿着通道侧壁继续聚集。分叉出口的设计允许在中心出口处采集较大的罕见细胞，而剩下的血液细胞则从侧出口移除。
图17A-17B示出了微通道在红细胞聚集处的纵横比(AR)的效果。图17A是示出增大纵横比的RBC平衡的平均合成图像。输入血样固定在1％红细胞比容并以Re＝100泵送。微通道在输入处始于200μm的宽度部分，并在输出处紧邻分叉点之前开口为300μm的宽度部分以促进分离。相邻的示意图图示了出口处的微通道截面内RBC的大致位置(虚线表示通道壁的大致位置)。图17B为呈现在出口处测得的RBC在微通道宽度的概率分布的线扫描。图中也示出了表示侧出口位置的出口分布。
图18A-18C示出了红细胞聚集的流速(Re)效果。图18A是示出增大流速的RBC平衡的平均合成图像。输入血样固定为1％红细胞比容并经过AR 5微通道泵送(虚线表示通道壁的大致位置)。图18B为呈现在出口处测得的RBC在微通道宽度的概率分布的线扫描。图18C为表示通道中心处的无细胞(cell-free)区的宽度以及增加雷诺数(Re)的细胞带(cellband)的厚度的实验结果。
图19A-19C示出了红细胞聚集处的红细胞比容效果。图19A是示出增大红细胞比容的RBC平衡的平均合成图像。输入血样通过AR 5微通道以Re＝100泵送(虚线表示通道壁的大致位置)。图19B为表示在出口处测得的RBC在微通道宽度的概率分布的线扫描。图19C为呈现通道中心处的无细胞区的宽度以及增加红细胞比容的细胞带的厚度的实验结果。
图20是表示开发的微流体装置的罕见细胞分离原理的时序图像的示意图。在细胞聚集区中，在剪切调节的惯性升力影响下的CTC(以黄圈表示的MCF-7细胞)沿着微通道侧壁保持平衡。这种情况在通道扩展区显而易见，这是由于CTC保持转移到微通道中心的两侧(白色虚线表示通道的大致中心)。CTC的惯性中心通过收聚部分并与微通道的宽度中心对齐。在扩展区，CTC继续随着流线流动并沿着微通道的宽度中心对齐。
图21A-21B示出了细胞收聚区的通道宽度对CTC分离效率的影响。图21A是示出增大具有变化“收聚”宽度的微通道中的流速的中心出口内的MCF-7细胞分离的平均合成图像(虚线表示通道壁的大致位置)。图21B表示增大Re的中心出口处采集的MCF-7细胞以及外周血液白细胞部分的图。
具体实施方式
本发明的示例性实施方式描述如下。
本发明通常用于微流体装置，以及该装置从具有2个或更多(多个)的细胞类型(例如细胞的采集物或混合物)的样本中检测和/或分离一种或多种特定类型的细胞(例如待检测和/或待分离的目标细胞)的用途。微流体装置包括一个或多个用于引入所述样本的入口，一个或多个样本流过的通道以及一个或多个出口，且通常为至少两个出口。其中，样本中待检测和/或待分离的细胞流经多个出口中的一个(例如第一出口)，而样本中其余的细胞不会流过待分离的细胞流过的同一出口，并/或流过另一(不同的)出口(例如第二出口)。一个或多个通道中的每个具有长度，以及限定纵横比的高度和宽度的截面，从而沿着通道截面的至少一部分而分离目标细胞，其中目标细胞沿着每个通道的第一部分流到第一出口，其余细胞沿着每个通道的第二部分流动，而且不会流过目标细胞流过的同一出口，并/或流过一个或多个(不同的，例如第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八等)出口。
如本文所述，微流体装置可具有一个或多个(至少一个)入口，用于将样本导入装置。例如，该装置可具有一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等入口。
可采用本领域技术人员公知的各种技术导入样本。例如可用注射器和/或泵导入样本。
同理，微流体装置可具有一个或多个出口。在某些方面，该装置可具有一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等出口。在特定方面，该装置具有至少2个出口。在另一方面，该装置具有3个出口。在又一方面，该装置具有4个出口。在再一方面，该装置具有8个出口。
该装置还包括将一个或多个入口连接到一个或多个出口的通道(例如平行通道，例如一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等平行通道)。通道包括限定纵横比的高度和宽度的截面，使得目标细胞从样本中的其余细胞分离出来。本文采用的纵横比是指通道的高度与宽度之比，该纵横比提供通道的近似截面积，以允许目标细胞沿着通道截面的至少一部分流到第一出口，而其余细胞沿通道的不同(例如第二、第三、第四)部分或截面流动，并且不会流到目标细胞流到的同一出口，例如流到不同的(例如第二、第三、第四等)出口。与样本中其余细胞的相同或相似的结构特性相比，基于样本中目标细胞的在结构特性上的差异，适当的纵横比可使得目标细胞沿着通道的区别部分流动。结构特性的例子包括细胞尺寸、硬度、变形性、粘性(例如细胞粘性)，诸如此类。例如此处所示，可采用1、2.5、3.75、5或7的纵横比。
本领域技术人员应当理解，通道可具有各种形状。在某些方面通道可为线性的。线性通道的高度范围可为约10μm-约200μm，例如约20μm、约50μm、约75μm、约100μm和约150μm。线性通道的宽度范围可为约10μm-约50μm，例如约12μm、约15μm和约20μm。线性通道的长度范围可为约1cm-约5cm，例如约3cm。
在其它方面，通道是弯曲的。在特定方面，通道为螺旋形。螺旋通道的高度范围可为约10μm-约200μm，例如约100μm、约140μm。螺旋通道的宽度范围可为约100μm-约500μm。螺旋通道的长度范围可为约1cm-约10cm。
样本能以各种流速通过微流体装置，例如生理流速(例如生理小动脉流速)或非生理流速。示例性流速包括2千万细胞/分钟或者其范围为约2.5ml/min-约5μl/min(分钟)。
此处描述的微流体装置可用于从细胞样本中检测、分离和/或隔离出目标细胞。细胞样本例如可为生物样本，例如血液(例如全血)、血浆、腹水、淋巴、髓液、尿液、组织及诸如此类。样本也可为细胞培养样本。在特定方面，样本为血样(例如全血样本)。血样可具有低的红细胞比容(例如约1-10％)或高的红细胞比容(例如约20-50％)。
血液是血浆中的复合细胞悬浮液(血容量为～40-45％)，起到数个关键的作用，包括向细胞运输氧气和营养，移除细胞废产物以及提供免疫保护。红细胞(RBC)占所有血液细胞组分的大于99％(每毫升全血有～5x109RBC)，其余1％以下的组分由外周血液白细胞(PBL)和血小板。由于性质复杂，采用微流体生物芯片分析血液已成为挑战性的问题。除了RBC和白细胞以外，在患者的外周血液中还可找到其他低丰度细胞，例如胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、干细胞以及白血病细胞，可用于各种生物医学应用，例如病人监护、疾病诊断、治疗处理监控和进行基础科学研究。然而，由于这些细胞极其稀少，因此在进行分析前，几乎始终需要进行富集或分离步骤以有效地将这些细胞从血液中分离。
因此，本文描述的一个或多个微流体装置(例如，级联(例如并联或串联)的微流体装置)可用于各种目的，并且在一方面，用于检测各种目标细胞的隔离和/或分离。能够检测到各种目标细胞。示例包括病变细胞，例如病变的血细胞(例如感染疟疾的红细胞)、白血病红细胞、镰状细胞贫血红细胞或它们的组合，异步混合中的同步细胞以及循环肿瘤细胞(CTC)。
在一个方面，该装置用于在血样中检测一种或多种病变血细胞的方法。该方法包括将血样导入微流体装置的至少一个入口，该微流体装置包括一个或多个线性通道，其中每个通道具有长度，以及由高度和宽度的组成限定纵横比的截面，适于根据病变血细胞与非病变血细胞相比而减弱的变形性沿着通道截面的至少一部分而分离病变血细胞，其中病变血细胞沿着每个通道的第一部分流到第一出口，而非病变血细胞沿着每个通道的第二部分流到第二出口。此处所用的病变细胞是指与非病变(如健康的)细胞相比在结构上有一个或多个方面不同的细胞。例如，病变细胞可具有与非病变细胞不同的尺寸、硬度、变形性、粘性或它们的组合。例如病变细胞可为感染疟疾的红细胞、镰状细胞贫血红细胞、白血病红细胞或它们的组合。在一个方面，病变细胞可为早期(例如环形阶段)或晚期(例如营养体阶段或裂殖体阶段)感染疟疾的红细胞。可用约5μL/min的流速导入血样。在一个方面，能够以约75％-约85％的效率分离出环形阶段感染疟疾的红细胞。另一方面，能够以约90％的效率分离出晚期感染疟疾的红细胞。该方法还可包括从第一出口采集病变细胞。在某些实施方式中，通道的纵横比范围可为约1-约2。在某些实施方式中，微流体装置还可包括用于改善可视效果的扩展区。在某些实施方式中，第二出口的宽度范围可为第一出口宽度的约2-约10倍。在某些实施方式中，通道宽度可为约15μm。在某些实施方式中，通道高度可为约10μm。
如上所述，在特定方面病变细胞为感染疟疾的红细胞。疟疾是最为严重的寄生虫病之一，全世界人口的一半(33亿)都有感染风险，估计每年有100-200万人死于此病。在资源缺乏的贫穷国家情况更加糟糕，在这些受到影响的国家，人们为了治疗疾病而背负沉重的经济负担。在四种人体疟疾中，镰状疟原虫(Plasmodium(P.)falciparum)是最为致命的。一旦感染，感染镰状疟原虫的血细胞(iRBC)在48小时的红细胞内周期中会经历各种发展阶段(环形、营养体和裂殖体阶段)。在此期间，寄生虫持续改造(remodel)宿主RBC并且释放某些寄生蛋白，使得iRBC膜粘性更强，从而随着寄生虫的成熟而促进细胞粘连和iRBC膜逐步硬化。这些寄生虫诱导的形态改变包括微循环，甚至能够产生病理生理学结果，例如贫血、代谢性酸中毒或重症疟疾时的器官衰竭。
一方面，本文受白细胞附壁体内现象(戈德史密斯·HL(Goldsmith HL)等，(1984)、微血管研究，27(2)：204-222页)；(菲比希·E(Fiebig E)等，(1991)、国际微循环杂志-临床与实验，10(2)：127-144页)的启示，描述了用于在微流体装置中分离感染红细胞(iRBC)的基于变形性的分离方法。在腔直径小于约300μm的血管中，比白细胞尺寸更小但更易变形的RBC趋于向血管的轴心迁移，结果形成邻近血管壁的红细胞比容降低的血浆层，同时在血管中心的红细胞(RBC)浓度升高(皮尔斯·AR(Pries AR)等，(1996)心血管研究，32(4)：654-667页)。这种向内的RBC迁移的原因在于血管内的泊肃叶(Poiseuille)流速剖面，其导致指向中心的由压力梯度所诱导的力(Goldsmith HL等，(1989)美国生理学杂志，257(3)：HI 005-H1015)。由于血管内存在抛物线流体速度剖面(最大值位于中心)，轴心处的RBC的主体流(bulk flow)释放得更快。这样引起血管红细胞比容释放的降低和法氏效应，也会由于细胞净除血浆层(法-林效应)而导致血液粘度明显降低。相同的，当RBC朝着轴心迁移时，白细胞与迁移RBC之间的机械碰撞使得较大(并且较不易变形)的白细胞朝着血管壁转移，这种现象适宜称为着边(Goldsmith HL等，(1984)微血管研究，27(2)：204-222页)以及(Fiebig E等，(1991)国际微循环杂志-临床与实验，10(2)：127-144页)。这两种血液动力学效应、法氏效应以及着边已用于进行血浆分离的微流体装置中(凡·R(Fan R)等，(2008)自然生物技术，26(12)：1373-1378页)和(雅吉·RD(Jaggi RD)等，(2007)微流体与纳米流体，3(1)：47-53页)以及从全血的白细胞富集(舍科普拉斯SS(Shevkoplyas SS)等，(2005)分析化学，77(3)：933-937页)。在上述例子中，待分离的细胞与RBC在变形性(硬度)和尺寸上显然不同。然而，此处描述的是分离正常和感染疟疾的iRBC的仿生分离技术的应用，具有相同的尺寸，并仅在变形性上有微小差别。
首先采用悬浮在全血中被深荧光标记的聚苯乙烯3μm珠来说明分离原理。然后采用与全血混合的环形阶段的iRBC和晚期营养体/裂殖体阶段的iRBC这两者来进行测试。此处的结果表明：环形阶段iRBC的分离效率为约75％，而晚期阶段的iRBC的分离效率大于90％，例如高达约99％。
此处描述的分离技术并不需要荧光染料或其它化学修饰，而且可以以高的红细胞比容数(～40％)直接实施在原始血样上。高红细胞比容数是约20％-约50％范围内的红细胞比容，并且在特定方面为约30％或约40％。在一方面，微流体装置是一入口-三出口装置，其流速可以允许与下游检测技术(例如姬姆萨染色法)容易得配合。装置的操作不需要用电或电池，不能使用重力进料泵。所有这些特征使之成为理想的iRBC富集技术，用于资源有限的临床设置中进行现场测试。此外，也可容易地应用于特征在于细胞硬度变化的其它血液细胞疾病(例如镰状细胞性贫血)(伊万斯·E(Evans E)等，(1984)临床调查杂志，73(2)：477-488页)；(洛森布鲁斯·MJ(Rosenbluth MJ)等，(2006)生物物理学杂志，90(8)：2994-3003页)。
现在已对随内部的寄生虫的成熟iRBC的硬度变化进行了广泛研究(保罗里斯克·M(Paulitschke M)等，(1993)实验与临床医学杂志，122(5)：581-589页)；(苏雷什·S(Suresh S)等，(2005)生物材料学报1(1)：15-30页)；(谢尔比·JP(Shelby JP)等，(2003)美国国家科学院学报，100(25)：14618-14622页)。Suresh等人采用光钳来扩展和测量单个iRBC在感染的不同阶段的弹性模量。未感染的RBC以及环状阶段、营养体阶段、裂殖体阶段的iRBC的弹性模量据报告分别为8、16、21.3、53.3μN/m(Sures S等，(2005)生物材料学报，1(1)：15-30页)。造成不同阶段之间细胞硬度的显著变化的原因部分在于细胞内居住着较大的不可变形的寄生虫，导致内部粘性大大增加(科林斯特·FK(Clenister FK)等，(2002)血液，99(3)：1060-1063页)以及(纳什·GB(Nash GB)等，(1989)血液，74(2)：855-861页)。随着寄生虫的成熟，平圆的(discoid)iRBC更加趋近为球状，其表面积与体积之比减小，导致细胞变形性减弱(Nash GB等，(1989)血液，74(2)：855-861页)和(赫利克·T(Herricks T)等，(2009)细胞微生物学，11(9)：1340-1353页)。此外，寄生蛋白的释放使得iRBC膜通过交联而硬化，并且稳定膜中的血影蛋白网络，从而降低其多变性(克兰斯顿·HA(CranstonHA)等，(1984)科学，223(4634)：400-403页)。据最近的研究报告，在营养体和裂殖体的晚期阶段的iRBC，膜的硬度在发热温度下继续增加，从而推测其作用为在微循环中造成血管堵塞(马林科维奇·M(Marinkovic M)等，(2009)美国生理学杂志：细胞生理学，296(1)：C59-C64)。RBC变形性(以及iRBC缺乏变形性)具有重要的生理学相关性。正常RBC可高度变形，从而在经过毛细血管时发生形状变形(萨顿·N(Sutton N)等，(1997)微血管研究，53(3)：272-281页)，逃避脾脏的清除(赛弗科瑞·I(Safeukui I)等，(2008)血液，122(6)：2520-2528页)，并且导致以低雷诺数进行横向(lateral)迁移(柯普瑞·G(Coupier G)等，(2008)流体物理学，20(11)：4)。iRBC变形性的降低可能导致多个重要的病理生理学成果。例如，Shevkoplyas等人研究了在模仿微血管网络的微流体装置中经戊二醛处理的RBC(变形性降低)(Shevkoplyas SS等，(2006)芯片实验室，6(7)：914-920页)，并通过网络显示了血液流速降低而RBC硬度增大，导致通道堵塞和红细胞比容的不均匀分布。近来的研究也表明硬化的RBC还会影响狭窄微通道的无细胞层的厚度(藤原·H(Fujiwara H)等，(2009)生物力学杂志，42(7)：838-843页)，并且iRBC，尤其是晚期阶段的营养体和裂殖体，在体内模拟内皮上的多步白细胞康复(旋转以及随后粘附)(Ho M等，(2000)实验医学杂志，192(8)：1205-1211页)。实际上，微脉管系统中的细胞粘连有助于iRBC逃避脾脏的清除，脾脏识别出它们变形性的减少。脾脏独有的狭缝状结构要求RBC在静脉窦的内皮(interendothelial)狭缝中发生相当大的变形(Safeukui I等，(2008)血液，122(6)：2520-2528页)。硬化的iRBC被保持在脾脏的上游并且进行“点蚀”(通过机械挤压从iRBC机械地提取寄生虫)，其有效地从循环中去除iRBC，从而降低寄生负载。
虽然流式细胞术已稳固地成为根据细胞表面标记而进行细胞分选的技术，但是如此处所示的，细胞变形性也为净化/丰富细胞提供了独立及生理学意义的度量标准。现在各种技术已应用于基于变形性的细胞分离(小米·T(Xiaomi T)等，(1995)色谱杂志B辑：生物医学科学与应用，674(l)：39-47页)以及(林肯·B(Lincoln B)等，(2004)细胞计数法A部分，59A(2)：203-209页)。然而，这些技术绝大多数都在分批流动模式下工作(Xiaomi T等，(1995)色谱杂志B辑：生物医学科学与应用，674(l)：39-47页)，导致生产量低，不能单独采集具有不同变形性的细胞(Lincoln B等，(2004)细胞计数法A部分，59A(2)：203-209页)。
另一方面，微流体装置可用于检测、分离和/或隔离循环肿瘤细胞。在所有癌症相关的死亡中，癌症转移和肿瘤致命性占了～90％的比例。对于主要负责转移的循环肿瘤细胞(CTC)的检测能提供关于疾病阶段和癌症发展的有价值的见解。其列举内容也用于临床评估和监控治疗处理反应。由于CTC非常稀少，每109个血液细胞中少到才有1个CTC，并具有高度异构的形态和分子标签，因此将其从血液中分离是一项技术挑战。
因此，在一方面，本发明也旨在一种检测个体样本的一种或多种循环肿瘤的方法。该方法包括将样本引入微流体装置的至少一个入口，微流体装置包括一个或多个螺旋通道，其中每个通道具有长度，以及限定纵横比的高度和宽度的截面，适于根据细胞尺寸沿着通道截面的多个部分分离循环肿瘤细胞，其中循环肿瘤细胞沿着通道的径向最内部分流到第一出口，而样本中的其余细胞沿着通道的另一部分流到第二出口。该方法还可包括从第一出口采集循环肿瘤细胞，及分析循环肿瘤细胞从而评估治疗处理效果。样本可为血样。
此处描述了利用微流体从血液中分选循环肿瘤细胞(CTC)的高生产量的细胞分离技术。一方面，设计由采用聚二甲硅氧烷(PDMS)制作的低纵横比螺旋形微通道组成。分离取决于由较大细胞尺寸导致的惯性升力与螺旋几何形状导致的迪恩拖曳力之间的相互作用，从而在微通道截面的区别位置上保持细胞平衡。通过设计适当的分为二部分的出口，能够根据细胞尺寸而单独地采集细胞。该技术应用于从血液细胞(～8μmRBC，～10-15μm白细胞(WBC))中分离单独的CTC(所述CTC尺寸较大，通常直径为～20μm)，以进行早期癌症检测及监控治疗效率。
在螺旋微通道中流动的细胞承受离心加速度诱导的迪恩拖曳力与惯性升力的组合。惯性升力随着细胞尺寸的四次方而变化，用于在微通道截面内将细胞聚集在区别的多个平衡位置。通过设计螺旋形微通道而增加迪恩拖曳分量，可将多个平衡位置减小为靠近微通道壁内部的仅一个位置。由于升力与迪恩拖曳力的比值随着细胞尺寸变化，因此可根据细胞尺寸在沿微通道截面的区别位置使细胞保持平衡，其中细胞越大，则平衡位置越靠近微通道壁。这样导致了可通过设计适当出口而单独采集的细胞区别流的演变。
装置由聚二甲硅氧烷(PDMS)制作并与显微镜载玻片结合(图7A-7B)。微通道设计由具有扩展的8等分出口系统的500x100μm(W×H)微通道组成。入口样本由刺入(spike)变化的CTC浓度的稀释全血(0.1％红细胞比容)组成。由于样本流经微通道，因此正常RBC、白细胞和CTC根据它们的尺寸在微通道截面上保持平衡。CTC由于尺寸较大(最高为～20μm)而受到惯性升力的显著影响，并且靠近通道内壁保持平衡。RBC(～8μm)以及白细胞(10-15μm)小于CTC，更多地受到迪恩拖曳的影响，并在远离微通道内壁处聚集，从而实现分离。通过设计低纵横比微通道，可以放大平衡位置的差异，便于从出口1采集罕见CTC，如图8所示，其它出口包含其余血细胞，从而实现高生产量的基于尺寸的持续分离。在该技术的另一实施方式中，可以采用分离技术从腹水中分离其它罕见细胞(包括基质细胞)，从血液中分离白血病细胞，以及从母血中分离胎儿有核红细胞。
在某些实施方式中，通道的纵横比范围为约1-约5，例如约3.75。在某些实施方式中，该方法可包括根据细胞直径将存在于混合细胞类型的群体内的干细胞或前体细胞分离为具有区别功能的亚种群。然后可从装置中采集这些亚种群并根据独有的新陈代谢功能进行分析，例如隔离并富集具有增值、区分或响应于特定药剂的强化能力的亚种群。在某些实施方式中，通道宽度可为约500μm，通道高度可为约100μm。
此处描述利用螺旋微通道几何形状从全血中分选循环肿瘤细胞(CTC)的高生产量的基于尺寸的细胞分离技术。该设计利用作用在各种尺寸的细胞上的惯性升力和粘滞拖曳力而实现差异迁移。螺旋微通道几何形状引起的主要的惯性力和迪恩旋转力使得较大的CTC聚集并占据微通道内壁附近的单个平衡位置。较小的血液成分(RBC和白细胞)在迪恩力的影响下迁移到通道的外半部分，从而形成随后在两个分离出口处被采集的两个区别流。由于具备处理全血的能力，此处提出的技术只需不到10分钟即可处理1mL全血，并能在内部出口移除99％血液细胞，并实现90％CTC回收。
流经曲线通道的流体承受指向径向向外的离心加速度，从而在通道顶半部和底半部形成两个反向旋转涡流，称为迪恩涡。这些二次流的大小采用无量纲参数进行量化，迪恩数(De)如下获取：
其中，ρ为流体密度，Uf为平均流速，μ为流体粘度，Rc为通道路径的曲率半径，Dh为通道液压直径，Re为流动雷诺数(惯性力与粘性力之比)。因此，在曲线通道中流动的颗粒由于这些横惯的(transverse)迪恩流的存在而承受拖曳力，从而在涡流内沿流动方向被吸入和推动。此动作是指从顶部或底部观察时，微粒在内外壁之间沿着通道宽度前后移动，并且下游距离增大。在通道内流动时，细胞横向迁移的速度取决于迪恩数，并可如下计算：
UDean＝1.8×10-4De1.63 (2)
可以根据“迪恩周期”限定微粒沿迪恩涡横穿(traverse)的横向距离。例如，初始位置靠近微通道内壁并以给定下游距离向通道外壁迁移的微粒可以说是完成了1/2迪恩周期。微粒返回微通道内壁附近的原始位置时则完成整个迪恩周期。因此对于给定微通道长度，在流速(Re)增大的条件下，微粒能这样经历多个迪恩周期迁移。完整迪恩周期的迁移长度计算如下：
LDC～2w+h (3)
其中w是微通道宽度，h是微通道高度。因此，迪恩迁移所需微通道总长如下：
除了迪恩拖曳力之外，直径可比得上微通道尺寸的较大细胞也承受了相当大的(由剪切和壁面两者诱导的)惯性升力(FL)，这使这些细胞聚集并且保持平衡。泊肃叶流中的抛物线速度剖面使得剪切诱导的作用于微粒的惯性升力FIL引导微粒从微通道中心向通道壁移动。由于微粒移动成更加靠近通道壁，通道壁的突然出现打乱了形成在微粒周围并诱导升力(FWL)的旋转尾流，该升力引导微粒从通道壁离开而朝向微通道中心移动。在这两种相反的升力作用下，微粒在区别和可预测位置上围绕微通道外围保持平衡(聚集)。这种效果对尺寸可比得上微通道尺寸ac/h～0.1的微粒尤为明显。在具有曲线几何形状的微通道中，惯性升力(FL)与迪恩拖曳力(FD)之间的相互作用使得平衡位置减少为通道内壁附近的仅两个位置，每个位置均在顶部和底部迪恩涡中。两个平衡位置在微通道高度方向上彼此重叠，并针对给定的微粒尺寸与微通道内壁保持相同的距离，也即在微通道宽度方向上看起来像是同一位置。
此处描述的工作利用了这两种现象(即迪恩迁移和惯性聚集)，从而从血液中分离CTC。一方面，该设计包括总长为～10cm的2入口2出口的螺旋微通道。微通道宽度为约500μm，高度为约140μm。如图15A-15B所示，通道尺寸选择为使得较大的CTC承受惯性聚集，而较小的血液细胞(RBC和白细胞)的迁移收到迪恩拖曳的影响(即仅有CTC满足ac/h～0.1的比值)。在入口处，全血样本通过螺旋微通道的外部入口泵送到内部入口和鞘液(例如1×PBS)(图14)。鞘液可用于在入口处收聚全血，从而将全血限定在通道宽度方向上的狭窄区内，使得所有细胞从大致相同的位置开始迁移。测试期间，在迪恩拖曳力的影响下，小细胞沿迪恩涡开始迁移并朝通道外壁移动。CTC承受的强大的惯性升力防止CTC在迪恩拖曳力的影响下迁移，并使CTC聚集并占据微通道内壁附近的两个平衡位置。另一方面，由于RBC和白细胞不受惯性力的影响，因此这些细胞继续沿迪恩涡循环。通过计算适当的流速，确保细胞经历半个迪恩周期迁移，在出口处CTC聚集在通道内壁附近，而RBC和白细胞则被运送到通道的外半部分。因此，可在内部出口隔离和采集CTC，而在外部出口采集其它血液细胞(图14)。使用该技术的优点是其处理极高红细胞比容样本(全血)从而减少样本制备步骤并大大缩短分析时间的能力。采用该技术可以在10分钟内处理1mL全血。
另一方面，在个体的样本中检测循环肿瘤细胞的方法包括将样本导入微流体装置的至少一个入口，该微流体装置包括一个或多个线性通道，其中每个通道具有长度，以及限定纵横比的高度和宽度的截面，适于根据细胞尺寸沿着通道截面的至少一部分而分离循环肿瘤细胞，其中循环肿瘤细胞沿着通道的第一部分流到第一出口，而样本中的其它细胞沿着通道的第二部分流到第二出口。该方法还可包括从第一出口采集循环肿瘤细胞，并分析所述循环肿瘤细胞从而评估治疗处理的效果。样本可为血样。在某些实施方式中，通道的纵横比范围可为约2-约10。在某些实施方式中，通道的纵横比范围可为约3-约5。远离入口的端部的通道宽度可具有待分离细胞的数量级，也就是说，在远离入口的端部处的通道宽度可以大约为待分离细胞的尺寸。在某些实施方式中，通道宽度可为约20μm。微流体装置还可包括位于远离入口的通道端部处的扩展区以改善视觉效果。在某些实施方式中，微流体装置还可包括至少一个细胞聚集区，其截面适于使得所有细胞朝着较长的通道尺寸迁移并沿其移动。
此处描述的是用于从血液中分离CTC的剪切调节的惯性微流体的应用。图16展示了开发的微流体装置的示意图。该装置在单个步骤中通过去除全部或绝大部分红细胞而从外周血液中有效地分离罕见细胞，所述红细胞占血液细胞大于99％。在一个方面，设计由具有伸-缩阵列构图的单入口高纵横比矩形微通道组成。伸区和缩区的宽度分别为约20μm、约60μm，它们的长度为约100μm。通道包括总长度为约1.5cm的75个由伸区和缩区构成的子单元(一对伸区和缩区构成一个子单元)。出口开放为约300μm宽的截面以增强视觉效果并且等分为3个约100μm宽的分支臂，两个侧出口以及中心出口臂。在中心出口采集目标细胞，而从侧出口去除全部其它血液成分。作为这种新颖技术的应用，此处例示了以高效率(大于80％CTC回收)和生产量(400uL/min流速)从血液中分离罕见CTC，从而采用单个通道进行108个细胞/分钟的处理。该通道设计能够在几分钟内处理多个毫升的临床血样。该装置可定制为用于从包含外周血液白细胞和胎儿有核红细胞的血液中分离其它罕见细胞(沃纳·G.(Vona,G.)等，美国病理学杂志，2002.160(1)：51页)。
基于通道(例如微通道)内细胞聚集的惯性升力正快速地促成新颖、高生产量的物理细胞分离技术的开发(巴哈特·A.A.S.(Bhagat,A.A.S.)等，医学与生物工程及计算，2010；迪·卡罗·D.(Di Carlo,D.)芯片实验室，2009.9(21)：第3038页)。开发的生物芯片利用这些惯性升力而从其它外周血细胞中成功分离CTC。高纵横比微通道截面可分为两个区：(1)细胞聚集区以及(2)罕见细胞收聚区(图16)。在细胞聚集区(前70个子单元)中，在剪切调节的惯性升力的影响下，所有细胞沿着较长的通道侧壁迁移并保持平衡(Bhagat,A.A.S.等，流体物理学，2008.20：第101702页)。在流经微通道的流体中悬浮的中性浮力微粒/细胞通常承受粘性拖曳力和惯性升力两者。平面泊肃叶流中的抛物线层流速度剖面产生剪切诱导的惯性升力，导致微粒从通道中心向微通道壁迁移(阿斯莫洛夫·E.S.(Asmolov,E.S.)，流体力学期刊，1999.381：63-87页)。由于微粒迁移成靠近通道壁，则微粒周围诱发的不对称尾流生成驱动微粒远离通道壁的壁诱导升力(增·L.(Zeng,L.)等，流体力学期刊，2005.536：1-25页)。这两个相反的升力彼此平衡，使得均匀分布的微粒在围绕微通道外周的狭窄带中保持平衡(马塔斯·J.P.(Matas,J.P.)等，油气科学与技术，2004.59(1)：59-70页；塞格雷·G.(Segre,G.)等，自然，1961.189：209-210页；Segre,G.等，流体机械期刊，1962.14：115-136页；Matas,J.P.等，流体机械期刊，2004.515：171-195页)。在基于微流体的流中，可论证，由于通道雷诺数低(通道尺寸小、流速小所致)而忽略这些惯性力。然而，当微粒/细胞尺寸可比得上通道尺寸时，这些惯性升力变得重要，并导致微粒沿流线横向迁移。
对于用于实际微流体应用的有限通道长度中聚集的细胞，在ac/Dh≥0.07时平衡产生，其中ac是细胞直径，Dh是微通道液压直径(Bhagat,A.A.S.等，流体物理学，2008.20：第101702页；Bhagat,A.A.S.等，芯片实验室，2008.8(11)：1906-1914页；汉普顿·R.E.(Hampton,R.E.)等，流变学期刊，1997.41：第621页；Di Carlo,D.等，美国国家科学院学报，2007.104(48)：第18892页)。在方形微通道中，在低雷诺数的流动(Re<100)中，由于全部四个侧面上的均匀剪切梯度而存在八个稳定平衡位置(Bhagat,A.A.S.等，流体物理学，2008.20：第101702页；春·B.(Chun,B.)等，流体物理学，2006.18：第031704页；Bhagat,AAS.等，微流体与纳米流体，2009.7(2)：217-226页)。近来的报告已证明在高纵横比矩形微通道中，剪切速率调节导致沿较长微通道尺寸(此处为高度)的优先聚集(Bhagat,A.A.S.等，流体物理学，2008.20：第101702页；Bhagat,AAS.等，微流体与纳米流体，2009.7(2)：217-226页)。由于惯性升力衡量为FLaG2(其中G为沿通道的剪切速率)，高纵横比(AR，通道高度与宽度之比)矩形微通道截面沿通道宽度产生更高的剪切速率(aAR2)，从而沿着微通道高度促进细胞平衡。因此，入口处的分散细胞在通道侧壁附近迁移并对齐为两个流，从而产生无细胞中心区。如本文所示，利用该现象沿着通道壁聚集所有外周血细胞以便在下游去除。术语“平衡”和“聚集”此处可互换地使用并意味着细胞沿着较长微通道侧壁迁移到最终的固定位置。
微流体装置还可包括位于通道出口前面的罕见细胞收聚区(例如最后5个伸-缩子单元)，用于从其它血液细胞中成功地分离出罕见细胞(图16)。此收聚区的收缩宽度(或收聚宽度)设计为可比得上CTC的直径(即在CTC直径的数量级上)，使得这些较大细胞的惯性中心沿微通道的轴心对齐。因此，在出口处红细胞和PBL沿通道侧壁保持聚集，而较大的CTC沿通道轴心释放，使得中心出口采集所有罕见细胞，而从侧出口去除大于99％的血液细胞。
在高纵横比装置中，微通道宽度是调节细胞聚集的重要尺寸。此处，该尺寸对应于收缩区的宽度并且约为20μm。在理想情况下，仅需一条直的微通道(不含伸-缩阵列)就足以沿通道侧壁有效地进行细胞平衡(Bhagat,A.A.S.等，流体物理学，2008.20：第101702页；Bhagat,AAS.等，微流体与纳米流体，2009.7(2)：217-226页)。然而，包含规则间隔的扩展区的原因是双重的。首先，由于这些通道是采用双模成型工艺由PDMS聚合物制成的(见下面的方法部分)，因此纵横比>2的释放结构极易变形和扭曲(德拉马什·E.(Delamarche,E.)等，高级材料学，1997.9(9)：741-746页；Xia,Y等，材料科学年鉴，1998.28(1)：153-184页)。约60μm宽的扩展区为微通道提供了更强的结构稳定性，从而能够制作纵横比高达7.5的特征。其次，扩展区也有助于减小微通道长度上的压降，从而允许进行高流动性测试而不会引起装置故障(Re>100)。
另一方面，微流体装置可用于从异步细胞混合物中分离一种或多种同步细胞的方法。该方法包括将异步细胞混合物导入微流体装置的至少一个入口，该微流体装置包括一个或多个螺旋通道，其中每个通道具有长度，以及限定纵横比的高度和宽度的截面，适于根据细胞尺寸沿着通道截面的多个部分分离同步细胞，其中较大的同步细胞沿着通道的径向最内侧部分流到第一出口，而较小的同步细胞沿着通道的其余部分流到至少一个其它出口。
细胞周期由有序的连续事件构成，通过有序连续事件，细胞复制其内容然后分裂为两个子代细胞。在真核细胞中，这些导致细胞正确分裂的区别事件可分为四个连续阶段：G1(间隙)、S(DNA合成)、G2(间隙)、M(有丝分裂)。随着细胞在细胞周期中前进，细胞在S阶段复制其染色体并在M阶段分离染色体。为了长期保持尺寸的体内平衡，细胞必须在分裂前使尺寸平均变为二倍。Gl、G2间隙阶段为新的大分子和各种细胞器的合成提供时间，并且允许细胞监控其外部环境以确保条件分别适于进入S、M阶段。有丝分裂之后，细胞进入临时休眠状态即G0阶段，然后重新进入细胞周期。
细胞周期同步对于细胞性质和生物过程的研究，以及对于阐述细胞分裂之前的每个阶段涉及的基因调节机制和事件而言都是必不可少的。同步培养是指细胞处于细胞周期的特定阶段并且显示类似的物理和生化性能，例如尺寸和DNA内容。接着，在后续时间点，细胞作为相对均匀的群体以相同阶段经历细胞周期。对癌细胞的研究揭示了特定细胞周期检验点中所暗示的关键致癌基因的表型和分布。已知抗癌药物是以细胞周期不同阶段的细胞为目标，因此癌症疗法广泛取决于同步肿瘤细胞样本的能力。高度同步的细胞群体的使用还极大地促进了各种生物系统和设施的开发。在干细胞疗法中，生成与患者的免疫属性匹配的细胞和组织需要进行细胞核移植，而细胞周期同步对于该技术的成功至关重要，因为G0/G1阶段的干细胞提供了更高的细胞核移植效率。因此，需要开发有效地技术以同步在其细胞周期各个阶段的细胞。
下面描述利用螺旋微通道内的惯性力而同步细胞的基于微流体的方法。近来，已经根据惯性迁移原理开发出在微流体系统中基于尺寸的微粒分离(Bhagat,A.A.S.等，微流体与纳米流体，2009.7(2)：217-226页；Di Carlo,D等美国国家科学院学报，2007.104(48)：第18892页)。在螺旋形微通道中，在泊肃叶流动条件下，不同尺寸的微粒在惯性升力和迪恩拖曳力的作用下沿着微通道截面的区别位置保持平衡。如本文所述，利用此原理，已将多个哺乳动物的永久细胞系(包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO-CD36)和癌细胞(HeLa、KKU-I00))成功同步为富含在G0/G1(>85％)、S和G2/M阶段的细胞的种群。该分离原理利用了细胞体积(因此采用直径或更上位地采用“尺寸”表示)与其在细胞周期中所处的阶段之间的关系。此处还描述了使用该技术来同步原代(primary)细胞系—骨髓—衍生人类间充质干细胞(hMSCs)。结果表明，异步样本G0/G1与G2/M之间约2.8：1的比值富集为15.7：1。类似地，G2/M种群在同步后富集为约四倍。这些结果可与采用其它微流体系统所报告的结果(金·U.(Kim,U.)等，美国国家科学院学报，2007.104(52)：第20708页；赛沃兹·P(Thevoz,P).等，分析化学，2010.82：3094-3098页；崔·S.(Choi,S.)等，分析化学，2009.81(5)：1964-1968页；昌万·S.(Migita,S.)等，分析方法，2010.2：657-660页)相比较，其生产量大大增加，从而能够以高存活性(～95％)同步大量细胞(～15x 106/hr)。可以认为与本装置的微通道设计相关的被动工作原理实现了许多不同的原代细胞类型的生物研究的多种应用。
本领域技术人员公知，“异步细胞”是处于多个阶段的细胞(例如G0/G1、S、G2/M)的混合物。而此处使用的“同步细胞”是指处于细胞阶段的相同周期内的细胞。异步细胞的混合物可为哺乳动物癌细胞悬浮液或间充质干细胞悬浮液、组织或它们的组合。该方法还可包括从第一出口采集同步细胞。在某些实施方式中，通道的纵横比范围为约1-约5。在某些实施方式中，通道宽度为约500μm，通道高度为约140μm。
此处描述的方法还可包括从装置采集(隔离)目标细胞以作进一步的分析，例如用于荧光激活的细胞分选。
本领域技术人员应当理解，该方法还可包括富集目标细胞。例如，对于具有多个出口的装置而言，出口尺寸的比例可设计成强化分离和/或富集。例如，以具有3个出口的装置为例，尺寸比例可为1：2：1、1：3：1、1：4：1、1：5：1、1：6：1、1：7：1、1：8：1、1：9：1、1：10：1，诸如此类。
目标细胞的富集例如可为约2倍、约3倍或约4倍富集。
范例
实施例1：用于细胞分离和隔离的基于变形性的分选
材料和方法
疟疾培养
此项研究中采用了恶性疟原虫(P.falciparum)3D7菌株。在RPMI 1640培养基(美国英杰公司(Invitrogen))中培养寄生虫，培养基中加入0.3g左旋谷酰胺、5g AlbumAX II(美国英杰公司)、2g NaHCO3、溶解于1ml 1M NaOH的0.05g次黄嘌呤(美国西格玛—奥德里奇公司)以及1ml 10mg/ml庆大霉素(美国英杰公司)。在环状阶段采用2.5％的山梨醇使得寄生虫同步以维持同步培养。培养产物经5％CO2、3％O2和92％N2的气体混合物处理后存储于37℃下，且它们的红细胞比容保持为2.5％。在环状阶段、晚期营养体和裂殖体阶段收获细胞。用于寄生虫培养的全血从健康的捐献者获得，并通过旋转减慢(spin down)来分离RBC。RBC小球采用CPDA处理三天，然后以RPMI 1640清洗三次，再进行存储以供使用。
样本制备
在进行实验之前，采用含有1×磷酸盐缓冲液(PBS)、2mM乙二胺四乙酸(EDTA)以及1％v/v牛血清白蛋白(BSA)的洗涤液对血样清洗三次。向血样中加入(0.01％体积分数)直径为3μm的荧光标记的微珠(新加坡波利科学(Polysciences)公司出品的微球)并使微珠重新悬浮于包含1x PBS、2mM EDTA、1％BSA以及3.5w/v％右旋糖酐40(新加坡艾普力亚洲公司(AppliChem Asia))的样本缓冲液中。右旋糖酐提供了常规血浆的有效粘度，并有助于在实验当中防止沉淀和红细胞叠连的形成(Yeh C等，(1994)66(5)：1706-1716)。采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(美国西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))将iRBC(0.01％寄生虫血症)染色以进行可视化和量化。然后相应地采用样本缓冲液将最终的血液悬浮液调节为各种红细胞比容(1％、10％、40％)。
装置特征化
采用标准精密加工软光刻技术(麦当劳·JC(McDonald JC)等，(2002)化学研究报告，35(7)：491-499)以聚二甲基硅氧烷(PDMS)(硅酮树脂(Sylgard)184，美国道康宁公司(Dow Corning))来制造该装置。为了特征化微流体装置，将细胞样本填充到1cc注射器中，并采用以各种流速驱动的注射器泵(Fusion 400，美国Chemyx公司)将其泵送到微流体装置。采用具有12位EMCCD相机(iXonEM+885，美国安道尔科技公司)装备的倒置荧光显微镜(Olympus 1X81，美国奥林巴斯公司)实验性地观测流速。测试中采用软件(美国分子仪器公司)在出口处捕捉通道的高速图像。
为了量化分离效率，根据从微通道出口拍摄的图像来测量荧光标记的微珠和iRBC的分散。将100μm宽的出口微通道分成10个各自为10μm的相等的容器(bin)并计数经过每个容器中的珠/iRBC的数量，从而测量微珠和iRBC的分散。(Bhagat AAS等，(2008)微型机械与微型工程学报，18(8)：9)。对计数值进行绘图从而显示珠/iRBC沿通道宽度的分布。将在侧出口处测量的珠/iRBC计数值标准化为总的出口计数值，从而确定过滤效率。若进行彻底过滤，则要求所有珠/iRBC迁移到通道的这两个侧壁并从这两个侧出口有效地过滤。通过采用BDTM LSRII流式细胞仪(美国BD生物科学公司)对采集的出口样本进行荧光激活细胞分选(FACS)分析，进一步验证分离效率。
微通道设计
微通道设计成具有扩展非对称3出口系统的3cm长、15x10μm(WxH)的微通道。微通道始于输入处的100μm的宽度部分，该宽度部分收缩为15μm；并在输出处微通道开放成100μm的宽度部分以强化可视效果。在测试被iRBC感染的血液之前，采用全血中悬浮的硬质聚苯乙烯的3μm珠来证实过滤原理。选择3μm珠是因为它们与晚期阶段iRBC中发现的寄生虫在尺寸上相似，因此能够表示实际的iRBC行为。样本由刺入0.05-0.1％的不同阶段的珠或iRBC的全血(40-45％红细胞比容)构成。当血样流过15x10μm微通道时，比iRBC更易变形的RBC横向迁移到通道的轴心，将硬度更高的iRBC朝向通道壁转移。通过设计低纵横比微通道，允许iRBC仅沿通道宽度方向着边(marginalize)，从而在各个侧壁附近对齐。然后，采用非对称3出口系统过滤iRBC，从而实现高生产量的基于变形的连续过滤。图1示出了开发的微流体设计的示意图。
结果与讨论
为了确定在浓缩的血液流动中基于变形的横向转移现象，在红细胞比容为10-40％的血液悬浮液中首先测试与RBC尺寸大致相同的直径6μm的刚性聚苯乙烯微珠。当血流到达出口时，所有珠在微通道的两个侧壁附近对齐，从而实现着边。然后采用较小的3μm荧光标记聚苯乙烯珠重复进行实验，因为其与晚期阶段的iRBC中发现的寄生虫的尺寸相似。僵硬的寄生虫主要负责减小感染细胞的变形性(Nash GB等，(1989)血液，74(2)：855-861)，因此3μm珠较好地表现了iRBC的流动行为。在1％、10％、40％红细胞比容的血液悬浮液中加入珠，然后以不同的流速泵送通过装置。通过计数经过每个容器位置的珠从而量化分离效率。为了保持一致，每次实验总共计数200个珠。图2A-2C描绘各种流速下在微通道宽度上的珠分布。当红细胞比容较低时(1％Hct)，珠和RBC在通道宽度上保持均匀分散，意味着轴向迁移和着边可忽略。将红细胞比容增加到10％和40％，使得在微通道中心形成发展良好的以RBC为主的核。珠与RBC强烈地相互作用，因此几乎所有珠(>90％)都朝通道侧壁转移(图2B-2C中的容器1、容器10)。这些结果与他人的报告相符，意味着用于细胞着边的高红细胞比容的作用(吉安娜·A(Jain A)，(2009)公共科学图书馆，4(9)：e7104)。图3A示出了针对各种红细胞比容样本在侧出口处和中心出口臂处测得的3μm珠分布。所有实验均在5μL/min的固定流速下进行。当红细胞比容为1％时，中心出口的珠数量是侧出口的大约两倍。这是因为微通道中心(泊肃叶流)的速度更快，使得在给定时间段内有更多的珠通过中心。然而，当红细胞比容更高时(10％、40％)，几乎所有珠(～90％)都朝通道侧壁转移并在侧出口采集。随着红细胞比容从10％增大到40％，过滤效率也从89％增大到97％，表示着边增多(赵·R(Zhao R)等，(2008)生物医学工程纪事，36(7)：1130-1141)。
高红细胞比容样本提高了我们微通道中珠的横向转移。接着，开展实验以确定流速对于分离效率的影响。根据图3A所示结果，在0.2μL/min-5μL/min的流速范围内对刺入了荧光标记珠的40％红细胞比容样本进行测试。图3B示出了在侧出口处和中心出口臂处测得的用于增大流速的3μm珠分布。在所有测试流动条件下，珠着边效率保持大致恒定(～90％)，与其它近期报告的结果一致(ZhaoR等，生物医学工程纪事，36(7)：1130-1141)。这种行为可用以下原因进行解释。当流速较低时，刚性珠需要花更长的时间横穿通道长度，因此有充分的时间进行多次细胞交互以实现横向着边。然而，当流速增加时，由于惯性更大，因此RBC更快地向微通道的轴向中心迁移，从而形成界定清楚的核。这使得刚性珠从中心被“推”向侧壁，从而在较高流速下也能实现有效的分离。
在采用聚苯乙烯珠进行实验而确定了设计原理之后，下一步进行对感染疟疾的iRBC的测试。根据图3A、3B所示结果，对具有10％、40％红细胞比容样本的iRBC进行测试。首先，所有进行的测试均采用晚期营养体/裂殖体阶段的iRBC，因为与早期阶段的iRBC相比，着边效果更主要地取决于其增加的硬度。图4A、4B示出了在不同的流动条件下，针对10％、40％的红细胞比容，在微通道出口处测量的iRBC分布结果。当红细胞比容为10％时，与采用硬聚苯乙烯珠获得的结果相反，我们看到iRBC朝向侧壁的着边可以忽略。iRBC的计数值表示围绕通道轴心的抛物线分布，其与泊肃叶速度剖面相符。这说明iRBC与普通RBC之间的变形差异不足以通过适当的细胞交互而使iRBC朝侧壁转移。
然而，当红细胞比容增大到40％时，会导致明显的iRBC着边(图4B)。从图中可见，在所有流动条件下，～80％iRBC转移到容器1、容器10，与采用聚苯乙烯珠获得的结果相似。在所有流速下观测到的着边效果表明红细胞比容是iRBC着边的主要因素。较高的红细胞比容便于增加细胞-细胞之间的互动，使不易变形的iRBC向通道侧壁转移，从而有效地分离感染细胞，并因此证明对于不易变形的iRBC的分离细胞着边的用途，还提倡将本技术应用于诊断其它以红血球细胞刚度发生变化为特征的疾病(例如镰状细胞贫血和白血病)。
图5示出了不同流速下的iRBC着边现象的分离效率。应当注意，该技术在包括高流速(5μL/min)的所有测试流动条件下都能同样良好地工作，高流速是高生产量分离的重要考虑因素。正如预料的那样，iRBC分离效率并未达到以硬珠测量所得的分离效率，这是因为iRBC仍然可变形从而以较低的效率向侧面着边。
最后，为了验证过滤效率的精度，采用荧光激活细胞分选法(FACS)分析出口样本。以5μL/min的流速将红细胞比容为40％的血液悬浮液的环状阶段和晚期营养体/裂殖体阶段的iRBC泵送经过本装置，在出口采用FACS进行采集和分析。总共记录了500,000次事件，从而更加精确地表现了iRBC分离效率。对采用晚期营养体/裂殖体阶段iRBC的实验，在侧出口和中心出口之间测得92％的过滤效率，这与容器计数数据相符(图6A)。由于侧出口在3个出口中占据了50％的容量，因此侧出口处的iRBC浓度示出了两倍于入口样本的富集。然而，这个数字受到出口通道的非优化设计的影响，并且在重复该相同过程时还可进一步提高。
为了将iRBC着边应用于疟疾诊断，重要的是富集环状阶段iRBC。通常在感染疟疾的患者中，晚期阶段(营养体/裂殖体)iRBC会在毛细血管后微静脉中隔绝(sequester)，在疟疾感染检测中仅能观察到环状阶段iRBC在外周血流中循环(德米尔福PA(Demirev PA)等，(2002)分析化学，74(14)：3262-3266；加斯科因P(Gascoyne P)等(2002)微型实验室，(2)：70-75)。在优化分离条件下(40％红细胞比容，5μL/min)测试该技术用于环状阶段iRBC的分离效率，并且采用FACS分析被采集的出口(图6B)。环状阶段iRBC的只是略硬于未感染细胞，这是因为细胞表面积与体积的比值减小而细胞膜硬度增加(Suresh S等，(2005)生物材料学报，1(1)：15-30；Nash GB等，(1989)血液，74(2)：855-861；哈力克斯T(Herricks T)等，(2009)细胞微生物学，11(9)：1340-1353)。然而，即使是这样微小的变形性差别也能通过采用着边现象而用于iRBC过滤。可以理解，环状阶段iRBC的分离效率低于晚期阶段iRBC。结果表明，环状阶段iRBC也会朝通道侧面着边，从而实现～80％的分离效率。分析被捕获的视频可知，晚期阶段iRBC朝向侧壁被完全转移，而早期阶段iRBC并不这样着边。例如采用更长的微通道可改善此情况，使得环状阶段iRBC有充足的时间向侧壁完全着边。此外，通过适当分割出口(例如在三个臂之间不采用1：2：1的比值，而是采用1：10：1的宽度比值)，开发的微流体装置也可用作疟疾诊断的富集工具，其对低寄生虫血症具有提高的检测灵敏度。
硬度更高的iRBC与白细胞行为相似并朝着侧壁着边。这种展示提供了对iRBC微循环的血液动力学效应及其对于细胞粘连病理生理学意义的深入了解。如前所述，iRBC中的两个关键形态学变化是iRBC膜的粘性增加和变形性减小。这些变化在导致iRBC细胞粘性到各种类型的宿主细胞的严重疟疾发病机制中至关重要。这些iRBC向毛细血管壁着边还导致小静脉毛细血管中的隔绝，引起微血管阻塞并且包括微循环(东卓普AM(Dondrop AM)等，(2000)寄生虫学趋势，16(6)：228-232；库克BM(Cooke BM)等，(2000)寄生虫学趋势，16(10)：416-420)。Ho等人已经指出，在体内iRBC与内皮的粘连模仿多步白细胞补充(例如滚动和粘附)，并且此过程在人体的毛细血管后微静脉以及小动脉脉管中都会发生(霍M(HoM)等，(2000)实验医学期刊，192(8)：1205-1211)。展现的结果表明刚性晚期营养体/裂殖体阶段iRBC进行横向转移并在微通道外周流动，这样在体内将利于它们进入细小的分支侧毛细血管，从而在毛细血管床上进行后续的iRBC隔绝。此外还在与生理小动脉流动类似的宽范围的流动条件下(Re＝0.01-2.22)对iRBC进行测试(勃别尔AS(Popel AS)等，(2005)流体力学年评，37：43-69)，进一步确认减小的变形性对体内隔绝和细胞粘连的作用。
应用细胞着边的生理现象能实现微流体装置中基于变形性的iRBC连续过滤。与其它微流体分离方法相比，该技术具有许多区别优势。首先，连续工作模式实现了高样本生产量(5μL/min,～2千万细胞/分)并强化了低寄生虫血症时的检测灵敏度(Gascoyne P等，(2002)微型实验室，2(2)：70-75；齐默尔曼PA(Zimmerman PA)等，(2006)美国热带药学与卫生学杂志，74(4)：568-572)。被动工作原理不需要结合外力场进行功能化，使外场设置变得理想。由于可以直接测试患者的全血，因此样本制备步骤不必区别于其它微型分离技术(Zimmerman PA等，(2006)美国热带药学与卫生学杂志，74(4)：568-572；Karl S等，(2008)疟疾杂志，7(1)：66)，进一步减少了处理时间和成本。此外，由于不需要特别的化学药品或抗体，因此有助于解决试剂存储问题，试剂存储问题对于遭受气候湿热和制冷缺乏的感染疟疾的国家而言是主要关心的问题)(斯蒂夫DY(Stevens DY)等，微型实验室，8(12)：2038-2045)。最后，装置的低成本和一次性用品性质使之适用于场上(on-the-field)临床诊所。
结论
此处介绍了基于仿生细胞着边的微流体装置中基于变形性的iRBC连续过滤方法。此处描述了硬度更高的iRBC与白细胞行为相似并在生理条件下朝着侧壁着边。通过宽范围流速范围内的观测，该结果表明高样本红细胞比容(40％)对于最佳着边非常重要。对与全血混合的环状阶段和晚期营养体/裂殖体阶段的iRBC两者以5μL/min的较高生产量进行测试。采用单个的容器计数方法和FACS分析来确定过滤效率。报告结果表明，对于早期环状阶段iRBC，过滤效率高达～75％，对于晚期营养体/裂殖体阶段iRBC，过滤效率>90％。由于在该被动微流体装置中可直接使用全血样本，因此无需额外的样本修改和制备。该技术在资源匮乏的环境中进行现场测试是理想的，使诊断更加迅速和准确。最后，由于分离原理基于将变型差异作为固有生物指标，因此易于将装置应用于以细胞硬度变化为特征的其它血细胞疾病(例如镰状细胞性贫血和白血病)。
实施例2：螺旋微流体中的细胞循环同步
材料与方法
细胞培养
在加入10％胎牛血清(FBS)(美国英杰)和1％青链霉素(美国英杰)的低糖的Dulbecco修饰的Eagle培养基(DMEM)(美国英杰)中培养间充质干细胞(瑞士龙沙)。在加入10％FBS和1％青链霉素的RPMI 1640培养基(美国英杰)中培养转染有人类CD36、CHO-CD36(美国ATCC)的中国仓鼠卵巢细胞。在加入10％FBS和1％青链霉素的低糖DMEM中培养宫颈癌细胞HeLa(美国ATCC CCL-2TM)。在含有10％FBS、3％HEPES缓冲液、1％青链霉素的Ham's F-12培养基中培养胆管癌细胞系和KKU-100(作为礼物收到)。所有培养均在包含有5％(v/v)CO2的潮湿气氛中保持为37℃。对MSC按500个细胞/cm2进行播种，并在无菌的175cm2烧瓶(康宁公司(Coming))中进行培养，并在48小时后采用0.01％胰岛素和5.3mM EDTA溶液使之分裂，以防止接触抑制。CHO-CD36、HeLa、KKU-100细胞在无菌的25cm2烧瓶(康宁公司)中进行培养，每周继代(1:4)培养三次，并且每48小时更换培养基。采用0.01％胰岛素和5.3mMEDTA溶液使亚融合(sub-confluent)单细胞层分裂。
在测试之前，在含有1x磷酸盐缓冲液(PBS)以及加入1％牛血清白蛋白(BSA)(德国美天旎)的2mM乙二胺四乙酸(EDTA)的缓冲液中将异步细胞稀释为100000个细胞/mL，从而防止其凝聚或吸附于微通道壁。加入3.5％w/v右旋糖酐40(新加坡艾普力亚洲公司)来调节溶液密度，从而防止细胞沉积。
通过接触抑制和血清饥饿进行间充质干细胞同步
为了通过接触抑制进行G1抑制，MSC按20000个细胞/cm2进行播种，并在加入10％FBS的DMEM中培养48小时。对于通过血清饥饿进行的G1阻滞(arrest)，MSC按500个细胞/cm2进行播种，并在不含FBS的DMEM中培养48小时。采用0.01％的胰岛素和5.3mM EDTA溶液使得阻滞细胞分裂，然后在70％的乙醇中固定30分钟。
微通道制造
采用标准的软光刻技术(Xia,Y.等，材料科学年度评论，1998.28(1)：153-184页)以聚二甲硅氧烷(PDMS，硅酮树脂184，美国道康宁公司)来制造装置(图9A)。简而言之，首先通过深反应离子蚀刻(DRIE)对6"硅晶片进行构图和蚀刻，从而在晶片上限定通道。在蚀刻之后，采用三氯(1H,1H,2H,2H全氟辛基)硅烷(美国西格玛奥德里奇公司)对构图硅晶片处理2小时，以便PDMS脱模。在硅烷化之后，将以10：1(w/w)的比例与固化剂混合的PDMS预聚物倒在硅母体(master)上并在70℃下固化2.5小时。然后，从硅晶片剥离出固化的PDMS模具，并作为后续PDMS浇铸的主模板使用。接着，使PDMS模板硅烷化两小时，以便随后的PDMS模具的脱离。在具有所需图案的最终PDMS模具固化之后，采用1.5mm活检穿孔器穿出出口孔和入口。然后，通过氧血浆处理剂(韩国Femto Science科文斯公司)将PDMS模具不可逆地粘接到显微镜载玻片(1"x3"x 1mm；美国飞世尔科技公司)。
装置特征化
在1x PBS和具有1％BSA的3.5(w/v)右旋糖酐40中以相等比例悬浮荧光聚苯乙烯珠(25μm绿色、15μm蓝色、10μm红色)(新加坡ITS Science&Medical)，总浓度为1.2x 105个珠/mL。为了特征化螺旋微流体装置，将珠混合物以及细胞悬浮物装入60mL注射器，并采用以2.5mL/min的流速驱动的注射器泵(NE-1000，美国新时代注射泵系统公司(New EraSyringe Pump Systems Inc.))注射到微通道中。采用装备有12位EMCCD相机(iXonEM+885，美国安道尔科技公司)的倒置荧光显微镜(Olympus 1X81，美国奥林巴斯公司)实验性地观测流速。在测试之后，采用软件(美国分子仪器公司)捕捉从出口采集的细胞样本的显微图像并根据照片计算细胞尺寸。
采用FACS进行细胞周期分析
对分选的样本采用碘化丙啶(PI)进行流式细胞分析，从而分析细胞DNA内容(沃斯特·R.P.(Wersto,R.P.)等，细胞计数法B部分：临床细胞计数法，2001.46(5)：296-306页)。分选的同步细胞样本采用1xPBS清洗，并于4℃下在70％的乙醇中固定30分钟。然后，以600g离心细胞5分钟，并在包含有1xPBS、3.8mM柠檬酸钠(美国西格玛奥德里奇公司)、10μg/ml核糖核酸酶(新加坡i-DNA生物技术公司)和50μg/ml碘化丙啶(美国西格玛奥德里奇公司)的染色溶液中培养30分钟。采用BDTM LSRII流式细胞仪(美国BD生物科学公司)和Cyflogic(芬兰CyFlo公司)数据分析软件进行FACS分析，从而测试染色细胞的同步效率。
结果与讨论
设计原理
图9A示出了螺旋分离器的示意图。由于其高分离度和极高生产量，采用惯性力在微流体系统中的基于尺寸的细胞分离已获得了广泛关注。在简单的充满颗粒的管流中，在泊肃叶流动条件下，剪切诱导力和壁诱导升力之间的平衡使得悬浮颗粒围绕管外周以环状方式保持平衡，即“管状收缩”效应(Segre,G.，自然，1961.189：209-210页；Segre,G.等，流体力学杂志，1962.14(01)：115-135页；Matas,J.P.等，流体力学杂志，2004.515：171-195页)。Chun(春)和Ladd(莱德)论述了在具有矩形截面的通道中，升力(FL)使得颗粒在通道截面的八个区别位置上保持平衡，相对于管道体现了破缺对称性(Chun,B.等，流体物理学，2006.18：第031704页)。艾斯莫洛夫(Asomolov)的数值计算表明该升力对于颗粒尺寸(d)非常敏感，并随其四次方而变化(FL∝d4)(Asmolov,E.S.，流体力学杂志，1999.381：63-87页)。近来，已在微通道流中采用颗粒的惯性迁移以分离1.9μm和590nm颗粒(Bhagat,A.A.S.等，微流体与纳米流体，2009.7(2)：217-226页)。研究表明当d/D≥0.07时(其中D为微通道直径)，惯性升力极大，使得颗粒在短距离内保持平衡，这对于微流体系统非常理想(Bhagat,A.A.S.等，微流体与纳米流体，2009.7(2)：217-226页；Di Carlo,D.等，美国国家科学院学报，，2007.104(48)：第18892页；Hampton,R.E.等，圆形管道中压力驱动下的流动颗粒的迁移，流变学报，1997.41：第621页)。在低纵横比的矩形微通道中，微通道直径D约等于微通道高度H(Bhagat,A.A.S.等，流体物理学，2008.20：第101702页)。
在螺旋形微通道中，向外的离心力增大了微通道顶半部和底半部中的反向旋转涡流(也称为迪恩涡)。这些二次迪恩涡向悬浮颗粒施加拖曳力，通过涡流携带悬浮颗粒。迪恩拖曳力(FD)的大小随着颗粒尺寸及它们在通道截面内的位置而变化(FDad)。因此，在螺旋微通道中流动的颗粒同时承受惯性升力和迪恩拖曳力。惯性升力(FL)与迪恩拖曳力(FD)之间的相互作用使得八个平衡位置减少为通道内壁附近的仅两个位置，每个位置均在顶部和底部迪恩涡中(罗素·A.(Russom,A.)等，新物理学杂志，2009.11：第075025页)。两个平衡位置在微通道高度方向上彼此重叠，并且针对给定的微粒尺寸与微通道内壁保持相同的距离，即在微通道宽度方向上看起来像是同一位置(图9B)。该集中位置由FL和FD同时决定，因此其随着颗粒尺寸变化显著FL/FD ad3。这意味着不同尺寸的颗粒在微通道截面内占据不同的横向位置，并且最大的颗粒最接近通道内壁(昆塔格万德哈利·S.S.(Kuntaegowdanahalli,S.S.)等，微型实验室，2009.9(20)：2973-2980页)。通过设计分支出口，可以提取不同尺寸的部分，从而实现分离。
Kuntaegowdanahalli等人通过利用惯性升力与迪恩涡的综合效应实施基于尺寸的连续分离，在单通道中分离10μm、15μm、20μm颗粒，并且分离SH-SY5Y神经母细胞瘤和C6大鼠胶质瘤细胞(Kuntaegowdanahalli,S.S.等，微型实验室，，2009.9(20)：2973-2980页)。Russom等人还应用该技术实现血液中的白细胞富集(Russom,A.等，新物理学杂志，2009.11：第075025页)。在本工作中，我们采用该原理基于它们在细胞周期的各阶段进行细胞同步。该装置工作原理利用细胞体积(也即它们的尺寸)与其在细胞周期内的阶段之间的关系来同步细胞。如本文所述，人体间充质干细胞(hMSC)按尺寸分级为G1/G2、S、G2/M阶段细胞的同步种群。
为了证实设计原理并确定流动条件，通过螺旋微通道测试25μm、15μm、10μm荧光标记的聚苯乙烯珠的混合物。选择珠直径以模拟哺乳动物细胞的尺寸范围。微通道设计由具有一个入口和八个分支出口的9-环螺旋几何形状组成。微通道宽度固定为500μm，高度可变，从而针对不同细胞类型满足d/D>0.07的比值。图9B示出了优化流速为2.5mL/min时在微通道入口和出口捕捉到的微珠的叠加荧光图像。当流体到达出口时，25μm、15μm、10μm的珠集中到微通道截面上的三个区别流中，并分别在出口1、2、3被有效采集。
恒久培养同步
在呈几何级数增长的哺乳动物细胞培养中，G1阶段的新生细胞的尺寸位于培养尺寸分布的较低端(Cooper,S.，细胞与分子生命科学，2003.60(6)：1099-1106页)。由于细胞通过蛋白质和脂类的合成实现了临界尺寸，因此这些细胞在G1晚期阶段开始新的细胞周期并在S阶段合成DNA。细胞持续生长直至有丝分裂(M阶段)，此时细胞已生长为G0/G1阶段的原始尺寸的大约两倍。因此，G2/M阶段的细胞具有两份DNA。
采用两个癌细胞系——HeLa和KKU-100细胞来检测装置的同步性能。由于HeLa和KKU-100细胞群的平均直径分别测得为16.3±2.5μm和17.8±2.4μm，因此采用140μm高的螺旋微通道(满足d/H≥0.07的条件)对细胞进行分选。向微通道内导入细胞时，将具有广泛尺寸分布的异步细胞分离到沿微通道内半部的不同横向位置处的区别轨迹。在分选之后，拍摄在出口1-4处采集的未分选(对照)和已分选细胞的光学显微图像，并记录和分析它们的直径。根据它们的尺寸成功地分离细胞。最大的细胞群在最靠近微通道内壁的出口(出口1)处采集，平均直径为19.4±5.6μm(HeLa)和24.6±3.0μm(KKU-100)。最小的HeLa和KKU-100细胞群在出口4处采集，平均直径分别为13.5±1.5μm和16.6±2.4μm。同理，还采用200μm高微通道按尺寸对另一细胞系CHO-CD36分级，以适应较大的尺寸分布(13.3-36.7μm)。
通过细胞DNA含量的数量来区分处于细胞周期不同阶段的细胞。采用流式细胞分析来评估不同阶段的已分离细胞的分布。如前所述，G2/M阶段的细胞的DNA荧光强度通常是G0/G1阶段的细胞的两倍。计算细胞在每个阶段的百分比，并通过荧光区和宽度标绘来区分双重(doublet)和聚集(aggregate)细胞(Wersto,R.P.等，细胞计数法B部分：临床细胞计数法，2001.46(5)：296-306页)。图10A-10C示出了表示在HeLa、KKU-100、CHO-CD36细胞同步之后，已分选的G0/G1、S、G2/M阶段的单细胞的DNA含量分布的直方图。在分离之后，通过同步到G0/G1阶段的84％HeLa、96％KKU-100、86％CHO-CD36的细胞，实现了从出口4采集的细胞的高度同步。同时，从出口1采集的细胞在G2/M阶段实现2-3x(倍)富集。
这些结果可与采用其它微流体系统报告的结果进行比较(Kim,U.等，美国国家科学院学报，2007.104(52)：第20708页；Thevoz,P.等，分析化学，2010.82：3094-3098页；Choi,S.等，分析化学，2009.81(5)：1964-1968页；Migita,S.等，分析方法，2010.2：657-660页)。然而，该技术的高流动生产量能够以～15x 106细胞/小时分级，远高于其它微流体方法的报告。该被动分选原理也保证了>90％的细胞存活性。表2总结了各种微流体细胞周期同步系统。
表2同步后分选的hMSC在细胞周期各阶段的分布
人体间充质干细胞(hMSCs)的原代培养同步
接着测试装置同步原代细胞系——人体充质干细胞(hMSC)的能力。与癌细胞系或转化细胞系不同，hMSC极易受到接触抑制。通过对以1500cm-2和3000cm-2的密度播种的hMSC的细胞DNA含量进行分析可知，经过两天的培养S和G2/M阶段的细胞很少。因此，为了富集S和G2/M阶段的细胞群，以500cm-2的较低密度播种，并在分选之前培养两天。图11A-11C示出了从出口1-4采集的分选的hMSC的光学显微照片和存活结果。从出口1采集的hMSC的平均细胞直径为23.5±5.6μm，明显大于从出口4采集的hMSC的平均细胞直径(约15.5±2.1μm)。分离之后，通过台盼蓝排除法和经长期再培养评估细胞存活性。分选细胞的存活性与对照未分选MSC相似，其中多于90％的细胞从每个出口采集(染料除外)，表明细胞在分选时未遭受任何物理损害(图11B)。经过14天培养，分选hMSC的形态与未分选(对照)细胞相似，进一步示出了分选后细胞存活性的维护(图11C)。
在对照MSC培养中，如DNA直方图所示，发现56.2％的细胞处于G0/G1阶段，24.3％的细胞处于S阶段，19.9％的细胞处于G2/M阶段(图12)。同步之后，从出口2采集的细胞群中共有72.7％的细胞处于S阶段和G2/M阶段，而来自出口4的细胞有86.1％被同步到G0/G1阶段(表1)。这些结果表明，同步样本中G0/G1与G2/M的比值3：1被富集为在从出口4采集的样本的16：1。同样，在从出口1采集的样本中实现了G2/M细胞群的四倍富集。
为了实验性地确认hMSC在G0/G1阶段同步，将最小hMSC细胞群(出口4)同步与通过血清饥饿和接触抑制在G0/G1阶段阻滞的hMSC进行比较。经比较发现，经过48小时，从装置的出口4采集的hMSC有86.2％在G0/G1阶段同步，而通过接触抑制产生的hMSC有76.4％同步，通过血清饥饿产生的hMSC有77.5％同步。从出口4采集的hMSC的相应直径(15.5±2.1μm)与经接触抑制(16.9±4.2μm)和血清饥饿(23.3±3.8μm)的细胞相比具有更窄的尺寸分布。应当注意，接触抑制产生的细胞具有相似的DNA数量，但阻滞的细胞群的细胞尺寸如原始培养物(21.9±3.5)一样不均匀。虽然同步成功的主要标准是同步细胞群的DNA含量应当相似，但是与原始细胞相比，细胞的尺寸分布也应相对均衡(Cooper,S.细胞与分子生命科学，2003.60(6)：1099-1106页)。接触抑制组的细胞直径变化范围较大，这表明只是按照相似的DNA数量阻滞细胞，而产生蛋白质和大量合成的其它细胞过程实际上并未同步。相反地，从培养物中取出血清使得hMSC与G1阶段DNA的数量和阻滞的大量的合成物同步，但细胞尺寸范围与采用本装置进行合成的尺寸范围相比仍然较大。因此，经血清饥饿的细胞虽然具有较为相似的DNA数量，但实际上并未被同步。还应注意，血清饥饿hMSC的形状更加不规则并相对地具有更多气泡，这表明hMSC的正常生理机能在血清饥饿诱导的压力下受到破坏。
下面探讨本装置同步的hMSC是否经历同步分裂。探讨的基本假设是同步细胞不仅具有相似的尺寸和DNA含量，而且能够作为相对均匀的群经历细胞周期。为了测试该假设，复制(replated)从出口4采集的86％在G0/G1阶段同步的hMSC，并在24、48、72小时后分析其DNA含量(图13)。有意思的是，经过24小时的培养，S和G2/M细胞的百分比为79.7％，表明绝大多数G0/G1细胞已经历了后续阶段(表3)。
表3合成后的不同时间点来自出口4的复制hMSC的细胞周期阶段分布
通常，哺乳动物细胞在G1/S阶段经历16-24小时，而在G2/M阶段仅经历大约2-3小时(Kim,U.等，利用介电电泳基于细胞周期阶段而选择哺乳动物细胞，美国国家科学院学报，2007.104(52)：第20708页)。因此可以预计，在培养之后的24小时可在S阶段和G2/M阶段发现大部分细胞。然而，内分裂时间内的随机变异导致细胞同步随着时间推移而衰退。经过74小时的培养之后，由于细胞生长的接触抑制，G0/G1hMSC细胞群增至69.4％。许多化学方法或“分批处理剂”(如阿非迪霉素、抑制剂、秋水仙碱)已用于在细胞培养的特定阶段阻滞细胞培养，但是正常细胞进程也经常被中断(Choi,S.等，分析化学，2009.81(5)：1964-1968页)。例如，Whitfield等采用胸苷-诺考达唑块阻滞G2阶段的HeLa细胞((惠特菲尔德·M.L.)Whitfield,M.L.等，分子细胞生物学，2002.13(6)：第1977页)。从阻滞过程释放出来12小时之后，细胞周期各阶段的细胞都会出现，而不是仅仅出现一个或至多两个阶段的细胞。相反，此处的结果表明装置所同步的hMSC显示了相对同步的分裂。
结论
此处所述为螺旋微流体装置的应用，其利用惯性力和迪恩拖曳力的综合效应根据尺寸将哺乳动物细胞分级到细胞周期的不同阶段。与其它微流体分离方法(包括连续工作)相比，该装置提供了许多独特的优势，实现了很高的样本生产量(～15x106细胞/小时)，从而极大地缩短了样本处理时间。被动工作原理无需结合外力场用于功能或抑制化学品，从而保持了分选细胞(>90％)的完整性和生命力。因此，此处说明了微流体的使用为细胞周期同步提供了存活性高出很多的高生产量。由于哺乳动物细胞悬浮液可直接分离和同步，因此样本制备步骤不必区别于其它方法(如FACS、CCE)，这进一步减少了处理时间和成本。凭借其高生产量和微创性质，细胞周期微流体装置可在生物技术研究和实用中实现多种用途。
实施例3
用于循环肿瘤细胞高生产量隔离的罕见细胞技术生物芯片的剪切调节提取
材料及方法
细胞培养与样本制备
本工作测试两个人体乳腺癌细胞系，MCF-7和MDA-MB-231。在加入10％胎牛血清(FBS)(美国英杰)和1％青链霉素(美国英杰)的低糖Dulbecco修饰的Eagle细胞培养基(DMEM)(美国英杰)中培养MCF-7细胞(HTB-22TM，美国ATCC)和MDA-MB-231细胞(HTB-26TM，美国ATCC)。该培养在包含有5％(v/v)CO2的潮湿气氛中保持为37℃。细胞在无菌的25cm2烧瓶(康宁公司)中进行培养，每周继代培养(1：4)三次，并且每48小时更换培养基。采用0.01％胰岛素和5.3mM EDTA溶液(瑞士Lonza)使亚融合单细胞层分裂。对于对照和回收实验，在含有1x磷酸盐缓冲液(PBS)以及加入0.5％牛血清白蛋白(BSA)(德国美天旎)的2mM乙二胺四乙酸(EDTA)的缓冲液中稀释癌细胞，从而防止其不确定地吸附于管道和微通道壁。加入3％w/v右旋糖酐40(新加坡艾普力亚洲公司)来增加缓冲液密度，从而防止细胞沉积((侯·H.W.)Hou,H.W.等，微型实验室，2010.10(19)：2605-2613页)。对RBC平衡实验，从健康的捐献者获得的全血通过旋转减慢来分离RBC。相应地采用样本缓冲液调节最终样本的浓度，以改变红细胞比容(0.5％-5％)。对白细胞对照实验，根据制造商的说明书采用RBC裂解缓冲液(美国eBioscience)来处理全血，以获得单纯的白细胞群。
微通道制造
采用双模工艺(Hou,H.W.等，微型实验室，2010.10(19)：2605–2613页)以聚二甲基硅氧烷(PDMS)(硅酮树脂184，美国道康宁公司)制造该装置。首先采用P4620光刻胶在硅晶片上对伸-缩微通道进行构图。光刻之后，采用深反应离子蚀刻(DRIE)在硅中蚀刻微通道。接着剥离光刻胶，采用三氯(1H,1H,2H,2H全氟辛基)硅烷(美国西格玛奥德里奇公司)对构图硅晶片进行2小时的硅烷化，以便PDMS脱模。将以5：1(w/w)的比例与固化剂混合的PDMS预聚物倒在硅晶片上并在70℃下固化2小时。较高的固化剂比例可促进交联，从而使得PDMS模具刚性更大以制造易于变形的高纵横比结构。此时固化PDMS模具作为后续PDMS浇铸的母体(复制阴模)。PDMS母体模板硅烷化两小时，以便随后释放具有构图微通道的PDMS模具。最后，打出入口孔与出口孔，并通过暴露在氧血浆环境中(韩国Femto Science Covance)而将PDMS模具不可逆地粘接到显微镜载玻片。在血浆处理之后，使表面立即相互接触并在70℃下保持3小时，以完成粘接。
装置特征化
在测试中采用注射器泵(NE-I000，美国新时代注射泵系统公司)以不同雷诺数(Re)将样本泵送到微流体装置。微通道安装在具有高速摄像机(FASTCAM1024PCI，美国Photron)的倒置相差显微镜(Olympus 1X71)上。然后采用软件来分析在通道出口处捕捉的高速视频。
免疫荧光染色法与FACS分析
采用BDTM LSRII流式细胞仪(美国BD生物科学公司)对中心出口和侧出口样本进行流式细胞仪分析，从而分析用于确定采集效率、回收和富集比的实验结果。免疫荧光染色可以区分各种细胞类型，以进行可视化和量化。采用FcR封闭液(1：100，美天旎新加坡亚太公司)培育出口样本15分钟以封闭不确定的粘合，然后采用别藻蓝蛋白(APC)共轭上皮细胞黏附分子(EpCAM)(1：100，美天旎新加坡亚太公司)培育40分钟以识别癌细胞。采用荧光素异硫氰酸酯(FITC)共轭CD45(1：100，美天旎新加坡亚太公司)标记染色40分钟而识别周边血液白细胞。
结果与讨论
RBC在所有血液细胞中占据大于99％，因此彻底去除RBC对实现有意义的富集来说至关重要。通过研究各个参数(包括微通道纵横比、流速、样本红细胞比容)对RBC聚集及其从侧出口去除的效果而优化微通道设计和测试条件。
纵横比(AR)的效果
图17A和17B示出了微通道纵横比对RBC聚集的效果。在具有矩形截面的微通道中，利用沿通道截面的剪切力调节优先使得细胞沿着较长的通道尺寸保持平衡。高纵横比的另一优点是能够以更高的流速处理样本，从而增大生产量。为了研究纵横比的效果，制造高度为20μm、50μm、75μm、100μm、150μm的微通道，分别获得1、2.5、3.75、5、7.5的纵横比。图17A-17B以纵横比的函数形式示出了表示通道上的RBC分布的合成图像和线扫描。
在正方形微通道中(AR 1)，RBC采用Re＝100以及1％红细胞比容以环形方式保持平衡，在通道截面上形成弱聚集的细胞环(如图所示)。截面上的均匀剪切要求较长的微通道长度，以使得细胞在其平衡位置强聚集。纵横比增大到2.5时，开始通道宽度上细胞的优选迁移以及沿微通道高度的平衡。然而，线扫描清楚地表明并非所有RBC都聚集在给定通道长度方向上的平衡位置。在纵横比为3.75的微通道中，所有RBC都在微通道高度方向上保持平衡，这可以通过沿微通道中心形成显著的无细胞区得到证实。纵横比进一步增大到5时，两个强聚集细胞带朝通道侧壁迁移。当微通道纵横比增大到7.5时，出现有趣的效果。在该极高纵横比通道中，可观察到聚集RBC带分裂为两部分，即内带和外带。此观察是与研究纵横比对惯性迁移的效果的最新实验和建模工作一致的(Bhagat,A.A.S.，剪切调节的惯性迁移2009，辛辛那提大学：辛辛那提；Gupta,A等，第47届AIAA航空航天科学会议2009，奥兰多)。此行为的确切机理尚不清楚，有待深入调查。然而，此效果对于分离应用不利，因此工作仅限于最大纵横比为5的通道。
雷诺数的效果(Re)
图18A-18C示出了Re对RBC聚集的效果。对于高生产量，有必要处理高流速样本。在AR 5(h＝100μm)的微通道中采用1％红细胞比容样本进行测试。针对10-150的Re研究RBC平衡。由于微通道上的高压降会导致装置故障，因此不能测试更高的流速。在低流速下(Re<25)，作用在RBC上的惯性升力弱于粘性拖曳力，因此不会观察到平衡。将流速增大到Re＝50及以上可使RBC克服拖曳力并优先地朝通道侧壁迁移，形成两个界限清晰的细胞带(从顶部或底部成像时均可观测到两个明显的峰)。还观察到随Re增大，RBC平衡位置向微通道壁迁移(Chun,B.等，流体物理学，2006.18：第031704页)。
为了将聚集程度量化为Re函数，定义两个参数：无细胞区宽度以及细胞带宽度(图18B)。无细胞区宽度是完全不存在任何RBC的微通道中心处的标准化微通道宽度。根据RBC概率分布曲线，通过测量两个细胞占据区之间的距离的半极大值全宽(FWHM)的而计算无细胞区宽度。类似地，通过测量RBC占据区的FWHM而计算细胞带宽度。图18C将无细胞区宽度以及细胞带宽度描绘成Re的函数。随着Re增大，大的惯性升力引起更强的RBC聚集；而细胞带宽度明显减小(图18C)。因此，无细胞区宽度随着流速的增大而增大。在低Re(<100)时，更为紧密的RBC聚集导致的细胞带宽度的减小，使微通道中心处的无细胞区宽度增大。在Re＝100以上，虽然细胞带宽度保持不变，但两个RBC带朝着通道侧壁的迁移使得无细胞区宽度增大。对于侧出口处的最佳RBC聚集和采集，重要的是在Re范围的强聚集区(≥100)进行操作(图18C)。
红细胞比容的效果
接着，确定可在微通道中处理而不会造成重大RBC聚集损失的最高样本红细胞比容。对涉及全血处理(～40％红细胞比容)的应用，需要以高红细胞比容进行工作，以减少处理和分析时间。无细胞区和细胞带的宽度参数用于确定最佳测试条件。在AR 5微通道中在Re＝100、红细胞比容为0.5％～5％时进行实验。图19A-19C示出了展示增大红细胞比容对RBC平衡的效果的合成图像和线扫描。随着输入红细胞比容的增大，RBC带宽度以线性方式增大，从而减小中心无细胞区宽度。该趋势有望在更多RBC试图占据平衡位置时增大体积分数(红细胞比容)，产生细胞-细胞互动诱导的色散。
当红细胞比容增大到3％及以上时，可观察到如下有趣的效应，如早起在纵横比为7.5的微通道中看到的，再次观察到细胞带分为内带和外带两个明显部分(如前所述)。这种形成多个带的现象前面已经在高纵横比微通道中观察到(Gupta,A等，第47届AIAA航空航天科学会议2009，奥兰多)，表明了体积分数对引起此现象所起的作用。此内带与外带的形成仍然对于分离应用不利，因为其减小了中心无细胞区的宽度。因此，本工作仅限于最大红细胞比容为2％的样本，意味着在测试之前进行20x稀释。
收聚宽度对CTC隔离和回收的效应
如设计原理一节所述，“收聚”宽度用于从其它血液细胞中成功地隔离罕见细胞。沿收聚区的收缩宽度被设计成可与罕见细胞直径相比较(小于或处于相同等级)，确保罕见细胞在横穿收缩通道时受到有效“挤压”。因此，在排放到扩展区中的过程中，这些较大细胞的惯性中心沿着微通道轴心对齐，从而实现分离((山田·M.)Yamada,M.等，分析化学，2004.76(18)：5465-5471页)(图20)。作为示范，该技术用于分离CTC。
本例测试平均测量直径分别为18.1±1.8μm和18.2±2.8μm的两个人体乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231。由于CTC的平均尺寸大于15μm(谭·S.(Tan,S.)等，生物医学微型设备，2009.11(4)：883-892页；(万a·G.)Von a,G.等，美国病理学杂志，2000.156(1)：57-63页)，收聚宽度分别为10μm、12μm、15μm的微通道被设计成确保CTC在侧出口处实现最小损失。图21A-21B示出了收聚宽度对增大通道Re的MCF-7细胞分离的影响。在低Re＝50时，对于三种收缩宽度，均在中心出口采集～95％的肿瘤细胞。增大Re导致采集效率降低，可能是因为癌细胞在高层流剪切应力下发生很大变形(Lincoln,B.等，细胞计数法A部分，2004.59(2)：203-209页；Hou,H.W.等，生物医学微型设备，2009.11(3)：557-564页)。在高流速下，悬浮细胞与载体缓冲诱导的界面应力之间的表面张力不匹配而导致CTC变形。粘弹性细胞从球形变形为细长的长球(伯恩·C(Born,C)等，生物技术与生物工程，1992.40(9)：1004-1010页)。由于CTC是细长的，因此其临界尺寸小于初始直径，从而阻碍了其有效收聚。在高流速下压力诱导PDMS变形，这是重要却又经常被忽略的一个因素，可部分导致高流速下采集效率降低。替换材料例如硬塑料(PMMA,COC)可能克服此问题，从而可能增大采集效率。由于CTC是极其罕见的细胞群，因此本工作目标是90％采集效率截止。仅采用RBC进行的实验的结果表明Re＝100是将RBC从侧出口去除的最佳流速。根据这些结果，选择10μm通道宽度进行有效的CTC采集。对于MDA-MB-231细胞可观测到类似结果。
通过收聚区的癌细胞经历极大的变形，由于受到较大应力以及较强剪切，因此需要考虑其完整性和存活性。在分离之后，采用方法一节所述流程将MCF-7细胞重新种入培养以测试细胞存活性，从而观测其增殖和生长。经过4天培养，隔离的MCF-7细胞的增殖速度与对照细胞相似，形态没有明显变化。此结果确认了该开发的技术在分选之后隔离期间对细胞的影响极小，维持高细胞存活性的。
对于后续的下游CTC分析，使隔离样本中外周血液白细胞(PBL)的出现导致的污染最小化非常重要。为了评估装置去除PBL的效率，使经过RBC裂解而隔离的纯种人体白细胞以各种Re通过微通道(收聚宽度＝10μm)。人体白细胞的平均直径小于10μm(塞修·P.(Sethu,P.)等，微型实验室，2006.6(1)：83-89页；Schmid-Schonbein,G.W.等血液，1980.56(5)：第866页；Downey,G.P.等应用生理学杂志，1990.69(5)：第1767页)，因此细胞收聚区中的PBL的流路保持不变，并从侧出口处过滤(图21B)。如图所证实的，当Re为50和75时，由于惯性细胞聚集较弱，因此部分PBL仍在中心出口处采集。然而，当Re≥100时，所有白细胞沿通道侧壁保持平衡，而在中心出口处采集不到细胞(采集效率～0％)。
为了进一步评估装置性质，各种浓度的MCF-7细胞被刺入到PBS缓冲液，并在生物芯片的中心出口处回收。采用FACS分析入口和中心出口样本，以确定回收率。测试期间的CTC损失可能导致错误的诊断。结果表明回收率为90％，与CTC隔离效率相符，意味着在样本采集和分析期间细胞损失可以忽略。在高浓度(104细胞/mL)时观察到CTC回收率的降低(～85％)，这可能是因为细胞沿收聚区的互动增强。
血液中的CTC富集
在装置尺寸和工作条件特征化以后，采用最优参数在装置中分析加入全血中的MCF-7细胞。加入了MCF-7细胞(500细胞/mL)的血样稀释为～1.5-2％红细胞比容并以Re＝100通过纵横比＝5微通道泵送。细胞收聚区的宽度固定为10μm。采用FACS和血细胞计分析标记了荧光标签的出口样本以计算分离富集。结果如表4所示，表明在智能装置(第1阶段)的单通道中有～300x的RBC富集，～850x的PBL富集，～85％的CTC回收。
表4采用FACS以及血细胞计数器计数测得的从装置的中心出口回收的RBC、白细胞和MCF-7细胞的相对浓度的实验数据
虽然这些富集比适用于绝大多数细胞分离应用，但涉及血细胞的分离理论上要求107-108倍富集(劳拉·O.(Lara,O.)等，实验血液学，2004.32(10)：891-904页)。由于收聚区中较大CTC的存在扰乱了其紧邻的流场，因此本工作的富集比受到限制。结果，在中心出口处采集到一小部分RBC和PBL，这种现象可通过在出口捕获的高速视频得到证明，在出口处CTC的到达始终伴随着未聚集血细胞的破裂。因此，为了针对CTC检测实现更高且更有意义的富集，通过装置再次处理从装置中心出口采集的样本，以彻底消除污染性血细胞(第2阶段)。上述操作可通过以级联方式将第1阶段的出口管路连接到另一装置而实现。通过添加第2阶段，MCF-7富集程度大大增加，为RBC的3.25x 105倍(5.5log10)，PBL的～1.2x 104倍(4.1log10)，而且总体CTC回收率(～81％)的损失最小。这样实现了每毫升血液大约15,000个RBC以及小于850个的PBL(假设1mL全血中有50亿个RBC和1000万个PBL)。
装置的富集性能可与其它通行的CTC分选技术相比较(纳格拉思·S.(Nagrath,S.)等，自然，2007.450(7173)：1235-1239页；Tan,S.等，生物医学微型装置，2009.11(4)：883-892页；默罕默德·H.(Mohamed,H.)等，色谱杂志A，2009.1216(47)：8289-8295页；Vona,G等，美国病理学杂志，2000.156(1)：57-63页；郑·S(Zheng,S)等，色谱杂志A，2007.1162(2)：154-161页；兹巴戈洛·L.(Zabaglo,L.)等，细胞计数法A部分，2003.55(2)：102-108页；Lara,O.等，实验血液学，2004.32(10)：891-904页)。例如，Zabaglo等人采用的聚碳酸酯膜过滤方法报道了>90％CTC回收率，带有0.1％PBL(Zabaglo,L.等，细胞计数法A部分，2003.55(2)：102-108页)。Vona等人报道的ISET技术报道了优秀的CTC富集比，回收率～80％，而且每毫升血样仅20PBL(Vona,G.等，美国病理学杂志，2000.156(1)：57-63页)。Lara等人采用结合了红细胞裂解和磁性免疫PBL损耗的两步消极(negative)选择技术，实现了5.17log10倍的CTC富集(Lara,O.等，实验血液学，2004.32(10)：891-904页)。由于通过细胞裂解有效消耗了100％的RBC，而隔离样本的DNA仍然受到大约0.3％的PBL的污染，因此富集因数可与装置相比较。装置性能还可以与能够实现104-106倍富集的介导免疫(包括磁性免疫、荧光免疫、结合免疫)CTC分离方法相比较(Nagrath,S.等，自然，2007.450(7173)：1235-1239页；帕特里尼-布里切特·P.(Paterlini-Brechot,P.)和NX.贝娜丽(NX.Benali)，癌症汇报，2007.253(2)：180-204页)。
用于从血液中隔离其它低丰度细胞的装置具有多用性，例如成功地从RBC中富集白细胞，此时仅需将细胞收聚区中的收缩宽度改变为8μm，这允许在中心出口采集更大的PBL(PBL尺寸范围为6-10μm(塞修·P.(Sethu,P.),A.辛(A.Sin)等，微型实验室，2006.6(1)：83-89页；施密特-斯科贝尼·G.W.(Schmid-Schonbein,G.W.)等，血液，1980.56(5)：第866页；唐尼·G.P.(Downey,G.P.)等，应用生理学杂志，1990.69(5)：第1767页)。通过侧出口有效去除所有RBC，使得装置以～60％的PBL回收率在中心出口实现100倍白细胞富集。
对于芯片上血液分析和血液中罕见细胞隔离，高生产量极为重要，以便在极短时间内处理以毫升计的临床血样。通过以400μl/min的流速(Re 100)测试2％的红细胞比容样本，能够采用单个装置处理～108个细胞/分钟。这样，1mL全血的处理时间为～50min。由于仅设计了四条平行通道，因此分析时间实际减少到15min/mL血液以下，远快于其它流行的CTC检测技术。微流体免疫结合方法通常限制为低流速处理，以实现CTC与抗体涂覆表面之间的最大相互作用，并防止分离期间CTC的脱离(Nagrath,S.等，自然，2007.450(7173)：1235-1239页；格莱亨·J.P.(Gleghorn,J.P.)等，微型实验室，2010.10(1)：27-29页)。与CTC物理俘获相关联的普通微流体过滤方法也限制为低流速，保证CTC被俘获而不会在通过陷阱或孔穴时变形(亚当斯·A.A.(Adams,A.A.)等，美国化学学会期刊，2008.130(27)：8633-8641页；Tan,S.等，生物医学微型设备，2009.11(4)：883-892页)。此外，存在被俘获的CTC在俘获区内改变流型的物理现象，因此在较高CTC数量处俘获效率减小。伴随用于分析的复杂回收程序的血液处理后所需的附加清洗进一步增加了总体处理时间。装置提供了连续的分选和采集能力，以回收CTC，用于下游分子检测，例如基因分析、药物筛选和分子靶向癌症治疗。也可实时枚举和分析隔离细胞而不必进行终点调查。
结论
上面描述了从血液中隔离活性的罕见细胞的高生产量及高灵敏度的技术。在装置中采用剪切调节的惯性细胞聚集，以实现基于尺寸从血液中隔离低丰度细胞。作为现有装置的应用，此处描述了以高效率(～80％)和生产量(～400μL/min)从外周血液分离CTC。装置采用2阶段级联设置实现了3.25x 105倍红细胞(RBC)富集以及1.2x 104倍PBL富集。虽然要求稀释样本，但是简单的通道设计使得并行化容易实现，并能在数分钟内分析数毫升临床血样。在装置下游进行基于芯片的检测可为临床癌症诊断提供有力的工具。最后，通过为特定应用定制收聚宽度，芯片可易于富集血液中的其它罕见细胞，包括胎儿细胞和干细胞。
通过引用将各种专利、发布的应用以及此处所引的参考文献的相关教导全部合并到本文中。
虽然已经参照其示例性实施方式具体示出并描述了本发明，本领域技术人员应当理解，在不偏离所附权利要求限定的本发明范围的前提下，可进行形式和细节的各种变化。
Claims (40)
1.一种检测血样中的一种或多种病变血细胞的方法，所述方法包括：将所述血样导入微流体装置的至少一个入口，所述微流体装置包括一个或多个线性通道，其中每个线性通道具有长度，以及限定纵横比的高度和宽度的截面，适于根据病变血细胞与非病变血细胞相比而减弱的变形性沿着所述通道截面的至少一部分而分离病变血细胞，其中病变血细胞沿着所述通道的第一部分流到第一出口，而非病变血细胞沿着所述通道的第二部分流到第二出口。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述病变细胞具有与所述非病变细胞不同的尺寸、硬度、变形性、粘性或它们的组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述血样为全血。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述病变细胞为环形阶段、营养体阶段或裂殖体阶段的感染疟疾的红细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述病变细胞为环形阶段感染疟疾的红细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中以约5μL/min的流速导入所述血样。
7.根据权利要求6所述的方法，其中以约75％-约85％的效率分离所述环形阶段感染疟疾的红细胞，并以约90％的效率分离所述营养体阶段感染疟疾的红细胞。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种病变细胞为感染疟疾的红细胞、镰状细胞贫血红细胞、白血病红细胞或它们的组合。
9.根据权利要求1所述的方法，还包括从所述第一出口采集所述病变细胞。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述通道的纵横比为约1-约2。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述微流体装置还包括扩展区。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二出口的宽度为所述第一出口的约2-约10倍。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述通道的宽度为约15μm。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述通道的高度为约10μm。
15.一种检测人体样本中的一种或多种循环肿瘤细胞的方法，所述方法包括：将所述样本导入微流体装置的至少一个入口，所述微流体装置包括一个或多个螺旋通道，其中每个通道具有长度，以及限定纵横比的高度和宽度的截面，适于根据细胞尺寸沿着所述通道截面的多个部分而分离循环肿瘤细胞，其中所述循环肿瘤细胞沿着所述通道的径向最内部分流到第一出口，而样本中的其余细胞沿着所述通道的另一部分流到第二出口。
16.根据权利要求15所述的方法，还包括从所述第一出口采集所述循环肿瘤细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，还包括分析所述循环肿瘤细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中分析所述循环肿瘤细胞包括评估治疗处理效果。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述通道的纵横比为约1-约5。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述通道的宽度为约500μm。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述通道的高度为约100μm。
22.根据权利要求15所述的方法，其中所述样本为血样。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述血样为包含胎儿有核红细胞的母体血样。
24.一种从异步细胞混合物中分离一种或多种同步细胞的方法，所述方法包括：将异步细胞悬浮液导入微流体装置的至少一个入口，所述微流体装置包括至少一个螺旋通道，其中每个螺旋通道具有长度，以及限定纵横比的高度和宽度的截面，适于根据细胞尺寸沿着所述通道截面的部分而分离同步细胞，其中较大的同步细胞沿着所述通道的径向最内侧部分流到第一出口，而较小的同步细胞沿着所述通道的其余部分流到至少一个其它出口。
25.根据权利要求24所述的方法，还包括从所述第一出口采集所述同步细胞。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述通道的纵横比为约1-约5。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述通道的宽度为约500μm。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述通道的高度为约140μm。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述异步细胞混合物为哺乳动物癌细胞悬浮液或间充质干细胞悬浮液或它们的组合。
30.一种检测人体样本中的一种或多种循环肿瘤细胞的方法，所述方法包括：将所述样本导入微流体装置的至少一个入口，所述微流体装置包括一个或多个线性通道，其中每个通道具有长度，以及具有限定纵横比的高度和宽度的截面，适于根据细胞尺寸沿着所述通道截面的至少一部分分离循环肿瘤细胞，其中所述循环肿瘤细胞沿着所述通道的第一部分流到第一出口，而所述样本中的其余细胞沿着所述通道的第二部分流到第二出口。
31.根据权利要求30所述的方法，还包括从所述第一出口采集所述循环肿瘤细胞。
32.根据权利要求31所述的方法，还包括分析所述循环肿瘤细胞。
33.根据权利要求32所述的方法，其中分析所述循环肿瘤细胞包括评估治疗处理效果。
34.根据权利要求30所述的方法，其中所述通道的纵横比为约2-约10。
35.根据权利要求30所述的方法，其中所述通道的纵横比为约3-约5。
36.根据权利要求30所述的方法，其中所述通道在远离所述入口的端部处的宽度具有待分离细胞的数量级。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述通道的宽度为约20μm。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述微流体装置还包括远离所述入口的所述通道端部处的扩展区。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述微流体装置还包括至少一个细胞聚集区，所述细胞聚集区具有使所有细胞向较长通道尺寸迁移并沿其移动的截面。
40.根据权利要求30所述的方法，其中所述样本为血样。
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