CN114713301A - 一种检测红细胞变形性及尺寸变化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测红细胞变形性及尺寸变化的方法，该微流控芯片由依次连接的入口储液槽、分离轨道和出口储液槽组成，所述分离轨道中平行分布有若干子通道，每个子通道中均设置有分离微柱所述分离轨道具有多段结构，每一段分离轨道中的所述分离微柱的排布均基于公式：Dc＝1.4G(tanθ)0.48。本发明中检测方法能在2分钟内评估红细胞损伤情况和变形性，样本量仅需10μL，且不会发生细胞堵塞，可重复使用，相较于传统检测方法更加灵敏，具有极高的实际应用价值。

Description

一种检测红细胞变形性及尺寸变化的方法
技术领域
本发明涉及细胞检测技术领域，具体涉及一种检测红细胞变形性及尺寸变化的方法。
背景技术
红细胞变形能力(Erythrocyte deformability,ED)在实现在血液和组织之间运输氧气和二氧化碳的关键功能方面发挥着重要作用。良好的红细胞变形性使红细胞(通常圆盘状直径为8μm)能够挤压通过直径小于2.5μm的微小毛细血管。而红细胞变形性受损或丧失会导致微循环受损、血液粘度改变或形成局部血栓。因此，红细胞变形性受损或丧失通常与许多疾病的病理学有关，例如败血症、心血管疾病和许多其他并发症。而自从发现了ED的临床重要性后，红细胞变形性一直是众多研究的重点，以应用于快速诊断疾病、监测严重程度、监测治疗效果以及筛选改善血液流变学特征的药物等发表等方面。
相关技术中用于表征红细胞变形性的常规技术包括微量吸管、原子力显微镜和光学镊子等，均仅适用于单细胞测量，其测量受到吞吐量的限制，仪器昂贵且检测速度相对缓慢、效率低且费力。血液过滤技术可以通过流速来推断红细胞悬液的变形能力，细胞计数法可用于全血或红细胞悬液测量剪切应力施加的红细胞伸长率，但这些测量方法均受制于最小样本量，并且不能揭示单细胞或亚群水平的信息。超声波技术具有分析细胞生物物理特性的能力，但其需要借助微珠或碳纳米管对样品进行预处理，使其附着到靶细胞上，检测成本和检测难度较高。而一些常规的基于微芯片的微流控技术虽然能够满足小样本量的要求，但需要高速相机等昂贵的设备进行辅助检测，且极容易发生设备堵塞问题，尽管能够通过对血液样本进行了预过滤以去除大的红细胞簇，但在样本分析中白细胞(WBC)的干扰是不可避免的，如果装置一旦被白细胞阻塞，则所观察到的红细胞变形性显著降低，导致错误地认为红细胞变形性降低，所以需要样品前处理步骤从而极大地限制了其精准性。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于分析红细胞变形性和细胞尺寸改变情况的微流控芯片及其应用，该微流控芯片基于“U”形柱和特定的分离公式，能高灵敏度的分析红细胞氧化损伤情况以及红细胞变形性的改变。而且该微流控芯片能够排除白细胞的干扰，避免红细胞堵塞，通量大，准确性高，稳定性好。操作简单，全血样本量仅需要10μL。
本发明的第一个方面，提供一种微流控芯片。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述微流控芯片由依次连接的入口储液槽、分离轨道和出口储液槽组成；所述分离轨道中横向平行分布有若干子通道，每个子通道中均设置有分离微柱；所述分离轨道纵向具有多段结构，每一段中的所述分离微柱的排布均基于公式：Dc＝1.4G(tanθ)0.48；
其中，式中Dc为临界半径，G为同行两个相邻微柱之间的间隔，θ表示同列两个相邻分离微柱的梯度角度；
按照样品流动方向，所述每一段分离轨道中的Dc值逐渐增大，所述Dc值为2.0～4.0μm。
在本发明的一些优选实施方式中，同列两个相邻分离微柱的间隔为10μm。
在本发明的一些优选实施方式中，所述分离轨道具有15～24段结构，每一段分离轨道的长度为365～1465μm。
对于段数的设置，其主要基于对于检测中Dc的使用需求来决定，θ在全分离轨道中随着段数的增加会逐渐增大，每一段位移步长最高可以达到0.1μm，因此，在G不发生改变的情况下，每一段分离轨道的长度会因为θ的增加而变小。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述分离轨道具有21段结构，其中，每一段结构Dc值递增0.1μm。
在本发明的一些更优选实施方式中，每一段分离轨道的长度如说明书表1所示。
在本发明的一些优选实施方式中，所述分离微柱为“U”形柱或圆形柱。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述分离微柱为“U”形柱。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述“U”形柱具体为：在边长为15μm的正方形左右任一侧向其中心削除，使之在正方形一侧表面形成向内的凹陷。内陷部分的尺寸如说明书附图2所示，“U”形凹陷的开口宽度为10μm，向内凹陷深度为12.5μm，“U”形凹陷最内部的弧形半径为5μm。圆形柱的直径为15μm。
由于红细胞作为一种可变形的颗粒，“U”形柱相对于圆形柱而言，拥有一个更好的分离效果。具体来说，在相同的间隙尺寸和梯度规格条件下，“U”形柱的Dapp偏移的灵敏度相对于圆形柱提高了一倍，这种“放大”效果为测量红细胞生物物理特性的变化提供了更好的动态范围和灵敏度，并可用于根据红细胞的尺寸分布有效地分析红细胞。
其中，在本发明中，术语“Dapp”是指表观细胞大小(The apparent cell size)，其是在给定设计参数Dc(来自公式1)和观察到的出口分布的情况下，上述微流控芯片中所显示的细胞尺寸。
在本发明的一些优选实施方式中，所述微流控芯片具有1～3个入口储液槽，所述入口储液槽的容积为10～20μL。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述微流控芯片具有3个入口储液槽，所述入口储液槽的容积为10μL。
当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理调控入口储液槽和出口储液槽数量，以满足实际检测需求。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述微流控芯片具有3个入口储液槽和1个出口储液槽，3个入口储液槽大小一致，呈圆形，半径为2.0mm，深度为5.0mm。
在本发明的一些更优选实施方式中，按同一时针方向，3条连接通道与分离轨道两两之间相差90°、180°、270°。当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择其他排布方式。
在本发明的一些更优选实施方式中，与分离轨道呈180°的入口储液槽1具有最细的连接通道，尺寸为10μm；与分离轨道呈90°的入口储液槽2和3则分别具有尺寸为650μm和130μm的连接通道。入口储液槽2和3分别位于入口储液槽1的两侧，入口储液槽2和3的具体分布情况(左右任一侧)不影响其本身的作用与使用效果。
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：按照本发明第一个方面中的尺寸在硅晶上进行造模，得到硅晶模具；向模具中加入疏水性有机硅材料和固化剂，加热固化得到母件；在母件上打孔后，将其与透明基板粘合形成闭合腔孔通道，得到微流控芯片。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述疏水性有机硅材料包括聚二甲基硅氧烷、环甲基硅氧烷、氨基硅氧烷、聚甲基苯基硅氧烷和聚醚聚硅氧烷共聚物中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方式中，所述疏水性有机硅材料为聚二甲基硅氧烷。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述透明基板的材料包括玻璃、PVC、PC和氧化铝陶瓷中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方式中，所述透明基板的材料为玻璃。
在本发明的一些优选实施方式中，所述微流控芯片的制备方法具体为：使用光刻机在硅晶片上造模，清洗干净后，在真空洁净环境下用25μL有机硅烷水溶液对硅晶片模具进行硅烷化处理(处理时间为60min)，以防止聚二甲基硅氧烷粘附，使后续步骤中固化的PDMS更容易去除。然后将重量比为10:1的PDMS和固化剂的混合物倒入模具中，在85℃的加热板上固化60min，得到PDMS母件。将PDMS母件从模具中剥离，在三个入口储液槽上打孔(孔径为2.0mm)，以用于灌注检测样品和其他溶液(如血样或RPMI-1640(含20％FBS)溶液)。出口储液槽上打孔，孔径为1.5mm。使用空气等离子机对PDMS母件等离子处理，使其能够不可逆地结合到透明基板(基板为载玻片)上，从而形成闭合的腔孔通道，得到微流控芯片。
本发明的第三个方面，提供一种红细胞形态分析系统，所述红细胞形态分析系统包括本发明第一个方面所述的微流控芯片、流体驱动装置和细胞计数装置。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述流体驱动装置包括动力泵和注射器。
在本发明的一些优选实施方式中，所述流体驱动装置包括动力泵。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，上述微流控芯片中的出口储液槽上的孔洞通过泵管与微流体注射泵连接，通过微流体注射泵驱动检测样品和缓冲溶液从入口储液槽经过分离轨道流向出口储液槽，实现红细胞变形性和细胞尺寸改变情况检测分析。
当然，本领域技术人员也可以采用其他方式推动液体流动，如从入口推注式驱动。
在本发明的一些优选实施方式中，所述流体驱动装置设置的流体流速为0.2-0.8μL min-1，该流速范围能够最高效的分析红细胞的Dapp以及红细胞变形性的改变。
在本发明的一些优选实施方式中，所述红细胞形态分析系统还包括成像装置，用于拍摄或录像，以供细胞技术装置使用。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述成像装置为带有电荷耦合器件(CCD)相机的基本显微镜。
在本发明的一些优选实施方式中，该系统基于一个简单的工作程序，将血样添加到微流控芯片的样品储液槽中，然后使用注射泵回抽样品，使红细胞流过“U”形柱阵列。红细胞在设备中产生尺寸分布光谱，可以在明场显微镜下使用CCD相机测量。
在本发明的一些优选实施方式中，具体使用方法为：将上述微流控芯片中的出口储液槽上的孔洞分别通过泵管与微流体注射泵连接，将缓冲液和/或检测样品通过入口储液槽上的孔洞添加至对应的入口储液槽中(检测样品通常放在入口储液槽1中，而入口储液槽2和3则分别放入等量缓冲液)，启动注射泵的回抽功能，使检测样品及缓冲液从入口储液槽经过分离轨道流向出口储液槽，完成检测。
本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的微流控芯片或本发明第三个方面所述的红细胞形态分析系统在制备红细胞变形性分析装置中的应用。
在相关技术中，测量红细胞变形性的方法受限于方法的复杂性、不敏感性以及需要抽取静脉血。而对于上述微流控芯片的检测方法，仅需通过指尖采血10μL，简单稀释后即可直接用于检测。红细胞尺寸和变形性检测可在2分钟内完成。适用于新生儿、婴儿和儿童的临床红细胞变形性的即时性测量。
在本发明实施例中，发明人通过构建脓毒症大鼠模型，有效验证了上述微流控芯片和红细胞形态分析系统在分析红细胞变形性上的适用性，展示出了高灵敏度、高准确性和高稳定性的技术优势。
本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面所述的微流控芯片或本发明第三个方面所述的红细胞形态分析系统在制备检测红细胞氧化性损伤装置中的应用。
本发明实施例中的微流控芯片的这种基于“U”形柱的特殊结构使其成为一种敏感且易于使用的工具，不仅可以检测正常红细胞及乙醇对红细胞氧化损伤的双相效应，还可以检测在吩嗪硫酸甲酯(PMS)刺激下显著的个体和剂量依赖性。
在本发明实施例中，发明人通过试验有效验证了上述微流控芯片和红细胞形态分析系统在分析乙醇对红细胞的双相效应以及氧化损伤引起的红细胞物理参数(尺寸和变形性)的改变上的可行性。
本发明的有益效果是：
1.本发明中的基于“U”形柱的微流控芯片设计特别，相较于传统的圆形柱结构更加灵敏，能够有效应用于不同场景，在脓毒症大鼠模型和实际采样来源样品均显示出了极好的适用性。
2.本发明中的基于微流控芯片构建得到的检测系统，其检测难度低，快速(2分钟内评估)、灵敏且无需标记，能够有效分析氧化应激(oxidative stress,OS)介导的红细胞损伤情况。而且，该检测系统不会发生细胞堵塞，可重复使用。样品需求量也极低，仅需使用一滴全血(10μL)即可评估红细胞OS受损情况。
3.本发明中的检测方法是一种低成本、快速和灵敏的红细胞大小和变形分析评估方法，侵入性较小，克服了传统方法对于新生儿或儿童患者时需要大量取血的问题，且经过动物试验验证具有极高的稳定性，减少了试验动物的牺牲，提高了结果的一致性。
附图说明
图1为本发明实施例中的微流控芯片结构示意图。
图2为本发明实施例中的分离微柱构造示意图。
图3为本发明实施例中的微流控芯片的使用原理示意图。
图4为“U”形柱和圆形柱阵列的模拟流体流线图以及红细胞两种阵列中的实际投影路径。
图5为红细胞Dapp在对照组和高浓度乙醇(7％)处理组中的频率分布直方图，其中，A为在“U”形柱阵列中，B为在圆形柱阵列中。
图6为“U”形柱阵中各种流速下红细胞Dapp分布柱状图(A)及其对应的尺寸-流量拟合曲线图(B)。
图7为红细胞在0.3％、3％、5％和7％乙醇处理下的测定的Dapp频率分布图。
图8为在0.3％、3％、5％和7％乙醇处理下的红细胞Dapp的柱状图。
图9为在0.3％、3％、5％和7％乙醇处理下的红细胞变形性的柱状图。
图10为0.3％乙醇保护组和PMS处理组的红细胞Dapp频率分布图。
图11为0.3％乙醇保护组和PMS处理组的红细胞Dapp(A)和红细胞变形性(B)的柱状图。
图12为健康大鼠和CLP大鼠红细胞Dapp变化直方图。
图13为健康大鼠和CLP大鼠红细胞平均Dapp(A)和红细胞变形性(B)柱状图(n＝3)。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
在本发明实施例中，“上下”，“左右”均是基于微流控芯片的入口端和出口端的位置决定的，“上下”的定义为：以入口端为上，以出口端为下；“左右”的定义为：以“上下”的判断标准为基础，正视条件下的左右即为本发明实施例的“左右”。
一种用于分析红细胞变形性和氧化损伤导致的细胞尺寸改变情况的微流控芯片
本实施例中的微流控芯片结构示意图如图1所示。
在本实施例中，该微流控芯片由基板和PDMS母件构成。基板用于闭合PDMS母件中的结构，使之形成腔孔。
PDMS母件中的结构依次为3个入口储液槽、分离轨道和1个出口储液槽。其中，3个入口储液槽大小一致，呈圆形，半径为2.0mm，深度为5mm，可承装10μL液体。3个入口储液槽均基于连接通道与分离轨道连接，但3条连接通道的尺寸各不相同。
在本实施例中，3条连接通道与分离轨道两两之间相差90°、180°、270°或360°。当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择其他排布方式。
在本实施例中，与分离轨道呈180°的入口储液槽1具有最细的连接管，尺寸为10μm；与分离轨道呈90°的入口储液槽2和3则分别具有尺寸为650μm和130μm的连接管。入口储液槽2和3分别位于入口储液槽1的两侧，入口储液槽2和3的具体分布情况(左右任一侧)不影响其本身的作用与使用效果。
上述分离轨道中设置有多个子通道，以用于提升分析效率和分离效果。在本实施例中，上述分离轨道中设置有28个子通道，每个子通道均用于分析红细胞大小和变形性。上述分离轨道由入口端至出口端共分为多段，在本实施例中，共被分为21段。每一段中的分离微柱设置基于公式：Dc＝1.4G(tanθ)0.48。其原理是基于使细胞尺寸小于临界直径的小颗粒在Z字形方向上移动，而大于该尺寸的大颗粒则会在碰撞中以横向位移模式移动。
其中，Dc为临界直径，即Z字形和位移模式之间的截止尺寸参数；G为左右两个相邻微柱之间的间隔。θ表示上下相邻的两个分离微柱的梯度角度。
其中，在本发明实施例中，“上下”的定义为：以入口端为上，以出口端为下。
在本实施例中，上下、左右相邻的两个分离微柱的间隔为10μm。
分离微柱可采用“U”形柱或圆形柱。其中，如图2所示，“U”形柱具体为：在边长为15μm的正方形左右任一侧向其中心削除，使之在正方形一侧表面形成向内的凹陷。圆形柱的直径为15μm。内陷部分的尺寸如图2所示，“U”形凹陷的开口宽度为10μm，向内凹陷深度为12.5μm，“U”形凹陷最内部的弧形半径为5μm。
其中，在本实施例中，随着Dc的增加(Dc范围为2.0～4.0μm)，每一段的分离微柱位移梯度(θ)会逐渐增大，每一段位移步长最高可以达到0.1μm，具体的21段中每一段的参数如表1所示。
表1
Figure BDA0003545636700000071
Figure BDA0003545636700000081
其中，段数顺序为：越靠近入口端的段数编号越小，反之，越靠近出口端的段数编号越大。
本实施例中的微流控芯片是在洁净室中使用常规光刻方法按照上述尺寸要求在硅晶片上造模得到的。具体制备方法为：使用光刻机按照上述尺寸要求在硅晶片上造模，清洗干净后，在真空洁净环境下用25μL有机硅烷水溶液(TMCS三甲基氯硅烷，麦克林上海)对硅晶片模具进行硅烷化处理(处理时间为60min)，以防止聚二甲基硅氧烷(PDMS)粘附，使后续步骤中固化的PDMS更容易去除。然后将重量比为10:1的基础胶剂和固化剂(道康宁美国)的混合物倒入模具中，在85℃的加热板上固化60min，得到PDMS母件。将PDMS母件从模具中剥离，在三个入口储液槽上打孔(孔径为2.0mm)，以用于灌注检测样品和其他溶液(如血样或RPMI-1640(含20％FBS)溶液)。出口储液槽上打孔，孔径为1.5mm。使用空气等离子机对PDMS母件等离子处理，使其能够不可逆地结合到透明基板(在本实施例中，基板为载玻片)上，从而形成闭合的腔孔通道，得到微流控芯片。
将上述微流控芯片中的出口储液槽上的孔洞通过泵管与微流体注射泵连接，通过微流体注射泵驱动检测样品和其他溶液从入口储液槽经过分离轨道流向出口储液槽，实现红细胞变形性和细胞尺寸改变情况检测分析。
基于上述微流控芯片的红细胞变形性和细胞尺寸改变情况分析方法
将上述微流控芯片中的出口储液槽上的孔洞分别通过泵管与微流体注射泵连接，将缓冲液和/或检测样品通过入口储液槽上的孔洞添加至对应的入口储液槽中(检测样品通常放在入口储液槽1中，而入口储液槽2和3则分别放入等量缓冲液)，启动注射泵的回抽功能(流速约为0.2和0.8μL min-1)使检测样品及缓冲液从入口储液槽经过分离轨道流向出口储液槽，完成检测。
其中，为了减少工作流程中，细胞在微流控芯片各部分腔孔中以及通道壁上的粘附，需在检测前先用泊洛沙姆188(1％m/v)对微流控芯片进行灌注改性，改性完成后使用RPMI-1640(含20％FBS)冲洗微流控芯片内残留的泊洛沙姆188。
在微流控芯片的透明基板侧观测细胞运动情况。细胞运动的所有视觉数据均通过显微镜(Leica DM IL LED)和CCD(charge coupled device)相机(Leica DFC 360FX)获得。分离轨道靠近入口储液槽一端设定为输入区域，近出口储液槽一端设定为输出区域，分别在输入和输出区域通过10帧/秒收集50～200张图片，数据保存为未压缩的“avi”格式，以保证其清晰度。使用Matlab软件对输入和输出区域中的细胞进行细胞计数分析，使用OriginPro 8.0根据28个子通道的位置绘制计数细胞的直方图。平均值、标准差、频率和分布数据显示在直方图中。通过分析未压缩的“avi”图片，获取输出区域红细胞的分布和细胞计数情况，从而进一步分析红细胞变形性和细胞尺寸改变情况。
上述方法的具体原理如图3所示。
上述方法可以实现基于红细胞的大小和红细胞变形性来表征红细胞的目的，整个检测步骤仅需2min。在这项工作中，通过使用不同的流速(0.2和0.8μL min-1)，测定获得了红细胞独特的生物物理特征(平均大小，Dapp和ED，ΔDapp)。由于正常红细胞具有较好的变形性，在0.8μL min-1流速下会发生较大的形变，而在0.2μL min-1流速下形变减小，此时我们通过计算0.8和0.2μL min-1流速下的Dapp的差值，可以得到ΔDapp，我们把这个差值定义为该状态下红细胞的变形性(ED)；当检测样品中的红细胞发生氧化损伤时，相对于正常红细胞而言，无论是在哪一种流速下，都会比正常红细胞具有一个较大的Dapp，而由于硬度增大，红细胞形变会减小，即ΔDapp将减少，意味着可变形的红细胞对于流速所造成的形变逐渐减小，趋向于不可变形的颗粒。ED＝ΔDapp＝Dapp(0.2μL min-1)-Dapp(0.8μL min-1)。
上述微流控芯片的实际应用效果
在本实施例中，共随机选择6位健康志愿者参见试验，该试验得到了医学伦理委员会的批准，并按照赫尔辛基宣言中规定的指导方针进行，所有志愿者均签署书面知情同意书。此外，其他试验动物，如Sprague-Dawley(SD)大鼠在实验过程中可以自由获取食物和水，对于试验动物的试验设计方案均经中国南方医科大学动物护理和使用委员会批准。
具体检测步骤为：
(1)血样获取：
通过指尖采血法从健康志愿者的指尖获得一滴全血，储存在含有10μL EDTA的试管中，所有采集血样均需2小时内使用。
(2)根据具体实验目的，选择下述任一种方式进行检测：
A.仅检测红细胞尺寸变化：
通过COMSOL模拟装置内流体运动，结果如图4所示，可以发现，对于相同的压力差，与圆形柱相比，采用了“U”形柱会使相邻柱之间的柱间流速显著增加。检测样品中的红细胞与“U”形柱碰撞为两个点，而与圆形柱碰撞仅为一个面，因此由于红细胞旋转和流动引起的位移增强，会使红细胞的分离更加容易实现。
B.同时检测红细胞变形性和非氧化性细胞尺寸改变情况：
将采集的全血(10μL)添加到90μL RPMI-1640(含20％FBS)溶液中，得到检测样品液。将检测样品液注入上述微流控芯片(分离微柱为“U”形柱)的入口储液槽1中，并向入口储液槽2和3中注入等体积的RPMI-1640(含20％FBS)缓冲液，利用注射泵分别在0.2，0.4，0.6和0.8μL min-1的流速下回抽血液样本和缓冲液，收集细胞计数等参数绘制直方图，并观察红细胞尺寸随流速变化的改变情况。
将红细胞在不同流速下得到的Dapp与对应的流速做线性分析，得到线性公式，其中，将Dapp(0.2μL min-1)与Dapp(0.8μL min-1)的差值ΔDapp来表征红细胞变形性。
在本实施例中，采用非氧化性试剂乙醇作为添加剂，用于同时检测红细胞变形性和细胞尺寸改变情况。
具体检测步骤为：
将采集的全血(10μL)添加到90μL混合液(含20％FBS的RPMI-1640+终浓度分别为0、0.3、3、5和7％(v/v)的乙醇)中，利用注射泵分别在0.2和0.8μL min-1的流速下回抽血液样本和缓冲液，收集细胞计数等参数绘制直方图，并观察红细胞尺寸随流速变化的改变情况。
如图5所示，其展示了输出区域相对于“U”形柱和圆形柱的右移红细胞光谱。其显示了在全血中加入7％乙醇并孵育30分钟会引起红细胞尺寸的变化，首先两种柱阵列芯片在相同流速(0.8μL min-1)下分别测得正常红细胞Dapp(U形2.80μm，圆形2.41μm)和7％乙醇孵育后的红细胞的Dapp(U形3.36μm，圆形2.62μm)。因此，会检测到红细胞不同状态分别在两种柱状阵列的Dapp变化和Dapp的相对变化(ΔDapp)。在本实施例中，“U”形柱和圆形柱的ΔDapp值分别为0.56μm和0.2μm。这意味着，在间隙尺寸和梯度规格一致的情况下，检测“U”形柱的Dapp偏移的灵敏度比圆形柱检测灵敏度提高了一倍。在此必须强调的是，正是这种“放大”的差异为测量红细胞生物物理特性的变化提供了更好的动态范围和灵敏度，并可用于根据红细胞的尺寸分布有效地分析红细胞。由于血液中的白细胞(WBC)尺寸远大于4.0μm，因此，样品中的白细胞会被被置换到最大的4.0μm子通道中，从而避免了对于红细胞的检测造成干扰。
红细胞作为一种可变形的颗粒，在外力作用下会改变其形态。而在上述微流控芯片中增加流速则会导致黏性应力的增加，进而影响生物细胞的行为。在基于“U”形柱的微流控芯片测试0.2-1.0μL min-1流速对红细胞的影响试验中，不同流速下Dapp的个体频率分布和平均Dapp如图6所示。可以发现，六个健康志愿者血样在不同流速下的平均Dapp，分别为2.97，2.89，2.84，2.79和2.78μm。总体来看，其结果表明红细胞的Dapp随液体流速的增加而减小。基于Dapp与流速的线性关系拟合线性方程为：y＝3.01797-0.2838x，其中，R2＝0.988。在0.2-0.8μL min-1流速范围内，平均Dapp降低幅度ΔDapp＝0.18μm。因此，通过计算0.8和0.2μL min-1流速下的Dapp的差值，可以得到ΔDapp，我们把这个差值定义为该状态下红细胞的变形性(ED)。
在现有技术中，乙醇被认为对正常红细胞变形性具有剂量依赖的双相效应，因此，通过调节乙醇浓度变化能够获知其对红细胞的作用的分子机制。而在本实施例中，为了能够验证基于“U”形柱的微流控芯片的检测性能，发明人基于不同乙醇浓度对红细胞Dapp(0.2和0.8μL min-1流速下测得的表观尺寸)和红细胞变形性(ΔDapp)的影响，以及6名健康志愿者Dapp个体频率分布情况，来验证基于“U”形柱的微流控芯片的检测方法的整体稳定性和重复性。
结果如图7和8所示。通过6名健康志愿者在不同乙醇浓度下乙醇对Dapp的总体影响数据，可以发现，乙醇介导的细胞损伤对Dapp具有明显的双相效应和剂量依赖性，与现有技术中的公开情况一致。此外，当乙醇浓度分别为0、0.3％、3％、5％和7％(v/v)时，在0.8μLmin-1流速下平均Dapp分别为2.8、2.65、2.92、3.06和3.36μm；在0.2μL min-1流速下平均Dapp分别为2.97、2.87、3.08、3.17和3.40μm。当乙醇浓度超过0.3％(v/v)时，红细胞Dapp随乙醇浓度的增加而增加，但只有当乙醇浓度大于5％(v/v)时，Dapp才出现显著性增加(P<0.001)。当乙醇浓度为0～7％(v/v)时，Dapp的平均增幅为0.56μm(流速为0.8μL min-1时)和0.43μm(流速为0.2μL min-1时)。上述结果表明，随着乙醇浓度的增加，平均Dapp至少增加了15％。
此外，乙醇对红细胞变形性的影响也十分显著，如图9所示，乙醇对红细胞变形性具有双相作用，低浓度(0.3％v/v以下)乙醇处理能改善红细胞变形性，而高浓度乙醇(5％v/v以上)处理则会显著降低红细胞变形性，而且，相同剂量的乙醇也会导致红细胞变形性的个体间变异，因此，一样一检是十分必要的(如图9热图中的个体间不同的易感性)。
C.同时检测红细胞变形性和氧化损伤性细胞尺寸改变情况：
在本实施例中，采用氧化性试剂PMS(吩嗪硫酸甲酯)作为添加剂，用于同时检测红细胞变形性和细胞尺寸改变情况。
将采集的全血(10μL)添加到90μL 500μM PMS溶液中，37℃孵育30分钟，利用注射泵分别在0.2和0.8μL min-1的流速下回抽血液样本和缓冲液，收集细胞计数等参数绘制直方图，并观察红细胞尺寸随流速变化的改变情况。
其中，设置对照组和乙醇保护组。对照组为10μL全血样品+90μL RPMI-1640(含20％FBS)溶液。乙醇保护组为：在10μL全血样品加入乙醇，使乙醇终浓度达到0.3％(v/v)，37℃孵育30分钟，然后加入90μL 500μM的PMS，37℃孵育30分钟后进行检测。
人体红细胞易被氧化剂破坏，其功能性质和结构会随着氧化剂的攻击而改变。这些与氧化损伤相关的变化可能会导致红细胞的流变行为(即大小和变形能力)的改变。
在上述实施例中，用于引起红细胞氧化损伤的试剂使用PMS，PMS作为一种强氧化剂，可引起红细胞的一系列变化。PMS产生的O2-自由基会干扰红细胞膜的流变学特性(增加膜刚性)。同时，氧自由基损伤会导致红细胞功能改变，包括阳离子通透性和红细胞变形性。而且，现有技术中还指出，低浓度乙醇共给药可改善O2-自由基生成导致的红细胞氧化损伤。因此，上述方法中，基于“U”形柱的微流控芯片，同时考察了0.3％(v/v)乙醇共用对红细胞变形性和红细胞Dapp的保护作用。
结果如图10-11所示，当流速为0.8μL min-1时，对照组、乙醇保护组和PMS组的平均Dapp输出光谱发别是2.8，3.17和3.44μm。与对照组相比，乙醇保护组和PMS组的ΔDapp分别增加了0.37μm和0.64μm，Dapp分别显著提高了13.2％和22.9％。与乙醇保护组相比，PMS组的ΔDapp增加了0.27μm，表明Dapp增加了8.5％。当流速为0.2μL min-1时，对照组、乙醇保护组和PMS组的平均Dapp输出光谱发别是2.97，3.29和3.53μm。相反，在所有测试条件下，红细胞变形性均只是出现了减少而不是增加的情况。少量乙醇(0.3％v/v)的处理对红细胞的氧化损伤有一定的保护作用，其保护机制可能与乙醇对正常红细胞的作用方式类似。
以上结果证明，基于“U”形柱的微流控芯片具有良好的重复性、灵敏度和准确性，且操作简单、使用方便、成本低廉。
上述微流控芯片在脓毒症动物模型中的应用
为了突出上述微流控芯片的实际应用价值，发明人将其实际应用于一般实验动物及脓毒症动物模型中，通过分析其红细胞变形性来显示出其实际效果。
(1)盲肠结扎-穿刺(CLP)诱导的大鼠脓毒症模型构建：
在本实施例中，所用试验动物为雄性无病原体SD大鼠(体重200-220g)，由南方医科大学(中国广州)动物中心提供。
具体构建方法为：
通过腹膜内施用10％(v/v)水合氯醛(4μL g-1体重)诱导麻醉。在其腹部中部切开2cm切口，通过该切口在回盲瓣下方结扎盲肠，不阻塞回肠或结肠。然后使用3mm宽的针头对盲肠进行“贯穿”穿孔。完成后，腹部切口用普通肠外科缝合线(4-0)和金属夹分层闭合。完成造模。造模48小时后，分别从对照组(假手术SD大鼠)和CLP处理组采集尾静脉血(全血10μL)。使用上述微流控芯片(“U”形柱)分别在0.2和0.8μL min-1的流速下回抽血液样本和缓冲液，通过数据采集绘制直方图，用来分析红细胞尺寸和红细胞变形性的改变情况。
通过既往对脓毒症患者和动物的研究表明，红细胞变形性降低和红细胞氧化损伤是影响脓毒症患者红细胞力学性能的主要因素。但常规方法中由于白细胞的干扰，并不是所有的红细胞变形性分析方法(如微孔体积过滤方法)都适合检测红细胞变形性的这些变化，因此，发明人以通过CLP诱导的脓毒症SD大鼠为试验对象，以此突出基于上述微流控芯片的检测方法的的稳健性和敏感性。
结果如图12～13所示。当流速为0.8μL min-1时，对照组和CLP组大鼠红细胞输出谱的Dapp平均值分别为2.60和2.88μm(图12)。当流速为0.2μL min-1时，对照组和CLP组大鼠红细胞输出谱的Dapp平均值分别为2.88和3.03μm(图12)。而对照组大鼠与CLP大鼠Dapp、红细胞变形性平均值也均出现显著性差异(P<0.01，图13)。同时，发明人使用全自动流变仪(中国南方数控设备有限公司)分析全血黏度、血浆黏度(PV)和红细胞流动系数(TK)后(其中，具体检测步骤为：试验大鼠腹腔注射8％水合氯醛(0.4mL/100g，i.p.)深度麻醉，剃掉腹部毛发，打开腹部，取动脉全血约4mL，放入EDTA抗凝管中，然后按照全自动流变仪使用说明进行检测)，也证明了上述盲肠结扎术造模方式成功得到了红细胞变形性下降血液黏度升高的脓毒症动物模型(结果如表2所示)。综上所述，可以认为上述基于“U”形柱的微流控芯片检测方法具有良好的灵敏度，在10μL全血条件下可在2分钟内完成无标记的脓毒症红细胞损伤检测。
表2全血黏度、血浆黏度(PV)和红细胞流动系数(TK)测定结果
对照组 CLP处理组
HS(200s<sup>-1</sup>)(mPa·s) 4.73±0.27 5.79±0.5*
MS(30s<sup>-1</sup>)(mPa·s) 5.53±0.35 6.91±0.66*
LS(1s<sup>-1</sup>)(mPa·s) 11.56±0.84 14.91±1.6*
PV(mPa·s) 0.94±0.08 1.16±0.04*
TK 1.07±0.03 1.17±0.03*
其中，*表示P<0.05，HS表示全血高切黏度，MS表示全血中切黏度，LS表示全血低切黏度。
综上所述，上述结果表明，本发明实施例中的微流控芯片可以实际用于红细胞变形性降低和红细胞氧化损伤的检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片由依次连接的入口储液槽、分离轨道和出口储液槽组成；
所述分离轨道中平行横向分布有若干子通道，每个子通道中均设置有分离微柱；
所述分离轨道纵向具有多段结构，每一段分离轨道中的所述分离微柱的排布均基于公式：
Dc＝1.4G(tanθ)0.48；
其中，式中Dc为临界半径，G为同行两个相邻微柱之间的间隔，θ表示同列两个相邻分离微柱的梯度角度；
按照样品流动方向，所述每一段分离轨道中的Dc值逐渐增大，所述Dc值为2.0～4.0μm。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述分离轨道具有15～24段结构，每一段分离轨道的长度为365～1465μm。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述分离微柱为“U”形柱或圆形柱。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片具有1～3个入口储液槽，所述入口储液槽的容积为10～20μL。
5.权利要求1～4任一项所述的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
按照权利要求1～4中的尺寸在硅晶上进行造模，得到硅晶模具；
向模具中加入疏水性有机硅材料和固化剂，加热固化得到母件；
在母件上打孔后，将其与透明基板粘合形成闭合腔孔通道，得到微流控芯片。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述疏水性有机硅材料包括聚二甲基硅氧烷、环甲基硅氧烷、氨基硅氧烷、聚甲基苯基硅氧烷和聚醚聚硅氧烷共聚物中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述透明基板的材料包括玻璃、PVC、PC和氧化铝陶瓷中的至少一种。
8.红细胞形态分析系统，其特征在于，所述红细胞形态分析系统包括权利要求1～4任一项所述的微流控芯片、流体驱动装置和细胞计数装置；
所述流体驱动装置包括动力泵和注射器。
9.权利要求1～4任一项所述的微流控芯片或权利要求8所述的红细胞形态分析系统在制备红细胞变形性及尺寸大小分析检测装置中的应用。
10.权利要求1～4任一项所述的微流控芯片或权利要求8所述的红细胞形态分析系统在制备检测红细胞氧化性损伤检测装置中的应用。
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